نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
الخزعة السائلة (LB) مفهوم يكتسب شعبية متزايدة في المجال الطبي الحيوي. يعتمد هذا المفهوم بشكل أساسي على الكشف عن شظايا الحمض النووي خارج الخلوي المتداول (ccfDNA)، والتي تُطلق في الغالب على شكل شظايا صغيرة بعد موت الخلايا في مختلف الأنسجة. نسبة ضئيلة من هذه الشظايا مصدرها أنسجة أو كائنات غريبة. في هذه الدراسة، طبقنا هذا المفهوم على بلح البحر، وهو نوع مؤشر معروف بقدرته العالية على ترشيح مياه البحر. نستغل قدرة بلح البحر على العمل كمرشحات طبيعية لالتقاط شظايا الحمض النووي البيئي من مصادر متنوعة، وذلك لتوفير معلومات حول التنوع البيولوجي للنظم البيئية البحرية الساحلية. تُظهر نتائجنا أن دم بلح البحر يحتوي على شظايا حمض نووي تتفاوت أحجامها بشكل كبير، من 1 إلى 5 كيلوبايت. أظهر تسلسل الحمض النووي بتقنية "شوتجن" أن عددًا كبيرًا من شظايا الحمض النووي ذات أصل ميكروبي غريب. من بينها، وجدنا شظايا حمض نووي من بكتيريا، وعتائق، وفيروسات، بما في ذلك فيروسات معروفة بإصابتها لمجموعة متنوعة من العوائل الشائعة في النظم البيئية البحرية الساحلية. في الختام، تُظهر دراستنا أن مفهوم LB المطبق على بلح البحر يمثل مصدراً غنياً ولكنه لم يتم استكشافه بعد للمعرفة حول التنوع الميكروبي في النظم البيئية الساحلية البحرية.
يُعدّ تأثير تغير المناخ على التنوع البيولوجي للنظم البيئية البحرية مجالًا بحثيًا متناميًا بسرعة. لا يقتصر تأثير الاحتباس الحراري على التسبب في ضغوط فسيولوجية كبيرة فحسب، بل يدفع أيضًا حدود التطور للاستقرار الحراري للكائنات البحرية، مما يؤثر على موائل العديد من الأنواع، ويحفزها على البحث عن ظروف أكثر ملاءمة [1، 2]. إضافةً إلى تأثيره على التنوع البيولوجي للحيوانات متعددة الخلايا، يُخلّ تغير المناخ بالتوازن الدقيق للتفاعلات بين العائل والميكروبات. يُشكّل هذا الخلل الميكروبي تهديدًا خطيرًا للنظم البيئية البحرية، إذ يجعل الكائنات البحرية أكثر عرضةً لمسببات الأمراض المعدية [3، 4]. يُعتقد أن التسمم بالبكتيريا يلعب دورًا هامًا في حالات النفوق الجماعي، وهو ما يُمثّل مشكلة خطيرة لإدارة النظم البيئية البحرية العالمية [5، 6]. تُعدّ هذه قضية بالغة الأهمية نظرًا للتأثيرات الاقتصادية والبيئية والغذائية على العديد من الأنواع البحرية. وينطبق هذا بشكل خاص على ذوات الصدفتين التي تعيش في المناطق القطبية، حيث تكون آثار تغير المناخ أكثر فوريةً وشدةً [6، 7]. في الواقع، تُعدّ ذوات الصدفتين، مثل بلح البحر (Mytilus spp.)، من بين هذه الأنواع. تُستخدم هذه الطرق على نطاق واسع لرصد تأثيرات تغير المناخ على النظم البيئية البحرية. وليس من المستغرب أن عددًا كبيرًا نسبيًا من المؤشرات الحيوية قد طُوِّر لمراقبة صحة هذه النظم، وغالبًا ما يُستخدم نهج ثنائي المستويات يتضمن مؤشرات حيوية وظيفية تعتمد على النشاط الإنزيمي أو الوظائف الخلوية مثل حيوية الخلايا ونشاط البلعمة [8]. وتشمل هذه الطرق أيضًا قياس تركيز مؤشرات ضغط محددة تتراكم في الأنسجة الرخوة بعد امتصاص كميات كبيرة من مياه البحر. ومع ذلك، فإن قدرة الترشيح العالية والجهاز الدوري شبه المفتوح للمحاريات توفر فرصة لتطوير مؤشرات حيوية جديدة للدم اللمفاوي باستخدام مفهوم الخزعة السائلة، وهو نهج بسيط وغير جراحي لإدارة المرضى، يعتمد على عينات الدم [9، 10]. على الرغم من إمكانية العثور على أنواع عديدة من الجزيئات الدورية في الخزعة السائلة البشرية، إلا أن هذا المفهوم يعتمد بشكل أساسي على تحليل تسلسل الحمض النووي لشظايا الحمض النووي خارج الخلوي المتداول في البلازما. في الواقع، عُرف وجود الحمض النووي المتداول في بلازما الدم البشري منذ منتصف القرن العشرين [11]، ولكن لم يُصبح التشخيص السريري القائم على الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) متاحًا إلا في السنوات الأخيرة مع ظهور تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية. ويعود وجود هذه الشظايا من الحمض النووي المتداول جزئيًا إلى الإطلاق السلبي للحمض النووي الجينومي (النووي والميتوكوندري) بعد موت الخلية. في الأفراد الأصحاء، يكون تركيز الحمض النووي الخالي من الخلايا منخفضًا عادةً (<10 نانوغرام/مل) ولكن يمكن زيادته بمقدار 5-10 أضعاف لدى المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. في الأفراد الأصحاء، يكون تركيز الحمض النووي الخالي من الخلايا منخفضًا عادةً (<10 نانوغرام/مل) ولكن يمكن زيادته بمقدار 5-10 أضعاف لدى المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو يتعرضون للإجهاد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. مع تركيز جيد جدًا من الناس في الحد الأدنى (<10 نانوغرام/مل)، ولكن يمكن زيادة تركيزه في 5-10 مرات في أجسام مختلفة الباثولوجيا أو الإجهاد المعزز، يخفف من التوتر. في الأشخاص الأصحاء، يكون تركيز cccDNA منخفضًا بشكل طبيعي (<10 نانوغرام/مل)، ولكنه يمكن أن يزداد بمقدار 5-10 أضعاف لدى المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو تحت ضغط يؤدي إلى تلف الأنسجة.أفضل ما في الأمر هو أن ccfDNA هو أفضل ما يمكن (<10) نانوغرام / مل)، يجب أن يكون حجم الجزيئات في حدود 5-10 ميكروغرام، وهو ما يعادل 5-10 ميكروغرامات.يمكن أن يكون مخففًا , ccfdna 的 浓度 较 低 (<10 نانوغرام / مل) 但 在 各 种 病理 或 承受 患者 中 可من 5 إلى 10 أيام، قم بذلك.تركيز ccfDNA جيد جدًا (<10 نانوغرام/مل) في الأشخاص الآخرين، ولكن يمكن أن يكون أفضل في 5-10 مرات في المرضى بمختلف أنواعهم الباثولوجيا أو التوتر الذي يؤدي إلى الإرهاق. عادة ما تكون تركيزات الحمض النووي الخالي من الخلايا منخفضة (<10 نانوغرام/مل) لدى الأفراد الأصحاء، ولكن يمكن أن تزداد من 5 إلى 10 أضعاف لدى المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة أو إجهاد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة.يتفاوت حجم شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) بشكل كبير، ولكنه يتراوح عادةً بين 150 و200 زوج قاعدي [12]. يُمكن استخدام تحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا المُستخلص ذاتيًا، أي الحمض النووي الخالي من الخلايا من خلايا مضيفة طبيعية أو مُتحولة، للكشف عن التغيرات الجينية والوراثية اللاجينية الموجودة في الجينوم النووي و/أو الميتوكوندري، مما يُساعد الأطباء على اختيار علاجات جزيئية مُستهدفة مُحددة [13]. مع ذلك، يُمكن الحصول على الحمض النووي الخالي من الخلايا من مصادر خارجية، مثل الحمض النووي الخالي من الخلايا من الخلايا الجنينية أثناء الحمل أو من الأعضاء المزروعة [14، 15، 16، 17]. يُعد الحمض النووي الخالي من الخلايا أيضًا مصدرًا هامًا للمعلومات للكشف عن وجود الأحماض النووية لعامل مُعدٍ (خارجي)، مما يسمح بالكشف غير الجراحي عن العدوى واسعة الانتشار التي لا تُكتشف بواسطة مزارع الدم، وتجنب الخزعة الجراحية للأنسجة المُصابة [18]. أظهرت دراسات حديثة أن دم الإنسان يحتوي على مصدر غني بالمعلومات التي يمكن استخدامها لتحديد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية، وأن حوالي 1% من الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) الموجود في بلازما الدم البشري ذو منشأ خارجي [19]. تُبين هذه الدراسات إمكانية تقييم التنوع البيولوجي للميكروبيوم المنتشر في دم الكائن الحي باستخدام تحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا. مع ذلك، وحتى وقت قريب، كان هذا المفهوم يُستخدم حصريًا في البشر، وبدرجة أقل في الفقاريات الأخرى [20، 21].
في هذه الورقة البحثية، نستخدم جهد LB لتحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) لبلح البحر Aulacomya atra، وهو نوع جنوبي شائع في جزر كيرغولين شبه القطبية الجنوبية، وهي مجموعة جزر تقع فوق هضبة كبيرة تشكلت قبل 35 مليون سنة نتيجة ثوران بركاني. باستخدام نظام تجريبي مخبري، وجدنا أن شظايا الحمض النووي في مياه البحر تُمتص بسرعة بواسطة بلح البحر وتدخل حيز الدم اللمفاوي. أظهر تسلسل الحمض النووي الشامل أن الحمض النووي الخالي من الخلايا في دم بلح البحر يحتوي على شظايا حمض نووي من مصدره الخاص ومصادر أخرى، بما في ذلك البكتيريا التكافلية وشظايا الحمض النووي من بيئات حيوية نموذجية للنظم البيئية البحرية الساحلية البركانية الباردة. يحتوي الحمض النووي الخالي من الخلايا في دم بلح البحر أيضًا على تسلسلات فيروسية مشتقة من فيروسات ذات نطاقات عوائل مختلفة. كما وجدنا شظايا حمض نووي من حيوانات متعددة الخلايا مثل الأسماك العظمية وشقائق النعمان البحرية والطحالب والحشرات. في الختام، تُظهر دراستنا أن مفهوم LB يمكن تطبيقه بنجاح على اللافقاريات البحرية لتوليد مجموعة جينومية غنية في النظم البيئية البحرية.
جُمعت عينات من بلح البحر الأزرق البالغ (بطول 55-70 مم) من نوعي Mytilus platensis (M. platensis) وAulacomya atra (A. atra) من الشواطئ الصخرية المدية لمدينة بورت أو فرانس (049°21.235 جنوبًا، 070°13.490 شرقًا) في جزر كيرغولين في ديسمبر 2018. كما جُمعت عينات أخرى من بلح البحر الأزرق البالغ (Mytilus spp.) من مورد تجاري (PEI Mussel King Inc.، جزيرة الأمير إدوارد، كندا) ووُضعت في حوض مُهوى ومُتحكم بدرجة حرارته (4 درجات مئوية) يحتوي على 10-20 لترًا من محلول ملحي اصطناعي بتركيز 32 جزءًا في الألف (ملح البحر الاصطناعي Reef Crystal، Instant Ocean، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية). وفي كل تجربة، قُيس طول ووزن كل صدفة على حدة.
يتوفر بروتوكول مجاني مفتوح المصدر لهذا البرنامج عبر الإنترنت (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). باختصار، جُمع اللمف الدموي من عضلات الفخذ الخارجية كما هو موضح في المرجع [22]. رُشِّح اللمف الدموي بالطرد المركزي عند 1200×g لمدة 3 دقائق، ثم جُمِّد الراسب (-20 درجة مئوية) لحين استخدامه. لعزل وتنقية الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA)، أُذيبت عينات (1.5-2.0 مل) وعُولجت باستخدام مجموعة NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel، بيت لحم، بنسلفانيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. حُفظ الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) عند -80 درجة مئوية لحين إجراء المزيد من التحليلات. في بعض التجارب، عُزل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) ونُقِّي باستخدام مجموعة QIAamp DNA Investigator (QIAGEN، تورنتو، أونتاريو، كندا). تم قياس كمية الحمض النووي المنقى باستخدام اختبار PicoGreen القياسي. وتم تحليل توزيع شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا المعزول بواسطة الفصل الكهربائي الشعيري باستخدام جهاز Agilent 2100 bioanalyzer (شركة Agilent Technologies Inc.، سانتا كلارا، كاليفورنيا) باستخدام مجموعة أدوات الحمض النووي عالية الحساسية. أُجري الاختبار باستخدام 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الخالي من الخلايا وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
لتحليل تسلسل أجزاء الحمض النووي الخالي من الخلايا في اللمف الدموي، قام مشروع جينوم كيبيك (مونتريال، كيبيك، كندا) بإعداد مكتبات تسلسل عشوائي باستخدام مجموعة Illumina DNA Mix من مجموعة Illumina MiSeq PE75. استُخدم محول قياسي (BioO). تتوفر ملفات البيانات الأولية من أرشيف قراءات التسلسل التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (SRR8924808 وSRR8924809). تم تقييم جودة القراءة الأساسية باستخدام برنامج FastQC [23]. استُخدم برنامج Trimmomatic [24] لقص المحولات والقراءات ذات الجودة الرديئة. تم دمج قراءات التسلسل العشوائي ذات النهايات المزدوجة بتقنية FLASH في قراءات مفردة أطول بحد أدنى للتداخل يبلغ 20 زوجًا قاعديًا لتجنب عدم التطابق [25]. تمت إضافة التعليقات التوضيحية للقراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ثنائية الصدفة (قيمة e < 1e−3 و 90٪ تشابه)، وتم إجراء إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. تمت إضافة التعليقات التوضيحية للقراءات المدمجة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف NCBI ثنائية الصدفة (قيمة e < 1e−3 و 90٪ تشابه)، وتم إجراء إخفاء التسلسلات منخفضة التعقيد باستخدام DUST [26]. تم إعداد التعليقات التوضيحية اللازمة باستخدام BLASTN باستخدام أسس تصنيفات الرخويات الصناعية NCBI (الملاحظة e < 1e-3 و 90% من العمليات)، ولم يتم استخدام أي صعوبة في التنظيف بعد ذلك. استخدام الغبار [26]. تمت إضافة التعليقات التوضيحية للقراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات تصنيف ثنائيات الصدفة NCBI (قيمة e < 1e-3 و 90٪ تشابه)، وتم إجراء إخفاء التسلسل منخفض التعقيد باستخدام DUST [26].NCBI NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性) BLASTN 注释合并的读数، 并使用DUST [26] لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.使用 双 壳类 NCBI 分类 （((<1e-3 و 90% 同源) 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 Dust [26] 进行. 掩蔽 掩蔽تم إعداد التعليقات التوضيحية اللازمة باستخدام BLASTN باستخدام الأساس التصنيفي لهذه الرخويات الصناعية NCBI (الملاحظة e <1e-3 و 90% من العمليات)، ولم يتم استخدام أي تعقيدات إضافية مع NCBI استخدام الغبار [26]. تمت إضافة التعليقات التوضيحية للقراءات المجمعة باستخدام BLASTN باستخدام قاعدة بيانات التصنيف ثنائية الصدفة NCBI (قيمة e <1e-3 و 90٪ تشابه)، وتم إجراء إخفاء التسلسل منخفض التعقيد باستخدام DUST [26].قُسّمت القراءات إلى مجموعتين: قراءات مرتبطة بتسلسلات الرخويات ثنائية الصدفة (تُسمى هنا القراءات الذاتية) وقراءات غير مرتبطة بها (القراءات غير الذاتية). جُمعت المجموعتان بشكل منفصل باستخدام برنامج MEGAHIT لإنشاء قطع متجاورة [27]. في الوقت نفسه، صُنّف التوزيع التصنيفي لقراءات الميكروبيوم الدخيل باستخدام برنامج Kraken2 [28]، وعُرض بيانيًا باستخدام مخطط دائري Krona على منصة Galaxy [29، 30]. وقد حُدّدت قيمة kmers-59 المثلى بناءً على تجاربنا الأولية. ثم تم تحديد القطع المتجاورة الذاتية عن طريق المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه) للحصول على تعليق نهائي. ثم تم تحديد القطع المتجاورة الذاتية عن طريق المحاذاة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه) للحصول على تعليق نهائي. تم تحديد هذه العناصر من خلال توافرها مع BLASTN (على أساس بيانات الرخويات الصناعية NCBI، بادئ ذي بدء <1e-10 و 60%) للتعليقات التوضيحية. ثم تم تحديد التسلسلات الذاتية عن طريق المطابقة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه) للتعليق النهائي.BLASTN (الحصول على NCBI من NCBI، e < 1e-10 و 60٪) (مرحبًا بك) لا تقلق بشأن هذا الأمر.BLASTN (الحصول على NCBI من NCBI، e < 1e-10 و 60٪) تم بعد ذلك تحديد التفاصيل الشخصية للتعليقات التوضيحية النهائية للدعم مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI لـ BLASTN) двустволчатый моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). ثم تم تحديد التسلسلات الذاتية للتعليق النهائي عن طريق المطابقة مع BLASTN (قاعدة بيانات NCBI ثنائية الصدفة، قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه). في الوقت نفسه، تم شرح مجموعات غير الذات باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI، قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه). في الوقت نفسه، تم شرح مجموعات غير الذات باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI، قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه). تم إضافة تعليقات على مجموعات الاتصال المتوازية باستخدام BLASTN (أساس بيانات NCBI، والتمييز e <1e-10 والتصنيف) 60%). في الوقت نفسه، تم شرح أجزاء المجموعة الأجنبية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات NT NCBI، قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه).تم اختباره بواسطة BLASTN (nt NCBI، e <1e-10 و60% من الـ NCBI).تم اختباره بواسطة BLASTN (nt NCBI، e <1e-10 و60% من الـ NCBI). العناصر المتوازية، التي لا ترتبط بالمجموعة الخاصة، والتي تم تعليقاتها باستخدام BLASTN (على أساس بيانات NCBI، بدءًا من <1e-10) والتصنيع 60٪). في الوقت نفسه، تم شرح أجزاء المجموعة غير الذاتية باستخدام BLASTN (قاعدة بيانات nt NCBI، قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه). تم أيضًا إجراء BLASTX على القطع غير الذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه). تم أيضًا إجراء BLASTX على القطع غير الذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e < 1e−10 و 60٪ تشابه). تم اختبار BLASTX أيضًا على مستندات غير متجانسة باستخدام أساس البيانات المرجعية رقم وRefSeq NCBI (الملاحظة e <1e-10 و تجانس 60٪). تم أيضًا إجراء BLASTX على القطع غير الذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e < 1e-10 و 60٪ تشابه).تم التحقق من ذلك من خلال RefSeq وNCBI من خلال اختبار BLASTX (e 1e-10 و60% ).تم التحقق من ذلك من خلال RefSeq وNCBI من خلال اختبار BLASTX (e 1e-10 و60% ). تم أيضًا استخدام BLASTX للمحتوى غير المتوافق مع الاستخدام على أساس البيانات الواردة رقم وRefSeq NCBI (الملاحظة e <1e-10 والتصنيع) 60%). تم أيضًا إجراء BLASTX على القطع غير الذاتية باستخدام قواعد بيانات البروتين nr و RefSeq NCBI (قيمة e <1e-10 و 60٪ تشابه).تمثل مجموعات BLASTN و BLASTX من القطع غير الذاتية القطع النهائية (انظر الملف التكميلي).
تم إدراج البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الجدول S1. استُخدم إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq (شركة Bio Basic Canada، ماركهام، أونتاريو) لتضخيم جينات ccfDNA المستهدفة. وتم تطبيق شروط التفاعل التالية: فصل السلاسل عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم ضبط درجة حرارة التلدين لمدة دقيقة واحدة، ثم استطالة السلسلة عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، وتكرار هذه العملية 35 مرة، وأخيرًا عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. فُصلت نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز (1.5%) المحتوي على صبغة SYBR™ Safe DNA Gel Stain (شركة Invitrogen، برلنغتون، أونتاريو، كندا) عند 95 فولت.
تمت تهيئة بلح البحر (Mytilus spp.) في 500 مل من مياه البحر المؤكسجة (32 وحدة ملوحة عملية) لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 4 مئوية. أُضيف الحمض النووي البلازميدي، الذي يحتوي على قطعة مُدرجة تُشفّر تسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) للجالاكتين-7 البشري (رقم الوصول في NCBI: L07769)، إلى القارورة بتركيز نهائي قدره 190 ميكروغرام/ميكرولتر. استُخدم بلح البحر الذي حُضن في نفس الظروف دون إضافة الحمض النووي كعينة ضابطة. احتوى خزان التحكم الثالث على الحمض النووي فقط دون بلح البحر. لمراقبة جودة الحمض النووي في مياه البحر، أُخذت عينات من مياه البحر (20 ميكرولتر؛ ثلاث تكرارات) من كل خزان في الأوقات المحددة. ولضمان تتبع الحمض النووي البلازميدي، جُمع بلح البحر LB في الأوقات المحددة وحُللت باستخدام تقنيتي qPCR وddPCR. نظرًا لارتفاع نسبة الملوحة في مياه البحر، خُففت العينات في ماء عالي الجودة لتقنية PCR (1:10) قبل إجراء جميع فحوصات PCR.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) باستخدام بروتوكول BioRad QX200 (ميسيسوجا، أونتاريو، كندا). استُخدم مخطط درجة الحرارة لتحديد درجة الحرارة المثلى (الجدول S1). تم توليد القطرات باستخدام مولد قطرات QX200 (BioRad). أُجري تفاعل ddPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم 50 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ودرجة حرارة تلدين محددة لمدة دقيقة واحدة، ثم 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق، ثم 90 درجة مئوية خلال 5 دقائق. تم قياس عدد القطرات والتفاعلات الإيجابية (عدد النسخ/ميكرولتر) باستخدام قارئ قطرات QX200 (BioRad). تم استبعاد العينات التي تحتوي على أقل من 10000 قطرة. لم يتم إجراء فحص النمط في كل مرة يُجرى فيها تفاعل ddPCR.
أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام جهاز Rotor-Gene® 3000 (شركة Corbett Research، سيدني، أستراليا) وبادئات خاصة بجين LGALS7. أُجريت جميع تفاعلات qPCR الكمية في حجم 20 ميكرولتر باستخدام مجموعة QuantiFast SYBR Green PCR Kit (شركة QIAGEN). بدأ تفاعل qPCR بحضانة لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية، تلتها 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ، ثم عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، مع جمع البيانات مرة واحدة. تم إنشاء منحنيات الذوبان باستخدام قياسات متتالية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ، و65 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، و97 درجة مئوية في نهاية تفاعل qPCR. أُجري كل تفاعل qPCR ثلاث مرات، باستثناء عينات التحكم.
نظرًا لأن بلح البحر معروف بقدرته العالية على الترشيح، فقد بحثنا أولًا فيما إذا كان بإمكانه ترشيح واحتجاز شظايا الحمض النووي الموجودة في مياه البحر. كما اهتممنا بمعرفة ما إذا كانت هذه الشظايا تتراكم في جهازه اللمفاوي شبه المفتوح. وقد حللنا هذه المسألة تجريبيًا بتتبع مصير شظايا الحمض النووي الذائبة المضافة إلى أحواض بلح البحر الأزرق. ولتسهيل تتبع شظايا الحمض النووي، استخدمنا بلازميدًا خارجيًا (ليس ذاتيًا) يحتوي على جين الجالاكتين-7 البشري. ويتتبع تفاعل البوليميراز الرقمي الرقمي (ddPCR) شظايا الحمض النووي البلازميدي في مياه البحر وبلح البحر. تُظهر نتائجنا أنه إذا ظلت كمية شظايا الحمض النووي في مياه البحر ثابتة نسبيًا بمرور الوقت (حتى 7 أيام) في غياب بلح البحر، فإن هذا المستوى يختفي تمامًا تقريبًا في وجود بلح البحر خلال 8 ساعات (الشكل 1أ، ب). وقد تم الكشف عن شظايا الحمض النووي الخارجي بسهولة في غضون 15 دقيقة في السائل داخل الصمامات والدم (الشكل 1ج). وظل من الممكن الكشف عن هذه الشظايا حتى 4 ساعات بعد التعرض. تُضاهي هذه العملية الترشيحية لشظايا الحمض النووي نشاط الترشيح لدى البكتيريا والطحالب [31]. تشير هذه النتائج إلى أن بلح البحر قادر على ترشيح الحمض النووي الغريب وتجميعه في سوائله.
التركيزات النسبية للحمض النووي البلازميدي في مياه البحر في وجود (أ) أو غياب (ب) بلح البحر، مقاسة بتقنية ddPCR. في (أ)، تُعرض النتائج كنسب مئوية، حيث تمثل حدود المربعات المئين 75 والمئين 25. يظهر المنحنى اللوغاريتمي المُطابق باللون الأحمر، وتمثل المنطقة المظللة باللون الرمادي فاصل الثقة 95%. في (ب)، يمثل الخط الأحمر المتوسط، ويمثل الخط الأزرق فاصل الثقة 95% للتركيز. (ج) تراكم الحمض النووي البلازميدي في الدم اللمفاوي والسائل الصمامي لبلح البحر في أوقات مختلفة بعد إضافة الحمض النووي البلازميدي. تُعرض النتائج كعدد النسخ المطلقة المكتشفة/مل (± الخطأ المعياري).
بعد ذلك، بحثنا في أصل الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق (cccDNA) في بلح البحر الذي جُمع من مزارع بلح البحر في جزر كيرغولين، وهي مجموعة جزر نائية ذات تأثير بشري محدود. ولتحقيق هذا الغرض، عُزل الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق (cccDNA) من دم بلح البحر ونُقي باستخدام طرق شائعة الاستخدام لتنقية الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق البشري [32، 33]. ووجدنا أن متوسط ​​تركيزات الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق في دم بلح البحر يقع في نطاق الميكروغرامات المنخفضة لكل مل من الدم (انظر الجدول S2، المعلومات التكميلية). هذا النطاق من التركيزات أكبر بكثير مما هو عليه في الأشخاص الأصحاء (نانوغرامات منخفضة لكل مل)، ولكن في حالات نادرة، لدى مرضى السرطان، يمكن أن يصل مستوى الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق إلى عدة ميكروغرامات لكل مل [34، 35]. وأظهر تحليل توزيع حجم الحمض النووي الحلقي التساهمي الدائري المغلق في الدم أن هذه الشظايا تختلف اختلافًا كبيرًا في الحجم، حيث تتراوح من 1000 زوج قاعدي إلى 5000 زوج قاعدي (الشكل 2). تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام مجموعة QIAamp Investigator Kit القائمة على السيليكا، وهي طريقة شائعة الاستخدام في علم الطب الشرعي لعزل وتنقية الحمض النووي الجينومي بسرعة من عينات الحمض النووي منخفضة التركيز، بما في ذلك ccfDNA [36].
صورة تمثيلية للرحلان الكهربائي لـ ccfDNA في دم بلح البحر. تم استخلاصه باستخدام مجموعة NucleoSnap Plasma Kit (أعلى) ومجموعة QIAamp DNA Investigator Kit. يوضح الرسم البياني الكماني توزيع تركيزات ccfDNA في دم بلح البحر (± الخطأ المعياري). يمثل الخط الأسود الوسيط، بينما يمثل الخط الأحمر الربعين الأول والثالث.
يُشكل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في البشر والرئيسيات ما يقارب 1% من مصدر خارجي [21، 37]. ونظرًا للجهاز الدوري شبه المفتوح في ذوات الصدفتين، وغنى مياه البحر بالميكروبات، وتوزيع أحجام الحمض النووي الخالي من الخلايا في بلح البحر، افترضنا أن الحمض النووي الخالي من الخلايا في دم بلح البحر قد يحتوي على مخزون غني ومتنوع من الحمض النووي الميكروبي. ولاختبار هذه الفرضية، قمنا بتسلسل الحمض النووي الخالي من الخلايا في دم عينات من بلح البحر Aulacomya atra التي جُمعت من جزر كيرغولين، ما أسفر عن أكثر من 10 ملايين قراءة، اجتاز 97.6% منها معايير مراقبة الجودة. ثم صُنفت القراءات وفقًا لمصادرها الذاتية وغير الذاتية باستخدام قواعد بيانات BLASTN وNCBI الخاصة بذوات الصدفتين (الشكل S1، المعلومات التكميلية).
في البشر، يمكن إطلاق كل من الحمض النووي النووي والميتوكوندري في مجرى الدم [38]. مع ذلك، لم يتسنَّ في هذه الدراسة وصف الحمض النووي الجينومي النووي لبلح البحر بالتفصيل، نظرًا لعدم تسلسل جينوم A. atra أو وصفه. لكننا تمكنا من تحديد عدد من شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) من أصلنا باستخدام مكتبة ثنائيات الصدفة (الشكل S2، المعلومات التكميلية). كما أكدنا وجود شظايا الحمض النووي من أصلنا عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الموجه لجينات A. atra التي تم تسلسلها (الشكل 3). وبالمثل، نظرًا لتوافر جينوم الميتوكوندريا الخاص بـ A. atra في قواعد البيانات العامة، يمكن العثور على دليل على وجود شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) للميتوكوندريا في دم A. atra. وقد تم تأكيد وجود شظايا الحمض النووي للميتوكوندريا عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الشكل 3).
تم تضخيم جينات الميتوكوندريا المختلفة في دم سمكة A. atra (النقاط الحمراء - رقم المخزون: SRX5705969) وسمكة M. platensis (النقاط الزرقاء - رقم المخزون: SRX5705968) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الشكل مقتبس من بريتون وآخرون، 2011. ب- تضخيم الراشح الدموي لسمكة A. atra المحفوظة على ورق FTA. استخدم مثقبًا بقطر 3 مم لإضافته مباشرةً إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يحتوي على مزيج التفاعل.
نظراً للمحتوى الميكروبي الوفير في مياه البحر، ركزنا في البداية على توصيف تسلسلات الحمض النووي الميكروبي في الدم اللمفاوي. ولتحقيق ذلك، استخدمنا استراتيجيتين مختلفتين. اعتمدت الاستراتيجية الأولى على برنامج Kraken2، وهو برنامج تصنيف تسلسلات قائم على الخوارزميات، قادر على تحديد التسلسلات الميكروبية بدقة تضاهي دقة برنامج BLAST وأدوات أخرى [28]. وقد تبين أن أكثر من 6719 قراءة تعود إلى أصل بكتيري، بينما كانت 124 قراءة من العتائق و64 قراءة من الفيروسات (الشكل 4). وكانت أكثر أجزاء الحمض النووي البكتيري وفرةً هي Firmicutes (46%)، وProteobacteria (27%)، وBacteroidetes (17%) (الشكل 4أ). ويتوافق هذا التوزيع مع الدراسات السابقة للميكروبيوم في بلح البحر الأزرق [39، 40]. وكانت Gammaproteobacteria هي الفئة الرئيسية من Proteobacteria (44%)، بما في ذلك العديد من Vibrionales (الشكل 4ب). أكدت طريقة ddPCR وجود شظايا الحمض النووي لبكتيريا Vibrio في الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في دم A. atra (الشكل 4ج) [41]. وللحصول على مزيد من المعلومات حول الأصل البكتيري للحمض النووي الخالي من الخلايا، تم اتباع نهج إضافي (الشكل S2، المعلومات التكميلية). في هذه الحالة، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات مزدوجة النهاية وتم تصنيفها على أنها من أصل ذاتي (ذوات الصدفتين) أو من أصل غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e تبلغ 1e−3 وعتبة مع تشابه >90٪. في هذه الحالة، تم تجميع القراءات المتداخلة كقراءات مزدوجة النهاية وتم تصنيفها على أنها من أصل ذاتي (ذوات الصدفتين) أو من أصل غير ذاتي باستخدام BLASTN وقيمة e تبلغ 1e−3 وعتبة مع تشابه >90٪. في هذه الحالة، تم تحسين المعلومات كمعلومات عن خلاصات الشراكة وتم تصنيفها كأشياء (الرخويات الصناعية) أو حشوة السمك باستخدام BLASTN و значения e 1e-3 و отсечения с гомологией> 90%. في هذه الحالة، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات مزدوجة النهاية وتم تصنيفها على أنها أصلية (ثنائية الصدفة) أو غير أصلية باستخدام BLASTN وقيمة e تساوي 1e-3 والقطع مع تشابه >90٪.قد يكون من الصعب الحصول على أفضل النتائج، بما في ذلك BLASTN و1e-3 的e و>90% يمكن أن تكون هذه هي المرة الأولى التي يحدث فيها هذا الأمر.يمكن أن تكون هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام هذه التقنية، حيث يتم تشغيلها من قبل شركة Blastn و 1e-3 的 的 值و> 90% من نسبة النجاح في التخفيضات (النسبة المئوية) هي 12. في هذه الحالة، تم تحسين المعرفة كتعلم من خلال ملخصات المحادثات والتصنيفات مثل الأشياء (الرخويات الصناعية) أو غير المرغوب فيها في التكاثر مع استخدام الطعم e BLASTN و 1e-3 والسمك гомологии> 90%. في هذه الحالة، تم جمع القراءات المتداخلة كقراءات مزدوجة الأطراف وتصنيفها على أنها خاصة (ذوات الصدفتين) أو غير أصلية باستخدام قيم e BLASTN و 1e-3 وعتبة التماثل >90٪.نظرًا لعدم تسلسل جينوم A. atra حتى الآن، استخدمنا استراتيجية التجميع من الصفر لبرنامج MEGAHIT لتجميع التسلسل من الجيل التالي (NGS). تم تحديد 147,188 قطعة متجاورة (contigs) ذات أصل تابع (من ذوات الصدفتين). ثم تم تحليل هذه القطع المتجاورة باستخدام قيم e-values ​​تساوي 1e-10 باستخدام BLASTN وBLASTX. سمحت لنا هذه الاستراتيجية بتحديد 482 قطعة غير تابعة لذوات الصدفتين موجودة في الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) لـ A. atra. أكثر من نصف هذه القطع (57%) تم الحصول عليها من البكتيريا، وخاصة من المتعايشات الخيشومية، بما في ذلك المتعايشات الكبريتية، ومن المتعايشات الخيشومية Solemya velum (الشكل 5).
الوفرة النسبية على مستوى النوع. ب. التنوع الميكروبي لشعبتين رئيسيتين (Firmicutes و Proteobacteria). ج. تضخيم نموذجي لتقنية ddPCR. د. أنواع Vibrio. أ. أجزاء من جين 16S rRNA (باللون الأزرق) في ثلاث عينات من دم اللمف من نوع atra.
تم تحليل 482 قطعة متجاورة تم جمعها. ب- لمحة عامة عن التوزيع التصنيفي لبيانات القطع المتجاورة في علم الجينوم البيئي (بدائيات النوى وحقيقيات النوى). ب- التوزيع التفصيلي لقطع الحمض النووي البكتيري التي تم تحديدها بواسطة BLASTN وBLASTX.
أظهر تحليل Kraken2 أيضًا أن الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في بلح البحر يحتوي على شظايا من الحمض النووي للعتائق، بما في ذلك شظايا الحمض النووي لـ Euryarchaeota (65%) و Crenarchaeota (24%) و Thaurmarcheota (11%) (الشكل 6أ). ولا يُعد وجود شظايا الحمض النووي المشتقة من Euryarchaeota و Crenarchaeota، والتي وُجدت سابقًا في المجتمع الميكروبي لبلح البحر في كاليفورنيا، أمرًا مفاجئًا [42]. فعلى الرغم من أن Euryarchaeota غالبًا ما ترتبط بالظروف القاسية، إلا أنه من المعروف الآن أن كلاً من Euryarchaeota و Crenarchaeota من بين أكثر بدائيات النوى شيوعًا في البيئة البحرية شديدة البرودة [43، 44]. كما أن وجود الكائنات الحية الدقيقة المنتجة للميثان في بلح البحر ليس بالأمر المستغرب، نظرًا للتقارير الحديثة عن تسربات واسعة النطاق للميثان من قاع هضبة كيرغولين [45]، واحتمالية إنتاج الميثان الميكروبي التي لوحظت قبالة سواحل جزر كيرغولين [46].
ثم تحول اهتمامنا إلى قراءات من فيروسات الحمض النووي. وحسب علمنا، تُعد هذه الدراسة الأولى من نوعها التي تتناول محتوى الفيروسات في بلح البحر خارج نطاق الهدف. وكما هو متوقع، وجدنا شظايا من الحمض النووي لبكتيريا العاثيات (Caudovirales) (الشكل 6ب). مع ذلك، فإن الحمض النووي الفيروسي الأكثر شيوعًا يأتي من شعبة الفيروسات النووية السيتوبلازمية، والمعروفة أيضًا باسم فيروس الحمض النووي النووي السيتوبلازمي الكبير (NCLDV)، والذي يمتلك أكبر جينوم بين جميع الفيروسات. ضمن هذه الشعبة، تنتمي معظم تسلسلات الحمض النووي إلى عائلتي Mimimidoviridae (58%) وPoxviridae (21%)، واللتان تشمل عوائلهما الطبيعية الفقاريات والمفصليات، بينما تنتمي نسبة صغيرة من هذه التسلسلات إلى طحالب معروفة بتأثيرها الفيروسي. يصيب هذا الفيروس الطحالب حقيقية النواة البحرية. كما تم الحصول على التسلسلات من فيروس باندورا، وهو الفيروس العملاق ذو أكبر حجم جينوم بين جميع الأجناس الفيروسية المعروفة. ومن المثير للاهتمام أن نطاق العوائل المعروفة بإصابتها بالفيروس، كما تم تحديده بواسطة تسلسل الحمض النووي الخلوي الحر في الدم، كان واسعًا نسبيًا (الشكل S3، المعلومات التكميلية). ويشمل هذا النطاق فيروسات تصيب الحشرات مثل فيروسات باكولوفيريداي وإيريدوفيريداي، بالإضافة إلى فيروسات تصيب الأميبا والطحالب والفقاريات. كما وجدنا تسلسلات مطابقة لجينوم فيروس بيثوفيروس سيبيريكوم. عُزلت فيروسات بيثوفيروس (المعروفة أيضًا باسم "فيروسات الزومبي") لأول مرة من التربة الصقيعية الدائمة التي يعود عمرها إلى 30,000 عام في سيبيريا [47]. وبالتالي، تتوافق نتائجنا مع التقارير السابقة التي تُشير إلى أن بعض الأنواع الحديثة من هذه الفيروسات لم تنقرض [48]، وأن هذه الفيروسات قد تكون موجودة في النظم البيئية البحرية شبه القطبية النائية.
أخيرًا، اختبرنا إمكانية العثور على شظايا الحمض النووي من حيوانات متعددة الخلايا أخرى. تم تحديد 482 قطعة متجاورة غريبة باستخدام برنامجي BLASTN وBLASTX مع مكتبات nt وnr وRefSeq (الجينومية والبروتينية). تُظهر نتائجنا أن الحمض النووي للعظام هو السائد بين شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا للحيوانات متعددة الخلايا (الشكل 5). كما تم العثور على شظايا حمض نووي من الحشرات وأنواع أخرى. لم يتم تحديد جزء كبير نسبيًا من شظايا الحمض النووي، ربما بسبب نقص تمثيل عدد كبير من الأنواع البحرية في قواعد البيانات الجينومية مقارنةً بالأنواع البرية [49].
في هذه الورقة البحثية، نُطبّق مفهوم LB على بلح البحر، مُشيرين إلى أن تسلسل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في دم بلح البحر يُمكن أن يُقدّم رؤى ثاقبة حول تكوين النظم البيئية الساحلية البحرية. وقد وجدنا على وجه الخصوص ما يلي: 1) يحتوي دم بلح البحر على تراكيز عالية نسبيًا (بمستويات الميكروغرام) من شظايا الحمض النووي الدائرية الكبيرة نسبيًا (1-5 كيلوبايت)؛ 2) هذه الشظايا من الحمض النووي مستقلة وغير مستقلة؛ 3) من بين المصادر الخارجية لهذه الشظايا، وجدنا حمضًا نوويًا بكتيريًا، وأثريًا، وفيروسيًا، بالإضافة إلى حمض نووي لحيوانات متعددة الخلايا أخرى؛ 4) يتراكم هذا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) الخارجي في دم بلح البحر بسرعة، ويُساهم في عملية الترشيح الداخلي لبلح البحر. وختامًا، تُبيّن دراستنا أن مفهوم LB، الذي طُبّق حتى الآن بشكل رئيسي في مجال الطب الحيوي، يُمثّل مصدرًا غنيًا وغير مُستكشف للمعرفة، يُمكن استخدامه لفهم أفضل للتفاعل بين الأنواع المُؤشّرة وبيئتها.
بالإضافة إلى الرئيسيات، تم الإبلاغ عن عزل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في الثدييات، بما في ذلك الفئران والكلاب والقطط والخيول [50، 51، 52]. ومع ذلك، حسب علمنا، تُعد دراستنا الأولى التي تُبلغ عن الكشف عن الحمض النووي الخالي من الخلايا وتسلسله في الكائنات البحرية ذات الجهاز الدوري المفتوح. قد تُفسر هذه السمة التشريحية وقدرة بلح البحر على الترشيح، جزئيًا على الأقل، اختلاف خصائص حجم شظايا الحمض النووي المتداولة مقارنةً بالأنواع الأخرى. في البشر، تكون معظم شظايا الحمض النووي المتداولة في الدم صغيرة الحجم، ويتراوح طولها بين 150 و200 زوج قاعدي، مع ذروة قصوى تبلغ 167 زوجًا قاعديًا [34، 53]. يوجد جزء صغير ولكنه مهم من شظايا الحمض النووي يتراوح حجمه بين 300 و500 زوج قاعدي، ونحو 5% منها يزيد طولها عن 900 زوج قاعدي [54]. يعود سبب هذا التوزيع الحجمي إلى أن المصدر الرئيسي للحمض النووي الخلوي الحر (ccfDNA) في البلازما ينتج عن موت الخلايا، إما بسبب موت الخلايا أو بسبب نخر الخلايا المكونة للدم المنتشرة في الدم لدى الأفراد الأصحاء، أو بسبب موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية لدى مرضى السرطان (المعروف باسم الحمض النووي الورمي المنتشر). تراوح التوزيع الحجمي للحمض النووي الخلوي الحر في دم بلح البحر الذي وجدناه بين 1000 و5000 زوج قاعدي، مما يشير إلى أن الحمض النووي الخلوي الحر في بلح البحر له أصل مختلف. هذه فرضية منطقية، نظرًا لأن بلح البحر يمتلك جهازًا وعائيًا شبه مفتوح ويعيش في بيئات مائية بحرية تحتوي على تركيزات عالية من الحمض النووي الجينومي الميكروبي. في الواقع، أظهرت تجاربنا المخبرية باستخدام الحمض النووي الخارجي أن بلح البحر يُراكم شظايا الحمض النووي في مياه البحر، وبعد بضع ساعات على الأقل، تتحلل هذه الشظايا بعد امتصاصها من قبل الخلايا و/أو إطلاقها و/أو تخزينها في مختلف الأنسجة. نظراً لندرة الخلايا (بدائية النواة وحقيقية النواة على حد سواء)، فإن استخدام الحجيرات داخل الصمام سيقلل من كمية الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) من المصادر الذاتية والغريبة على حد سواء. ونظراً لأهمية المناعة الفطرية لدى ذوات الصدفتين وكثرة الخلايا البلعمية المنتشرة في الدم، افترضنا أيضاً أن الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) الغريب يتراكم في الخلايا البلعمية المنتشرة التي تُراكم الحمض النووي الغريب عند ابتلاعها للكائنات الدقيقة و/أو الحطام الخلوي. وبناءً على ذلك، تُظهر نتائجنا أن الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في دم ذوات الصدفتين يُعدّ مستودعاً فريداً للمعلومات الجزيئية، مما يُعزز مكانتها كنوعٍ مراقب.
تشير بياناتنا إلى أن تسلسل وتحليل أجزاء الحمض النووي الخلوي الحر (ccfDNA) المستخلص من دم اللمف البكتيري يمكن أن يوفر معلومات أساسية حول البكتيريا المضيفة والبكتيريا الموجودة في النظام البيئي البحري المحيط. وقد كشفت تقنيات التسلسل السريع عن تسلسلات بكتيريا A. atra gill المتعايشة، والتي كان من الممكن تفويتها لو تم استخدام طرق تحديد الحمض النووي الريبوزي 16S التقليدية، ويعود ذلك جزئيًا إلى تحيز المكتبة المرجعية. في الواقع، أظهر استخدامنا لبيانات LB التي تم جمعها من M. platensis في نفس طبقة بلح البحر في كيرغولين أن تركيبة البكتيريا التكافلية المرتبطة بالخياشيم كانت متطابقة لكلا نوعي بلح البحر (الشكل S4، المعلومات التكميلية). قد يعكس هذا التشابه بين نوعي بلح البحر المختلفين جينيًا تركيبة المجتمعات البكتيرية في الرواسب الباردة والكبريتية والبركانية في كيرغولين [55، 56، 57، 58]. وُصفت مستويات أعلى من الكائنات الدقيقة المختزلة للكبريت عند حصاد بلح البحر من المناطق الساحلية المتأثرة بالنشاط الحيوي [59]، مثل ساحل بورت أو فرانس. وثمة احتمال آخر يتمثل في تأثر البكتيريا المتعايشة في بلح البحر بالانتقال الأفقي [60، 61]. ولا تزال هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد العلاقة بين البيئة البحرية وسطح قاع البحر وتكوين البكتيريا التكافلية في بلح البحر. وتجري هذه الدراسات حاليًا.
يُعد طول وتركيز الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في دم بلح البحر، وسهولة تنقيته، وجودته العالية التي تسمح بالتسلسل السريع بتقنية التسلسل العشوائي، من بين المزايا العديدة لاستخدام الحمض النووي الخالي من الخلايا في بلح البحر لتقييم التنوع البيولوجي في النظم البيئية البحرية الساحلية. ويُعدّ هذا النهج فعالاً بشكل خاص في توصيف المجتمعات الفيروسية (الفيروسات) في نظام بيئي معين [62، 63]. وعلى عكس البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى، لا تحتوي الجينومات الفيروسية على جينات محفوظة تطوريًا مثل تسلسلات 16S. وتشير نتائجنا إلى إمكانية استخدام الخزعات السائلة من الأنواع المؤشرة، مثل بلح البحر، لتحديد أعداد كبيرة نسبيًا من شظايا فيروسات الحمض النووي الخالي من الخلايا المعروفة بإصابتها للعوائل التي تسكن عادةً النظم البيئية البحرية الساحلية. ويشمل ذلك الفيروسات المعروفة بإصابتها للأوليات، والمفصليات، والحشرات، والنباتات، والفيروسات البكتيرية (مثل العاثيات). وُجد توزيع مماثل عند فحصنا للفيروسات الموجودة في دم بلح البحر الأزرق (M. platensis) الذي جُمع من نفس طبقة بلح البحر في كيرغولين (الجدول S2، المعلومات التكميلية). يُعدّ تسلسل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) بتقنية التسلسل العشوائي نهجًا جديدًا يكتسب زخمًا في دراسة فيروسات الإنسان أو الأنواع الأخرى [21، 37، 64]. يُعدّ هذا النهج مفيدًا بشكل خاص لدراسة فيروسات الحمض النووي ثنائي السلسلة، نظرًا لعدم وجود جين واحد محفوظ بين جميع فيروسات الحمض النووي ثنائي السلسلة، والتي تُمثّل الفئة الأكثر تنوعًا واتساعًا من الفيروسات في بالتيمور [65]. على الرغم من أن معظم هذه الفيروسات لا تزال غير مصنفة، وقد تشمل فيروسات من جزء غير معروف تمامًا من عالم الفيروسات [66]، فقد وجدنا أن نطاقات الفيروسات والمضيف لبلح البحر A. atra وM. platensis تقع بين النوعين بشكل مماثل (انظر الشكل S3، معلومات إضافية). هذا التشابه ليس مفاجئًا، إذ قد يعكس نقصًا في الانتقائية في امتصاص الحمض النووي الموجود في البيئة. هناك حاجة حاليًا إلى دراسات مستقبلية تستخدم الحمض النووي الريبي النقي لتوصيف الفيروسات الريبية.
في دراستنا، استخدمنا منهجية دقيقة للغاية مُقتبسة من عمل كوارسكي وزملائه [37]، الذين اعتمدوا حذفًا ثنائي المراحل للقراءات والقطع المتجاورة المجمعة قبل وبعد تجميع الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) الأصلي، مما أدى إلى نسبة عالية من القراءات غير المُرتبطة. لذلك، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يكون لبعض هذه القراءات غير المُرتبطة أصلها الخاص، ويرجع ذلك أساسًا إلى عدم امتلاكنا جينومًا مرجعيًا لهذا النوع من بلح البحر. كما استخدمنا هذه المنهجية نظرًا لقلقنا بشأن التداخلات بين القراءات الذاتية وغير الذاتية، وأطوال القراءات الناتجة عن جهاز Illumina MiSeq PE75. سبب آخر لغالبية القراءات غير المُحددة هو أن العديد من الميكروبات البحرية، وخاصة في المناطق النائية مثل جزر كيرغولين، لم تُصنّف بعد. استخدمنا جهاز Illumina MiSeq PE75، بافتراض أطوال قطع الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) مماثلة للحمض النووي الخالي من الخلايا البشري. في الدراسات المستقبلية، ونظرًا لنتائجنا التي تُظهر أن الحمض النووي الخالي من الخلايا في الدم (ccfDNA) يحتوي على قراءات أطول من تلك الموجودة لدى البشر و/أو الثدييات، نوصي باستخدام منصة تسلسل أكثر ملاءمة لقطع الحمض النووي الخالي من الخلايا الأطول. ستُسهّل هذه الممارسة تحديد المزيد من المؤشرات لإجراء تحليل أعمق. كما أن الحصول على التسلسل الكامل لجينوم A. atra النووي، غير المتوفر حاليًا، سيُسهّل بشكل كبير التمييز بين الحمض النووي الخالي من الخلايا من مصادر ذاتية وغير ذاتية. وبما أن بحثنا قد ركّز على إمكانية تطبيق مفهوم الخزعة السائلة على بلح البحر، فإننا نأمل أنه مع استخدام هذا المفهوم في الأبحاث المستقبلية، سيتم تطوير أدوات ومنهجيات جديدة لزيادة إمكانات هذه الطريقة في دراسة التنوع الميكروبي في بلح البحر والنظام البيئي البحري.
باعتبارها مؤشرًا حيويًا سريريًا غير جراحي، ترتبط المستويات المرتفعة من الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في بلازما الدم البشري بأمراض متنوعة، وتلف الأنسجة، وحالات الإجهاد [67، 68، 69]. ويرتبط هذا الارتفاع بإطلاق شظايا الحمض النووي من منشأه الخاص بعد تلف الأنسجة. تناولنا هذه المسألة باستخدام الإجهاد الحراري الحاد، حيث عُرِّضت بلح البحر لفترة وجيزة لدرجة حرارة 30 درجة مئوية. أجرينا هذا التحليل على ثلاثة أنواع مختلفة من بلح البحر في ثلاث تجارب مستقلة. ومع ذلك، لم نجد أي تغيير في مستويات الحمض النووي الخالي من الخلايا بعد الإجهاد الحراري الحاد (انظر الشكل S5، معلومات إضافية). قد يفسر هذا الاكتشاف، جزئيًا على الأقل، حقيقة أن بلح البحر يمتلك جهازًا دوريًا شبه مفتوح ويتراكم لديه كميات كبيرة من الحمض النووي الغريب نظرًا لنشاطه العالي في الترشيح. من ناحية أخرى، قد يكون بلح البحر، مثل العديد من اللافقاريات، أكثر مقاومة لتلف الأنسجة الناتج عن الإجهاد، مما يحد من إطلاق الحمض النووي الخالي من الخلايا في دمه [70، 71].
حتى الآن، ركز تحليل الحمض النووي للتنوع البيولوجي في النظم البيئية المائية بشكل أساسي على الترميز الجيني البيئي (eDNA). مع ذلك، عادةً ما تكون هذه الطريقة محدودة في تحليل التنوع البيولوجي عند استخدام البادئات. يتجاوز استخدام تسلسل الجينوم الكامل (Shotgun sequencing) قيود تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والاختيار المتحيز لمجموعات البادئات. وبالتالي، فإن طريقتنا أقرب، من ناحية ما، إلى طريقة تسلسل الجينوم الكامل عالي الإنتاجية المستخدمة مؤخرًا، والتي تُمكّن من تسلسل الحمض النووي المجزأ مباشرةً وتحليل جميع الكائنات الحية تقريبًا [72، 73]. مع ذلك، هناك عدد من القضايا الأساسية التي تميز طريقة تسلسل الجينوم الكامل (LB) عن طرق الحمض النووي البيئي القياسية. بالطبع، يكمن الاختلاف الرئيسي بين الحمض النووي البيئي وطريقة تسلسل الجينوم الكامل في استخدام مضيفات ترشيح طبيعية. وقد تم الإبلاغ عن استخدام أنواع بحرية مثل الإسفنجيات وذوات الصدفتين (Dresseina spp.) كمرشح طبيعي لدراسة الحمض النووي البيئي [74، 75]. مع ذلك، استخدمت دراسة Dreissena خزعات الأنسجة التي تم استخلاص الحمض النووي منها. لا يتطلب تحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) من الخزعات السائلة أخذ خزعة نسيجية، أو معدات متخصصة باهظة الثمن، أو الخدمات اللوجستية المرتبطة بتحليل الحمض النووي البيئي (eDNA) أو الخزعات النسيجية. في الواقع، أفدنا مؤخرًا بإمكانية تخزين وتحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا من الخزعات السائلة باستخدام تقنية FTA دون الحاجة إلى سلسلة تبريد، وهو ما يمثل تحديًا كبيرًا للبحوث في المناطق النائية [76]. كما أن استخلاص الحمض النووي الخالي من الخلايا من الخزعات السائلة بسيط، ويوفر حمضًا نوويًا عالي الجودة لتسلسل الحمض النووي بتقنية Shotgun وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تُعد هذه ميزة كبيرة نظرًا لبعض القيود التقنية المرتبطة بتحليل الحمض النووي البيئي [77]. كما أن بساطة طريقة أخذ العينات وانخفاض تكلفتها تجعلها مناسبة بشكل خاص لبرامج الرصد طويلة الأجل. إضافةً إلى قدرتها العالية على الترشيح، تتميز الرخويات ثنائية الصدفة بتركيبها الكيميائي من عديدات السكاريد المخاطية في مخاطها، مما يعزز امتصاص الفيروسات [78، 79]. وهذا ما يجعل الرخويات ثنائية الصدفة مرشحًا طبيعيًا مثاليًا لتوصيف التنوع البيولوجي وتأثير تغير المناخ في أي نظام بيئي مائي. على الرغم من أن وجود شظايا الحمض النووي المشتقة من العائل يُعدّ قيدًا على هذه الطريقة مقارنةً بالحمض النووي البيئي (eDNA)، إلا أن التكلفة المرتبطة بالحصول على هذا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) مقارنةً بالحمض النووي البيئي (eDNA) مفهومةٌ في الوقت نفسه نظرًا لكمية المعلومات الهائلة المتاحة للدراسات الصحية. يشمل ذلك وجود تسلسلات فيروسية مُدمجة في جينوم العائل. يُعدّ هذا الأمر بالغ الأهمية بالنسبة لبلح البحر، نظرًا لوجود فيروسات قهرية ليمفاوية تنتقل أفقيًا في ذوات الصدفتين [80، 81]. ومن المزايا الأخرى لتقنية LB على الحمض النووي البيئي (eDNA) أنها تستغل النشاط البلعومي لخلايا الدم المنتشرة في اللمف الدموي، والتي تبتلع الكائنات الدقيقة (وجينوماتها). البلعمة هي الوظيفة الرئيسية لخلايا الدم في ذوات الصدفتين [82]. أخيرًا، تستفيد هذه الطريقة من قدرة بلح البحر العالية على الترشيح (بمعدل 1.5 لتر/ساعة من مياه البحر) ودوران المياه على مدار يومين، مما يزيد من اختلاط طبقات مياه البحر المختلفة، ويسمح بالتقاط الحمض النووي البيئي غير المتجانس. [83، 84]. لذا، يُعد تحليل الحمض النووي الخالي من الخلايا في بلح البحر مجالًا واعدًا نظرًا لتأثيراته الغذائية والاقتصادية والبيئية. وعلى غرار تحليل الحمض النووي المأخوذ من البشر، تتيح هذه الطريقة أيضًا إمكانية قياس التغيرات الجينية والوراثية اللاجينية في الحمض النووي للمضيف استجابةً للمواد الخارجية. فعلى سبيل المثال، يمكن استخدام تقنيات التسلسل من الجيل الثالث لإجراء تحليل مثيلة على مستوى الجينوم في الحمض النووي الخالي من الخلايا الأصلي باستخدام تقنية تسلسل النانوبور. يُفترض أن تُسهّل هذه العملية حقيقة أن طول شظايا الحمض النووي الخالي من الخلايا (ccfDNA) في بلح البحر يتوافق بشكل مثالي مع منصات التسلسل طويلة القراءة، مما يسمح بتحليل مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم من خلال عملية تسلسل واحدة دون الحاجة إلى تحويلات كيميائية. [85، 86] يُعدّ هذا احتمالًا مثيرًا للاهتمام، إذ ثبت أن أنماط مثيلة الحمض النووي تعكس استجابةً للضغوط البيئية وتستمر عبر أجيال عديدة. لذلك، يمكن أن يُقدّم هذا رؤى قيّمة حول الآليات الكامنة وراء الاستجابة بعد التعرّض لتغير المناخ أو الملوثات [87]. مع ذلك، فإن استخدام تقنية LB ليس خاليًا من القيود. من البديهي أن هذا يتطلب وجود أنواع مؤشرة في النظام البيئي. كما ذُكر سابقًا، يتطلب استخدام تقنية LB لتقييم التنوع البيولوجي لنظام بيئي مُعيّن أيضًا مسارًا دقيقًا للمعلوماتية الحيوية يأخذ في الاعتبار وجود شظايا الحمض النووي من المصدر. تتمثل مشكلة رئيسية أخرى في توافر الجينومات المرجعية للأنواع البحرية. يُؤمل أن تُسهّل مبادرات مثل مشروع جينوم الثدييات البحرية ومشروع Fish10k الذي أُنشئ مؤخرًا [88] إجراء مثل هذا التحليل في المستقبل. كما أن تطبيق مفهوم LB على الكائنات البحرية المُتغذية بالترشيح يتوافق مع أحدث التطورات في تقنية التسلسل، مما يجعله مناسبًا تمامًا لتطوير المؤشرات الحيوية متعددة الأوم لتوفير معلومات مهمة حول صحة الموائل البحرية في مواجهة الضغوط البيئية.
تم إيداع بيانات تسلسل الجينوم في أرشيف قراءة التسلسل التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 تحت مشروع Bioprojects SRR8924808.
بريرلي إيه إس، كينغسفورد إم جيه. تأثير تغير المناخ على الحياة البحرية والنظم البيئية. مجلة كول بيولوجي. 2009؛ 19: ص602-ص614.
جيسي إي، مانيا إي، مازاريس إيه دي، فراشيتي إس، ألمبانيدو في، بيفيلكوا إس، وآخرون. دراسة التأثيرات المشتركة لتغير المناخ والضغوط المحلية الأخرى على البيئة البحرية. البيئة العلمية العامة. 2021؛755:142564.
كاريلا إف، أنتوفيرمو إي، فارينا إس، سالاتي إف، مانداس د، برادو بي، وآخرون. ). علوم الأول من مارس. 2020;7:48.
سيرونت إل، نيكاسترو سي آر، زاردي جي آي، غوبرفيل إي. انخفاض تحمل الحرارة في ظل ظروف الإجهاد الحراري المتكرر يفسر ارتفاع معدل نفوق بلح البحر الأزرق في فصل الصيف. تقرير علمي 2019؛ 9:17498.
فاي إس بي، سيبيلسكي إيه إم، نوسل إس، سيرفانتس-يوشيدا كيه، هوان جيه إل، هوبر إي آر، وآخرون. التغيرات الحديثة في معدل وأسباب ومدى نفوق الحيوانات. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية. 2015؛112:1083-8.
سكاربا إف، سانا د، أزينا الأول، موغيتي د، شيروتي إف، حسيني إس، وآخرون. ربما تسببت مسببات الأمراض المتعددة غير الخاصة بالأنواع في حدوث وفيات جماعية لطيور Pinna nobilis. حياة. 2020;10:238.
برادلي إم، كوتس إس جيه، جينكينز إي، أوهارا تي إم. التأثير المحتمل لتغير المناخ على الأمراض الحيوانية المنشأ في القطب الشمالي. المجلة الدولية لصحة المناطق القطبية. 2005؛ 64: 468-77.
باير جيه، غرين إن دبليو، بروكس إس، آلان آي جيه، روس إيه، غوميز تي وآخرون. بلح البحر الأزرق (Mytilus edulis spp.) ككائنات مؤشرة في رصد التلوث الساحلي: مراجعة. مجلة أبحاث البيئة البحرية 2017؛ 130: 338-65.
سيرافينيا جي، مارسوني إس، سيينا إس، بارديلي إيه. دمج الخزعة السائلة في علاج السرطان. نات ريف كلين أونكول. 2017؛ 14:531-48.
وان جيه سي إم، ماسي سي، غارسيا-كورباتشو جيه، موليير إف، برينتون جيه دي، كالداس سي، وآخرون. نضج الخزعة السائلة: يسمح للحمض النووي للورم بالانتشار. نات ريف كانسر. 2017؛17:223-38.
ماندل ب.، ميتايس ب. الأحماض النووية في بلازما الدم البشري. محاضر اجتماعات الفروع التابعة لجمعية البيولوجيا. 1948؛ 142:241-3.
برونكهورست إيه جيه، أونغيرر دبليو، هولدنريدر إس. دور جديد للحمض النووي الخالي من الخلايا كعلامة جزيئية لعلاج السرطان. قياس التحليل البيومولاري. 2019؛17:100087.
إغناتياديس م.، سليدج ج.و.، جيفري س.س. الخزعة السائلة تدخل العيادة - قضايا التنفيذ والتحديات المستقبلية. نات ريف كلين أونكول. 2021؛ 18:297-312.
لو واي إم، كوربيتا إن، تشامبرلين بي إف، راي دبليو، سارجنت آي إل، ريدمان سي دبليو وآخرون. الحمض النووي الجنيني موجود في بلازما ومصل الأم. لانسيت. 1997؛ 350: 485-7.
موفاراي إم إن، وونغ آر جيه، شو جي إم، ستيفنسون دي كيه، كويك إس آر. دراسة مسار الحمل ومضاعفاته باستخدام الحمض النووي الريبي خارج الخلية في دم النساء أثناء الحمل. طب الأطفال. 2020؛8:605219.
أوليريش إم، شيروود كيه، كيون بي، شوتز إي، بيك جيه، ستيجباور جيه، وآخرون. الخزعة السائلة: استخدام الحمض النووي الخالي من الخلايا من المتبرع للكشف عن الآفات المتباينة في طعم الكلى. نات ريف نيفرول. 2021؛ 17: 591-603.
خوان إف سي، لو واي إم. ابتكارات في التشخيص قبل الولادة: تسلسل جينوم بلازما الأم. آنا إم دي. 2016؛67:419-32.
غو و، دينغ إكس، لي إم، سوتشو واي دي، أريفالو إس، سترايك دي، وآخرون. الكشف السريع عن مسببات الأمراض باستخدام التسلسل الميتاجينومي من الجيل التالي لسوائل الجسم المصابة. نات ميديسين. 2021؛27:115-24.