Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Ny biopsy ranoka (LB) dia foto-kevitra iray izay miha-malaza haingana eo amin'ny sehatry ny biomedika. Ny foto-kevitra dia mifototra indrindra amin'ny fitadiavana sombin-ADN ivelan'ny sela (ccfDNA), izay avoaka betsaka amin'ny endrika sombin-javatra kely aorian'ny fahafatesan'ny sela ao amin'ny sela isan-karazany. Ny ampahany kely amin'ireo sombin-javatra ireo dia avy amin'ny sela na zavamananaina vahiny (vahiny). Amin'ny asa ankehitriny, dia nampiharinay tamin'ny sifotra io foto-kevitra io, karazana mpiambina fantatra amin'ny fahafahany manivana rano an-dranomasina avo lenta. Mampiasa ny fahafahan'ny sifotra miasa ho toy ny sivana voajanahary izahay mba hisambotra sombin-ADN avy amin'ny tontolo iainana avy amin'ny loharano isan-karazany mba hanomezana fampahalalana momba ny zavamananaina isan-karazany ao amin'ny tontolo iainana amorontsiraka an-dranomasina. Ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa ny hemolymph sifotra dia misy sombin-ADN izay miovaova be ny habeny, manomboka amin'ny 1 ka hatramin'ny 5 kb. Ny fandaharana basy poleta dia naneho fa ny sombin-ADN maro dia avy amin'ny mikraoba vahiny. Anisan'izany, nahita sombin-ADN avy amin'ny bakteria, archaea, ary viriosy izahay, anisan'izany ny viriosy fantatra fa mamindra karazana mpampiantrano isan-karazany izay matetika hita ao amin'ny tontolo iainana amorontsiraka an-dranomasina. Ho famaranana, ny fanadihadianay dia mampiseho fa ny foto-kevitry ny LB ampiharina amin'ny sifotra dia maneho loharanom-pahalalana manankarena nefa mbola tsy voazaha momba ny fahasamihafan'ny mikraoba ao amin'ny tontolo iainana amorontsiraka an-dranomasina.
Sehatra fikarohana mitombo haingana ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro (CC) amin'ny zavamananaina isan-karazany ao amin'ny tontolo iainana an-dranomasina. Tsy vitan'ny hoe miteraka adin-tsaina ara-batana manan-danja ny fiakaran'ny mari-pana maneran-tany, fa manosika ny fetran'ny evolisiona amin'ny fahamarinan'ny hafanan'ny zavamananaina an-dranomasina ihany koa, izay misy fiantraikany amin'ny toeram-ponenan'ny karazana maromaro, ka manosika azy ireo hitady toe-javatra tsara kokoa [1, 2]. Ankoatra ny fiantraikany amin'ny zavamananaina isan-karazany ao amin'ny metazoans, ny CC dia manakorontana ny fifandanjana marefo eo amin'ny fifandraisan'ny mpampiantrano sy ny mikraoba. Ity dysbacteriosis mikraoba ity dia miteraka fandrahonana lehibe ho an'ny tontolo iainana an-dranomasina satria mahatonga ny zavamananaina an-dranomasina ho mora voan'ny aretina [3, 4]. Inoana fa mitana anjara toerana lehibe amin'ny fahafatesana faobe ny SS, izay olana lehibe ho an'ny fitantanana ny tontolo iainana an-dranomasina manerantany [5, 6]. Olana manan-danja izany noho ny fiantraikan'ny karazam-biby an-dranomasina maro ara-toekarena, ara-tontolo iainana ary ara-tsakafo. Marina indrindra izany ho an'ny bivalves monina any amin'ny faritra tendrontany, izay misy ny vokatry ny CK eo no ho eo sy mafy kokoa [6, 7]. Raha ny marina, ny bivalves toy ny Mytilus spp. dia ampiasaina betsaka hanaraha-maso ny vokatry ny CC amin'ny tontolo iainana an-dranomasina. Tsy mahagaga raha maro ireo mari-pamantarana biolojika novolavolaina mba hanaraha-maso ny fahasalamany, matetika amin'ny fampiasana fomba fiasa roa sosona izay ahitana mari-pamantarana biolojika miasa mifototra amin'ny asan'ny anzima na ny asan'ny sela toy ny fahaveloman'ny sela sy ny asan'ny phagocyte [8]. Ireo fomba ireo dia ahitana ihany koa ny fandrefesana ny fifantohana amin'ireo mari-pamantarana tsindry manokana izay miangona ao amin'ny sela malefaka aorian'ny fidiran'ny rano an-dranomasina be dia be. Na izany aza, ny fahafaha-manao sivana avo lenta sy ny rafitra fivezivezen'ny ra semi-open an'ny bivalves dia manome fahafahana hampivelatra mari-pamantarana hemolymph vaovao amin'ny fampiasana ny foto-kevitry ny biopsy ranoka (LB), fomba tsotra sy tsy dia manafika loatra amin'ny fitantanana ny marary. santionan-dra [9, 10]. Na dia misy karazana molekiola mivezivezy maromaro aza hita ao amin'ny LB olombelona, ​​ity foto-kevitra ity dia mifototra indrindra amin'ny famakafakana ny filaharan'ny ADN amin'ny sombin-ADN extracellular mivezivezy (ccfDNA) ao amin'ny plasma. Raha ny marina, ny fisian'ny ADN mivezivezy ao amin'ny plasma olombelona dia fantatra hatramin'ny tapaky ny taonjato faha-20 [11], saingy tato anatin'ny taona vitsivitsy izay no nahatonga ny fisian'ny fomba filaharan'ny throughput avo lenta ho amin'ny diagnostika klinika mifototra amin'ny ccfDNA. Ny fisian'ireo sombin-ADN miely patrana ireo dia vokatry ny famoahana tsy mavitrika ny ADN genomic (nokleary sy mitochondrial) aorian'ny fahafatesan'ny sela. Amin'ny olona salama tsara, ny fifantohan'ny ccfDNA dia mazàna ambany (<10 ng/mL) saingy azo ampitomboina in-5–10 amin'ny marary mijaly amin'ny aretina isan-karazany na iharan'ny adin-tsaina, ka miteraka fahasimban'ny sela. Amin'ny olona salama tsara, ny fifantohan'ny ccfDNA dia mazàna ambany (<10 ng/mL) saingy azo ampitomboina in-5–10 amin'ny marary mijaly amin'ny aretina isan-karazany na iharan'ny adin-tsaina, ka miteraka fahasimban'ny sela. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у хлин патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Amin'ny olona salama tsara, ny fifantohan'ny cccDNA dia mazàna ambany (<10 ng/mL), saingy mety hitombo in-5–10 izany amin'ny marary voan'ny aretina isan-karazany na ao anatin'ny adin-tsaina izay mitarika fahasimban'ny sela.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 或 承受可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у лица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Mazàna ambany (<10 ng/ml) ny fifantohan'ny ccfDNA amin'ny olona salama, saingy mety hitombo in-5-10 izany amin'ny marary voan'ny aretina isan-karazany na adin-tsaina, ka miteraka fahasimban'ny sela.Miovaova be ny haben'ny sombin-doko ccfDNA, saingy mazàna eo anelanelan'ny 150 sy 200 bp. [12]. Ny famakafakana ny ccfDNA azo avy amin'ny tenany, izany hoe, ccfDNA avy amin'ny sela mpampiantrano ara-dalàna na niova, dia azo ampiasaina hamantarana ny fiovana ara-pandovan-toetra sy epigenetika misy ao amin'ny genome nokleary sy/na mitochondrial, ka manampy ny mpitsabo hisafidy fitsaboana manokana mikendry molekiola [13]. Na izany aza, ny ccfDNA dia azo avy amin'ny loharano vahiny toy ny ccfDNA avy amin'ny sela foetus mandritra ny fitondrana vohoka na avy amin'ny taova nafindra [14,15,16,17]. Ny ccfDNA koa dia loharano fampahalalana manan-danja amin'ny famantarana ny fisian'ny asidra nokleika amin'ny otrikaretina (vahiny), izay ahafahana mamantatra tsy misy fandidiana ny aretina miely patrana izay tsy voafaritry ny kolontsaina ra, ka misoroka ny biopsy manafika ny sela voan'ny aretina [18]. Ny fanadihadiana vao haingana dia naneho fa ny ran'olombelona dia misy loharano fampahalalana manankarena izay azo ampiasaina hamantarana ny pathogens viraliny sy bakteria, ary eo amin'ny 1% eo ho eo amin'ny ccfDNA hita ao amin'ny plasma olombelona dia avy any ivelany [19]. Ireo fanadihadiana ireo dia mampiseho fa ny zavamananaina isan-karazany ao amin'ny mikrôbiôma miparitaka ao amin'ny zavamananaina iray dia azo tombanana amin'ny alàlan'ny fanadihadiana ccfDNA. Na izany aza, hatramin'ny vao haingana, ity foto-kevitra ity dia nampiasaina manokana tamin'ny olombelona ary, amin'ny ambaratonga kely kokoa, tamin'ny biby manana hazondamosina hafa [20, 21].
Ato amin'ity lahatsoratra ity, mampiasa ny mety ho vitan'ny LB izahay mba handinihana ny ccfDNA an'ny Aulacomya atra, karazana atsimo izay matetika hita any amin'ny Nosy Kerguelen any atsimon'i Antarktika, vondron-nosy eo an-tampon'ny lembalemba lehibe izay niforona 35 tapitrisa taona lasa izay. fipoahan'ny volkano. Amin'ny fampiasana rafitra fanandramana in vitro, dia hitanay fa ny sombin-ADN ao anaty ranomasina dia raisin'ny sifotra haingana ary miditra ao amin'ny fizarana hemolymph. Ny fandaharana amin'ny basy poleta dia naneho fa ny hemolymph ccfDNA an'ny sifotra dia misy sombin-ADN avy amin'ny tenany sy tsy avy amin'ny tenany, anisan'izany ny bakteria simbiotika sy sombin-ADN avy amin'ny biome mahazatra ny tontolo iainana amorontsiraka volkano mangatsiaka. Ny Hemolymph ccfDNA koa dia misy filaharan'ny viriosy avy amin'ny viriosy manana karazana mpampiantrano samihafa. Nahita sombin-ADN avy amin'ny biby maro sela toy ny trondro taolana, anemone an-dranomasina, ahidrano ary bibikely ihany koa izahay. Ho famaranana, ny fianarantsika dia mampiseho fa ny foto-kevitra LB dia azo ampiharina amim-pahombiazana amin'ny biby tsy manana hazon-damosina an-dranomasina mba hamoronana repertoire genomic manankarena ao amin'ny tontolo iainana an-dranomasina.
Ny Mytilus platensis (M. platensis) sy Aulacomya atra (A. atra) efa lehibe (55-70 mm ny lavany) dia nangonina avy any amin'ny morontsiraka be vato any Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .), Nosy Kerguelen tamin'ny Desambra 2018. Ny sifotra manga efa lehibe hafa (Mytilus spp.) dia nalaina avy amin'ny mpamatsy ara-barotra (PEI Mussel King Inc., Nosy Prince Edward, Kanada) ary napetraka tao anaty tanky misy rivotra voafehy ny mari-pana (4°C) misy rano masira artifisialy 32‰ 10–20 L. (sira an-dranomasina artifisialy Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, Etazonia). Ho an'ny andrana tsirairay, dia norefesina ny halavany sy ny lanjan'ny akorandriaka tsirairay.
Misy protocole fidirana malalaka ho an'ity fandaharana ity azo jerena an-tserasera (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Raha fintinina, nangonina avy amin'ny hozatry ny abductor ny hemolymph LB araka ny voalaza [22]. Nohazavaina tamin'ny alalan'ny centrifugation tamin'ny 1200×g nandritra ny 3 minitra ny hemolymph, ary nangatsiaka (-20°C) ny supernatant mandra-pahatongan'ny fampiasana azy. Ho an'ny fanasarahana sy fanadiovana ny cfDNA, dia natsonika sy nokarakaraina tamin'ny fampiasana ny kitapo NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) araka ny torolalan'ny mpanamboatra ny santionany (1.5-2.0 ml). Notehirizina tamin'ny -80°C ny ccfDNA mandra-pahatongan'ny fanadihadiana fanampiny. Tamin'ny andrana sasany, dia navahana sy nodiovina tamin'ny fampiasana ny QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) ny ccfDNA. Nohamarinina tamin'ny fampiasana ny fanadihadiana PicoGreen mahazatra ny ADN voadio. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny electrophoresis kapila ny fizarana sombin-javatra tamin'ny ccfDNA mitokana, nampiasa ny Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) tamin'ny fampiasana High Sensitivity DNA Kit. Natao tamin'ny fampiasana 1 µl amin'ny santionan'ny ccfDNA araka ny toromariky ny mpanamboatra ny fanadihadiana.
Ho an'ny fandaharana ny sombin-tsoratra hemolymph ccfDNA, ny Génome Québec (Montreal, Québec, Canada) dia nanomana tranomboky shotgun tamin'ny fampiasana ny kitapo Illumina DNA Mix an'ny kitapo Illumina MiSeq PE75. Nampiasaina ny adaptatera mahazatra (BioO). Azo alaina avy amin'ny NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 sy SRR8924809) ny rakitra angona manta. Notombanana tamin'ny fampiasana FastQC [23] ny kalitaon'ny famakiana fototra. Ny Trimmomatic [24] dia nampiasaina ho an'ny adaptatera fanapahana sy famakiana ambany kalitao. Ny famakiana shotgun misy tendrony mifanandrify dia natambatra tamin'ny FLASH ho famakiana tokana lava kokoa miaraka amin'ny fifanindriana farafahakeliny 20 bp mba hisorohana ny tsy fitoviana [25]. Nomena fanamarihana tamin'ny BLASTN ireo famakiana natambatra tamin'ny fampiasana angon-drakitra momba ny taksonomie bivalve NCBI (e value < 1e−3 ary 90% homology), ary ny fanaronana ireo filaharana tsy dia sarotra dia natao tamin'ny fampiasana DUST [26]. Nomena fanamarihana tamin'ny BLASTN ireo famakiana natambatra tamin'ny fampiasana angon-drakitra momba ny taksonomie bivalve NCBI (e value < 1e−3 ary 90% homology), ary ny fanaronana ireo filaharana tsy dia sarotra dia natao tamin'ny fampiasana DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчатылюских < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Nomena fanamarihana tamin'ny BLASTN ireo famakiana mitambatra tamin'ny fampiasana ny tahiry taksonomie bivalve NCBI (e value < 1e-3 ary 90% homology), ary ny fanaronana ny filaharan'ny sela ambany fahasarotana dia natao tamin'ny fampiasana ny DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，用数，生进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 使并 读数 ， 2进行 复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустволскмча (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с [исполнено с использом]. Nomena fanamarihana tamin'ny BLASTN ireo famakiana mitambatra tamin'ny fampiasana ny tahiry taksonomian'ny bivalve NCBI (e value <1e-3 ary 90% homology), ary ny fanaronana ny filaharan'ny sela ambany fahasarotana dia natao tamin'ny fampiasana ny DUST [26].Nozaraina ho vondrona roa ny famakiana: mifandraika amin'ny filaharan'ny bivalve (antsoina hoe mamaky tena eto) sy tsy mifandray (tsy mamaky tena). Nisy vondrona roa natambatra misaraka tamin'ny fampiasana MEGAHIT mba hamoronana contigs [27]. Mandritra izany fotoana izany, ny fizarana taksonomikan'ny famakiana microbiome vahiny dia nosokajiana tamin'ny fampiasana Kraken2 [28] ary aseho amin'ny sary amin'ny alàlan'ny tabilao Krona pie ao amin'ny Galaxy [29, 30]. Ny kmers tsara indrindra dia voafaritra ho kmers-59 avy amin'ny andrana voalohany nataonay. Avy eo dia fantatra ireo sela mifanitsy amin'ny tena tamin'ny alàlan'ny fampifanarahana tamin'ny BLASTN (database NCBI bivalve, e value < 1e−10 ary homology 60%) ho an'ny fanamarihana farany. Avy eo dia fantatra ireo sela mifanitsy amin'ny tena tamin'ny alàlan'ny fampifanarahana tamin'ny BLASTN (database NCBI bivalve, e value < 1e−10 ary homology 60%) ho an'ny fanamarihana farany. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Avy eo dia fantatra ireo sela mifanitsy amin'ny tena tamin'ny alalan'ny fampifanarahana tamin'ny BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ary 60% homology) ho an'ny fanamarihana farany.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал даNCBIн) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Avy eo dia nofantarina ireo sela mifanitsy ho azy mba hanaovana fanamarihana farany amin'ny alàlan'ny fampifanarahana amin'ny BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ary 60% homology). Mifanindran-dalana amin'izany, ireo vondrona tsy miankina amin'ny tena dia nasiana fanamarihana tamin'ny BLASTN (database nt NCBI, sanda e < 1e−10 ary homology 60%). Mifanindran-dalana amin'izany, ireo vondrona tsy miankina amin'ny tena dia nasiana fanamarihana tamin'ny BLASTN (database nt NCBI, sanda e < 1e−10 ary homology 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1g-10 % . Mifanindran-dalana amin'izany, ireo vondrona vahiny mifandraika dia nasiana fanamarihana tamin'ny BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 ary 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt 1 гомология 60%). Mifanindran-dalana amin'izany, ireo vondrona tsy miankina amin'ny tena dia nasiana fanamarihana tamin'ny BLASTN (database nt NCBI, sanda e <1e-10 ary homology 60%). Natao tamin'ny zavatra tsy mifandray amin'ny tena ihany koa ny BLASTX tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra nr sy ny proteinina RefSeq NCBI (e value < 1e−10 ary homology 60%). Natao tamin'ny zavatra tsy mifandray amin'ny tena ihany koa ny BLASTX tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra nr sy ny proteinina RefSeq NCBI (e value < 1e−10 ary homology 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение e <1e. Natao tamin'ny zavatra tsy mifandray amin'ny tena ihany koa ny BLASTX tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra proteinina nr sy RefSeq NCBI (e value < 1e-10 ary homology 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 同 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Natao tamin'ny zavatra tsy mifandray amin'ny tena ihany koa ny BLASTX tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra proteinina nr sy RefSeq NCBI (e value <1e-10 ary 60% homology).Ny vondron'ny BLASTN sy BLASTX misy ireo tsy mifamatotra amin'ny tenany dia maneho ireo mifamatotra farany (jereo ny rakitra fanampiny).
Voatanisa ao amin'ny Tabilao S1 ireo "primer" ampiasaina amin'ny PCR. Nampiasaina ny Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) mba hanamafisana ireo fototarazo kendrena ccfDNA. Ireto fepetra manaraka ireto no nampiasaina tamin'ny fihetsika: denaturation amin'ny 95°C mandritra ny 3 minitra, 95°C mandritra ny 1 minitra, fametrahana ny mari-pana fanafanana mandritra ny 1 minitra, elongation amin'ny 72°C mandritra ny 1 minitra, tsingerina 35, ary farany 72°C ao anatin'ny 10 minitra. . Nosarahina tamin'ny alalan'ny electrophoresis tao anaty gel agarose (1.5%) misy SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) amin'ny 95 V ny vokatra PCR.
Nampidirina tao anaty ranomasimbe misy oksizenina 500 ml (32 PSU) nandritra ny 24 ora tamin'ny 4°C ny sifotra (Mytilus spp.). Nampiana tao anaty tavoahangy ny ADN plasmida misy soratra hoe human galectin-7 cDNA (NCBI accession number L07769) tamin'ny fifantohana farany 190 μg/μl. Ny sifotra notezaina tamin'ny toe-javatra mitovy tsy nisy ADN no fanaraha-maso. Ny tanky fanaraha-maso fahatelo dia nisy ADN tsy nisy sifotra. Mba hanaraha-maso ny kalitaon'ny ADN ao anaty ranomasimbe, dia nalaina avy amin'ny tanky tsirairay ny santionan'ny ranomasimbe (20 μl; intelo) tamin'ny fotoana voatondro. Mba hahafahana mamantatra ny ADN plasmida, dia nojinjaina tamin'ny fotoana voatondro ny sifotra LB ary nohadihadiana tamin'ny alàlan'ny qPCR sy ddPCR. Noho ny habetsahan'ny sira ao anaty ranomasimbe, dia nohamainina tao anaty rano PCR (1:10) ny aliquots talohan'ny fanadihadiana PCR rehetra.
Natao tamin'ny alalan'ny protocole BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada) ny PCR nomerika (ddPCR). Ampiasao ny mombamomba ny mari-pana mba hamaritana ny mari-pana tsara indrindra (Tabilao S1). Noforonina tamin'ny alalan'ny mpamokatra QX200 (BioRad) ny rano mitete. Natao toy izao manaraka izao ny ddPCR: 95°C mandritra ny 5 minitra, tsingerina 50 amin'ny 95°C mandritra ny 30 segondra ary mari-pana fanafanana voafaritra mandritra ny 1 minitra ary 72°C mandritra ny 30 segondra, 4°C mandritra ny 5 minitra ary 90°C ao anatin'ny 5 minitra. Ny isan'ny rano mitete sy ny fihetsika tsara (isan'ny dika mitovy/µl) dia norefesina tamin'ny alalan'ny mpamaky rano mitete QX200 (BioRad). Nolavina ireo santionany latsaky ny 10.000 ny rano mitete. Tsy natao isaky ny nampandeha ny ddPCR ny fanaraha-maso ny lamina.
Natao tamin'ny fampiasana Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Aostralia) sy "primer" manokana an'ny LGALS7 ny qPCR. Natao tao anaty 20 µl avokoa ny PCR rehetra tamin'ny fampiasana ny QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Natomboka tamin'ny incubation 15 minitra tamin'ny 95°C ny qPCR, narahin'ny tsingerina 40 tamin'ny 95°C nandritra ny 10 segondra ary tamin'ny 60°C nandritra ny 60 segondra niaraka tamin'ny fanangonana angon-drakitra indray mandeha. Noforonina ny fiolahana mitsonika tamin'ny fampiasana fandrefesana mifanesy amin'ny 95°C mandritra ny 5 segondra, 65°C mandritra ny 60 segondra, ary 97°C tamin'ny faran'ny qPCR. Natao intelo ny qPCR tsirairay, afa-tsy ny santionany fanaraha-maso.
Koa satria fantatra amin'ny tahan'ny sivana avo lenta ny sifotra, dia nodinihinay aloha raha afaka manivana sy mitazona sombin-ADN ao anaty ranomasina izy ireo. Nahaliana anay ihany koa raha miangona ao amin'ny rafi-lifatika misokatra antsasany ireo sombin-ADN ireo. Namaha ity olana ity tamin'ny alalan'ny fanandramana izahay tamin'ny fanaraha-maso ny anjaran'ireo sombin-ADN mety levona nampidirina tao anaty fitoeran-dranon'ny sifotra manga. Mba hanamorana ny fanaraha-maso ireo sombin-ADN, dia nampiasa ADN plasmid vahiny (tsy tena izy) misy ny gène galectin-7 olombelona izahay. Ny ddPCR dia manara-maso ireo sombin-ADN plasmid ao anaty ranomasina sy sifotra. Ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa raha mijanona ho tsy miova ny habetsahan'ny sombin-ADN ao anaty rano an-dranomasina mandritra ny fotoana maharitra (hatramin'ny 7 andro) raha tsy misy sifotra, dia saika nanjavona tanteraka tao anatin'ny 8 ora io ambaratonga io raha misy sifotra (Sary 1a,b). Mora hita tao anatin'ny 15 minitra tao anaty ranoka intravalvular sy hemolymph ny sombin-ADN ivelany (Sary 1c). Mbola azo hita hatramin'ny 4 ora aorian'ny fiparitahana ireo sombin-ADN ireo. Ity asa fanivanana ity raha oharina amin'ny sombin-ADN dia azo ampitahaina amin'ny asa fanivanana ataon'ny bakteria sy ahidrano [31]. Ireo valiny ireo dia manondro fa ny sifotra dia afaka manivana sy manangona ADN vahiny ao anatin'ireo ranoka ao anatiny.
Fifantohana mifandraika amin'ny ADN plasmid ao anaty ranomasina eo anatrehan'ny (A) na ny tsy fisian'ny (B) sifotra, refesina amin'ny ddPCR. Ao amin'ny A, ny valiny dia aseho amin'ny isan-jato, ary ny sisin'ny boaty dia maneho ny percentile faha-75 sy faha-25. Ny fiolahana logaritmika mifanaraka dia aseho amin'ny loko mena, ary ny faritra voaloko volondavenona dia maneho ny elanelam-pitokisana 95%. Ao amin'ny B, ny tsipika mena dia maneho ny salan'isa ary ny tsipika manga dia maneho ny elanelam-pitokisana 95% ho an'ny fifantohana. C Fanangonana ADN plasmid ao amin'ny hemolymph sy ny ranon-valvular an'ny sifotra amin'ny fotoana samihafa aorian'ny fanampiana ADN plasmid. Ny valiny dia aseho amin'ny endrika dika mitovy tanteraka hita/mL (±SE).
Manaraka izany, dia nodinihinay ny niandohan'ny ccfDNA tao amin'ny sifotra nangonina avy amin'ny fandriana sifotra tao amin'ny Nosy Kerguelen, vondron-nosy mitokana izay tsy dia nisy fiantraikany firy tamin'ny olombelona. Ho an'izany tanjona izany, ny cccDNA avy amin'ny hemolymphs sifotra dia navahana sy nodiovina tamin'ny fomba mahazatra ampiasaina hanadiovana ny cccDNA olombelona [32, 33]. Hitanay fa ny salan'isan'ny fifantohana hemolymph ccfDNA ao amin'ny sifotra dia ao anatin'ny mikrograma ambany isaky ny ml hemolymph (jereo ny Tabilao S2, Fampahalalana Fanampiny). Io elanelan'ny fifantohana io dia lehibe kokoa noho ny amin'ny olona salama (nanograma ambany isaky ny milliliter), fa amin'ny tranga tsy fahita firy, amin'ny marary homamiadana, ny haavon'ny ccfDNA dia mety hahatratra mikrograma maromaro isaky ny milliliter [34, 35]. Ny fanadihadiana ny fizarana haben'ny hemolymph ccfDNA dia naneho fa ireo sombin-javatra ireo dia miovaova be ny habeny, manomboka amin'ny 1000 bp ka hatramin'ny 1000 bp. hatramin'ny 5000 bp (Sary 2). Nahazoana vokatra mitovy amin'izany ny fampiasana ny QIAamp Investigator Kit miorina amin'ny silica, fomba iray ampiasaina matetika amin'ny siansa forensika mba hanasarahana sy hanadiovana haingana ny ADN genomic avy amin'ny santionan'ny ADN ambany fifantohana, anisan'izany ny ccfDNA [36].
Sary elektroforegrama ccfDNA solontenan'ny hemolymph sifotra. Nalaina tamin'ny NucleoSnap Plasma Kit (ambony) sy QIAamp DNA Investigator Kit. Sary B Violin mampiseho ny fizarana ny fifantohana hemolymph ccfDNA (±SE) ao amin'ny sifotra. Ny tsipika mainty sy mena dia maneho ny mediana sy ny quartile voalohany ary fahatelo.
Eo amin'ny 1% eo ho eo amin'ny ccfDNA ao amin'ny olombelona sy ny rajako no avy any ivelany [21, 37]. Noho ny rafi-pitatitra misokatra antsasany amin'ny bivalves, ny ranomasina manankarena mikraoba, ary ny fizarazarana ny haben'ny moule ccfDNA, dia nihevitra izahay fa ny hemolymph ccfDNA amin'ny moule dia mety misy ADN mikraoba manankarena sy isan-karazany. Mba hitsapana io petra-kevitra io, dia nandinika ny hemolymph ccfDNA avy amin'ny santionan'ny Aulacomya atra nangonina avy any amin'ny Nosy Kerguelen izahay, ka nahazo famakiana mihoatra ny 10 tapitrisa, izay 97.6% tamin'izy ireo no nandalo ny fanaraha-maso ny kalitao. Avy eo dia nosokajiana araka ny loharano tena izy sy tsy tena izy ny famakiana tamin'ny fampiasana ny angon-drakitra bivalve BLASTN sy NCBI (Sary S1, Fampahalalana fanampiny).
Ao amin'ny olombelona, ​​samy afaka avoaka ao amin'ny lalan-drà ny ADN nokleary sy ny ADN mitochondrial [38]. Na izany aza, tamin'ity fanadihadiana ity, dia tsy azo natao ny nanazava amin'ny antsipiriany ny ADN genomic nokleary an'ny sifotra, satria tsy mbola voasokajy na voafaritra ny genome A. atra. Na izany aza, dia afaka namantatra sombin-doko ccfDNA maromaro avy amin'ny niaviany izahay tamin'ny fampiasana ny tranomboky bivalve (Sary S2, Fampahalalana fanampiny). Nohamafisinay ihany koa ny fisian'ny sombin-doko ADN avy amin'ny niaviany tamin'ny alàlan'ny fanamafisana PCR mivantana an'ireo fototarazo A. atra izay voasokajy (Sary 3). Toy izany koa, satria hita ao amin'ny tahiry ho an'ny daholobe ny genome mitochondrial an'ny A. atra, dia afaka mahita porofo momba ny fisian'ny sombin-doko ccfDNA mitochondrial ao amin'ny hemolymph an'ny A. atra. Ny fisian'ny sombin-doko ADN mitochondrial dia nohamafisina tamin'ny alàlan'ny fanamafisana PCR (Sary 3).
Nisy fototarazo mitochondria isan-karazany tao amin'ny hemolymph an'ny A. atra (teboka mena - laharan'ny tahiry: SRX5705969) sy M. platensis (teboka manga - laharan'ny tahiry: SRX5705968) nohamafisina tamin'ny alalan'ny PCR. Sary nalaina avy amin'i Breton et al., 2011 B Fanamafisana ny supernatant hemolymph avy amin'ny A. atra Tehirizina amin'ny taratasy FTA. Ampiasao ny totohondry 3 mm mba hampidirana mivantana ao amin'ny fantsona PCR misy ny fangaro PCR.
Noho ny habetsahan'ny mikraoba ao anaty ranomasina, dia nifantoka tamin'ny famaritana ny filaharan'ny ADN mikraoba ao amin'ny hemolymph izahay tamin'ny voalohany. Mba hanaovana izany, dia mampiasa paikady roa samihafa izahay. Ny paikady voalohany dia nampiasa ny Kraken2, programa fanasokajiana filaharana mifototra amin'ny algorithm izay afaka mamantatra ny filaharan'ny mikraoba amin'ny fahamarinan'ny BLAST sy fitaovana hafa [28]. Maherin'ny 6719 ny famakiana no voafaritra fa avy amin'ny bakteria, raha 124 sy 64 kosa no avy amin'ny archaea sy viriosy (Sary 4). Ny sombin-ADN bakteria betsaka indrindra dia ny Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ary Bacteroidetes (17%) (Sary 4a). Mifanaraka amin'ny fanadihadiana teo aloha momba ny microbiome an'ny moule manga an-dranomasina ity fizarana ity [39, 40]. Gammaproteobacteria no kilasy lehibe indrindra amin'ny Proteobacteria (44%), anisan'izany ny Vibrionales maro (Sary 4b). Ny fomba ddPCR dia nanamafy ny fisian'ny sombin-ADN Vibrio ao amin'ny ccfDNA an'ny A. atra hemolymph (Sary 4c) [41]. Mba hahazoana fampahalalana bebe kokoa momba ny niandohan'ny ccfDNA avy amin'ny bakteria, dia nisy fomba fiasa fanampiny noraisina (Sary S2, Fampahalalana Fanampiny). Amin'ity tranga ity, ireo famakiana izay nifanindry dia nangonina ho famakiana mifanindry ary nosokajiana ho avy amin'ny tena (bivalves) na tsy avy amin'ny tena tamin'ny fampiasana BLASTN sy sanda e 1e−3 ary fanapahana miaraka amin'ny homology >90%. Amin'ity tranga ity, ireo famakiana izay nifanindry dia nangonina ho famakiana mifanindry ary nosokajiana ho avy amin'ny tena (bivalves) na tsy avy amin'ny tena tamin'ny fampiasana BLASTN sy sanda e 1e−3 ary fanapahana miaraka amin'ny homology >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированыестости моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Amin'ity tranga ity, ny famakiana mifanindry dia nangonina ho famakiana mifanandrify ary nosokajiana ho teratany (bivalve) na tsy tany am-boalohany tamin'ny fampiasana BLASTN sy ny sandan'ny e 1e-3 ary tapaka miaraka amin'ny homology >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 会和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的图片 1 的3 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственный моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Amin'ity tranga ity, ny famakiana mifanindry dia nangonina ho famakiana mifanindry ary nosokajiana ho azy (bivalves) na tsy tany am-boalohany amin'ny alàlan'ny fampiasana ny sandan'ny e BLASTN sy 1e-3 ary ny tokonam-baravaran'ny homology >90%.Koa satria mbola tsy voasokajy ny genome-n'ny A. atra, dia nampiasa ny paikady fanangonana de novo an'ny MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler izahay. Miisa 147.188 ireo contigs no fantatra fa miankina (bivalves) niaviany. Avy eo dia nopotehina tamin'ny e-values ​​​​1e-10 ireo contigs ireo tamin'ny fampiasana BLASTN sy BLASTX. Io paikady io dia namela anay hamantatra sombin-javatra tsy bivalve 482 hita ao amin'ny A. atra ccfDNA. Maherin'ny antsasaky ny (57%) amin'ireo sombin-ADN ireo no azo avy amin'ny bakteria, indrindra avy amin'ny symbionts gill, anisan'izany ny symbionts sulfotrophic, ary avy amin'ny symbionts gill Solemya velum (Sary 5).
Habetsahana mifandraika amin'ny ambaratongan'ny karazana. B Fahasamihafan'ny mikrôba amin'ny phyla roa lehibe (Firmicutes sy Proteobacteria). Fanamafisana solontenan'ny ddPCR C Vibrio spp. A. Sombin-javatra amin'ny gène 16S rRNA (manga) ao amin'ny hemolymphs atra telo.
Nohadihadiana ny fitambaran'ny contigs miisa 482 voangona. Mombamomba ankapobeny ny fizarana taksonomikan'ny fanamarihana contig metagenomika (prokaryotes sy eukaryotes). B Fizarana amin'ny antsipiriany ny sombin-ADN bakteria voafaritry ny BLASTN sy BLASTX.
Ny fanadihadiana Kraken2 koa dia naneho fa ny ccfDNA an'ny moule dia nahitana sombin-ADN archaeal, anisan'izany ny sombin-ADN an'ny Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ary Thaurmarcheota (11%) (Sary 6a). Ny fisian'ny sombin-ADN avy amin'ny Euryarchaeota sy Crenarchaeota, izay hita teo aloha tao amin'ny vondrom-piarahamonina mikraoba an'ny moule Kalifornia, dia tsy tokony hahagaga [42]. Na dia matetika aza ny Euryarchaeota dia mifandray amin'ny toe-javatra tafahoatra, dia ekena ankehitriny fa ny Euryarchaeota sy Crenarcheota dia anisan'ny prokaryotes mahazatra indrindra ao amin'ny tontolo iainana cryogenic an-dranomasina [43, 44]. Ny fisian'ny zavamananaina methanogenic ao amin'ny moule dia tsy mahagaga, raha jerena ny tatitra vao haingana momba ny fivoahan'ny metana be dia be avy amin'ny fivoahan'ny rano ambany ao amin'ny Kerguelen Plateau [45] sy ny mety ho famokarana metana mikraoba hita any amin'ny morontsirak'i Kerguelen Islands [46].
Nifindra tany amin'ny famakiana avy amin'ny viriosy ADN ny sainay avy eo. Araka ny fantatray tsara indrindra, ity no fandalinana tsy voafaritra voalohany momba ny votoatin'ny viriosy ao amin'ny sifotra. Araka ny nantenaina, nahita sombin-ADN amin'ny bacteriophages (Caudovirales) izahay (Sary 6b). Na izany aza, ny ADN viraliny mahazatra indrindra dia avy amin'ny filuman'ny nucleocytoviruses, fantatra ihany koa amin'ny hoe viriosy ADN lehibe cytoplasmic nokleary (NCLDV), izay manana ny genome lehibe indrindra amin'ny viriosy rehetra. Ao anatin'ity filum ity, ny ankamaroan'ny filaharan'ny ADN dia an'ny fianakaviana Mimimidoviridae (58%) sy Poxviridae (21%), izay ahitana biby manana hazon-damosina sy arthropoda voajanahary, raha toa ka ampahany kely amin'ireo filaharan'ny ADN ireo dia an'ny ahidrano virolojika fantatra. Mahazo aretina amin'ny ahidrano eukaryotic an-dranomasina. Ny filaharana dia azo avy amin'ny viriosy Pandora ihany koa, ilay viriosy goavambe manana ny haben'ny genome lehibe indrindra amin'ny karazana viriosy fantatra rehetra. Mahaliana fa ny isan'ny mpampiantrano fantatra fa voan'ny viriosy, araka ny voafaritry ny filaharan'ny hemolymph ccfDNA, dia somary lehibe (Sary S3, Fampahalalana fanampiny). Tafiditra ao anatin'izany ny viriosy izay mamindra bibikely toy ny Baculoviridae sy Iridoviridae, ary koa ny viriosy izay mamindra amoeba, ahidrano ary biby manana hazon-damosina. Nahita filaharana mifanaraka amin'ny genome Pithovirus sibericum ihany koa izahay. Ny Pitovirus (fantatra ihany koa amin'ny hoe "viriosy zombie") dia nalaina voalohany avy amin'ny permafrost 30.000 taona tany Siberia [47]. Noho izany, ny valin'ny fikarohanay dia mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha izay mampiseho fa tsy ny karazana maoderina rehetra amin'ireo viriosy ireo no lany tamingana [48] ary mety ho hita any amin'ny tontolo iainana an-dranomasina subarctic lavitra ireo viriosy ireo.
Farany, nanao andrana izahay mba hahitana raha afaka mahita sombin-ADN avy amin'ny biby maro sela hafa. Vahiny miisa 482 no fantatra tamin'ny alalan'ny BLASTN sy BLASTX tamin'ny alalan'ny tranomboky nt, nr ary RefSeq (genomika sy proteinina). Ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa amin'ireo sombin-ADN ccfDNA vahiny amin'ny biby maro sela dia ny ADN amin'ny taolana no manjaka (Sary 5). Nahitana sombin-ADN avy amin'ny bibikely sy karazana hafa ihany koa. Mbola tsy fantatra ny ampahany betsaka amin'ny sombin-ADN, angamba noho ny tsy fahampian'ny fanehoana karazana an-dranomasina maro ao amin'ny tahiry genomika raha oharina amin'ny karazana an-tanety [49].
Ato amin'ity lahatsoratra ity, dia ampiharinay amin'ny sifotra ny foto-kevitra LB, ary milaza izahay fa ny fandinihana ny hemolymph ccfDNA dia afaka manome fahatakarana lalindalina kokoa momba ny firafitry ny tontolo iainana amorontsiraka an-dranomasina. Indrindra indrindra, hitanay fa 1) ny hemolymph sifotra dia misy fifantohana avo lenta (ambaratonga microgram) amin'ny sombin-ADN miparitaka be (~1-5 kb); 2) ireo sombin-ADN ireo dia samy mahaleo tena sy tsy mahaleo tena 3) Anisan'ireo loharano vahiny amin'ireo sombin-ADN ireo, dia nahita ADN bakteria, arkeolojika ary viriosy izahay, ary koa ADN an'ny biby maro sela hafa; 4) Ny fiangonan'ireo sombin-ADN vahiny ireo ao amin'ny hemolymph dia mitranga haingana ary mandray anjara amin'ny asa fanivanana anatiny amin'ny sifotra. Ho famaranana, ny fanadihadianay dia mampiseho fa ny foto-kevitry ny LB, izay ampiharina indrindra amin'ny sehatry ny biomedicine, dia mandika loharano fahalalana manankarena nefa tsy voazaha izay azo ampiasaina mba hahatakarana bebe kokoa ny fifandraisana misy eo amin'ny karazana mpiambina sy ny tontolo iainany.
Ankoatra ny rajako, dia voalaza fa nisy ny fitokana-monina ccfDNA tamin'ny biby mampinono, anisan'izany ny totozy, alika, saka ary soavaly [50, 51, 52]. Na izany aza, araka ny fantatray, ny fanadihadianay no voalohany nitatitra ny fahitana sy ny filaharan'ny ccfDNA amin'ny karazana an-dranomasina misy rafitra fivezivezena misokatra. Io endri-javatra anatomika sy ny fahaizan'ny sifotra manivana io dia mety, farafaharatsiny amin'ny ampahany, hanazava ny toetran'ny haben'ny sombin-ADN miparitaka raha oharina amin'ny karazana hafa. Amin'ny olombelona, ​​ny ankamaroan'ny sombin-ADN miparitaka ao amin'ny ra dia sombin-javatra kely manomboka amin'ny 150 ka hatramin'ny 200 bp. miaraka amin'ny tampon'isa ambony indrindra 167 bp [34, 53]. Ny ampahany kely nefa manan-danja amin'ny sombin-ADN dia eo anelanelan'ny 300 sy 500 bp ny habeny, ary eo amin'ny 5% eo ho eo no lava kokoa noho ny 900 bp. [54]. Ny antony mahatonga ity fizarana habe ity dia satria ny loharanon'ny ccfDNA ao amin'ny plasma dia vokatry ny fahafatesan'ny sela, na noho ny fahafatesan'ny sela na noho ny nekrose amin'ny sela hematopoietika mivezivezy amin'ny olona salama na noho ny apoptosis amin'ny sela fivontosana amin'ny marary homamiadana (fantatra amin'ny hoe ADN fivontosana mivezivezy). , ctDNA). Ny fizarana habe amin'ny hemolymph ccfDNA izay hitanay tao amin'ny sifotra dia nanomboka tamin'ny 1000 ka hatramin'ny 5000 bp, izay manondro fa ny ccfDNA sifotra dia avy amin'ny fiaviana hafa. Vinavina lojika izany, satria ny sifotra dia manana rafitra lalan-dra misokatra antsasany ary miaina ao anaty tontolo an-dranomasina misy ADN genomic mikraoba be dia be. Raha ny marina, ny andrana nataonay tao amin'ny laboratoara nampiasa ADN exogenous dia naneho fa ny sifotra dia manangona sombin-ADN ao anaty ranomasina, farafaharatsiny aorian'ny ora vitsivitsy dia simba izy ireo aorian'ny fidiran'ny sela sy/na avoaka ary/na tehirizina amin'ny fikambanana isan-karazany. Noho ny tsy fahitan'ny sela (na prokaryotic na eukaryotic), ny fampiasana fizarana intravalvular dia hampihena ny habetsaky ny ccfDNA avy amin'ny loharano tena izy ary koa avy amin'ny loharano vahiny. Raha jerena ny maha-zava-dehibe ny hery fiarovana voajanahary ao amin'ny bivalve sy ny habetsahan'ny phagocytes mivezivezy, dia nanombantombana ihany koa izahay fa na dia ny ccfDNA vahiny aza dia manankarena amin'ny phagocytes mivezivezy izay manangona ADN vahiny rehefa mihinana zavamiaina bitika sy/na poti-sela. Raha fintinina, ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho fa ny hemolymph ccfDNA bivalve dia toerana fitehirizana fampahalalana molekiolary miavaka ary manamafy ny toerany amin'ny maha-karazana mpiambina azy.
Asehon'ny angon-drakitray fa ny fandaharana sy ny famakafakana ireo sombin-tsoratra hemolymph ccfDNA avy amin'ny bakteria dia afaka manome fampahalalana manan-danja momba ny flora bakteria mpampiantrano sy ny bakteria misy ao amin'ny tontolo iainana an-dranomasina manodidina. Ny teknika fandaharana amin'ny tifitra dia naneho ny filaharan'ny bakteria commensal A. atra gill izay ho tsy hita raha toa ka nampiasaina ny fomba famantarana 16S rRNA mahazatra, noho ny ampahany amin'ny fiangarana amin'ny tranomboky referansa. Raha ny marina, ny fampiasanay ny angon-drakitra LB nangonina avy amin'ny M. platensis tao amin'ny sosona sifotra iray ihany tao Kerguelen dia naneho fa ny firafitry ny symbionts bakteria mifandraika amin'ny gill dia mitovy ho an'ny karazana sifotra roa (Sary S4, Fampahalalana fanampiny). Ity fitoviana amin'ny sifotra roa samy hafa fototarazo ity dia mety maneho ny firafitry ny vondrom-piarahamonina bakteria ao amin'ny toerana mangatsiaka, misy solifara ary volkanika ao Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Ny haavon'ny zavamananaina bitika mampihena solifara ambony kokoa dia voalaza tsara rehefa mijinja sifotra avy amin'ny faritra amorontsiraka bioturbated [59], toy ny morontsirak'i Port-au-France. Mety ho vokatry ny fifindran'ny sifotra mitsivalana ny flora ao amin'ny sifotra commensal [60, 61]. Ilaina ny fikarohana bebe kokoa mba hamaritana ny fifandraisana misy eo amin'ny tontolo iainana an-dranomasina, ny velaran'ny fanambanin'ny ranomasina, ary ny firafitry ny bakteria simbiotika ao amin'ny sifotra. Mbola mitohy ireo fanadihadiana ireo amin'izao fotoana izao.
Ny halavan'ny sy ny fifantohan'ny hemolymph ccfDNA, ny fahamoran'ny fanadiovana azy, ary ny kalitao avo lenta ahafahana manao ny filaharana haingana dia anisan'ny tombony maro amin'ny fampiasana ny moule ccfDNA mba hanombanana ny zavamananaina ao amin'ny tontolo iainana amorontsiraka an-dranomasina. Ity fomba fiasa ity dia tena mandaitra amin'ny famaritana ireo vondrom-piarahamonina viriosy (virome) ao amin'ny tontolo iainana iray [62, 63]. Tsy toy ny bakteria, archaea, ary eukaryotes, ny genome viraliny dia tsy misy fototarazo voatahiry ara-filogenetika toy ny filaharana 16S. Ny valin'ny fikarohanay dia manondro fa ny biopsies ranoka avy amin'ny karazana famantarana toy ny moule dia azo ampiasaina hamantarana ny sombin-virus ccfDNA maro be fantatra fa manimba ireo mpampiantrano izay matetika mipetraka amin'ny tontolo iainana an-dranomasina amorontsiraka. Tafiditra ao anatin'izany ny viriosy fantatra fa manimba ny protozoa, arthropods, bibikely, zavamaniry, ary viriosy bakteria (ohatra, bacteriophages). Hita fa nisy fizarana mitovy amin'izany rehefa nodinihinay ny virome hemolymph ccfDNA an'ny moule manga (M. platensis) nangonina tao amin'ny sosona moule mitovy ao Kerguelen (Tabilao S2, Fampahalalana fanampiny). Ny fandaharana ccfDNA amin'ny alalan'ny basy dia fomba fiasa vaovao izay mahazo vahana amin'ny fandalinana ny virome-n'ny olombelona na karazana hafa [21, 37, 64]. Ity fomba fiasa ity dia tena ilaina amin'ny fandalinana ny viriosy ADN roa sosona, satria tsy misy fototarazo tokana voatahiry amin'ireo viriosy ADN roa sosona rehetra, izay maneho ny kilasy viriosy isan-karazany sy midadasika indrindra any Baltimore [65]. Na dia mbola tsy voasokajy aza ny ankamaroan'ireo viriosy ireo ary mety ahitana viriosy avy amin'ny faritra tsy fantatra mihitsy amin'ny tontolon'ny viriosy [66], dia hitanay fa ny virome sy ny faritra misy ny sifotra A. atra sy M. platensis dia eo anelanelan'ny karazana roa. mitovy amin'izany (jereo ny sary S3, fampahalalana fanampiny). Tsy mahagaga io fitoviana io, satria mety maneho ny tsy fahampian'ny fifantenana amin'ny fandraisana ny ADN misy ao amin'ny tontolo iainana. Ilaina amin'izao fotoana izao ny fanadihadiana amin'ny ho avy mampiasa RNA voadio mba hamantarana ny virome RNA.
Tao amin'ny fanadihadianay, nampiasa fantsona tena hentitra izahay izay nalaina avy amin'ny asan'i Kowarski sy ireo mpiara-miasa [37], izay nampiasa famafana dingana roa amin'ny famakiana mitambatra sy ny contigs taloha sy taorian'ny fanangonana ny ccfDNA teratany, ka nahatonga ny ampahany betsaka amin'ny famakiana tsy voasarimakirana. Noho izany, tsy afaka manilika izahay fa ny sasany amin'ireo famakiana tsy voasarimakirana ireo dia mety mbola manana ny niandohany manokana, indrindra satria tsy manana genome referansa ho an'ity karazana sifotra ity izahay. Nampiasa ity fantsona ity ihany koa izahay satria nanahy momba ny chimera eo amin'ny famakiana tena sy tsy tena ary ny halavan'ny famakiana novokarin'ny Illumina MiSeq PE75. Antony iray hafa mahatonga ny ankamaroan'ny famakiana tsy voasarimakirana dia ny hoe ny ankamaroan'ny mikraoba an-dranomasina, indrindra fa any amin'ny faritra mitokana toa an'i Kerguelen, dia tsy mbola nasiana fanamarihana. Nampiasa Illumina MiSeq PE75 izahay, raha mihevitra fa mitovy amin'ny halavan'ny sombin-javatra ccfDNA amin'ny ccfDNA olombelona ny halavany. Ho an'ny fanadihadiana amin'ny ho avy, raha jerena ny valin'ny fanadihadianay izay mampiseho fa ny hemolymph ccfDNA dia manana famakiana lava kokoa noho ny olombelona sy/na ny biby mampinono, dia manoro hevitra ny hampiasa sehatra fandaharana mety kokoa amin'ny sombin-javatra ccfDNA lava kokoa izahay. Hanamora kokoa ny famantarana ireo famantarana bebe kokoa ho an'ny fanadihadiana lalindalina kokoa ity fomba fanao ity. Ny fahazoana ny filaharan'ny genome nokleary A. atra feno izay tsy azo ampiasaina amin'izao fotoana izao dia hanamora be ihany koa ny fanavahana ny ccfDNA amin'ny loharano tena izy sy tsy tena izy. Koa satria nifantoka tamin'ny fahafahana mampihatra ny foto-kevitra momba ny biopsy ranoka amin'ny sifotra ny fikarohanay, dia manantena izahay fa rehefa ampiasaina amin'ny fikarohana amin'ny ho avy ity foto-kevitra ity, dia hisy fitaovana sy fantsona vaovao hamolavola mba hampitomboana ny fahafahan'ity fomba ity handalinana ny fahasamihafan'ny mikraoba amin'ny sifotra. tontolo iainana an-dranomasina.
Amin'ny maha-biomarker klinika tsy manafika, ny haavon'ny ccfDNA avo lenta ao amin'ny plasma olombelona dia mifandray amin'ny aretina isan-karazany, fahasimban'ny sela, ary toe-javatra misy adin-tsaina [67,68,69]. Io fitomboana io dia mifandray amin'ny famoahana sombin-ADN avy amin'ny niaviany taorian'ny fahasimban'ny sela. Noresahinay ity olana ity tamin'ny alàlan'ny adin-tsaina mafana tampoka, izay nampiharina vetivety tamin'ny mari-pana 30 °C ny sifotra. Nanao ity fanadihadiana ity tamin'ny karazana sifotra telo samihafa izahay tamin'ny andrana tsy miankina telo. Na izany aza, tsy nahita fiovana teo amin'ny haavon'ny ccfDNA izahay taorian'ny adin-tsaina mafana tampoka (jereo ny Sary S5, fampahalalana fanampiny). Ity fahitana ity dia mety hanazava, farafaharatsiny amin'ny ampahany, ny zava-misy fa ny sifotra dia manana rafitra fikorianan'ny ra semi-open ary manangona ADN vahiny betsaka noho ny asany sivana avo lenta. Etsy ankilany, ny sifotra, toy ny biby tsy manana hazon-damosina maro, dia mety ho mahatohitra kokoa ny fahasimban'ny sela vokatry ny adin-tsaina, ka mametra ny famoahana ccfDNA ao amin'ny hemolymph-ny [70, 71].
Hatreto, ny famakafakana ADN ny zavamananaina ao amin'ny tontolo iainana anaty rano dia nifantoka indrindra tamin'ny metabarcoding ADN momba ny tontolo iainana (eDNA). Na izany aza, ity fomba ity dia mazàna voafetra amin'ny famakafakana ny zavamananaina rehefa ampiasaina ny primer. Ny fampiasana ny shotgun sequencing dia mandingana ny fetran'ny PCR sy ny fisafidianana mitongilana ny andiana primer. Noho izany, amin'ny lafiny iray, ny fomba fiasantsika dia akaiky kokoa ny fomba famakafakana eDNA Shotgun avo lenta vao nampiasaina vao haingana, izay afaka mandamina mivantana ny ADN voazarazara ary mamakafaka saika ny zavamananaina rehetra [72, 73]. Na izany aza, misy olana fototra maromaro izay mampiavaka ny LB amin'ny fomba eDNA mahazatra. Mazava ho azy fa ny fahasamihafana lehibe eo amin'ny eDNA sy ny LB dia ny fampiasana mpampiantrano sivana voajanahary. Ny fampiasana karazana an-dranomasina toy ny sponjy sy bivalves (Dresseina spp.) ho sivana voajanahary handinihana ny eDNA dia notaterina [74, 75]. Na izany aza, ny fanadihadian'i Dreissena dia nampiasa biopsies sela izay nalaina ny ADN. Ny famakafakana ny ccfDNA avy amin'ny LB dia tsy mitaky biopsy sela, fitaovana manokana ary indraindray lafo vidy ary logistika mifandraika amin'ny eDNA na biopsy sela. Raha ny marina, vao haingana izahay no nitatitra fa ny ccfDNA avy amin'ny LB dia azo tehirizina sy hadihadiana amin'ny alàlan'ny fanohanan'ny FTA tsy misy fitazonana rojo mangatsiaka, izay fanamby lehibe ho an'ny fikarohana any amin'ny faritra mitokana [76]. Ny fitrandrahana ccfDNA avy amin'ny biopsies ranoka dia tsotra ihany koa ary manome ADN avo lenta ho an'ny shotgun sequencing sy ny fanadihadiana PCR. Tombony lehibe izany noho ny sasany amin'ireo fetra ara-teknika mifandraika amin'ny fanadihadiana eDNA [77]. Ny fahatsorana sy ny vidiny mirary amin'ny fomba fakana santionany dia mety tsara amin'ny fandaharan'asa fanaraha-maso maharitra. Ankoatra ny fahaizany manivana avo lenta, ny endri-javatra iray hafa fantatra amin'ny bivalves dia ny firafitry ny mucopolysaccharide simika amin'ny mucus, izay mampiroborobo ny fidiran'ny viriosy [78, 79]. Izany dia mahatonga ny bivalves ho sivana voajanahary tsara indrindra amin'ny famaritana ny zavamananaina sy ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro amin'ny tontolo iainana anaty rano. Na dia azo jerena ho fetran'ny fomba aza ny fisian'ny sombin-ADN avy amin'ny mpampiantrano raha oharina amin'ny eDNA, ny vidiny mifandraika amin'ny fananana ccfDNA teratany toy izany raha oharina amin'ny eDNA dia azo takarina miaraka amin'izay noho ny habetsahan'ny fampahalalana azo alaina amin'ny fanadihadiana ara-pahasalamana. offset host. Tafiditra ao anatin'izany ny fisian'ny andian-virus tafiditra ao amin'ny genome-n'ny mpampiantrano. Zava-dehibe indrindra ho an'ny sifotra izany, noho ny fisian'ny retrovirus leukemia mifindra mitsivalana ao amin'ny bivalves [80, 81]. Tombony iray hafa amin'ny LB raha oharina amin'ny eDNA ny fampiasana ny asan'ny phagocytic an'ny sela ra mivezivezy ao amin'ny hemolymph, izay mitelina ny zavamananaina bitika (sy ny genome-ny). Ny phagocytosis no tena asan'ny sela ra ao amin'ny bivalves [82]. Farany, ity fomba ity dia manararaotra ny fahafahan'ny sifotra manivana avo lenta (salan'isa 1.5 l/ora amin'ny ranomasina) sy ny fivezivezena roa andro, izay mampitombo ny fifangaroan'ny sosona samihafa amin'ny ranomasina, ahafahana misambotra eDNA heterologous. [83, 84]. Noho izany, ny famakafakana ny ccfDNA amin'ny sifotra dia fomba mahaliana noho ny fiantraikan'ny sifotra amin'ny sakafo, ara-toekarena ary ara-tontolo iainana. Mitovy amin'ny famakafakana ny LB nangonina avy amin'ny olombelona, ​​ity fomba ity koa dia manokatra ny fahafahana handrefesana ny fiovan'ny fototarazo sy epigenetika ao amin'ny ADN mpampiantrano ho setrin'ny akora ivelany. Ohatra, ny teknolojia fandaharana taranaka fahatelo dia azo eritreretina hanaovana fanadihadiana methylation manerana ny genome amin'ny ccfDNA teratany amin'ny alàlan'ny fandaharana nanopore. Tokony ho mora kokoa ity dingana ity noho ny hoe ny halavan'ny sombin-tsokajy ccfDNA moule dia mifanaraka tsara amin'ny sehatra fandaharana lava izay mamela ny fanadihadiana methylation ADN manerana ny genome avy amin'ny fandaharana tokana tsy mila fiovana simika.85,86] Mety mahaliana izany, satria naseho fa ny lamina methylation ADN dia maneho ny valin'ny adin-tsaina ara-tontolo iainana ary maharitra mandritra ny taranaka maro. Noho izany, dia afaka manome fahatakarana sarobidy momba ny mekanisma fototra mifehy ny valiny aorian'ny fiparitahan'ny fiovan'ny toetr'andro na ny loto [87]. Na izany aza, ny fampiasana LB dia tsy hoe tsy misy fetra. Mazava ho azy fa mitaky ny fisian'ny karazana famantarana ao amin'ny tontolo iainana izany. Araka ny voalaza etsy ambony, ny fampiasana LB hanombanana ny zavamananaina ao amin'ny tontolo iainana iray dia mitaky fantsona bioinformatika hentitra izay mandinika ny fisian'ny sombin-tsokajy ADN avy amin'ny loharano. Olana lehibe iray hafa ny fisian'ny genome fanondroana ho an'ny karazana an-dranomasina. Antenaina fa ireo hetsika toy ny Tetikasa Genome Biby Mammal an-dranomasina sy ny tetikasa Fish10k vao natsangana [88] dia hanamora ny fanadihadiana toy izany amin'ny ho avy. Ny fampiharana ny foto-kevitra LB amin'ny zavamananaina an-dranomasina izay mamahana sivana dia mifanaraka amin'ny fandrosoana farany amin'ny teknolojia fandaharana, ka mahatonga azy io ho mety tsara amin'ny fampivoarana ny mari-pamantarana biolojika multi-ohm mba hanomezana fampahalalana manan-danja momba ny fahasalaman'ny toeram-ponenana an-dranomasina ho setrin'ny adin-tsaina ara-tontolo iainana.
Ny angon-drakitra momba ny filaharan'ny genome dia napetraka ao amin'ny NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ao amin'ny Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro eo amin'ny fiainana an-dranomasina sy ny tontolo iainana. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Diniho ny fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro sy ireo adin-tsaina eo an-toerana hafa eo amin'ny tontolo iainana an-dranomasina. tontolo iainana ara-tsiansa ankapobeny. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Science ny voalohan'ny volana martsa. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ny fihenan'ny fandeferana hafanana eo ambanin'ny toe-javatra miverimberina amin'ny hafanana dia manazava ny fahafatesan'ny sifotra manga amin'ny fahavaratra. Tatitra siantifika 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Fiovana vao haingana teo amin'ny fahamaroan'ny fahafatesana biby, ny antony ary ny haben'ny fahafatesany. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Ny otrikaretina marobe tsy voafaritra manokana dia mety nahatonga ny fahafatesan'ny Pinna nobilis faobe. Fiainana. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Mety ho fiantraikan'ny fiovan'ny toetr'andro amin'ny aretina zoonotika any amin'ny Tendrontany Avaratra. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Sifotra manga (Mytilus edulis spp.) ho toy ny zavamananaina famantarana amin'ny fanaraha-maso ny fahalotoan'ny morontsiraka: famerenana. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Fampidirana ny biopsy ranoka amin'ny fitsaboana homamiadana. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Fahamatorana amin'ny biopsy ranoka: Mamela ny ADN-n'ny fivontosana hivezivezy. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asidra nokleika ao amin'ny plasman'olombelona. Tatitry ny fivorian'ireo sampana Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Anjara asa vaovao ho an'ny ADN tsy misy sela ho toy ny mari-pamantarana molekiola ho an'ny fitsaboana homamiadana. Fandrefesana ny fanadihadiana biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Niditra tao amin'ny toeram-pitsaboana ny biopsy ranoka - olana amin'ny fampiharana sy ny fanamby amin'ny ho avy. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW sy ny hafa. Hita ao amin'ny plasma sy serum-n'ny reny ny ADN-n'ny foetus. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Fandinihana ny fizotran'ny fitondrana vohoka sy ny fahasarotany amin'ny fampiasana ARN ivelan'ny sela ao amin'ny ran'ny vehivavy mandritra ny fitondrana vohoka. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsie ranoka: ADN tsy misy sela mpanome no ampiasaina hamantarana ny lesoka allogeneic amin'ny grefy voa. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Fanavaozana amin'ny diagnostika mialoha ny fiterahana: fandaharana ny genome plasma an'ny reny. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Fitiliana haingana ny pathogen miaraka amin'ny fandaharana metagenomika taranaka manaraka amin'ny tsiranoka voan'ny aretina. Nat Medicine. 2021;27:115-24.