Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Tekuća biopsija (LB) koncept je koji brzo dobiva na popularnosti u biomedicinskom području. Koncept se uglavnom temelji na detekciji fragmenata cirkulirajuće izvanstanične DNA (ccfDNA), koji se uglavnom oslobađaju kao mali fragmenti nakon stanične smrti u raznim tkivima. Mali udio tih fragmenata potječe iz stranih (stranih) tkiva ili organizama. U trenutnom radu primijenili smo ovaj koncept na dagnje, sentinel vrstu poznatu po svom visokom kapacitetu filtracije morske vode. Koristimo sposobnost dagnji da djeluju kao prirodni filteri za hvatanje fragmenata DNA iz okoliša iz različitih izvora kako bismo pružili informacije o bioraznolikosti morskih obalnih ekosustava. Naši rezultati pokazuju da hemolimfa dagnji sadrži fragmente DNA koji se uvelike razlikuju po veličini, od 1 do 5 kb. Sekvenciranje sačmaricom pokazalo je da je veliki broj fragmenata DNA stranog mikrobnog podrijetla. Među njima smo pronašli fragmente DNA iz bakterija, arheja i virusa, uključujući viruse za koje se zna da inficiraju razne domaćine koji se obično nalaze u obalnim morskim ekosustavima. Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB-a primijenjen na dagnje predstavlja bogat, ali još neistražen izvor znanja o mikrobnoj raznolikosti u morskim obalnim ekosustavima.
Utjecaj klimatskih promjena (CC) na bioraznolikost morskih ekosustava brzorastuće je područje istraživanja. Globalno zatopljenje ne samo da uzrokuje važne fiziološke stresove, već i pomiče evolucijske granice toplinske stabilnosti morskih organizama, utječući na stanište brojnih vrsta, potičući ih na potragu za povoljnijim uvjetima [1, 2]. Osim što utječe na bioraznolikost metazoa, CC narušava osjetljivu ravnotežu interakcija domaćina i mikroba. Ova mikrobna disbakterioza predstavlja ozbiljnu prijetnju morskim ekosustavima jer čini morske organizme osjetljivijima na zarazne patogene [3, 4]. Vjeruje se da SS igraju važnu ulogu u masovnim uginuljima, što je ozbiljan problem za upravljanje globalnim morskim ekosustavima [5, 6]. Ovo je važno pitanje s obzirom na ekonomske, ekološke i prehrambene utjecaje mnogih morskih vrsta. To se posebno odnosi na školjkaše koji žive u polarnim regijama, gdje su učinci CK neposredniji i teži [6, 7]. Zapravo, školjkaši poput Mytilus spp. široko se koriste za praćenje učinaka CC na morske ekosustave. Nije iznenađujuće da je razvijen relativno velik broj biomarkera za praćenje njihovog zdravlja, često korištenjem dvoslojnog pristupa koji uključuje funkcionalne biomarkere temeljene na enzimskoj aktivnosti ili staničnim funkcijama poput stanične održivosti i fagocitne aktivnosti [8]. Ove metode također uključuju mjerenje koncentracije specifičnih pokazatelja tlaka koji se akumuliraju u mekim tkivima nakon apsorpcije velikih količina morske vode. Međutim, visoki kapacitet filtracije i poluotvoreni krvožilni sustav školjkaša pružaju priliku za razvoj novih biomarkera hemolimfe korištenjem koncepta tekuće biopsije (LB), jednostavnog i minimalno invazivnog pristupa liječenju pacijenata. uzorci krvi [9, 10]. Iako se u ljudskoj LB može pronaći nekoliko vrsta cirkulirajućih molekula, ovaj koncept se prvenstveno temelji na analizi sekvenciranja DNA fragmenata cirkulirajuće izvanstanične DNA (ccfDNA) u plazmi. Zapravo, prisutnost cirkulirajuće DNA u ljudskoj plazmi poznata je od sredine 20. stoljeća [11], ali tek je posljednjih godina pojava metoda sekvenciranja visokog protoka dovela do kliničke dijagnoze temeljene na ccfDNA. Prisutnost ovih cirkulirajućih fragmenata DNA djelomično je posljedica pasivnog oslobađanja genomske DNA (nuklearne i mitohondrijske) nakon stanične smrti. U zdravih osoba, koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su izloženi stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. U zdravih osoba, koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su izloženi stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. U zdravih ljudi koncentracija vkkDNK u normi je niska (<10 ng/ml), ali se može povećati u 5-10 puta u bolesnika s različitom patologijom ili podvrgnutih stresu, potaknutom oštećenjem tkiva. U zdravih ljudi koncentracija cccDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata s raznim patologijama ili pod stresom koji dovodi do oštećenja tkiva.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL，但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Koncentracije ccfDNA obično su niske (<10 ng/ml) kod zdravih ljudi, ali se mogu povećati za 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. Koncentracije ccfDNA su obično niske (<10 ng/ml) kod zdravih osoba, ali se mogu povećati 5-10 puta kod pacijenata s raznim patologijama ili stresom, što rezultira oštećenjem tkiva.Veličina fragmenata ccfDNA uvelike varira, ali obično se kreće od 150 do 200 bp. [12]. Analiza vlastite ccfDNA, tj. ccfDNA iz normalnih ili transformiranih stanica domaćina, može se koristiti za otkrivanje genetskih i epigenetskih promjena prisutnih u nuklearnom i/ili mitohondrijskom genomu, čime se pomaže kliničarima u odabiru specifičnih molekularno usmjerenih terapija [13]. Međutim, ccfDNA se može dobiti iz stranih izvora kao što je ccfDNA iz fetalnih stanica tijekom trudnoće ili iz transplantiranih organa [14,15,16,17]. ccfDNA je također važan izvor informacija za otkrivanje prisutnosti nukleinskih kiselina zaraznog agensa (stranog), što omogućuje neinvazivno otkrivanje raširenih infekcija koje nisu identificirane hemokulturama, izbjegavajući invazivnu biopsiju zaraženog tkiva [18]. Nedavne studije su doista pokazale da ljudska krv sadrži bogat izvor informacija koje se mogu koristiti za identifikaciju virusnih i bakterijskih patogena, te da je oko 1% ccfDNA pronađene u ljudskoj plazmi stranog podrijetla [19]. Ove studije pokazuju da se bioraznolikost cirkulirajućeg mikrobioma organizma može procijeniti pomoću ccfDNA analize. Međutim, do nedavno se ovaj koncept koristio isključivo kod ljudi i, u manjoj mjeri, kod drugih kralježnjaka [20, 21].
U ovom radu koristimo LB potencijal za analizu ccfDNA Aulacomya atra, južne vrste koja se obično nalazi na subantarktičkim otocima Kerguelen, skupini otoka na vrhu velike visoravni koja je nastala prije 35 milijuna godina. vulkanska erupcija. Koristeći in vitro eksperimentalni sustav, otkrili smo da dagnje brzo apsorbiraju fragmente DNK u morskoj vodi i ulaze u odjeljak hemolimfe. Sekvenciranje sačmaricom pokazalo je da ccfDNA hemolimfe dagnji sadrži fragmente DNK vlastitog i nesopstvenog podrijetla, uključujući simbiotske bakterije i fragmente DNK iz bioma tipičnih za hladne vulkanske morske obalne ekosustave. CcfDNA hemolimfe također sadrži virusne sekvence izvedene iz virusa s različitim rasponima domaćina. Također smo pronašli fragmente DNK višestaničnih životinja poput koštanih riba, morskih anemona, algi i kukaca. Zaključno, naša studija pokazuje da se LB koncept može uspješno primijeniti na morske beskralježnjake kako bi se stvorio bogat genomski repertoar u morskim ekosustavima.
Odrasle jedinke (duljine 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) prikupljene su s međuplimnih stjenovitih obala Port-au-Francea (049°21.235 J, 070°13.490 I) na otocima Kerguelen u prosincu 2018. Ostale odrasle plave dagnje (Mytilus spp.) nabavljene su od komercijalnog dobavljača (PEI Mussel King Inc., Otok princa Edwarda, Kanada) i smještene u temperaturno kontrolirani (4°C) prozračeni spremnik koji je sadržavao 10-20 L umjetne salamure od 32‰ (umjetna morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAD). Za svaki eksperiment izmjerena je duljina i težina pojedinačnih školjki.
Besplatni protokol otvorenog pristupa za ovaj program dostupan je na mreži (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Ukratko, LB hemolimfa je prikupljena iz abduktornih mišića kako je opisano [22]. Hemolimfa je pročišćena centrifugiranjem na 1200×g tijekom 3 minute, supernatant je zamrznut (-20°C) do upotrebe. Za izolaciju i pročišćavanje cfDNA, uzorci (1,5-2,0 ml) su odmrznuti i obrađeni pomoću NucleoSnap cfDNA kita (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) prema uputama proizvođača. ccfDNA je pohranjena na -80°C do daljnje analize. U nekim eksperimentima, ccfDNA je izolirana i pročišćena pomoću QIAamp DNA Investigator Kita (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Pročišćena DNA je kvantificirana pomoću standardnog PicoGreen testa. Raspodjela fragmenata izolirane ccfDNA analizirana je kapilarnom elektroforezom pomoću bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) i High Sensitivity DNA Kita. Test je proveden korištenjem 1 µl uzorka ccfDNA prema uputama proizvođača.
Za sekvenciranje fragmenata ccfDNA hemolimfe, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pripremio je "shotgun" biblioteke koristeći Illumina DNA Mix kit iz Illumina MiSeq PE75 kita. Korišten je standardni adapter (BioO). Datoteke sirovih podataka dostupne su iz NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 i SRR8924809). Osnovna kvaliteta očitavanja procijenjena je pomoću FastQC [23]. Trimmomatic [24] korišten je za adaptere za izrezivanje i očitavanja loše kvalitete. "Shotgun" očitavanja s uparenim krajevima spojena su FLASH metodom u dulja pojedinačna očitavanja s minimalnim preklapanjem od 20 bp kako bi se izbjegla neusklađenost [25]. Spojeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI taksonomske baze podataka za školjkaše (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti provedeno je pomoću DUST-a [26]. Spojeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI taksonomske baze podataka za školjkaše (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti provedeno je pomoću DUST-a [26]. Ujedinjeni podaci bili su zabilježeni uz pomoć BLASTN-a korištenjem baze podataka taksonomije dvustvornih moljuskova NCBI (značenje e < 1e-3 i 90% gomologije), a maskiranje uzastopne niske složenosti izvršeno je pomoću DUST [26]. Združeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI baze podataka taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti provedeno je pomoću DUST-a [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 prašina [26]进行 复杂度 序列 的。。。.掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Ujedinjeni podaci bili su zabilježeni uz pomoć BLASTN-a korištenjem taksonomske baze podataka dvustvornih moljuskova NCBI (značenje e <1e-3 i 90% gomologije), a maskiranje uzastopne niske složenosti izvršeno je pomoću DUST [26]. Združeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI taksonomske baze podataka školjkaša (e vrijednost <1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti provedeno je pomoću DUST-a [26].Očitavanja su podijeljena u dvije skupine: povezana sa sekvencama školjkaša (ovdje nazvana samoočitavanja) i nepovezana (ne-samoočitavanja). Dvije skupine su zasebno sastavljene pomoću MEGAHIT-a za generiranje kontiga [27]. U međuvremenu, taksonomska distribucija očitavanja stranog mikrobioma klasificirana je pomoću Kraken2 [28] i grafički prikazana Krona tortnim dijagramom na Galaxyju [29, 30]. Optimalni kmeri određeni su kao kmeri-59 iz naših preliminarnih eksperimenata. Samokontigi su zatim identificirani usklađivanjem s BLASTN-om (baza podataka NCBI za školjkaše, e-vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Samokontigi su zatim identificirani usklađivanjem s BLASTN-om (baza podataka NCBI za školjkaše, e-vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Zatim su vlastiti kontigenti identificirani putem supostavljenja s BLASTN (baza podataka dvostvornih moljuskova NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%) za konačnu bilješku. Samokontigi su zatim identificirani usporedbom s BLASTN-om (NCBI baza podataka školjkaša, e-vrijednost <1e-10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Zatim su identificirani vlastiti kontigi za konačnu bilješku putem supostavljenosti s BLASTN (baza podataka NCBI za dvostvorne mekušce, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Samokontigi su zatim identificirani za konačnu anotaciju usporedbom s BLASTN-om (NCBI baza podataka školjkaša, e-vrijednost <1e-10 i 60% homologije). Paralelno, nesopstveni grupni kontigi su označeni pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelno, nesopstveni grupni kontigi su označeni pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelno su kontigumenti stranog roda bili označeni pomoću BLASTN (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigi stranih grupa označeni su pomoću BLASTN-a (baza podataka NT NCBI, e-vrijednost <1e-10 i 60% homologije).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Paralelno kontigi, koji se ne odnose na vlastitu grupu, bili su označeni pomoću BLASTN (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, ne-vlastiti grupni kontigi su označeni pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq protein NCBI baza podataka (e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq protein NCBI baza podataka (e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigama korištenjem baze podataka belka nr i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također proveden na ne-vlastitim kontigima korištenjem nr i RefSeq NCBI baza podataka proteina (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX također izvodi nesamostalne kontigate korištenjem baze podataka belka nr i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također proveden na ne-vlastitim kontigima korištenjem nr i RefSeq NCBI baza podataka proteina (e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).BLASTN i BLASTX skupovi ne-samostalnih kontiga predstavljaju konačne kontige (vidi Dodatnu datoteku).
Primeri korišteni za PCR navedeni su u Tablici S1. Za amplifikaciju ciljnih gena ccfDNA korištena je Taq DNA polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON). Korišteni su sljedeći reakcijski uvjeti: denaturacija na 95 °C tijekom 3 minute, 95 °C tijekom 1 minute, postavljena temperatura žarenja tijekom 1 minute, elongacija na 72 °C tijekom 1 minute, 35 ciklusa i konačno 72 °C unutar 10 minuta. PCR produkti odvojeni su elektroforezom u agaroznim gelovima (1,5%) koji sadrže SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) na 95 V.
Dagnje (Mytilus spp.) aklimatizirane su u 500 ml oksigenirane morske vode (32 PSU) tijekom 24 sata na 4°C. Plazmidska DNA koja sadrži umetak koji kodira cDNA sekvencu ljudskog galektina-7 (NCBI pristupni broj L07769) dodana je u bočicu u konačnoj koncentraciji od 190 μg/μl. Dagnje inkubirane pod istim uvjetima bez dodatka DNA bile su kontrola. Treći kontrolni spremnik sadržavao je DNA bez dagnji. Kako bi se pratila kvaliteta DNA u morskoj vodi, uzorci morske vode (20 μl; tri ponavljanja) uzeti su iz svakog spremnika u navedeno vrijeme. Za sljedivost plazmidne DNA, LB dagnje su ulovljene u navedeno vrijeme i analizirane qPCR-om i ddPCR-om. Zbog visokog sadržaja soli u morskoj vodi, alikvoti su razrijeđeni u vodi PCR kvalitete (1:10) prije svih PCR testova.
Digitalna PCR kapljica (ddPCR) provedena je korištenjem protokola BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Za određivanje optimalne temperature upotrijebite temperaturni profil (Tablica S1). Kapi su generirane korištenjem generatora kapljica QX200 (BioRad). ddPCR je proveden na sljedeći način: 95°C tijekom 5 minuta, 50 ciklusa od 95°C tijekom 30 sekundi i zadana temperatura zagrijavanja tijekom 1 minute te 72°C tijekom 30 sekundi, 4°C tijekom 5 minuta i 90°C unutar 5 minuta. Broj kapljica i pozitivnih reakcija (broj kopija/µl) izmjereni su korištenjem čitača kapljica QX200 (BioRad). Uzorci s manje od 10 000 kapljica su odbačeni. Kontrola uzorka nije provedena svaki put kada je ddPCR pokrenut.
qPCR je proveden korištenjem Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australija) i LGALS7 specifičnih primera. Svi kvantitativni PCR-i provedeni su u 20 µl korištenjem QuantiFast SYBR Green PCR Kita (QIAGEN). qPCR je započet s 15-minutnom inkubacijom na 95°C, nakon čega je uslijedilo 40 ciklusa na 95°C tijekom 10 sekundi i na 60°C tijekom 60 sekundi s jednim prikupljanjem podataka. Krivulje taljenja generirane su korištenjem uzastopnih mjerenja na 95°C tijekom 5 sekundi, 65°C tijekom 60 sekundi i 97°C na kraju qPCR-a. Svaki qPCR je proveden u tri ponavljanja, osim za kontrolne uzorke.
Budući da su dagnje poznate po svojoj visokoj brzini filtracije, prvo smo istražili mogu li filtrirati i zadržati fragmente DNA prisutne u morskoj vodi. Također nas je zanimalo akumuliraju li se ti fragmenti u njihovom poluotvorenom limfnom sustavu. Ovaj smo problem eksperimentalno riješili praćenjem sudbine topljivih fragmenata DNA dodanih u bazene s plavim dagnjama. Kako bismo olakšali praćenje fragmenata DNA, koristili smo stranu (ne vlastitu) plazmidnu DNA koja sadrži ljudski gen galektin-7. ddPCR prati fragmente plazmidne DNA u morskoj vodi i dagnjama. Naši rezultati pokazuju da ako je količina fragmenata DNA u morskoj vodi ostala relativno konstantna tijekom vremena (do 7 dana) u odsutnosti dagnji, tada je u prisutnosti dagnji ta razina gotovo potpuno nestala unutar 8 sati (slika 1a,b). Fragmenti egzogene DNA lako su se detektirali unutar 15 minuta u intravalvularnoj tekućini i hemolimfi (slika 1c). Ovi fragmenti su se još uvijek mogli detektirati do 4 sata nakon izlaganja. Ova aktivnost filtriranja u odnosu na fragmente DNA usporediva je s aktivnošću filtriranja bakterija i algi [31]. Ovi rezultati ukazuju na to da dagnje mogu filtrirati i akumulirati stranu DNK u svojim tekućim odjeljcima.
Relativne koncentracije plazmidne DNA u morskoj vodi u prisutnosti (A) ili odsutnosti (B) dagnji, mjerene ddPCR-om. U A, rezultati su izraženi kao postoci, s rubovima okvira koji predstavljaju 75. i 25. percentil. Prilagođena logaritamska krivulja prikazana je crvenom bojom, a područje osjenčano sivom bojom predstavlja 95% interval pouzdanosti. U B, crvena linija predstavlja srednju vrijednost, a plava linija predstavlja 95% interval pouzdanosti za koncentraciju. C Akumulacija plazmidne DNA u hemolimfi i valvularnoj tekućini dagnji u različitim vremenima nakon dodavanja plazmidne DNA. Rezultati su prikazani kao apsolutni broj detektiranih kopija/mL (±SE).
Zatim smo istražili podrijetlo ccfDNA u dagnjama prikupljenim iz ležišta dagnji na otocima Kerguelen, udaljenoj skupini otoka s ograničenim antropogenim utjecajem. U tu svrhu, cccDNA iz hemolimfi dagnji je izolirana i pročišćena metodama koje se uobičajeno koriste za pročišćavanje ljudske cccDNA [32, 33]. Otkrili smo da su prosječne koncentracije ccfDNA hemolimfe u dagnjama u rasponu niskih mikrograma po ml hemolimfe (vidi Tablicu S2, Dodatne informacije). Ovaj raspon koncentracija je mnogo veći nego kod zdravih ljudi (niski nanogrami po mililitru), ali u rijetkim slučajevima, kod pacijenata oboljelih od raka, razina ccfDNA može doseći nekoliko mikrograma po mililitru [34, 35]. Analiza raspodjele veličine ccfDNA hemolimfe pokazala je da se ti fragmenti uvelike razlikuju po veličini, u rasponu od 1000 bp do 1000 bp pa sve do 5000 bp (slika 2). Slični rezultati dobiveni su korištenjem QIAamp Investigator Kita na bazi silicijevog dioksida, metode koja se često koristi u forenzičkoj znanosti za brzu izolaciju i pročišćavanje genomske DNA iz uzoraka DNA niske koncentracije, uključujući ccfDNA [36].
Reprezentativni ccfDNA elektroforegram hemolimfe dagnji. Ekstrahirano s NucleoSnap Plasma Kitom (gore) i QIAamp DNA Investigator Kitom. B Violinski dijagram prikazuje raspodjelu koncentracija ccfDNA hemolimfe (±SE) u dagnjama. Crne i crvene linije predstavljaju medijan, odnosno prvi i treći kvartil.
Otprilike 1% ccfDNA u ljudi i primata ima strani izvor [21, 37]. S obzirom na poluotvoreni krvožilni sustav školjkaša, morsku vodu bogatu mikrobima i raspodjelu veličine ccfDNA dagnji, postavili smo hipotezu da ccfDNA hemolimfe dagnji može sadržavati bogat i raznolik skup mikrobne DNA. Kako bismo testirali ovu hipotezu, sekvencirali smo ccfDNA hemolimfe iz uzoraka Aulacomya atra prikupljenih s otoka Kerguelen, što je dalo preko 10 milijuna očitanja, od kojih je 97,6% prošlo kontrolu kvalitete. Očitavanja su zatim klasificirana prema vlastitim i tuđim izvorima pomoću baza podataka o školjkašima BLASTN i NCBI (slika S1, Dodatne informacije).
Kod ljudi se i nuklearna i mitohondrijska DNA mogu osloboditi u krvotok [38]. Međutim, u ovoj studiji nije bilo moguće detaljno opisati nuklearnu genomsku DNA dagnji, s obzirom na to da genom A. atra nije sekvenciran ili opisan. Međutim, uspjeli smo identificirati brojne fragmente ccfDNA vlastitog podrijetla koristeći biblioteku školjkaša (slika S2, Dodatne informacije). Također smo potvrdili prisutnost fragmenata DNA vlastitog podrijetla usmjerenom PCR amplifikacijom onih gena A. atra koji su sekvencirani (slika 3). Slično tome, s obzirom na to da je mitohondrijski genom A. atra dostupan u javnim bazama podataka, mogu se pronaći dokazi o prisutnosti fragmenata mitohondrijske ccfDNA u hemolimfi A. atra. Prisutnost fragmenata mitohondrijske DNA potvrđena je PCR amplifikacijom (slika 3).
Različiti mitohondrijski geni bili su prisutni u hemolimfi A. atra (crvene točkice – broj zaliha: SRX5705969) i M. platensis (plave točkice – broj zaliha: SRX5705968) amplificiranoj PCR-om. Slika prilagođena od Breton et al., 2011 B Amplifikacija supernatanta hemolimfe iz A. atra Pohranjeno na FTA papiru. Koristite bušilicu od 3 mm za izravno dodavanje u PCR epruvetu koja sadrži PCR smjesu.
S obzirom na obilan mikrobni sadržaj u morskoj vodi, u početku smo se usredotočili na karakterizaciju sekvenci mikrobne DNA u hemolimfi. Za to smo koristili dvije različite strategije. Prva strategija koristila je Kraken2, program za klasifikaciju sekvenci temeljen na algoritmu koji može identificirati mikrobne sekvence s točnošću usporedivom s BLAST-om i drugim alatima [28]. Utvrđeno je da je više od 6719 očitanja bakterijskog podrijetla, dok je 124 i 64 bilo od arheja i virusa (slika 4). Najzastupljeniji fragmenti bakterijske DNA bili su Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (slika 4a). Ova distribucija u skladu je s prethodnim studijama mikrobioma morske plave školjke [39, 40]. Gamaproteobakterije bile su glavna klasa Proteobacteria (44%), uključujući mnoge Vibrionale (slika 4b). Metoda ddPCR potvrdila je prisutnost fragmenata Vibrio DNA u ccfDNA hemolimfe A. atra (slika 4c) [41]. Kako bi se dobilo više informacija o bakterijskom podrijetlu ccfDNA, korišten je dodatni pristup (slika S2, Dodatne informacije). U ovom slučaju, očitanja koja su se preklapala sastavljena su kao očitanja sparenih krajeva i klasificirana su kao vlastitog (školjkaši) ili nesopstvenog porijekla pomoću BLASTN-a i e vrijednosti od 1e−3 te granične vrijednosti s >90% homologije. U ovom slučaju, očitanja koja su se preklapala sastavljena su kao očitanja sparenih krajeva i klasificirana su kao vlastitog (školjkaši) ili nesopstvenog porijekla pomoću BLASTN-a i e vrijednosti od 1e−3 te granične vrijednosti s >90% homologije. U ovom slučaju ispravke su sastavljene kao stavke s parnim krajevima i klasificirane kao vlastite (dvustvorčati moljuski) ili druge po podrijetlu pomoću BLASTN i značenja e 1e-3 i ocjene s gomologijom> 90%. U ovom slučaju, preklapajući očitanja prikupljena su kao očitanja s parnim završecima i klasificirana su kao nativna (školjkaši) ili neoriginalna pomoću BLASTN-a i e vrijednosti od 1e-3 te granične vrijednosti s >90% homologije.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 U ovom slučaju, prekrivajuće stavke su prikupljene kao stavke s parnim krajevima i klasificirane kao vlastite (dvustvorčati moljuski) ili neosobne po podrijetlu s korištenjem vrijednosti e BLASTN i 1e-3 i poroga gomologije> 90%. U ovom slučaju, preklapajući očitanja prikupljena su kao očitanja s parnim završecima i klasificirana kao vlastita (školjke) ili neoriginalna pomoću vrijednosti e BLASTN i 1e-3 ​​i praga homologije >90%.Budući da genom A. atra još nije sekvenciran, koristili smo de novo strategiju sastavljanja MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblera. Ukupno 147 188 kontiga identificirano je kao ovisno (školjkaši) porijeklo. Ti su kontigi zatim razloženi s e-vrijednostima od 1e-10 pomoću BLASTN-a i BLASTX-a. Ova nam je strategija omogućila identifikaciju 482 fragmenta koji nisu školjkaši prisutni u ccfDNA A. atra. Više od polovice (57%) ovih fragmenata DNK dobiveno je iz bakterija, uglavnom iz simbionta škrga, uključujući sulfotrofne simbionte, i iz simbionta škrga Solemya velum (slika 5).
Relativna brojnost na razini tipa. B Mikrobna raznolikost dvaju glavnih koljena (Firmicutes i Proteobacteria). Reprezentativna amplifikacija ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenti gena 16S rRNA (plavo) u tri atra hemolimfe.
Analizirano je ukupno 482 prikupljena kontiga. Opći profil taksonomske distribucije metagenomskih kontignih anotacija (prokarioti i eukarioti). B Detaljna distribucija bakterijskih fragmenata DNA identificiranih BLASTN-om i BLASTX-om.
Analiza Kraken2 također je pokazala da ccfDNA dagnji sadrži fragmente arhealne DNK, uključujući fragmente DNK Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (slika 6a). Prisutnost fragmenata DNK izvedenih iz Euryarchaeota i Crenarchaeota, prethodno pronađenih u mikrobnoj zajednici kalifornijskih dagnji, ne bi trebala biti iznenađenje [42]. Iako se Euryarchaeota često povezuje s ekstremnim uvjetima, sada je prepoznato da su i Euryarchaeota i Crenarcheota među najčešćim prokariotima u morskom kriogenom okruženju [43, 44]. Prisutnost metanogenih mikroorganizama u dagnjama nije iznenađujuća, s obzirom na nedavna izvješća o opsežnom curenju metana s dna na visoravni Kerguelen [45] i mogućoj mikrobnoj proizvodnji metana uočenoj uz obalu otoka Kerguelen [46].
Naša se pozornost zatim prebacila na očitanja DNA virusa. Koliko znamo, ovo je prva izvanciljna studija sadržaja virusa u školjkama. Kao što se i očekivalo, pronašli smo fragmente DNA bakteriofaga (Caudovirales) (slika 6b). Međutim, najčešća virusna DNA dolazi iz koljena nukleocitovirusa, poznatih i kao nuklearni citoplazmatski veliki DNA virus (NCLDV), koji ima najveći genom od bilo kojeg virusa. Unutar ovog koljena, većina DNA sekvenci pripada porodicama Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), čiji prirodni domaćini uključuju kralježnjake i člankonošce, dok mali udio tih DNA sekvenci pripada poznatim virološkim algama. Inficira morske eukariotske alge. Sekvence su također dobivene iz virusa Pandora, divovskog virusa s najvećom veličinom genoma od svih poznatih virusnih rodova. Zanimljivo je da je raspon domaćina za koje se zna da su zaraženi virusom, utvrđen sekvenciranjem ccfDNA hemolimfe, bio relativno velik (slika S3, Dodatne informacije). Uključuje viruse koji inficiraju kukce poput Baculoviridae i Iridoviridae, kao i viruse koji inficiraju amebe, alge i kralježnjake. Također smo pronašli sekvence koje odgovaraju genomu Pithovirus sibericum. Pitovirusi (također poznati kao "zombi virusi") prvi su put izolirani iz 30 000 godina starog permafrosta u Sibiru [47]. Stoga su naši rezultati u skladu s prethodnim izvješćima koja pokazuju da nisu sve moderne vrste ovih virusa izumrle [48] i da ti virusi mogu biti prisutni u udaljenim subarktičkim morskim ekosustavima.
Konačno, testirali smo možemo li pronaći fragmente DNK iz drugih višestaničnih životinja. Ukupno 482 strana kontiga identificirana su BLASTN-om i BLASTX-om s nt, nr i RefSeq knjižnicama (genomskim i proteinskim). Naši rezultati pokazuju da među stranim fragmentima ccfDNK višestaničnih životinja prevladava DNK koštanih kostiju (slika 5). Pronađeni su i fragmenti DNK kukaca i drugih vrsta. Relativno veliki dio fragmenata DNK nije identificiran, moguće zbog nedovoljne zastupljenosti velikog broja morskih vrsta u genomskim bazama podataka u usporedbi s kopnenim vrstama [49].
U ovom radu primjenjujemo koncept LB na dagnje, tvrdeći da sekvenciranje ccfDNA hemolimfe može pružiti uvid u sastav morskih obalnih ekosustava. Posebno smo otkrili da 1) hemolimfa dagnji sadrži relativno visoke koncentracije (mikrogramske razine) relativno velikih (~1-5 kb) cirkulirajućih fragmenata DNA; 2) ovi fragmenti DNA su i neovisni i ne-neovisni 3) Među stranim izvorima ovih fragmenata DNA pronašli smo bakterijsku, arhealnu i virusnu DNA, kao i DNA drugih višestaničnih životinja; 4) Akumulacija ovih stranih fragmenata ccfDNA u hemolimfi događa se brzo i doprinosi unutarnjoj aktivnosti filtriranja dagnji. Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB, koji se do sada primjenjivao uglavnom u području biomedicine, kodira bogat, ali neistražen izvor znanja koji se može koristiti za bolje razumijevanje interakcije između sentinel vrsta i njihovog okoliša.
Osim primata, izolacija ccfDNA zabilježena je i kod sisavaca, uključujući miševe, pse, mačke i konje [50, 51, 52]. Međutim, koliko znamo, naša studija je prva koja izvještava o detekciji i sekvenciranju ccfDNA u morskim vrstama s otvorenim cirkulacijskim sustavom. Ova anatomska značajka i sposobnost filtriranja dagnji mogu, barem djelomično, objasniti različite karakteristike veličine cirkulirajućih fragmenata DNA u usporedbi s drugim vrstama. Kod ljudi, većina fragmenata DNA koji cirkuliraju u krvi su mali fragmenti veličine od 150 do 200 bp s maksimalnim vrhom od 167 bp [34, 53]. Mali, ali značajan dio fragmenata DNA veličine je između 300 i 500 bp, a oko 5% je dulje od 900 bp. [54]. Razlog za ovu raspodjelu veličine je taj što glavni izvor ccfDNA u plazmi nastaje kao posljedica stanične smrti, bilo zbog stanične smrti ili zbog nekroze cirkulirajućih hematopoetskih stanica kod zdravih osoba ili zbog apoptoze tumorskih stanica kod pacijenata s rakom (poznato kao cirkulirajuća tumorska DNA). , ctDNA). Raspodjela veličine ccfDNA hemolimfe koju smo pronašli u dagnjama kretala se od 1000 do 5000 bp, što sugerira da ccfDNA dagnji ima drugačije podrijetlo. Ovo je logična hipoteza, budući da dagnje imaju poluotvoreni vaskularni sustav i žive u morskim vodenim okruženjima koja sadrže visoke koncentracije mikrobne genomske DNA. Zapravo, naši laboratorijski eksperimenti s egzogenom DNA pokazali su da dagnje akumuliraju fragmente DNA u morskoj vodi, barem nakon nekoliko sati kada se razgrađuju nakon staničnog unosa i/ili oslobađaju i/ili pohranjuju u raznim organizacijama. S obzirom na rijetkost stanica (i prokariotskih i eukariotskih), korištenje intravalvularnih odjeljaka smanjit će količinu ccfDNA iz vlastitih izvora, kao i iz stranih izvora. Uzimajući u obzir važnost urođenog imuniteta školjkaša i veliki broj fagocita u cirkulaciji, nadalje smo postavili hipotezu da je čak i strana ccfDNA obogaćena u cirkulirajućim fagocitima koji akumuliraju stranu DNA nakon gutanja mikroorganizama i/ili staničnih ostataka. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je ccfDNA hemolimfe školjkaša jedinstveno spremište molekularnih informacija i jača njihov status sentinel vrste.
Naši podaci ukazuju na to da sekvenciranje i analiza fragmenata ccfDNA hemolimfe bakterijskog podrijetla može pružiti ključne informacije o bakterijskoj flori domaćina i bakterijama prisutnim u okolnom morskom ekosustavu. Tehnike sekvenciranja shot-om otkrile su sekvence komenzalne bakterije A. atra gill koje bi bile propuštene da su korištene konvencionalne metode identifikacije 16S rRNA, dijelom zbog pristranosti referentne knjižnice. Zapravo, naša upotreba LB podataka prikupljenih od M. platensis u istom sloju dagnji u Kerguelenu pokazala je da je sastav bakterijskih simbionta povezanih sa škrgama bio isti za obje vrste dagnji (slika S4, Dodatne informacije). Ova sličnost dviju genetski različitih dagnji može odražavati sastav bakterijskih zajednica u hladnim, sumpornim i vulkanskim naslagama Kerguelena [55, 56, 57, 58]. Više razine mikroorganizama koji smanjuju sumpor dobro su opisane prilikom ulova dagnji iz bioturbiranih obalnih područja [59], poput obale Port-au-Francea. Druga mogućnost je da je flora komenzalnih školjki pogođena horizontalnim prijenosom [60, 61]. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdila korelacija između morskog okoliša, površine morskog dna i sastava simbiotskih bakterija u školjkama. Ta su istraživanja trenutno u tijeku.
Duljina i koncentracija ccfDNA hemolimfe, jednostavnost pročišćavanja i visoka kvaliteta koja omogućuje brzo sekvenciranje metodom "sagma" neke su od mnogih prednosti korištenja ccfDNA dagnji za procjenu bioraznolikosti u morskim obalnim ekosustavima. Ovaj pristup je posebno učinkovit za karakterizaciju virusnih zajednica (viroma) u danom ekosustavu [62, 63]. Za razliku od bakterija, arheja i eukariota, virusni genomi ne sadrže filogenetski konzervirane gene poput 16S sekvenci. Naši rezultati pokazuju da se tekući biopsijski uzorci indikatorskih vrsta poput dagnji mogu koristiti za identifikaciju relativno velikog broja fragmenata virusa ccfDNA za koje se zna da inficiraju domaćine koji obično nastanjuju obalne morske ekosustave. To uključuje viruse za koje se zna da inficiraju protozoe, člankonošce, kukce, biljke i bakterijske viruse (npr. bakteriofage). Slična distribucija pronađena je kada smo ispitivali virom ccfDNA hemolimfe plavih dagnji (M. platensis) prikupljenih u istom sloju dagnji u Kerguelenu (Tablica S2, Dodatne informacije). Sekvenciranje ccfDNA metodom sačmarice doista je novi pristup koji dobiva na zamahu u proučavanju viroma ljudi ili drugih vrsta [21, 37, 64]. Ovaj pristup je posebno koristan za proučavanje dvolančanih DNA virusa, budući da nijedan gen nije očuvan među svim dvolančanim DNA virusima, što predstavlja najraznolikiju i najširu klasu virusa u Baltimoreu [65]. Iako većina ovih virusa ostaje neklasificirana i može uključivati ​​viruse iz potpuno nepoznatog dijela virusnog svijeta [66], otkrili smo da se viromi i rasponi domaćina dagnji A. atra i M. platensis slično nalaze između te dvije vrste (vidi sliku S3, dodatne informacije). Ova sličnost nije iznenađujuća, jer može odražavati nedostatak selektivnosti u unosu DNA prisutne u okolišu. Trenutno su potrebna buduća istraživanja korištenjem pročišćene RNA kako bi se karakterizirao RNA virom.
U našoj studiji koristili smo vrlo rigorozan cjevovod prilagođen radu Kowarskog i kolega [37], koji su koristili dvostupanjsko brisanje združenih očitanja i kontiga prije i nakon sastavljanja izvorne ccfDNA, što je rezultiralo visokim udjelom nemapiranih očitanja. Stoga ne možemo isključiti da neka od ovih nemapiranih očitanja još uvijek mogu imati vlastito podrijetlo, prvenstveno zato što nemamo referentni genom za ovu vrstu dagnji. Također smo koristili ovaj cjevovod jer smo bili zabrinuti zbog himera između vlastitih i nesopstvenih očitanja i duljina očitanja koje je generirao Illumina MiSeq PE75. Drugi razlog za većinu neistraženih očitanja je taj što mnogi morski mikrobi, posebno u udaljenim područjima poput Kerguelena, nisu označeni. Koristili smo Illumina MiSeq PE75, pretpostavljajući da su duljine fragmenata ccfDNA slične ljudskoj ccfDNA. Za buduća istraživanja, s obzirom na naše rezultate koji pokazuju da ccfDNA hemolimfe ima dulja očitanja od ljudi i/ili sisavaca, preporučujemo korištenje platforme za sekvenciranje prikladnije za dulje fragmente ccfDNA. Ova praksa će znatno olakšati identificiranje više indikacija za dublju analizu. Dobivanje trenutno nedostupne kompletne sekvence nuklearnog genoma A. atra također bi uvelike olakšalo razlikovanje ccfDNA od vlastitih i tuđih izvora. S obzirom na to da se naše istraživanje usredotočilo na mogućnost primjene koncepta tekuće biopsije na dagnje, nadamo se da će se, kako se ovaj koncept bude koristio u budućim istraživanjima, razviti novi alati i cjevovodi kako bi se povećao potencijal ove metode za proučavanje mikrobne raznolikosti dagnji. morski ekosustav.
Kao neinvazivni klinički biomarker, povišene razine ccfDNA u ljudskoj plazmi povezane su s raznim bolestima, oštećenjem tkiva i stresnim stanjima [67,68,69]. Ovo povećanje povezano je s oslobađanjem fragmenata DNK vlastitog podrijetla nakon oštećenja tkiva. Ovaj smo problem riješili korištenjem akutnog toplinskog stresa, u kojem su dagnje kratkotrajno izložene temperaturi od 30 °C. Ovu smo analizu proveli na tri različite vrste dagnji u tri neovisna eksperimenta. Međutim, nismo pronašli nikakvu promjenu u razinama ccfDNA nakon akutnog toplinskog stresa (vidi sliku S5, dodatne informacije). Ovo otkriće može barem djelomično objasniti činjenicu da dagnje imaju poluotvoreni krvožilni sustav i akumuliraju velike količine strane DNK zbog svoje visoke aktivnosti filtriranja. S druge strane, dagnje, kao i mnogi beskralježnjaci, mogu biti otpornije na oštećenje tkiva uzrokovano stresom, čime se ograničava oslobađanje ccfDNA u njihovoj hemolimfi [70, 71].
Do danas se analiza DNK bioraznolikosti u vodenim ekosustavima uglavnom usredotočila na metabarkodiranje okolišne DNK (eDNK). Međutim, ova metoda je obično ograničena u analizi bioraznolikosti kada se koriste primeri. Korištenje shotgun sekvenciranja zaobilazi ograničenja PCR-a i pristran odabir setova primera. Stoga je naša metoda, u određenom smislu, bliža nedavno korištenoj metodi visokopropusnog sekvenciranja eDNK Shotgun, koja je u stanju izravno sekvencirati fragmentiranu DNK i analizirati gotovo sve organizme [72, 73]. Međutim, postoji niz temeljnih problema koji razlikuju LB od standardnih eDNK metoda. Naravno, glavna razlika između eDNK i LB je korištenje prirodnih filtera domaćina. Prijavljena je upotreba morskih vrsta poput spužvi i školjkaša (Dresseina spp.) kao prirodnog filtera za proučavanje eDNK [74, 75]. Međutim, Dreissenina studija koristila je biopsije tkiva iz kojih je DNK ekstrahirana. Analiza ccfDNK iz LB ne zahtijeva biopsiju tkiva, specijaliziranu i ponekad skupu opremu i logistiku povezanu s eDNK ili biopsijom tkiva. Zapravo, nedavno smo izvijestili da se ccfDNA iz LB može pohraniti i analizirati uz FTA podršku bez održavanja hladnog lanca, što je veliki izazov za istraživanja u udaljenim područjima [76]. Ekstrakcija ccfDNA iz tekućih biopsija također je jednostavna i pruža visokokvalitetnu DNK za sekvenciranje "sagma" i PCR analizu. To je velika prednost s obzirom na neka tehnička ograničenja povezana s analizom eDNA [77]. Jednostavnost i niska cijena metode uzorkovanja također su posebno prikladni za dugoročne programe praćenja. Osim njihove visoke sposobnosti filtriranja, još jedna dobro poznata značajka školjkaša je kemijski sastav mukopolisaharida njihove sluzi, koji potiče apsorpciju virusa [78, 79]. To čini školjkaše idealnim prirodnim filterom za karakterizaciju bioraznolikosti i utjecaja klimatskih promjena u određenom vodenom ekosustavu. Iako se prisutnost fragmenata DNK izvedenih iz domaćina može smatrati ograničenjem metode u usporedbi s eDNA, trošak povezan s takvom nativnom ccfDNA u usporedbi s eDNA istovremeno je razumljiv zbog ogromne količine informacija dostupnih za zdravstvene studije. offset domaćin. To uključuje prisutnost virusnih sekvenci integriranih u genom domaćina. To je posebno važno za dagnje, s obzirom na prisutnost horizontalno prenesenih leukemijskih retrovirusa u školjkašima [80, 81]. Druga prednost LB u odnosu na eDNA je ta što iskorištava fagocitnu aktivnost krvnih stanica u hemolimfi, koje zahvaćaju mikroorganizme (i njihove genome). Fagocitoza je glavna funkcija krvnih stanica u školjkašima [82]. Konačno, metoda koristi visoki kapacitet filtriranja dagnji (prosječno 1,5 l/h morske vode) i dvodnevnu cirkulaciju, što povećava miješanje različitih slojeva morske vode, omogućujući hvatanje heterologne eDNA. [83, 84]. Stoga je analiza ccfDNA dagnji zanimljiv put s obzirom na prehrambene, ekonomske i ekološke utjecaje dagnji. Slično analizi LB prikupljene od ljudi, ova metoda također otvara mogućnost mjerenja genetskih i epigenetskih promjena u DNK domaćina kao odgovor na egzogene tvari. Na primjer, tehnologije sekvenciranja treće generacije mogu se predvidjeti za provođenje analize metilacije cijelog genoma u nativnoj ccfDNA korištenjem sekvenciranja nanopora. Ovaj proces trebao bi biti olakšan činjenicom da je duljina fragmenata ccfDNA dagnji idealno kompatibilna s platformama za sekvenciranje dugog čitanja koje omogućuju analizu metilacije DNA cijelog genoma iz jednog niza sekvenciranja bez potrebe za kemijskim transformacijama.85,86] Ovo je zanimljiva mogućnost, jer je pokazano da obrasci metilacije DNA odražavaju odgovor na stres u okolišu i traju tijekom mnogih generacija. Stoga može pružiti vrijedan uvid u temeljne mehanizme koji upravljaju odgovorom nakon izloženosti klimatskim promjenama ili zagađivačima [87]. Međutim, korištenje LB-a nije bez ograničenja. Nepotrebno je reći da to zahtijeva prisutnost indikatorskih vrsta u ekosustavu. Kao što je gore spomenuto, korištenje LB-a za procjenu bioraznolikosti određenog ekosustava također zahtijeva rigorozan bioinformatički cjevovod koji uzima u obzir prisutnost fragmenata DNA iz izvora. Drugi veliki problem je dostupnost referentnih genoma za morske vrste. Nadamo se da će inicijative poput Projekta genoma morskih sisavaca i nedavno pokrenutog projekta Fish10k [88] olakšati takvu analizu u budućnosti. Primjena LB koncepta na organizme koji se hrane filtriranjem vode također je kompatibilna s najnovijim dostignućima u tehnologiji sekvenciranja, što ga čini vrlo prikladnim za razvoj višeohmskih biomarkera koji će pružiti važne informacije o zdravlju morskih staništa kao odgovor na okolišni stres.
Podaci sekvenciranja genoma pohranjeni su u NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Utjecaj klimatskih promjena na morski život i ekosustave. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alppanidou V, Bevilacqua S, i dr. Razmotrite kombinirane utjecaje klimatskih promjena i drugih lokalnih stresora na morski okoliš. opći znanstveni okoliš. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Znanost o prvom martu. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Smanjena tolerancija na toplinu u uvjetima ponovljenog toplinskog stresa objašnjava visoku ljetnu smrtnost plavih školjki. Znanstveno izvješće 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER i dr. Nedavne promjene u učestalosti, uzrocima i opsegu uginuća životinja. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Višestruki patogeni nespecifični za vrstu mogli su uzrokovati masovnu smrtnost Pinne nobilis. Život. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potencijalni utjecaj klimatskih promjena na arktičke zoonoze. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. i dr. Plave dagnje (Mytilus edulis spp.) kao signalni organizmi u praćenju onečišćenja obale: pregled. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tekuće biopsije u liječenju raka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Sazrijevanje tekuće biopsije: Omogućuje cirkulaciju tumorske DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kiseline u ljudskoj plazmi. Zapisnici sa sastanaka podružnica Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova uloga slobodne DNA kao molekularnog markera za liječenje raka. Kvantifikacija biomolarne analize. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekuća biopsija ulazi u kliniku – problemi s implementacijom i budući izazovi. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i drugi. Fetalna DNA prisutna je u majčinoj plazmi i serumu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Proučavanje tijeka trudnoće i njezinih komplikacija korištenjem cirkulirajuće izvanstanične RNA u krvi žena tijekom trudnoće. Dopediatrija. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J i dr. Tekuća biopsija: DNK donora bez stanica koristi se za otkrivanje alogenih lezija u transplantiranom bubregu. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacije u prenatalnoj dijagnostici: sekvenciranje genoma majčine plazme. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Brzo otkrivanje patogena metagenomskim sekvenciranjem zaraženih tjelesnih tekućina sljedeće generacije. Nat Medicine. 2021;27:115-24.