Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Vloeibare biopsie (LV) is 'n konsep wat vinnig gewild raak in die biomediese veld. Die konsep is hoofsaaklik gebaseer op die opsporing van fragmente van sirkulerende ekstrasellulêre DNS (ccfDNS), wat hoofsaaklik as klein fragmente vrygestel word na seldood in verskeie weefsels. 'n Klein deel van hierdie fragmente is afkomstig van vreemde (vreemde) weefsels of organismes. In huidige werk het ons hierdie konsep toegepas op mossels, 'n wagspesie wat bekend is vir hul hoë seewaterfiltrasiekapasiteit. Ons gebruik die vermoë van mossels om as natuurlike filters op te tree om omgewings-DNS-fragmente van 'n verskeidenheid bronne vas te vang om inligting oor die biodiversiteit van mariene kus-ekosisteme te verskaf. Ons resultate toon dat mosselhemolimf DNS-fragmente bevat wat baie in grootte wissel, van 1 tot 5 kb. Haelgeweer-volgordebepaling het getoon dat 'n groot aantal DNS-fragmente van vreemde mikrobiese oorsprong is. Onder hulle het ons DNS-fragmente van bakterieë, argea en virusse gevind, insluitend virusse wat bekend is om 'n verskeidenheid gashere te infekteer wat algemeen in kus-mariene ekosisteme voorkom. Ten slotte toon ons studie dat die konsep van LB wat op mossels toegepas word, 'n ryk maar tot dusver onontginde bron van kennis oor mikrobiese diversiteit in mariene kus-ekosisteme verteenwoordig.
Die impak van klimaatsverandering (KK) op die biodiversiteit van mariene ekosisteme is 'n vinnig groeiende navorsingsgebied. Aardverwarming veroorsaak nie net belangrike fisiologiese spanning nie, maar stoot ook die evolusionêre grense van die termiese stabiliteit van mariene organismes, wat die habitat van 'n aantal spesies beïnvloed en hulle aanspoor om na gunstiger toestande te soek [1, 2]. Benewens die beïnvloeding van die biodiversiteit van metazoa, ontwrig KK die delikate balans van gasheer-mikrobiese interaksies. Hierdie mikrobiese disbakteriese hou 'n ernstige bedreiging vir mariene ekosisteme in, aangesien dit mariene organismes meer vatbaar maak vir aansteeklike patogene [3, 4]. Daar word geglo dat SS 'n belangrike rol speel in massasterftes, wat 'n ernstige probleem is vir die bestuur van globale mariene ekosisteme [5, 6]. Dit is 'n belangrike kwessie gegewe die ekonomiese, ekologiese en voedingsimpakte van baie mariene spesies. Dit is veral waar vir tweekleppiges wat in die poolstreke leef, waar die gevolge van KK meer onmiddellik en ernstig is [6, 7]. Trouens, tweekleppiges soos Mytilus spp. word wyd gebruik om die gevolge van KK op mariene ekosisteme te monitor. Dit is nie verbasend dat 'n relatief groot aantal biomerkers ontwikkel is om hul gesondheid te monitor nie, dikwels met behulp van 'n tweeledige benadering wat funksionele biomerkers behels gebaseer op ensiematiese aktiwiteit of sellulêre funksies soos sel-lewensvatbaarheid en fagositiese aktiwiteit [8]. Hierdie metodes sluit ook die meting van die konsentrasie van spesifieke drukaanwysers in wat in sagteweefsel ophoop na die absorpsie van groot hoeveelhede seewater. Die hoë filtrasiekapasiteit en semi-oop bloedsomloopstelsel van tweekleppiges bied egter 'n geleentheid om nuwe hemolimf-biomerkers te ontwikkel deur die konsep van vloeibare biopsie (LB) te gebruik, 'n eenvoudige en minimaal indringende benadering tot pasiëntbestuur. bloedmonsters [9, 10]. Alhoewel verskeie tipes sirkulerende molekules in menslike LB gevind kan word, is hierdie konsep hoofsaaklik gebaseer op DNS-volgordebepalingsanalise van sirkulerende ekstrasellulêre DNS (ccfDNS)-fragmente in plasma. Trouens, die teenwoordigheid van sirkulerende DNS in menslike plasma is sedert die middel van die 20ste eeu bekend [11], maar dit is eers in onlangse jare dat die koms van hoë-deurset-volgordebepalingsmetodes gelei het tot kliniese diagnose gebaseer op ccfDNS. Die teenwoordigheid van hierdie sirkulerende DNS-fragmente is deels te wyte aan die passiewe vrystelling van genomiese DNS (kern- en mitochondriaal) na seldood. By gesonde individue is die konsentrasie van ccfDNA normaalweg laag (<10 ng/mL), maar dit kan met 5-10 keer verhoog word by pasiënte wat aan verskeie patologieë ly of aan stres blootgestel word, wat weefselskade tot gevolg het. By gesonde individue is die konsentrasie van ccfDNA normaalweg laag (<10 ng/mL), maar dit kan met 5-10 keer verhoog word by pasiënte wat aan verskeie patologieë ly of aan stres blootgestel word, wat weefselskade tot gevolg het. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), nie может повышаться в 5–10 teen 5-10 jaar патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. By gesonde mense is die konsentrasie van cccDNA normaalweg laag (<10 ng/mL), maar dit kan met 5-10 keer toeneem by pasiënte met verskeie patologieë of onder stres wat tot weefselskade lei.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 扅理 刖 扊中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, nо могут быть увеличены в 5-10 мл. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsentrasies is gewoonlik laag (<10 ng/ml) in gesonde individue, maar kan 5-10-voudig verhoog word in pasiënte met verskeie patologieë of stres, wat lei tot weefselskade.Die grootte van ccfDNA-fragmente wissel wyd, maar wissel gewoonlik van 150 tot 200 bp. [12]. Analise van self-afgeleide ccfDNA, d.w.s. ccfDNA van normale of getransformeerde gasheerselle, kan gebruik word om genetiese en epigenetiese veranderinge in die kern- en/of mitochondriale genoom op te spoor, waardeur klinici spesifieke molekulêr-geteikende terapieë kan kies [13]. CcfDNA kan egter verkry word van vreemde bronne soos ccfDNA van fetale selle tydens swangerskap of van oorgeplante organe [14,15,16,17]. ccfDNA is ook 'n belangrike bron van inligting vir die opsporing van die teenwoordigheid van nukleïensure van 'n aansteeklike agent (vreemd), wat nie-indringende opsporing van wydverspreide infeksies wat nie deur bloedkulture geïdentifiseer word nie, moontlik maak, wat indringende biopsie van besmette weefsel vermy [18]. Onlangse studies het inderdaad getoon dat menslike bloed 'n ryk bron van inligting bevat wat gebruik kan word om virale en bakteriële patogene te identifiseer, en dat ongeveer 1% van die ccfDNA wat in menslike plasma voorkom, van vreemde oorsprong is [19]. Hierdie studies toon dat die biodiversiteit van 'n organisme se sirkulerende mikrobioom beoordeel kan word deur middel van ccfDNA-analise. Tot onlangs is hierdie konsep egter uitsluitlik by mense en, in 'n mindere mate, by ander gewerweldes gebruik [20, 21].
In die huidige artikel gebruik ons ​​die LB-potensiaal om die ccfDNA van Aulacomya atra te analiseer, 'n suidelike spesie wat algemeen voorkom in die subantarktiese Kerguelen-eilande, 'n groep eilande bo-op 'n groot plato wat 35 miljoen jaar gelede gevorm het. vulkaniese uitbarsting. Deur 'n in vitro eksperimentele stelsel te gebruik, het ons gevind dat DNS-fragmente in seewater vinnig deur mossels opgeneem word en die hemolimf-kompartement binnedring. Haelgeweer-volgordebepaling het getoon dat mossel-hemolimf-ccfDNA DNS-fragmente van sy eie en nie-self-oorsprong bevat, insluitend simbiotiese bakterieë en DNS-fragmente van biome tipies van koue vulkaniese mariene kus-ekosisteme. Hemolimf-ccfDNA bevat ook virale volgordes afgelei van virusse met verskillende gasheerreekse. Ons het ook DNS-fragmente van meersellige diere soos beenvisse, seeanemone, alge en insekte gevind. Ten slotte toon ons studie dat die LB-konsep suksesvol op mariene ongewerweldes toegepas kan word om 'n ryk genomiese repertoire in mariene ekosisteme te genereer.
Volwassenes (55-70 mm lank) Mytilus platensis (M. platensis) en Aulacomya atra (A. atra) is in Desember 2018 versamel vanaf die tussengety-rotsagtige oewers van Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 O.). Kerguelen-eilande. Ander volwasse bloumossels (Mytilus spp.) is verkry van 'n kommersiële verskaffer (PEI Mussel King Inc., Prins Edward-eiland, Kanada) en in 'n temperatuurbeheerde (4°C) belugte tenk geplaas wat 10-20 L 32‰ kunsmatige pekelwater bevat (kunsmatige seesout Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, VSA). Vir elke eksperiment is die lengte en gewig van individuele skulpe gemeet.
'n Gratis ooptoegangprotokol vir hierdie program is aanlyn beskikbaar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kortliks, LB-hemolimf is van abduktorspiere versamel soos beskryf [22]. Die hemolimf is deur sentrifugering by 1200 × g vir 3 minute geklaar, die supernatant is gevries (-20 °C) tot gebruik. Vir die isolasie en suiwering van cfDNA is monsters (1.5-2.0 ml) ontdooi en verwerk met behulp van die NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) volgens die vervaardiger se instruksies. ccfDNA is by -80 °C gestoor tot verdere analise. In sommige eksperimente is ccfDNA geïsoleer en gesuiwer met behulp van die QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Gesuiwerde DNA is gekwantifiseer met behulp van 'n standaard PicoGreen-toets. Die fragmentverspreiding van die geïsoleerde ccfDNA is geanaliseer deur kapillêre elektroforese met behulp van 'n Agilent 2100 bioanaliseerder (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) met behulp van 'n hoë-sensitiwiteits-DNA-kit. Die toets is uitgevoer met 1 µl van die ccfDNA-monster volgens die vervaardiger se instruksies.
Vir die volgordebepaling van hemolimf-ccfDNA-fragmente het Genome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) haelgeweerbiblioteke voorberei met behulp van die Illumina DNA Mix-stel van die Illumina MiSeq PE75-stel. 'n Standaardadapter (BioO) is gebruik. Rou datalêers is beskikbaar vanaf die NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 en SRR8924809). Basiese leeskwaliteit is beoordeel met behulp van FastQC [23]. Trimmomatic [24] is gebruik vir knipadapters en swak kwaliteit lesings. Haelgeweerlesings met gepaarde punte is FLASH saamgevoeg in langer enkellesings met 'n minimum oorvleueling van 20 bp om wanpassings te vermy [25]. Saamgevoegde lesings is geannoteer met BLASTN met behulp van 'n tweekleppige NCBI Taksonomie databasis (e waarde < 1e−3 en 90% homologie), en maskering van lae-kompleksiteit rye is uitgevoer met behulp van DUST [26]. Saamgevoegde lesings is geannoteer met BLASTN met behulp van 'n tweekleppige NCBI Taksonomie databasis (e waarde < 1e−3 en 90% homologie), en maskering van lae-kompleksiteit rye is uitgevoer met behulp van DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии BINCOVE двулхорч (snachene e < 1e-3 en 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельос с 26польс с ис. Gepoolde lesings is geannoteer met BLASTN met behulp van die NCBI tweekleppige taksonomiedatabasis (e-waarde < 1e-3 en 90% homologie), en lae-kompleksiteit volgordemaskering is uitgevoer met behulp van DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿娰2进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2 ，进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных мазых двусков (snachene e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнель с исп6]. Gepoolde lesings is geannoteer met BLASTN met behulp van die NCBI tweekleppige taksonomiese databasis (e-waarde <1e-3 en 90% homologie), en lae-kompleksiteit volgordemaskering is uitgevoer met behulp van DUST [26].Lesings is in twee groepe verdeel: verwant aan tweekleppige reekse (hier selflesings genoem) en onverwante (nie-selflesings). Twee groepe is afsonderlik saamgestel met behulp van MEGAHIT om contigs te genereer [27]. Intussen is die taksonomiese verspreiding van uitheemse mikrobioomlesings geklassifiseer met behulp van Kraken2 [28] en grafies voorgestel deur 'n Krona-sirkelgrafiek op Galaxy [29, 30]. Die optimale kmers is bepaal as kmers-59 uit ons voorlopige eksperimente. Selfkontigs is toe geïdentifiseer deur belyning met BLASTN (tweekleppige NCBI-databasis, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) vir 'n finale annotasie. Selfkontigs is toe geïdentifiseer deur belyning met BLASTN (tweekleppige NCBI-databasis, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie) vir 'n finale annotasie. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлых, скопоставления с BLASTN) <1e-10 и гомология 60%) vir окончательной аннотации. Self-kontigs is toe geïdentifiseer deur ooreenstemming met BLASTN (NCBI tweekleppige databasis, e-waarde <1e-10 en 60% homologie) vir finale annotasie.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги vir окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (ByNC vir BLASTN) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 en гомология 60%). Self-kontigs is toe geïdentifiseer vir finale annotasie deur ooreenstemming teen BLASTN (NCBI tweekleppige databasis, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). Parallel is nie-selfgroep-kontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI-databasis, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Parallel is nie-selfgroep-kontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI-databasis, e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (by NCBI, op 1 Januarie 10 60%). Parallel is vreemde groep-contigs geannoteer met BLASTN (NT NCBI-databasis, e-waarde <1e-10 en 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (bаза данныNC) <1e-10 и гомология 60%). Parallel is nie-selfgroep-kontigs geannoteer met BLASTN (nt NCBI-databasis, e-waarde <1e-10 en 60% homologie). BLASTX is ook op nie-self-contigs uitgevoer met behulp van die nr- en RefSeq-proteïen NCBI-databasisse (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX is ook op nie-self-contigs uitgevoer met behulp van die nr- en RefSeq-proteïen NCBI-databasisse (e-waarde < 1e−10 en 60% homologie). BLASTX is beskikbaar vir onnodige kontak met использованием as 'n nommer en RefSeq NCBI (vanaf <1e-0 гомология 60%. BLASTX is ook uitgevoer op nie-self-contigs met behulp van die nr- en RefSeq NCBI-proteïendatabasisse (e-waarde < 1e-10 en 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 BLASTX kan gebruik word vir onnodige verbindings met использованием op grond van 'n nommer en RefSeq NCBI (vanaf <1e-1 гомология 60%. BLASTX is ook uitgevoer op nie-self-contigs met behulp van die nr- en RefSeq NCBI-proteïendatabasisse (e-waarde <1e-10 en 60% homologie).Die BLASTN- en BLASTX-poele van nie-self-kontigs verteenwoordig die finale kontigs (sien Aanvullende lêer).
Die primers wat vir PCR gebruik is, word in Tabel S1 gelys. Taq DNA-polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) is gebruik om die ccfDNA-teikengene te amplifiseer. Die volgende reaksiekondisies is gebruik: denaturasie by 95°C vir 3 minute, 95°C vir 1 minuut, ingestelde uitgloeiingstemperatuur vir 1 minuut, verlenging by 72°C vir 1 minuut, 35 siklusse, en uiteindelik 72°C binne 10 minute. PCR-produkte is geskei deur elektroforese in agarosegels (1.5%) wat SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) teen 95 V bevat.
Mossels (Mytilus spp.) is vir 24 uur by 4°C in 500 ml suurstofryke seewater (32 PSU) geakklimatiseer. Plasmied-DNS wat 'n insetsel bevat wat die menslike galectin-7 cDNS-volgorde kodeer (NCBI-toegangsnommer L07769) is by die flessie gevoeg teen 'n finale konsentrasie van 190 μg/μl. Mossels wat onder dieselfde toestande sonder DNA-byvoeging geïnkubeer is, was die kontrole. Die derde kontroletenk het DNA sonder mossels bevat. Om die kwaliteit van DNA in seewater te monitor, is seewatermonsters (20 μl; drie herhalings) op die aangeduide tyd uit elke tenk geneem. Vir plasmied-DNS-naspeurbaarheid is LB-mossels op die aangeduide tye geoes en deur qPCR en ddPCR geanaliseer. As gevolg van die hoë soutinhoud van seewater, is aliquots in PCR-kwaliteit water (1:10) verdun voor alle PCR-toetse.
Digitale druppel-PCR (ddPCR) is uitgevoer met behulp van die BioRad QX200-protokol (Mississauga, Ontario, Kanada). Gebruik die temperatuurprofiel om die optimale temperatuur te bepaal (Tabel S1). Druppels is gegenereer met behulp van 'n QX200-druppelgenerator (BioRad). ddPCR is soos volg uitgevoer: 95°C vir 5 min, 50 siklusse van 95°C vir 30 s en 'n gegewe uitgloeiingstemperatuur vir 1 min en 72°C vir 30 s, 4°C vir 5 min en 90°C binne 5 minute. Die aantal druppels en positiewe reaksies (aantal kopieë/µl) is gemeet met behulp van 'n QX200-druppelleser (BioRad). Monsters met minder as 10 000 druppels is verwerp. Patroonbeheer is nie elke keer uitgevoer wanneer ddPCR uitgevoer is nie.
qPCR is uitgevoer met behulp van Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australië) en LGALS7-spesifieke primers. Alle kwantitatiewe PCR's is in 20 µl uitgevoer met behulp van die QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR is begin met 'n 15 min inkubasie by 95°C, gevolg deur 40 siklusse by 95°C vir 10 sekondes en by 60°C vir 60 sekondes met een data-insameling. Smeltkrommes is gegenereer deur opeenvolgende metings by 95°C vir 5 s, 65°C vir 60 s, en 97°C aan die einde van die qPCR te gebruik. Elke qPCR is in drievoud uitgevoer, behalwe vir kontrolemonsters.
Aangesien mossels bekend is vir hul hoë filtrasietempo, het ons eers ondersoek ingestel of hulle DNA-fragmente wat in seewater teenwoordig is, kon filter en behou. Ons was ook geïnteresseerd in of hierdie fragmente in hul semi-oop limfstelsel ophoop. Ons het hierdie probleem eksperimenteel opgelos deur die lot van oplosbare DNA-fragmente wat by bloumosseltenks gevoeg is, na te spoor. Om die opsporing van DNA-fragmente te vergemaklik, het ons vreemde (nie self-) plasmied-DNS gebruik wat die menslike galectin-7-geen bevat. ddPCR spoor plasmied-DNS-fragmente in seewater en mossels na. Ons resultate toon dat as die hoeveelheid DNA-fragmente in seewater relatief konstant gebly het oor tyd (tot 7 dae) in die afwesigheid van mossels, dan het hierdie vlak in die teenwoordigheid van mossels binne 8 uur byna heeltemal verdwyn (Fig. 1a,b). Fragmente van eksogene DNA is maklik binne 15 minute in intravalvulêre vloeistof en hemolimf opgespoor (Fig. 1c). Hierdie fragmente kon steeds tot 4 uur na blootstelling opgespoor word. Hierdie filteraktiwiteit met betrekking tot DNA-fragmente is vergelykbaar met die filteraktiwiteit van bakterieë en alge [31]. Hierdie resultate dui daarop dat mossels vreemde DNA in hul vloeistofkompartemente kan filter en ophoop.
Relatiewe konsentrasies van plasmied-DNS in seewater in die teenwoordigheid (A) of afwesigheid (B) van mossels, gemeet deur ddPCR. In A word die resultate as persentasies uitgedruk, met die grense van die blokkies wat die 75ste en 25ste persentiele verteenwoordig. Die gepaste logaritmiese kurwe word in rooi getoon, en die area wat in grys geskakeer is, verteenwoordig die 95%-vertrouensinterval. In B verteenwoordig die rooi lyn die gemiddelde en die blou lyn die 95%-vertrouensinterval vir die konsentrasie. C Akkumulasie van plasmied-DNS in die hemolimf en klepvloeistof van mossels op verskillende tye na die byvoeging van plasmied-DNS. Resultate word aangebied as absolute kopieë opgespoor/ml (±SE).
Vervolgens het ons die oorsprong van ccfDNA in mossels wat versamel is uit mosselbeddings op die Kerguelen-eilande, 'n afgeleë groep eilande met beperkte antropogeniese invloed, ondersoek. Vir hierdie doel is cccDNA van mosselhemolimfe geïsoleer en gesuiwer deur metodes wat algemeen gebruik word om menslike cccDNA te suiwer [32, 33]. Ons het gevind dat gemiddelde hemolimf-ccfDNA-konsentrasies in mossels in die lae mikrogram per ml hemolimfreeks is (sien Tabel S2, Aanvullende Inligting). Hierdie reeks konsentrasies is baie groter as in gesonde mense (lae nanogram per milliliter), maar in seldsame gevalle, in kankerpasiënte, kan die vlak van ccfDNA etlike mikrogram per milliliter bereik [34, 35]. 'n Analise van die grootteverspreiding van hemolimf-ccfDNA het getoon dat hierdie fragmente baie in grootte wissel, wat wissel van 1000 bp tot 1000 bp tot 5000 bp (Fig. 2). Soortgelyke resultate is verkry met behulp van die silika-gebaseerde QIAamp Investigator Kit, 'n metode wat algemeen in forensiese wetenskap gebruik word om genomiese DNS vinnig te isoleer en te suiwer uit lae-konsentrasie DNS-monsters, insluitend ccfDNS [36].
Verteenwoordigende ccfDNA-elektroforegram van mosselhemolimf. Onttrek met NucleoSnap Plasma Kit (bo) en QIAamp DNA Investigator Kit. B Vioolgrafiek wat die verspreiding van hemolimf ccfDNA-konsentrasies (±SE) in mossels toon. Die swart en rooi lyne verteenwoordig onderskeidelik die mediaan en die eerste en derde kwartiele.
Ongeveer 1% van ccfDNA in mense en primate het 'n vreemde bron [21, 37]. Gegewe die semi-oop bloedsomloopstelsel van tweekleppiges, mikrobieelryke seewater en die grootteverspreiding van mossel-ccfDNA, het ons gehipotetiseer dat mossel-hemolimf-ccfDNA 'n ryk en diverse poel mikrobiese DNS kan bevat. Om hierdie hipotese te toets, het ons hemolimf-ccfDNA van Aulacomya atra-monsters wat van die Kerguelen-eilande versamel is, gesekwensieer, wat meer as 10 miljoen lesings opgelewer het, waarvan 97.6% kwaliteitskontrole geslaag het. Die lesings is toe geklassifiseer volgens self- en nie-selfbronne met behulp van die BLASTN- en NCBI-twekleppigedatabasisse (Fig. S1, Aanvullende Inligting).
By mense kan beide kern- en mitochondriale DNS in die bloedstroom vrygestel word [38]. In die huidige studie was dit egter nie moontlik om die kerngenomiese DNS van mossels in detail te beskryf nie, aangesien die A. atra-genoom nog nie gesekwensieer of beskryf is nie. Ons kon egter 'n aantal ccfDNA-fragmente van ons eie oorsprong identifiseer deur die tweekleppige biblioteek te gebruik (Fig. S2, Aanvullende Inligting). Ons het ook die teenwoordigheid van DNS-fragmente van ons eie oorsprong bevestig deur gerigte PCR-amplifikasie van daardie A. atra-gene wat gesekwensieer is (Fig. 3). Net so, aangesien die mitochondriale genoom van A. atra in openbare databasisse beskikbaar is, kan 'n mens bewyse vind vir die teenwoordigheid van mitochondriale ccfDNA-fragmente in die hemolimf van A. atra. Die teenwoordigheid van mitochondriale DNS-fragmente is bevestig deur PCR-amplifikasie (Fig. 3).
Verskeie mitochondriale gene was teenwoordig in die hemolimf van A. atra (rooi kolletjies – voorraadnommer: SRX5705969) en M. platensis (blou kolletjies – voorraadnommer: SRX5705968) geamplifiseer deur PCR. Figuur aangepas vanaf Breton et al., 2011 B Amplifikasie van hemolimfsupernatant van A. atra Gestoor op FTA-papier. Gebruik 'n 3 mm-pons om direk by die PCR-buis wat die PCR-mengsel bevat, te voeg.
Gegewe die oorvloedige mikrobiese inhoud in seewater, het ons aanvanklik gefokus op die karakterisering van mikrobiese DNS-reekse in hemolimf. Om dit te doen, gebruik ons ​​twee verskillende strategieë. Die eerste strategie het Kraken2 gebruik, 'n algoritme-gebaseerde reeksklassifikasieprogram wat mikrobiese reekse kan identifiseer met 'n akkuraatheid vergelykbaar met BLAST en ander gereedskap [28]. Meer as 6719 lesings is bepaal as van bakteriële oorsprong, terwyl 124 en 64 onderskeidelik van archaea en virusse was (Fig. 4). Die volopste bakteriële DNS-fragmente was Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) en Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Hierdie verspreiding stem ooreen met vorige studies van die mariene bloumossel-mikrobioom [39, 40]. Gammaproteobacteria was die hoofklas van Proteobacteria (44%), insluitend baie Vibrionales (Fig. 4b). Die ddPCR-metode het die teenwoordigheid van Vibrio-DNS-fragmente in die ccfDNS van A. atra-hemolimf bevestig (Fig. 4c) [41]. Om meer inligting oor die bakteriële oorsprong van ccfDNS te verkry, is 'n bykomende benadering gevolg (Fig. S2, Aanvullende Inligting). In hierdie geval is lesings wat oorvleuel het, as gepaarde-einde lesings saamgestel en geklassifiseer as van self- (tweekleppige) of nie-self-oorsprong met behulp van BLASTN en 'n e-waarde van 1e−3 en 'n afsnypunt met >90% homologie. In hierdie geval is lesings wat oorvleuel het, as gepaarde-einde lesings saamgestel en geklassifiseer as van self- (tweekleppige) of nie-self-oorsprong met behulp van BLASTN en 'n e-waarde van 1e−3 en 'n afsnypunt met >90% homologie. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en были класиксиов (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 en отсечения> 0%. In hierdie geval is oorvleuelende lesings as gepaarde lesings versamel en is geklassifiseer as inheems (tweekleppige) of nie-oorspronklik met behulp van BLASTN en e-waarde van 1e-3 en afsnypunt met >90% homologie.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和和和和嚒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焚 使焚 的 的 的 皌值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами en классианфиковиров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN en 1e-3 и порого 0%. In hierdie geval is oorvleuelende lesings as gepaarde lesings versamel en geklassifiseer as eie (tweekleppiges) of nie-oorspronklik met behulp van e BLASTN- en 1e-3-waardes en 'n homologiedrempel >90%.Aangesien die A. atra-genoom nog nie gesekwensieer is nie, het ons die de novo-samestellingsstrategie van die MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assembleerder gebruik. 'n Totaal van 147 188 contigs is geïdentifiseer as afhanklike (tweekleppiges) van oorsprong. Hierdie contigs is toe ontplof met e-waardes van 1e-10 deur gebruik te maak van BLASTN en BLASTX. Hierdie strategie het ons toegelaat om 482 nie-tweekleppiges fragmente wat in A. atra ccfDNA teenwoordig is, te identifiseer. Meer as die helfte (57%) van hierdie DNS-fragmente is verkry van bakterieë, hoofsaaklik van kieusimbionte, insluitend sulfotrofiese simbionte, en van kieusimbionte Solemya velum (Fig. 5).
Relatiewe oorvloed op tipevlak. B Mikrobiese diversiteit van twee hooffilums (Firmicutes en Proteobacteria). Verteenwoordigende amplifikasie van ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmente van die 16S rRNA-geen (blou) in drie atra-hemolimfe.
'n Totaal van 482 versamelde contigs is geanaliseer. Algemene profiel van die taksonomiese verspreiding van metagenomiese contig-annotasies (prokariote en eukariote). B Gedetailleerde verspreiding van bakteriële DNS-fragmente geïdentifiseer deur BLASTN en BLASTX.
Kraken2-analise het ook getoon dat mossel-ccfDNA argeale DNS-fragmente bevat het, insluitend DNS-fragmente van Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) en Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). Die teenwoordigheid van DNS-fragmente afgelei van Euryarchaeota en Crenarchaeota, wat voorheen in die mikrobiese gemeenskap van Kaliforniese mossels gevind is, behoort nie as 'n verrassing te kom nie [42]. Alhoewel Euryarchaeota dikwels met uiterste toestande geassosieer word, word dit nou erken dat beide Euryarchaeota en Crenarcheota van die mees algemene prokariote in die mariene kriogeniese omgewing is [43, 44]. Die teenwoordigheid van metanogene mikroörganismes in mossels is nie verbasend nie, gegewe onlangse berigte van uitgebreide metaanlekkasies vanaf bodemlekkasies op die Kerguelen-plato [45] en moontlike mikrobiese metaanproduksie wat langs die kus van die Kerguelen-eilande waargeneem is [46].
Ons aandag het toe verskuif na lesings van DNS-virusse. Na ons beste wete is dit die eerste studie van die virusinhoud van mossels buite die teiken. Soos verwag, het ons DNS-fragmente van bakteriofage (Caudovirales) gevind (Fig. 6b). Die mees algemene virale DNS kom egter van 'n filum van nukleositovirusse, ook bekend as die kern-sitoplasmiese groot DNS-virus (NCLDV), wat die grootste genoom van enige virus het. Binne hierdie filum behoort die meeste DNS-reekse aan die families Mimimidoviridae (58%) en Poxviridae (21%), waarvan die natuurlike gashere gewerweldes en geleedpotiges insluit, terwyl 'n klein deel van hierdie DNS-reekse aan bekende virologiese alge behoort. Infekteer mariene eukariotiese alge. Die reekse is ook verkry van die Pandora-virus, die reusevirus met die grootste genoomgrootte van enige bekende virale genera. Interessant genoeg was die reeks gashere wat bekend is om met die virus besmet te wees, soos bepaal deur hemolimf ccfDNS-volgordebepaling, relatief groot (Figuur S3, Aanvullende Inligting). Dit sluit virusse in wat insekte soos Baculoviridae en Iridoviridae infekteer, sowel as virusse wat amoebes, alge en gewerweldes infekteer. Ons het ook rye gevind wat ooreenstem met die Pithovirus sibericum-genoom. Pitovirusse (ook bekend as "zombievirusse") is die eerste keer geïsoleer uit 30 000 jaar oue permafrost in Siberië [47]. Dus stem ons resultate ooreen met vorige verslae wat toon dat nie alle moderne spesies van hierdie virusse uitgesterf het nie [48] en dat hierdie virusse moontlik in afgeleë subarktiese mariene ekosisteme teenwoordig is.
Laastens het ons getoets om te sien of ons DNS-fragmente van ander meersellige diere kon vind. 'n Totaal van 482 vreemde contigs is deur BLASTN en BLASTX geïdentifiseer met nt-, nr- en RefSeq-biblioteke (genomies en proteïen). Ons resultate toon dat onder die vreemde fragmente van ccfDNS van meersellige diere DNS van beenbene oorheers (Fig. 5). DNS-fragmente van insekte en ander spesies is ook gevind. 'n Relatief groot deel van die DNS-fragmente is nie geïdentifiseer nie, moontlik as gevolg van die onderverteenwoordiging van 'n groot aantal mariene spesies in genomiese databasisse in vergelyking met terrestriële spesies [49].
In die huidige artikel pas ons die LB-konsep op mossels toe, en argumenteer dat hemolimf-ccfDNA-skootvolgordebepaling insig kan gee in die samestelling van mariene kus-ekosisteme. In die besonder het ons gevind dat 1) mossel-hemolimf relatief hoë konsentrasies (mikrogramvlakke) van relatief groot (~1-5 kb) sirkulerende DNA-fragmente bevat; 2) hierdie DNA-fragmente beide onafhanklik en nie-onafhanklik is; 3) Onder die vreemde bronne van hierdie DNA-fragmente het ons bakteriële, argeale en virale DNA, sowel as DNA van ander meersellige diere, gevind; 4) Die ophoping van hierdie vreemde ccfDNA-fragmente in die hemolimf vind vinnig plaas en dra by tot die interne filteraktiwiteit van mossels. Ten slotte toon ons studie dat die konsep van LB, wat tot dusver hoofsaaklik op die gebied van biomedisyne toegepas is, 'n ryk maar onontginde bron van kennis kodeer wat gebruik kan word om die interaksie tussen waghondspesies en hul omgewing beter te verstaan.
Benewens primate, is ccfDNA-isolasie ook in soogdiere, insluitend muise, honde, katte en perde, gerapporteer [50, 51, 52]. Na ons wete is ons studie egter die eerste wat die opsporing en volgordebepaling van ccfDNA in mariene spesies met 'n oop sirkulasiestelsel rapporteer. Hierdie anatomiese kenmerk en filtervermoë van mossels kan, ten minste gedeeltelik, die verskillende grootte-eienskappe van sirkulerende DNA-fragmente in vergelyking met ander spesies verklaar. By mense is die meeste DNA-fragmente wat in die bloed sirkuleer, klein fragmente wat wissel in grootte van 150 tot 200 bp, met 'n maksimum piek van 167 bp [34, 53]. 'n Klein maar beduidende gedeelte van DNA-fragmente is tussen 300 en 500 bp in grootte, en ongeveer 5% is langer as 900 bp. [54]. Die rede vir hierdie grootteverspreiding is dat die hoofbron van ccfDNA in plasma voorkom as gevolg van seldood, óf as gevolg van seldood óf as gevolg van nekrose van sirkulerende hematopoïetiese selle in gesonde individue óf as gevolg van apoptose van tumorselle in kankerpasiënte (bekend as sirkulerende tumor-DNA, ctDNA). Die grootteverspreiding van hemolimf-ccfDNA wat ons in mossels gevind het, het gewissel van 1000 tot 5000 bp, wat daarop dui dat mossel-ccfDNA 'n ander oorsprong het. Dit is 'n logiese hipotese, aangesien mossels 'n semi-oop vaskulêre stelsel het en in mariene akwatiese omgewings leef wat hoë konsentrasies mikrobiese genomiese DNS bevat. Trouens, ons laboratoriumeksperimente met eksogene DNS het getoon dat mossels DNS-fragmente in seewater ophoop, ten minste na 'n paar uur word hulle afgebreek na sellulêre opname en/of vrygestel en/of gestoor in verskeie organisasies. Gegewe die seldsaamheid van selle (beide prokarioties en eukarioties), sal die gebruik van intravalvulêre kompartemente die hoeveelheid ccfDNA van selfbronne sowel as van buitelandse bronne verminder. In die lig van die belangrikheid van aangebore immuniteit van tweekleppige selle en die groot aantal sirkulerende fagosiete, het ons verder gehipotetiseer dat selfs vreemde ccfDNA verryk is met sirkulerende fagosiete wat vreemde DNS ophoop na inname van mikroörganismes en/of sellulêre puin. Saamgevat toon ons resultate dat tweekleppige hemolimf-ccfDNA 'n unieke bewaarplek van molekulêre inligting is en hul status as 'n waghondspesie versterk.
Ons data dui daarop dat volgordebepaling en analise van bakterie-afgeleide hemolimf ccfDNA-fragmente sleutelinligting kan verskaf oor die gasheerbakteriese flora en die bakterieë wat in die omliggende mariene ekosisteem teenwoordig is. Skootvolgordebepalingstegnieke het volgordes van die kommensale bakterieë A. atra-kieue onthul wat gemis sou gewees het as konvensionele 16S rRNA-identifikasiemetodes gebruik was, deels as gevolg van 'n verwysingsbiblioteekvooroordeel. Trouens, ons gebruik van LB-data wat versamel is van M. platensis in dieselfde mossellaag by Kerguelen het getoon dat die samestelling van kieu-geassosieerde bakteriese simbionte dieselfde was vir beide mosselspesies (Fig. S4, Aanvullende Inligting). Hierdie ooreenkoms van twee geneties verskillende mossels kan die samestelling van bakteriese gemeenskappe in die koue, swaelagtige en vulkaniese afsettings van Kerguelen weerspieël [55, 56, 57, 58]. Hoër vlakke van swaelreduserende mikroörganismes is goed beskryf wanneer mossels uit bioturbeerde kusgebiede geoes word [59], soos die kus van Port-au-France. Nog 'n moontlikheid is dat die kommensale mosselflora deur horisontale oordrag beïnvloed kan word [60, 61]. Meer navorsing is nodig om die korrelasie tussen die mariene omgewing, seebodemoppervlak en die samestelling van simbiotiese bakterieë in mossels te bepaal. Hierdie studies is tans aan die gang.
Die lengte en konsentrasie van hemolimf ccfDNA, die gemak van suiwering en die hoë gehalte om vinnige haelgeweervolgordebepaling moontlik te maak, is van die vele voordele van die gebruik van mossel-ccfDNA om biodiversiteit in mariene kus-ekosisteme te bepaal. Hierdie benadering is veral effektief vir die karakterisering van virale gemeenskappe (virome) in 'n gegewe ekosisteem [62, 63]. Anders as bakterieë, argea en eukariote, bevat virale genome nie filogeneties gekonserveerde gene soos 16S-reekse nie. Ons resultate dui daarop dat vloeibare biopsies van indikatorspesies soos mossels gebruik kan word om relatief groot getalle ccfDNA-virusfragmente te identifiseer wat bekend is om gashere te infekteer wat tipies kus-mariene ekosisteme bewoon. Dit sluit virusse in wat bekend is om protosoë, geleedpotiges, insekte, plante en bakteriese virusse (bv. bakteriofage) te infekteer. 'n Soortgelyke verspreiding is gevind toe ons die hemolimf ccfDNA-viroom van bloumossels (M. platensis) ondersoek het wat in dieselfde mossellaag by Kerguelen versamel is (Tabel S2, Aanvullende Inligting). Haelgeweer-volgordebepaling van ccfDNA is inderdaad 'n nuwe benadering wat momentum kry in die studie van die viroom van mense of ander spesies [21, 37, 64]. Hierdie benadering is veral nuttig vir die bestudering van dubbelstrengige DNS-virusse, aangesien geen enkele geen onder alle dubbelstrengige DNS-virusse behoue ​​bly nie, wat die mees diverse en breë klas virusse in Baltimore verteenwoordig [65]. Alhoewel die meeste van hierdie virusse ongeklassifiseerd bly en virusse van 'n heeltemal onbekende deel van die viruswêreld kan insluit [66], het ons gevind dat die virome en gasheerreekse van die mossels A. atra en M. platensis tussen die twee spesies val. soortgelyk (sien figuur S3, bykomende inligting). Hierdie ooreenkoms is nie verbasend nie, aangesien dit 'n gebrek aan selektiwiteit in die opname van DNS wat in die omgewing teenwoordig is, kan weerspieël. Toekomstige studies met behulp van gesuiwerde RNS is tans nodig om die RNS-viroom te karakteriseer.
In ons studie het ons 'n baie streng pyplyn gebruik wat aangepas is uit die werk van Kowarski en kollegas [37], wat 'n tweestap-verwydering van saamgevoegde lesings en contigs voor en na die samestelling van inheemse ccfDNA gebruik het, wat 'n hoë proporsie ongekarteerde lesings tot gevolg gehad het. Daarom kan ons nie uitsluit dat sommige van hierdie ongekarteerde lesings steeds hul eie oorsprong kan hê nie, hoofsaaklik omdat ons nie 'n verwysingsgenoom vir hierdie mosselspesie het nie. Ons het ook hierdie pyplyn gebruik omdat ons bekommerd was oor die chimeras tussen self- en nie-selflesings en die leeslengtes wat deur die Illumina MiSeq PE75 gegenereer word. Nog 'n rede vir die meerderheid ongekarteerde lesings is dat baie van die mariene mikrobes, veral in afgeleë gebiede soos Kerguelen, nie geannoteer is nie. Ons het Illumina MiSeq PE75 gebruik, met die aanname dat ccfDNA-fragmentlengtes soortgelyk is aan menslike ccfDNA. Vir toekomstige studies, gegewe ons resultate wat toon dat hemolimf ccfDNA langer lesings het as mense en/of soogdiere, beveel ons aan om 'n volgordebepalingsplatform te gebruik wat meer geskik is vir langer ccfDNA-fragmente. Hierdie praktyk sal dit baie makliker maak om meer aanduidings vir dieper analise te identifiseer. Die verkryging van die tans onbeskikbare volledige A. atra-kerngenoomvolgorde sal ook die onderskeiding van ccfDNA van self- en nie-selfbronne aansienlik vergemaklik. Aangesien ons navorsing gefokus het op die moontlikheid om die konsep van vloeibare biopsie op mossels toe te pas, hoop ons dat soos hierdie konsep in toekomstige navorsing gebruik word, nuwe gereedskap en pyplyne ontwikkel sal word om die potensiaal van hierdie metode te verhoog om die mikrobiese diversiteit van mossels in die mariene ekosisteem te bestudeer.
As 'n nie-indringende kliniese biomerker word verhoogde menslike plasmavlakke van ccfDNA geassosieer met verskeie siektes, weefselskade en strestoestande [67,68,69]. Hierdie toename word geassosieer met die vrystelling van DNA-fragmente van sy eie oorsprong na weefselskade. Ons het hierdie probleem aangespreek deur akute hittestres te gebruik, waarin mossels kortliks aan 'n temperatuur van 30 °C blootgestel is. Ons het hierdie analise op drie verskillende tipes mossels in drie onafhanklike eksperimente uitgevoer. Ons het egter geen verandering in ccfDNA-vlakke na akute hittestres gevind nie (sien Figuur S5, bykomende inligting). Hierdie ontdekking kan, ten minste gedeeltelik, die feit verklaar dat mossels 'n semi-oop bloedsomloopstelsel het en groot hoeveelhede vreemde DNA ophoop as gevolg van hul hoë filteraktiwiteit. Aan die ander kant kan mossels, soos baie ongewerweldes, meer bestand wees teen stres-geïnduseerde weefselskade, wat die vrystelling van ccfDNA in hul hemolimf beperk [70, 71].
Tot op hede het DNS-analise van biodiversiteit in akwatiese ekosisteme hoofsaaklik gefokus op omgewings-DNS (eDNS) metabarkodering. Hierdie metode is egter gewoonlik beperk in biodiversiteitsanalise wanneer primers gebruik word. Die gebruik van haelgeweer-volgordebepaling omseil die beperkings van PCR en die bevooroordeelde seleksie van primerstelle. Dus, in 'n sekere sin, is ons metode nader aan die onlangs gebruikte hoë-deurset eDNS Haelgeweer-volgordebepalingsmetode, wat in staat is om gefragmenteerde DNS direk te volgordebepaal en byna alle organismes te analiseer [72, 73]. Daar is egter 'n aantal fundamentele kwessies wat LB van standaard eDNS-metodes onderskei. Natuurlik is die hoofverskil tussen eDNS en LB die gebruik van natuurlike filtergashere. Die gebruik van mariene spesies soos sponse en tweekleppiges (Dresseina spp.) as 'n natuurlike filter vir die bestudering van eDNS is gerapporteer [74, 75]. Dreissena se studie het egter weefselbiopsies gebruik waaruit DNS onttrek is. Analise van ccfDNS van LB vereis nie weefselbiopsie, gespesialiseerde en soms duur toerusting en logistiek wat met eDNS of weefselbiopsie geassosieer word nie. Trouens, ons het onlangs berig dat ccfDNA van LB gestoor en geanaliseer kan word met FTA-ondersteuning sonder om 'n koue ketting te handhaaf, wat 'n groot uitdaging vir navorsing in afgeleë gebiede is [76]. Die ekstraksie van ccfDNA uit vloeibare biopsieë is ook eenvoudig en bied hoë kwaliteit DNS vir haelgeweervolgordebepaling en PCR-analise. Dit is 'n groot voordeel gegewe sommige van die tegniese beperkings wat met eDNA-analise geassosieer word [77]. Die eenvoud en lae koste van die monsternemingsmetode is ook veral geskik vir langtermynmoniteringsprogramme. Benewens hul hoë filtervermoë, is 'n ander bekende kenmerk van tweekleppiges die chemiese mukopolisakkariedsamestelling van hul slym, wat die absorpsie van virusse bevorder [78, 79]. Dit maak tweekleppiges 'n ideale natuurlike filter vir die karakterisering van biodiversiteit en die impak van klimaatsverandering in 'n gegewe akwatiese ekosisteem. Alhoewel die teenwoordigheid van gasheer-afgeleide DNS-fragmente as 'n beperking van die metode gesien kan word in vergelyking met eDNA, is die koste verbonde aan die besit van so 'n inheemse ccfDNA in vergelyking met eDNA terselfdertyd verstaanbaar vir die groot hoeveelheid inligting wat beskikbaar is vir gesondheidstudies wat die gasheer verreken. Dit sluit die teenwoordigheid van virale volgordes in wat in die genoom van die gasheer geïntegreer is. Dit is veral belangrik vir mossels, gegewe die teenwoordigheid van horisontaal oorgedraagde leukemiese retrovirusse in tweekleppiges [80, 81]. Nog 'n voordeel van LB bo eDNA is dat dit die fagositiese aktiwiteit van sirkulerende bloedselle in die hemolimf benut, wat mikroörganismes (en hul genome) verswelg. Fagositose is die hooffunksie van bloedselle in tweekleppiges [82]. Laastens maak die metode gebruik van die hoë filterkapasiteit van mossels (gemiddeld 1.5 l/h seewater) en tweedaagse sirkulasie, wat die vermenging van verskillende lae seewater verhoog, wat die vaslegging van heteroloë eDNA moontlik maak. [83, 84]. Dus is mossel-ccfDNA-analise 'n interessante weg gegewe die voedings-, ekonomiese en omgewingsimpakte van mossels. Soortgelyk aan die analise van LB wat van mense versamel is, bied hierdie metode ook die moontlikheid om genetiese en epigenetiese veranderinge in gasheer-DNA te meet in reaksie op eksogene stowwe. Byvoorbeeld, derdegenerasie-volgordebepalingstegnologieë kan in die vooruitsig gestel word om genoomwye metileringsanalise in inheemse ccfDNA uit te voer deur gebruik te maak van nanoporie-volgordebepaling. Hierdie proses behoort vergemaklik te word deur die feit dat die lengte van die mossel-ccfDNA-fragmente ideaal versoenbaar is met langlees-volgordebepalingsplatforms wat genoomwye DNS-metileringsanalise vanaf 'n enkele volgordebepalingslopie moontlik maak sonder die behoefte aan chemiese transformasies.85,86] Dit is 'n interessante moontlikheid, aangesien dit getoon is dat DNS-metileringspatrone 'n reaksie op omgewingsstres weerspieël en oor baie generasies voortduur. Daarom kan dit waardevolle insig bied in die onderliggende meganismes wat reaksie na blootstelling aan klimaatsverandering of besoedelingstowwe beheer [87]. Die gebruik van LB is egter nie sonder beperkings nie. Dit spreek vanself dat dit die teenwoordigheid van indikatorspesies in die ekosisteem vereis. Soos hierbo genoem, vereis die gebruik van LB om die biodiversiteit van 'n gegewe ekosisteem te bepaal ook 'n streng bioinformatika-pyplyn wat die teenwoordigheid van DNS-fragmente van die bron in ag neem. Nog 'n groot probleem is die beskikbaarheid van verwysingsgenome vir mariene spesies. Daar word gehoop dat inisiatiewe soos die Mariene Soogdiergenomeprojek en die onlangs gevestigde Fish10k-projek [88] sulke analise in die toekoms sal vergemaklik. Die toepassing van die LB-konsep op mariene filtervoedende organismes is ook versoenbaar met die nuutste vooruitgang in volgordebepalingstegnologie, wat dit goed geskik maak vir die ontwikkeling van multi-ohm biomerkers om belangrike inligting oor die gesondheid van mariene habitats in reaksie op omgewingsstres te verskaf.
Genoomvolgordebepalingsdata is gedeponeer in die NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 onder Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impak van klimaatsverandering op seelewe en ekosisteme. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Oorweeg die gekombineerde impak van klimaatsverandering en ander plaaslike stressors op die mariene omgewing. algemene wetenskaplike omgewing. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Wetenskap van die eerste Maart. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Verminderde hittetoleransie onder herhalende hittestrestoestande verklaar die hoë somermortaliteit van bloumossels. Wetenskaplike verslag 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Onlangse veranderinge in die frekwensie, oorsake en omvang van dierevrftes. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Veelvuldige nie-spesie-spesifieke patogene het moontlik massa-sterftes van Pinna nobilis veroorsaak. Lewe. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensiële impak van klimaatsverandering op Arktiese soönotiese siektes. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Bloumossels (Mytilus edulis spp.) as seinorganismes in kusbesoedelingsmonitering: 'n oorsig. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasie van vloeibare biopsie in kankerbehandeling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Vloeibare biopsie-rypwording: Laat tumor-DNS toe om te sirkuleer. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleïensure in menslike plasma. Vergadernotules van Soc Biol-filiale. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. 'n Nuwe rol vir selvrye DNS as 'n molekulêre merker vir kankerbehandeling. Kwantifisering van biomolêre analise. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vloeibare biopsie betree die kliniek – implementeringskwessies en toekomstige uitdagings. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW en ander. Fetale DNS is teenwoordig in moederlike plasma en serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie van die verloop van swangerskap en die komplikasies daarvan met behulp van sirkulerende ekstrasellulêre RNA in die bloed van vroue tydens swangerskap. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Vloeibare biopsie: skenkerselvrye DNS word gebruik om allogene letsels in 'n nieroorplanting op te spoor. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovasies in prenatale diagnostiek: moederlike plasma genoomvolgordebepaling. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Vinnige patogeenopsporing met volgende-generasie metagenomiese volgordebepaling van besmette liggaamsvloeistowwe. Nat Medicine. 2021;27:115-24.