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La biopsia liquida (LB) è un concetto che sta rapidamente guadagnando popolarità in campo biomedico. Il concetto si basa principalmente sul rilevamento di frammenti di DNA extracellulare circolante (ccfDNA), che vengono rilasciati principalmente come piccoli frammenti dopo la morte cellulare in vari tessuti. Una piccola parte di questi frammenti proviene da tessuti o organismi estranei. Nel nostro lavoro attuale, abbiamo applicato questo concetto ai mitili, una specie sentinella nota per la sua elevata capacità di filtrazione dell'acqua di mare. Utilizziamo la capacità dei mitili di agire come filtri naturali per catturare frammenti di DNA ambientale da una varietà di fonti, al fine di fornire informazioni sulla biodiversità degli ecosistemi marini costieri. I nostri risultati mostrano che l'emolinfa dei mitili contiene frammenti di DNA di dimensioni molto variabili, da 1 a 5 kb. Il sequenziamento shotgun ha mostrato che un gran numero di frammenti di DNA è di origine microbica estranea. Tra questi, abbiamo trovato frammenti di DNA di batteri, archaea e virus, inclusi virus noti per infettare una varietà di ospiti comunemente presenti negli ecosistemi marini costieri. In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB applicato alle cozze rappresenta una ricca ma ancora inesplorata fonte di conoscenza sulla diversità microbica negli ecosistemi marini costieri.
L'impatto del cambiamento climatico (CC) sulla biodiversità degli ecosistemi marini è un'area di ricerca in rapida crescita. Il riscaldamento globale non solo causa importanti stress fisiologici, ma spinge anche i limiti evolutivi della stabilità termica degli organismi marini, influenzando l'habitat di numerose specie, spingendole a cercare condizioni più favorevoli [1, 2]. Oltre a influenzare la biodiversità dei metazoi, il CC interrompe il delicato equilibrio delle interazioni ospite-microbico. Questa disbatteriosi microbica rappresenta una seria minaccia per gli ecosistemi marini in quanto rende gli organismi marini più suscettibili agli agenti patogeni infettivi [3, 4]. Si ritiene che i SS svolgano un ruolo importante nelle morti di massa, il che rappresenta un grave problema per la gestione degli ecosistemi marini globali [5, 6]. Questa è una questione importante dati gli impatti economici, ecologici e nutrizionali di molte specie marine. Ciò è particolarmente vero per i bivalvi che vivono nelle regioni polari, dove gli effetti della CK sono più immediati e gravi [6, 7]. Infatti, bivalvi come Mytilus spp. sono ampiamente utilizzati per monitorare gli effetti del CC sugli ecosistemi marini. Non sorprende che sia stato sviluppato un numero relativamente elevato di biomarcatori per monitorarne la salute, spesso utilizzando un approccio a due livelli che coinvolge biomarcatori funzionali basati sull'attività enzimatica o su funzioni cellulari come la vitalità cellulare e l'attività fagocitaria [8]. Questi metodi includono anche la misurazione della concentrazione di specifici indicatori di pressione che si accumulano nei tessuti molli dopo l'assorbimento di grandi quantità di acqua di mare. Tuttavia, l'elevata capacità di filtrazione e il sistema circolatorio semi-aperto dei bivalvi offrono l'opportunità di sviluppare nuovi biomarcatori dell'emolinfa utilizzando il concetto di biopsia liquida (LB), un approccio semplice e minimamente invasivo alla gestione del paziente. campioni di sangue [9, 10]. Sebbene diversi tipi di molecole circolanti possano essere trovati nel LB umano, questo concetto si basa principalmente sull'analisi del sequenziamento del DNA di frammenti di DNA extracellulare circolante (ccfDNA) nel plasma. In effetti, la presenza di DNA circolante nel plasma umano è nota fin dalla metà del XX secolo [11], ma è solo negli ultimi anni che l'avvento di metodi di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla diagnosi clinica basata sul ccfDNA. La presenza di questi frammenti di DNA circolante è dovuta in parte al rilascio passivo di DNA genomico (nucleare e mitocondriale) dopo la morte cellulare. Negli individui sani la concentrazione di ccfDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL), ma può aumentare di 5–10 volte nei pazienti affetti da diverse patologie o sottoposti a stress, con conseguente danno tissutale. Negli individui sani la concentrazione di ccfDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL), ma può aumentare di 5–10 volte nei pazienti affetti da diverse patologie o sottoposti a stress, con conseguente danno tissutale. Se un concentratore è in condizioni normali (<10 ng/ml), non è possibile farlo in 5-10 ore più grande con la patologia razionale o ili alleviare lo stress, fornire un supporto per il corpo. Nelle persone sane, la concentrazione di cccDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL), ma può aumentare di 5–10 volte nei pazienti affetti da varie patologie o sotto stress che provoca danni ai tessuti.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL） ，在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。La concentrazione di ccfDNA è elevata (<10 ng/ml) per i bambini, non è possibile ottenere risultati in 5-10 anni Pazienti con patologie complesse o altri stress, che si rivolge a un lavoratore inesperto. Le concentrazioni di ccfDNA sono solitamente basse (<10 ng/ml) negli individui sani, ma possono aumentare di 5-10 volte nei pazienti affetti da varie patologie o da stress, con conseguente danno tissutale.La dimensione dei frammenti di ccfDNA varia ampiamente, ma di solito varia da 150 a 200 bp. [12]. L'analisi del ccfDNA auto-derivato, ovvero ccfDNA da cellule ospiti normali o trasformate, può essere utilizzata per rilevare cambiamenti genetici ed epigenetici presenti nel genoma nucleare e/o mitocondriale, aiutando così i medici a selezionare terapie specifiche a bersaglio molecolare [13]. Tuttavia, il ccfDNA può essere ottenuto da fonti straniere come il ccfDNA da cellule fetali durante la gravidanza o da organi trapiantati [14,15,16,17]. Il ccfDNA è anche un'importante fonte di informazioni per rilevare la presenza di acidi nucleici di un agente infettivo (estraneo), che consente il rilevamento non invasivo di infezioni diffuse non identificate dalle emocolture, evitando la biopsia invasiva del tessuto infetto [18]. Studi recenti hanno infatti dimostrato che il sangue umano contiene una ricca fonte di informazioni che possono essere utilizzate per identificare agenti patogeni virali e batterici e che circa l'1% del ccfDNA trovato nel plasma umano è di origine estranea [19]. Questi studi dimostrano che la biodiversità del microbioma circolante di un organismo può essere valutata utilizzando l'analisi del ccfDNA. Tuttavia, fino a poco tempo fa, questo concetto era utilizzato esclusivamente negli esseri umani e, in misura minore, in altri vertebrati [20, 21].
Nel presente articolo, utilizziamo il potenziale LB per analizzare il ccfDNA di Aulacomya atra, una specie meridionale comunemente presente nelle Isole Kerguelen subantartiche, un gruppo di isole in cima a un vasto altopiano formatosi 35 milioni di anni fa a seguito di un'eruzione vulcanica. Utilizzando un sistema sperimentale in vitro, abbiamo scoperto che i frammenti di DNA presenti nell'acqua di mare vengono rapidamente assorbiti dai mitili ed entrano nel compartimento dell'emolinfa. Il sequenziamento shotgun ha dimostrato che il ccfDNA dell'emolinfa dei mitili contiene frammenti di DNA di origine propria e non propria, inclusi batteri simbiontici e frammenti di DNA provenienti da biomi tipici degli ecosistemi costieri marini vulcanici freddi. Il ccfDNA dell'emolinfa contiene anche sequenze virali derivate da virus con diversi intervalli di ospiti. Abbiamo anche trovato frammenti di DNA di animali multicellulari come pesci ossei, anemoni di mare, alghe e insetti. In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB può essere applicato con successo agli invertebrati marini per generare un ricco repertorio genomico negli ecosistemi marini.
Gli adulti (55-70 mm di lunghezza) di Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) sono stati raccolti dalle coste rocciose intertidali di Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Isole Kerguelen nel dicembre 2018. Altre cozze blu adulte (Mytilus spp.) sono state acquistate da un fornitore commerciale (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) e poste in una vasca aerata a temperatura controllata (4°C) contenente 10-20 L di salamoia artificiale al 32‰ (sale marino artificiale Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Per ogni esperimento, sono stati misurati la lunghezza e il peso delle singole conchiglie.
Un protocollo open access gratuito per questo programma è disponibile online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). In breve, l'emolinfa LB è stata raccolta dai muscoli abduttori come descritto [22]. L'emolinfa è stata chiarificata mediante centrifugazione a 1200 × g per 3 minuti, il surnatante è stato congelato (-20 °C) fino all'uso. Per l'isolamento e la purificazione del cfDNA, i campioni (1,5-2,0 ml) sono stati scongelati e processati utilizzando il kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) secondo le istruzioni del produttore. Il ccfDNA è stato conservato a -80 °C fino a ulteriore analisi. In alcuni esperimenti, il ccfDNA è stato isolato e purificato utilizzando il kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Il DNA purificato è stato quantificato utilizzando un test PicoGreen standard. La distribuzione dei frammenti del ccfDNA isolato è stata analizzata mediante elettroforesi capillare utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizzando un kit DNA ad alta sensibilità. Il test è stato eseguito utilizzando 1 µl del campione di ccfDNA secondo le istruzioni del produttore.
Per il sequenziamento dei frammenti di ccfDNA dell'emolinfa, Génome Québec (Montréal, Quebec, Canada) ha preparato librerie shotgun utilizzando il kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75. È stato utilizzato un adattatore standard (BioO). I file di dati grezzi sono disponibili presso l'archivio di lettura delle sequenze NCBI (SRR8924808 e SRR8924809). La qualità di lettura di base è stata valutata utilizzando FastQC [23]. Trimmomatic [24] è stato utilizzato per il clipping degli adattatori e per le letture di scarsa qualità. Le letture shotgun con estremità accoppiate sono state unite tramite FLASH in letture singole più lunghe con una sovrapposizione minima di 20 bp per evitare incongruenze [25]. Le letture unite sono state annotate con BLASTN utilizzando un database di tassonomia NCBI bivalve (valore e < 1e−3 e omologia al 90%) e il mascheramento delle sequenze a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26]. Le letture unite sono state annotate con BLASTN utilizzando un database di tassonomia NCBI bivalve (valore e < 1e−3 e omologia al 90%) e il mascheramento delle sequenze a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26]. La manutenzione ordinaria è stata effettuata con BLASTN con l'utilizzo delle basi dati двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% omologazione), una maschera di protezione successiva all'uso di DUST [26]. Le letture aggregate sono state annotate con BLASTN utilizzando il database di tassonomia bivalve NCBI (valore e < 1e-3 e omologia al 90%) e il mascheramento della sequenza a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26].并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数, 并 使用 polvere [26]进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽La manutenzione ordinaria è stata effettuata con BLASTN con l'utilizzo di basi dati taksonomiche двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 e 90% omologazioni), la mascheratura successiva non ha avuto problemi con l'uso di DUST [26]. Le letture aggregate sono state annotate con BLASTN utilizzando il database tassonomico dei bivalvi NCBI (valore e <1e-3 e omologia al 90%) e il mascheramento della sequenza a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26].Le letture sono state divise in due gruppi: correlate alle sequenze bivalvi (qui chiamate auto-letture) e non correlate (non-auto-letture). Due gruppi sono stati assemblati separatamente utilizzando MEGAHIT per generare contig [27]. Nel frattempo, la distribuzione tassonomica delle letture del microbioma alieno è stata classificata utilizzando Kraken2 [28] e rappresentata graficamente da un grafico a torta Krona su Galaxy [29, 30]. Il kmers ottimale è stato determinato essere kmers-59 dai nostri esperimenti preliminari. Gli autocontig sono stati quindi identificati tramite allineamento con BLASTN (database NCBI dei bivalvi, valore e < 1e−10 e omologia del 60%) per un'annotazione finale. Gli autocontig sono stati quindi identificati tramite allineamento con BLASTN (database NCBI dei bivalvi, valore e < 1e−10 e omologia del 60%) per un'annotazione finale. I paesi in cui sono stati identificati i conti possono essere sostituiti con BLASTN (base dati моллюсков NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%) per le annotazioni visibili. Gli autocontig sono stati quindi identificati confrontandoli con BLASTN (database NCBI dei bivalvi, valore e <1e-10 e omologia del 60%) per l'annotazione finale.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Abbiamo elencato i conti identificativi per la registrazione delle annotazioni tramite BLASTN (base questo è l'NCBI двустворчатых molлюсков, значение e <1e-10 e гомология 60%). Gli autocontig sono stati quindi identificati per l'annotazione finale mediante confronto con BLASTN (database NCBI dei bivalvi, valore e <1e-10 e omologia del 60%). Parallelamente, i contig dei gruppi non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e < 1e−10 e omologia al 60%). Parallelamente, i contig dei gruppi non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e < 1e−10 e omologia al 60%). I conti di un gruppo parallelo di gruppi di lavoro sono stati annotati con BLASTN (baza da nt NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%). Parallelamente, i contig dei gruppi stranieri sono stati annotati con BLASTN (database NT NCBI, valore e <1e-10 e omologia del 60%).平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. I conti paralleli che non sono stati presi in considerazione dal gruppo costante sono stati annotati con BLASTN (bazada nt NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%). Parallelamente, i contig dei gruppi non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e <1e-10 e omologia al 60%). BLASTX è stato condotto anche su contig non self utilizzando i database NCBI delle proteine ​​nr e RefSeq (valore e < 1e−10 e omologia del 60%). BLASTX è stato condotto anche su contig non self utilizzando i database NCBI delle proteine ​​nr e RefSeq (valore e < 1e−10 e omologia del 60%). BLASTX è stato anche fornito sui conti non più disponibili con l'utilizzo dei dati di base nr e RefSeq NCBI (analisi e <1e-10 e гомология 60%). BLASTX è stato eseguito anche su contig non-self utilizzando i database proteici NCBI nr e RefSeq (valore e < 1e-10 e omologia del 60%).还使用nr e RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）.还使用nr e RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）. BLASTX è stato utilizzato anche per i conti non più disponibili con l'utilizzo dei dati di base nr e RefSeq NCBI (impostazione e <1e-10 e гомология 60%). BLASTX è stato eseguito anche su contig non-self utilizzando i database proteici NCBI nr e RefSeq (valore e <1e-10 e omologia del 60%).I pool BLASTN e BLASTX di non-self-contig rappresentano i contig finali (vedere file supplementare).
I primer utilizzati per la PCR sono elencati nella Tabella S1. La Taq DNA polimerasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) è stata utilizzata per amplificare i geni target del ccfDNA. Sono state utilizzate le seguenti condizioni di reazione: denaturazione a 95 °C per 3 minuti, 95 °C per 1 minuto, temperatura di annealing impostata per 1 minuto, allungamento a 72 °C per 1 minuto, 35 cicli e infine 72 °C entro 10 minuti. I prodotti di PCR sono stati separati mediante elettroforesi in gel di agarosio (1,5%) contenente SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) a 95 V.
Le cozze (Mytilus spp.) sono state acclimatate in 500 ml di acqua di mare ossigenata (32 PSU) per 24 ore a 4 °C. Il DNA plasmidico contenente un inserto codificante la sequenza del cDNA della galectina-7 umana (numero di accesso NCBI L07769) è stato aggiunto alla fiala a una concentrazione finale di 190 μg/μl. Le cozze incubate nelle stesse condizioni senza aggiunta di DNA sono state utilizzate come controllo. La terza vasca di controllo conteneva DNA senza cozze. Per monitorare la qualità del DNA nell'acqua di mare, campioni di acqua di mare (20 μl; tre ripetizioni) sono stati prelevati da ciascuna vasca ai tempi indicati. Per la tracciabilità del DNA plasmidico, le cozze LB sono state raccolte ai tempi indicati e analizzate mediante qPCR e ddPCR. A causa dell'elevato contenuto salino dell'acqua di mare, alcune aliquote sono state diluite in acqua di qualità PCR (1:10) prima di tutte le analisi PCR.
La PCR digitale a gocce (ddPCR) è stata eseguita utilizzando il protocollo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Utilizzare il profilo di temperatura per determinare la temperatura ottimale (Tabella S1). Le gocce sono state generate utilizzando un generatore di gocce QX200 (BioRad). La ddPCR è stata eseguita come segue: 95 °C per 5 min, 50 cicli di 95 °C per 30 s e una data temperatura di annealing per 1 min e 72 °C per 30 s, 4 °C per 5 min e 90 °C entro 5 minuti. Il numero di gocce e le reazioni positive (numero di copie/µl) sono stati misurati utilizzando un lettore di gocce QX200 (BioRad). I campioni con meno di 10.000 gocce sono stati scartati. Il controllo del pattern non è stato eseguito ogni volta che è stata eseguita la ddPCR.
La qPCR è stata eseguita utilizzando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) e primer specifici per LGALS7. Tutte le PCR quantitative sono state eseguite in 20 µl utilizzando il kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). La qPCR è stata avviata con un'incubazione di 15 minuti a 95 °C seguita da 40 cicli a 95 °C per 10 secondi e a 60 °C per 60 secondi con una sola raccolta dati. Le curve di melting sono state generate utilizzando misurazioni successive a 95 °C per 5 s, 65 °C per 60 s e 97 °C al termine della qPCR. Ogni qPCR è stata eseguita in triplicato, ad eccezione dei campioni di controllo.
Poiché le cozze sono note per la loro elevata capacità di filtrazione, abbiamo innanzitutto studiato se fossero in grado di filtrare e trattenere frammenti di DNA presenti nell'acqua di mare. Eravamo anche interessati a verificare se questi frammenti si accumulassero nel loro sistema linfatico semiaperto. Abbiamo risolto questo problema sperimentalmente tracciando il destino dei frammenti di DNA solubili aggiunti alle vasche di cozze. Per facilitare il tracciamento dei frammenti di DNA, abbiamo utilizzato DNA plasmidico estraneo (non autologo) contenente il gene umano della galectina-7. La ddPCR traccia i frammenti di DNA plasmidico nell'acqua di mare e nelle cozze. I nostri risultati mostrano che se la quantità di frammenti di DNA nell'acqua di mare è rimasta relativamente costante nel tempo (fino a 7 giorni) in assenza di cozze, in presenza di cozze questo livello è quasi completamente scomparso entro 8 ore (Fig. 1a, b). Frammenti di DNA esogeno sono stati facilmente rilevati entro 15 minuti nel fluido intravalvolare e nell'emolinfa (Fig. 1c). Questi frammenti potevano ancora essere rilevati fino a 4 ore dopo l'esposizione. Questa attività di filtraggio rispetto ai frammenti di DNA è paragonabile all'attività di filtraggio di batteri e alghe [31]. Questi risultati suggeriscono che le cozze possono filtrare e accumulare DNA estraneo nei loro compartimenti fluidi.
Concentrazioni relative di DNA plasmidico in acqua di mare in presenza (A) o assenza (B) di cozze, misurate mediante ddPCR. In A, i risultati sono espressi in percentuale, con i bordi dei riquadri che rappresentano il 75° e il 25° percentile. La curva logaritmica approssimata è mostrata in rosso e l'area ombreggiata in grigio rappresenta l'intervallo di confidenza al 95%. In B, la linea rossa rappresenta la media e la linea blu rappresenta l'intervallo di confidenza al 95% per la concentrazione. C Accumulo di DNA plasmidico nell'emolinfa e nel fluido valvolare di cozze a diversi tempi dopo l'aggiunta di DNA plasmidico. I risultati sono presentati come copie assolute rilevate/mL (±SE).
Successivamente, abbiamo studiato l'origine del ccfDNA nei mitili raccolti dai banchi di mitili delle Isole Kerguelen, un remoto gruppo di isole con limitata influenza antropica. A tale scopo, il cccDNA dalle emolinfe dei mitili è stato isolato e purificato con metodi comunemente utilizzati per purificare il cccDNA umano [32, 33]. Abbiamo scoperto che le concentrazioni medie di ccfDNA dell'emolinfa nei mitili sono nell'intervallo di bassi microgrammi per ml di emolinfa (vedere Tabella S2, Informazioni supplementari). Questo intervallo di concentrazioni è molto più ampio rispetto alle persone sane (bassi nanogrammi per millilitro), ma in rari casi, nei pazienti oncologici, il livello di ccfDNA può raggiungere diversi microgrammi per millilitro [34, 35]. Un'analisi della distribuzione dimensionale del ccfDNA dell'emolinfa ha mostrato che questi frammenti variano notevolmente in dimensioni, da 1000 bp a 1000 bp fino a 5000 bp (Fig. 2). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando il kit QIAamp Investigator a base di silice, un metodo comunemente utilizzato nella scienza forense per isolare e purificare rapidamente il DNA genomico da campioni di DNA a bassa concentrazione, incluso il ccfDNA [36].
Elettroforegramma rappresentativo del ccfDNA dell'emolinfa di cozze. Estratto con il kit NucleoSnap Plasma (in alto) e il kit QIAamp DNA Investigator. B Grafico a violino che mostra la distribuzione delle concentrazioni di ccfDNA dell'emolinfa (±SE) nelle cozze. Le linee nera e rossa rappresentano rispettivamente la mediana e il primo e il terzo quartile.
Circa l'1% del ccfDNA negli esseri umani e nei primati ha una fonte esterna [21, 37]. Dato il sistema circolatorio semi-aperto dei bivalvi, l'acqua di mare ricca di microbi e la distribuzione dimensionale del ccfDNA di cozze, abbiamo ipotizzato che il ccfDNA dell'emolinfa di cozze possa contenere un pool ricco e diversificato di DNA microbico. Per verificare questa ipotesi, abbiamo sequenziato il ccfDNA dell'emolinfa da campioni di Aulacomya atra raccolti dalle Isole Kerguelen, ottenendo oltre 10 milioni di letture, il 97,6% delle quali ha superato il controllo di qualità. Le letture sono state quindi classificate in base a fonti proprie e non proprie utilizzando i database di bivalvi BLASTN e NCBI (Fig. S1, Informazioni supplementari).
Nell'uomo, sia il DNA nucleare che quello mitocondriale possono essere rilasciati nel flusso sanguigno [38]. Tuttavia, nel presente studio, non è stato possibile descrivere in dettaglio il DNA genomico nucleare dei mitili, dato che il genoma di A. atra non è stato sequenziato o descritto. Tuttavia, siamo stati in grado di identificare numerosi frammenti di ccfDNA di nostra origine utilizzando la libreria dei bivalvi (Fig. S2, Informazioni supplementari). Abbiamo anche confermato la presenza di frammenti di DNA di nostra origine mediante amplificazione PCR diretta dei geni di A. atra che erano stati sequenziati (Fig. 3). Analogamente, dato che il genoma mitocondriale di A. atra è disponibile in database pubblici, si possono trovare prove della presenza di frammenti di ccfDNA mitocondriale nell'emolinfa di A. atra. La presenza di frammenti di DNA mitocondriale è stata confermata mediante amplificazione PCR (Fig. 3).
Vari geni mitocondriali erano presenti nell'emolinfa di A. atra (punti rossi - codice prodotto: SRX5705969) e M. platensis (punti blu - codice prodotto: SRX5705968) amplificata mediante PCR. Figura adattata da Breton et al., 2011 B Amplificazione del surnatante dell'emolinfa di A. atra. Conservato su carta FTA. Utilizzare un perforatore da 3 mm per aggiungere direttamente alla provetta PCR contenente la miscela PCR.
Dato l'abbondante contenuto microbico nell'acqua di mare, inizialmente ci siamo concentrati sulla caratterizzazione delle sequenze di DNA microbico nell'emolinfa. Per fare ciò, utilizziamo due diverse strategie. La prima strategia ha utilizzato Kraken2, un programma di classificazione delle sequenze basato su algoritmi in grado di identificare sequenze microbiche con un'accuratezza paragonabile a BLAST e ad altri strumenti [28]. Più di 6719 letture sono state determinate come di origine batterica, mentre 124 e 64 provenivano rispettivamente da archaea e virus (Fig. 4). I frammenti di DNA batterico più abbondanti erano Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Questa distribuzione è coerente con precedenti studi sul microbioma della cozza blu marina [39, 40]. I Gammaproteobacteria erano la classe principale di Proteobacteria (44%), inclusi molti Vibrionales (Fig. 4b). Il metodo ddPCR ha confermato la presenza di frammenti di DNA di Vibrio nel ccfDNA dell'emolinfa di A. atra (Fig. 4c) [41]. Per ottenere maggiori informazioni sull'origine batterica del ccfDNA, è stato adottato un approccio aggiuntivo (Fig. S2, Informazioni supplementari). In questo caso, le letture sovrapposte sono state assemblate come letture a coppie e sono state classificate come di origine propria (bivalvi) o non propria utilizzando BLASTN e un valore e di 1e−3 e un cutoff con >90% di omologia. In questo caso, le letture sovrapposte sono state assemblate come letture a coppie e sono state classificate come di origine propria (bivalvi) o non propria utilizzando BLASTN e un valore e di 1e−3 e un cutoff con >90% di omologia. In questo caso la protezione professionale è stata eseguita con successo con i farmaci e i classici trattamenti come собственные (diffusione dei molluschi) o il cibo per l'elaborazione con l'uso di BLASTN e la creazione di e 1e-3 e l'estrazione di гомологией> 90%. In questo caso, le letture sovrapposte sono state raccolte come letture a coppie e sono state classificate come native (bivalvi) o non originali utilizzando BLASTN e un valore e di 1e-3 e un cutoff con >90% di omologia.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 In questo caso, la protezione professionale è stata garantita come la protezione con i pacchetti e i classici come собственные (двустворчатые molluschi) o inadeguati durante il processo di utilizzo di BLASTN e 1e-3 e di piccole dimensioni > 90%. In questo caso, le letture sovrapposte sono state raccolte come letture a coppie e classificate come proprie (bivalvi) o non originali utilizzando i valori e BLASTN e 1e-3 e una soglia di omologia >90%.Poiché il genoma di A. atra non è ancora stato sequenziato, abbiamo utilizzato la strategia di assemblaggio de novo dell'assemblatore MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Un totale di 147.188 contig sono stati identificati come dipendenti (bivalvi) dall'origine. Questi contig sono stati poi esplosi con valori e di 1e-10 utilizzando BLASTN e BLASTX. Questa strategia ci ha permesso di identificare 482 frammenti non bivalvi presenti nel ccfDNA di A. atra. Più della metà (57%) di questi frammenti di DNA è stata ottenuta da batteri, principalmente da simbionti branchiali, inclusi i simbionti solfotrofi, e da simbionti branchiali Solemya velum (Fig. 5).
Abbondanza relativa a livello di tipo. B Diversità microbica di due phyla principali (Firmicutes e Proteobacteria). Amplificazione rappresentativa tramite ddPCR. C Vibrio spp. A. Frammenti del gene 16S rRNA (blu) in tre emolinfe atra.
Sono stati analizzati in totale 482 contig raccolti. Profilo generale della distribuzione tassonomica delle annotazioni dei contig metagenomici (procarioti ed eucarioti). B Distribuzione dettagliata dei frammenti di DNA batterico identificati da BLASTN e BLASTX.
L'analisi di Kraken2 ha anche mostrato che il ccfDNA di cozze conteneva frammenti di DNA archeale, inclusi frammenti di DNA di Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). La presenza di frammenti di DNA derivati ​​da Euryarchaeota e Crenarchaeota, precedentemente trovati nella comunità microbica delle cozze californiane, non dovrebbe sorprendere [42]. Sebbene Euryarchaeota sia spesso associato a condizioni estreme, è ormai riconosciuto che sia Euryarchaeota che Crenarcheota sono tra i procarioti più comuni nell'ambiente criogenico marino [43, 44]. La presenza di microrganismi metanogeni nelle cozze non è sorprendente, dati i recenti rapporti di estese perdite di metano dalle perdite sul fondale dell'altopiano di Kerguelen [45] e la possibile produzione microbica di metano osservata al largo delle isole Kerguelen [46].
La nostra attenzione si è poi spostata sulle letture dei virus a DNA. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo studio fuori bersaglio del contenuto virale nei mitili. Come previsto, abbiamo trovato frammenti di DNA di batteriofagi (Caudovirales) (Fig. 6b). Tuttavia, il DNA virale più comune proviene da un phylum di nucleocitovirus, noto anche come virus a DNA nucleare citoplasmatico di grandi dimensioni (NCLDV), che ha il genoma più grande di tutti i virus. All'interno di questo phylum, la maggior parte delle sequenze di DNA appartiene alle famiglie Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), i cui ospiti naturali includono vertebrati e artropodi, mentre una piccola parte di queste sequenze di DNA appartiene ad alghe virologiche note. Infetta alghe eucariotiche marine. Le sequenze sono state ottenute anche dal virus Pandora, il virus gigante con il genoma più grande di tutti i generi virali conosciuti. È interessante notare che la gamma di ospiti noti per essere infetti dal virus, come determinato dal sequenziamento ccfDNA dell'emolinfa, era relativamente ampia (Figura S3, Informazioni supplementari). Include virus che infettano insetti come Baculoviridae e Iridoviridae, così come virus che infettano amebe, alghe e vertebrati. Abbiamo anche trovato sequenze corrispondenti al genoma del Pithovirus sibericum. I pitovirus (noti anche come "virus zombie") sono stati isolati per la prima volta dal permafrost siberiano di 30.000 anni [47]. Pertanto, i nostri risultati sono coerenti con precedenti rapporti che mostrano che non tutte le specie moderne di questi virus sono estinte [48] e che questi virus possono essere presenti in remoti ecosistemi marini subartici.
Infine, abbiamo testato se potessimo trovare frammenti di DNA di altri animali multicellulari. Un totale di 482 contig estranei sono stati identificati da BLASTN e BLASTX con librerie nt, nr e RefSeq (genomiche e proteiche). I nostri risultati mostrano che tra i frammenti estranei di ccfDNA di animali multicellulari predomina il DNA delle ossa (Fig. 5). Sono stati trovati anche frammenti di DNA di insetti e altre specie. Una parte relativamente ampia dei frammenti di DNA non è stata identificata, probabilmente a causa della sottorappresentazione di un gran numero di specie marine nei database genomici rispetto alle specie terrestri [49].
Nel presente articolo, applichiamo il concetto di LB ai mitili, sostenendo che il sequenziamento del ccfDNA shot dell'emolinfa può fornire informazioni sulla composizione degli ecosistemi marini costieri. In particolare, abbiamo scoperto che 1) l'emolinfa dei mitili contiene concentrazioni relativamente elevate (livelli di microgrammi) di frammenti di DNA circolanti relativamente grandi (~1-5 kb); 2) questi frammenti di DNA sono sia indipendenti che non indipendenti; 3) Tra le fonti estranee di questi frammenti di DNA, abbiamo trovato DNA batterico, archeale e virale, così come DNA di altri animali multicellulari; 4) L'accumulo di questi frammenti di ccfDNA estranei nell'emolinfa avviene rapidamente e contribuisce all'attività di filtraggio interno dei mitili. In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB, finora applicato principalmente nel campo della biomedicina, codifica una ricca ma inesplorata fonte di conoscenza che può essere utilizzata per comprendere meglio l'interazione tra le specie sentinella e il loro ambiente.
Oltre ai primati, l'isolamento di ccfDNA è stato segnalato nei mammiferi, inclusi topi, cani, gatti e cavalli [50, 51, 52]. Tuttavia, a nostra conoscenza, il nostro studio è il primo a segnalare il rilevamento e il sequenziamento di ccfDNA in specie marine con un sistema di circolazione aperto. Questa caratteristica anatomica e la capacità di filtraggio delle cozze possono, almeno in parte, spiegare le diverse caratteristiche dimensionali dei frammenti di DNA circolanti rispetto ad altre specie. Negli esseri umani, la maggior parte dei frammenti di DNA circolanti nel sangue sono piccoli frammenti di dimensioni comprese tra 150 e 200 bp, con un picco massimo di 167 bp [34, 53]. Una piccola ma significativa porzione di frammenti di DNA ha dimensioni comprese tra 300 e 500 bp e circa il 5% è più lungo di 900 bp. [54]. La ragione di questa distribuzione dimensionale è che la principale fonte di ccfDNA nel plasma si verifica a seguito di morte cellulare, sia per morte cellulare o per necrosi delle cellule emopoietiche circolanti in individui sani, sia per apoptosi delle cellule tumorali nei pazienti oncologici (noto come DNA tumorale circolante, ctDNA). La distribuzione dimensionale del ccfDNA dell'emolinfa che abbiamo trovato nei mitili variava da 1000 a 5000 bp, suggerendo che il ccfDNA dei mitili abbia un'origine diversa. Questa è un'ipotesi logica, poiché i mitili hanno un sistema vascolare semi-aperto e vivono in ambienti acquatici marini contenenti alte concentrazioni di DNA genomico microbico. Infatti, i nostri esperimenti di laboratorio utilizzando DNA esogeno hanno dimostrato che i mitili accumulano frammenti di DNA nell'acqua di mare, che almeno dopo poche ore vengono degradati dopo l'assorbimento cellulare e/o rilasciati e/o immagazzinati in varie organizzazioni. Data la rarità delle cellule (sia procariotiche che eucariotiche), l'uso di compartimenti intravalvolari ridurrà la quantità di ccfDNA proveniente da fonti proprie e da fonti esogene. Considerando l'importanza dell'immunità innata dei bivalvi e l'elevato numero di fagociti circolanti, abbiamo inoltre ipotizzato che anche il ccfDNA esogeno sia presente in quantità maggiore nei fagociti circolanti che accumulano DNA estraneo in seguito all'ingestione di microrganismi e/o detriti cellulari. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che il ccfDNA dell'emolinfa dei bivalvi è un deposito unico di informazioni molecolari e rafforza il loro status di specie sentinella.
I nostri dati indicano che il sequenziamento e l'analisi di frammenti di ccfDNA di emolinfa derivati ​​da batteri possono fornire informazioni chiave sulla flora batterica dell'ospite e sui batteri presenti nell'ecosistema marino circostante. Le tecniche di sequenziamento a scatti hanno rivelato sequenze del batterio commensale A. atra gill che sarebbero state perse se fossero stati utilizzati i metodi convenzionali di identificazione dell'rRNA 16S, in parte a causa di un bias della libreria di riferimento. Infatti, il nostro utilizzo dei dati LB raccolti da M. platensis nello stesso strato di cozze a Kerguelen ha mostrato che la composizione dei simbionti batterici associati alle branchie era la stessa per entrambe le specie di cozze (Fig. S4, Informazioni supplementari). Questa somiglianza di due cozze geneticamente diverse può riflettere la composizione delle comunità batteriche nei depositi freddi, solforosi e vulcanici di Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Livelli più elevati di microrganismi che riducono lo zolfo sono stati ampiamente descritti durante la raccolta di cozze da aree costiere bioturbate [59], come la costa di Port-au-France. Un'altra possibilità è che la flora commensale delle cozze possa essere influenzata dalla trasmissione orizzontale [60, 61]. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare la correlazione tra l'ambiente marino, la superficie del fondale marino e la composizione dei batteri simbiontici nelle cozze. Questi studi sono attualmente in corso.
La lunghezza e la concentrazione del ccfDNA di emolinfa, la sua facilità di purificazione e l'elevata qualità che consente un rapido sequenziamento shotgun sono alcuni dei numerosi vantaggi dell'utilizzo del ccfDNA di mitili per valutare la biodiversità negli ecosistemi marini costieri. Questo approccio è particolarmente efficace per caratterizzare le comunità virali (viromi) in un dato ecosistema [62, 63]. A differenza di batteri, archaea ed eucarioti, i genomi virali non contengono geni filogeneticamente conservati come le sequenze 16S. I nostri risultati indicano che le biopsie liquide di specie indicatrici come i mitili possono essere utilizzate per identificare un numero relativamente elevato di frammenti di virus ccfDNA noti per infettare ospiti che tipicamente vivono negli ecosistemi marini costieri. Ciò include virus noti per infettare protozoi, artropodi, insetti, piante e virus batterici (ad esempio, batteriofagi). Una distribuzione simile è stata trovata quando abbiamo esaminato il viroma ccfDNA dell'emolinfa di cozze blu (M. platensis) raccolte nello stesso strato di cozze a Kerguelen (Tabella S2, Informazioni supplementari). Il sequenziamento shotgun del ccfDNA è in effetti un nuovo approccio che sta guadagnando slancio nello studio del viroma degli esseri umani o di altre specie [21, 37, 64]. Questo approccio è particolarmente utile per studiare i virus a DNA a doppio filamento, poiché nessun singolo gene è conservato tra tutti i virus a DNA a doppio filamento, che rappresentano la classe di virus più diversificata e ampia a Baltimora [65]. Sebbene la maggior parte di questi virus rimanga non classificata e possa includere virus provenienti da una parte completamente sconosciuta del mondo virale [66], abbiamo scoperto che i viromi e gli intervalli di ospiti delle cozze A. atra e M. platensis rientrano tra le due specie in modo simile (vedi figura S3, informazioni aggiuntive). Questa somiglianza non è sorprendente, poiché potrebbe riflettere una mancanza di selettività nell'assorbimento del DNA presente nell'ambiente. Sono attualmente necessari studi futuri che utilizzino RNA purificato per caratterizzare il viroma a RNA.
Nel nostro studio, abbiamo utilizzato una pipeline molto rigorosa adattata dal lavoro di Kowarski e colleghi [37], che hanno utilizzato un'eliminazione in due fasi di letture raggruppate e contig prima e dopo l'assemblaggio del ccfDNA nativo, con conseguente elevata percentuale di letture non mappate. Pertanto, non possiamo escludere che alcune di queste letture non mappate possano ancora avere una propria origine, principalmente perché non disponiamo di un genoma di riferimento per questa specie di cozza. Abbiamo utilizzato questa pipeline anche perché eravamo preoccupati per le chimere tra letture self e non-self e per le lunghezze delle letture generate da Illumina MiSeq PE75. Un altro motivo per la maggior parte delle letture non mappate è che gran parte dei microbi marini, soprattutto in aree remote come Kerguelen, non sono stati annotati. Abbiamo utilizzato Illumina MiSeq PE75, ipotizzando lunghezze dei frammenti di ccfDNA simili a quelle del ccfDNA umano. Per studi futuri, dati i nostri risultati che mostrano che il ccfDNA dell'emolinfa presenta sequenze più lunghe rispetto a quelle umane e/o dei mammiferi, raccomandiamo di utilizzare una piattaforma di sequenziamento più adatta a frammenti di ccfDNA più lunghi. Questa pratica renderà molto più facile identificare ulteriori indicazioni per analisi più approfondite. Ottenere la sequenza completa del genoma nucleare di A. atra, attualmente non disponibile, faciliterebbe inoltre notevolmente la discriminazione del ccfDNA da fonti proprie e non proprie. Dato che la nostra ricerca si è concentrata sulla possibilità di applicare il concetto di biopsia liquida ai mitili, ci auguriamo che, con l'utilizzo di questo concetto in ricerche future, vengano sviluppati nuovi strumenti e pipeline per aumentare il potenziale di questo metodo nello studio della diversità microbica dei mitili e dell'ecosistema marino.
Come biomarcatore clinico non invasivo, elevati livelli plasmatici di ccfDNA nell'uomo sono associati a varie malattie, danni ai tessuti e condizioni di stress [67,68,69]. Questo aumento è associato al rilascio di frammenti di DNA di origine propria dopo il danno tissutale. Abbiamo affrontato questo problema utilizzando lo stress termico acuto, in cui le cozze sono state brevemente esposte a una temperatura di 30 °C. Abbiamo eseguito questa analisi su tre diversi tipi di cozze in tre esperimenti indipendenti. Tuttavia, non abbiamo riscontrato alcun cambiamento nei livelli di ccfDNA dopo lo stress termico acuto (vedi Figura S5, informazioni aggiuntive). Questa scoperta potrebbe spiegare, almeno in parte, il fatto che le cozze abbiano un sistema circolatorio semi-aperto e accumulino grandi quantità di DNA estraneo a causa della loro elevata attività di filtraggio. D'altra parte, le cozze, come molti invertebrati, potrebbero essere più resistenti al danno tissutale indotto dallo stress, limitando così il rilascio di ccfDNA nella loro emolinfa [70, 71].
Finora, l'analisi del DNA della biodiversità negli ecosistemi acquatici si è concentrata principalmente sul metabarcoding del DNA ambientale (eDNA). Tuttavia, questo metodo è solitamente limitato nell'analisi della biodiversità quando vengono utilizzati i primer. L'uso del sequenziamento shotgun aggira i limiti della PCR e la selezione distorta dei set di primer. Pertanto, in un certo senso, il nostro metodo è più vicino al metodo di sequenziamento shotgun di eDNA ad alto rendimento recentemente utilizzato, che è in grado di sequenziare direttamente il DNA frammentato e analizzare quasi tutti gli organismi [72, 73]. Tuttavia, vi sono una serie di questioni fondamentali che distinguono il LB dai metodi eDNA standard. Naturalmente, la principale differenza tra eDNA e LB è l'uso di ospiti filtranti naturali. È stato riportato l'uso di specie marine come spugne e bivalvi (Dresseina spp.) come filtro naturale per lo studio dell'eDNA [74, 75]. Tuttavia, lo studio di Dreissena ha utilizzato biopsie tissutali da cui è stato estratto il DNA. L'analisi del ccfDNA da LB non richiede biopsia tissutale, attrezzature specializzate e talvolta costose e la logistica associata all'eDNA o alla biopsia tissutale. Infatti, abbiamo recentemente riportato che il ccfDNA da LB può essere conservato e analizzato con supporto FTA senza mantenere una catena del freddo, che rappresenta una sfida importante per la ricerca in aree remote [76]. Anche l'estrazione del ccfDNA da biopsie liquide è semplice e fornisce DNA di alta qualità per il sequenziamento shotgun e l'analisi PCR. Questo rappresenta un grande vantaggio, dati alcuni dei limiti tecnici associati all'analisi dell'eDNA [77]. La semplicità e il basso costo del metodo di campionamento lo rendono particolarmente adatto anche per programmi di monitoraggio a lungo termine. Oltre alla loro elevata capacità di filtraggio, un'altra caratteristica ben nota dei bivalvi è la composizione chimica mucopolisaccaridica del loro muco, che favorisce l'assorbimento dei virus [78, 79]. Ciò rende i bivalvi un filtro naturale ideale per caratterizzare la biodiversità e l'impatto del cambiamento climatico in un dato ecosistema acquatico. Sebbene la presenza di frammenti di DNA derivati ​​dall'ospite possa essere vista come una limitazione del metodo rispetto all'eDNA, il costo associato all'avere un ccfDNA nativo di questo tipo rispetto all'eDNA è allo stesso tempo comprensibile data la grande quantità di informazioni disponibili per gli studi sulla salute. offset dell'ospite. Ciò include la presenza di sequenze virali integrate nel genoma dell'ospite. Ciò è particolarmente importante per i mitili, data la presenza di retrovirus leucemici trasmessi orizzontalmente nei bivalvi [80, 81]. Un altro vantaggio del LB rispetto all'eDNA è che sfrutta l'attività fagocitaria delle cellule del sangue circolanti nell'emolinfa, che fagocita i microrganismi (e i loro genomi). La fagocitosi è la funzione principale delle cellule del sangue nei bivalvi [82]. Infine, il metodo sfrutta l'elevata capacità di filtraggio dei mitili (in media 1,5 l/h di acqua di mare) e la circolazione di due giorni, che aumentano la miscelazione di diversi strati di acqua di mare, consentendo la cattura di eDNA eterologo. [83, 84]. Pertanto, l'analisi del ccfDNA di cozze rappresenta una strada interessante, dati gli impatti nutrizionali, economici e ambientali di queste specie. Analogamente all'analisi del LB raccolto dagli esseri umani, questo metodo apre anche la possibilità di misurare i cambiamenti genetici ed epigenetici nel DNA ospite in risposta a sostanze esogene. Ad esempio, si possono prevedere tecnologie di sequenziamento di terza generazione per eseguire analisi di metilazione genomica nel ccfDNA nativo utilizzando il sequenziamento nanopore. Questo processo dovrebbe essere facilitato dal fatto che la lunghezza dei frammenti di ccfDNA di cozze è idealmente compatibile con piattaforme di sequenziamento a lettura lunga che consentono l'analisi di metilazione del DNA genomica da una singola sessione di sequenziamento senza la necessità di trasformazioni chimiche.85,86] Questa è una possibilità interessante, poiché è stato dimostrato che i modelli di metilazione del DNA riflettono una risposta allo stress ambientale e persistono per molte generazioni. Pertanto, può fornire preziose informazioni sui meccanismi sottostanti che governano la risposta dopo l'esposizione ai cambiamenti climatici o agli inquinanti [87]. Tuttavia, l'uso di LB non è privo di limitazioni. Inutile dire che ciò richiede la presenza di specie indicatrici nell'ecosistema. Come accennato in precedenza, l'utilizzo di LB per valutare la biodiversità di un dato ecosistema richiede anche una rigorosa pipeline bioinformatica che tenga conto della presenza di frammenti di DNA dalla fonte. Un altro problema importante è la disponibilità di genomi di riferimento per le specie marine. Si spera che iniziative come il Marine Mammal Genomes Project e il progetto Fish10k di recente istituzione [88] facilitino tale analisi in futuro. L'applicazione del concetto di LB agli organismi marini filtratori è anche compatibile con i più recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento, rendendolo adatto allo sviluppo di biomarcatori multi-ohm per fornire informazioni importanti sulla salute degli habitat marini in risposta allo stress ambientale.
I dati del sequenziamento del genoma sono stati depositati nell'archivio di lettura delle sequenze NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sotto Bioprojects SRR8924808.
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