Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, déanfaimid an suíomh a rindreáil gan stíleanna ná JavaScript.
Is coincheap atá ag éirí níos coitianta sa réimse bithleighis é bithóipse leachtach (LB). Tá an coincheap bunaithe go príomha ar bhrath blúirí de DNA eachtarcheallach imshruthaithe (ccfDNA), a scaoiltear den chuid is mó mar bhlúirí beaga tar éis bhás cille i bhfíocháin éagsúla. Tagann cuid bheag de na blúirí seo ó fhíocháin nó ó orgánaigh choigríche. Inár gcuid oibre reatha, chuireamar an coincheap seo i bhfeidhm ar dhiúilicíní, speiceas fairtheora ar a dtugtar a gcumas ard scagacháin uisce farraige. Bainimid úsáid as cumas na ndiúilicíní gníomhú mar scagairí nádúrtha chun blúirí DNA comhshaoil ​​a ghabháil ó fhoinsí éagsúla chun faisnéis a sholáthar faoi bhithéagsúlacht éiceachóras cósta na mara. Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil blúirí DNA i hemolimfe diúilicíní a bhfuil éagsúlacht mhór i méid, ó 1 go 5 kb. Léirigh seicheamhú gunna gráin go bhfuil líon mór blúirí DNA de bhunadh miocróbach coigríche. Ina measc, fuaireamar blúirí DNA ó bhaictéir, arcaea, agus víris, lena n-áirítear víris ar a dtugtar ionfhabhtú a dhéanamh ar réimse óstach a fhaightear go coitianta in éiceachórais mhuirí cósta. Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar gur foinse shaibhir eolais nár taiscéaladh go fóill faoi éagsúlacht mhiocróbach in éiceachórais chósta mhuirí í an coincheap LB a chuirtear i bhfeidhm ar dhiúilicíní.
Is réimse taighde atá ag fás go mear é tionchar an athraithe aeráide (CC) ar bhithéagsúlacht éiceachóras mara. Ní hamháin go mbíonn strusanna fiseolaíocha tábhachtacha mar thoradh ar an téamh domhanda, ach cuireann sé brú ar theorainneacha éabhlóideacha chobhsaíocht theirmeach orgánach mara, rud a théann i bhfeidhm ar ghnáthóg roinnt speiceas, rud a spreagann iad chun coinníollacha níos fabhraí a lorg [1, 2]. Chomh maith le dul i bhfeidhm ar bhithéagsúlacht meiteazoan, cuireann CC isteach ar an gcothromaíocht íogair idirghníomhaíochtaí óstach-miocróbach. Is bagairt thromchúiseach é an disbaictéaróis mhiocróbach seo ar éiceachórais mhuirí toisc go ndéanann sé orgánaigh mhuirí níos so-ghabhálaí do phataiginí tógálacha [3, 4]. Creidtear go bhfuil ról tábhachtach ag SS i mbásanna mais, rud atá ina fhadhb thromchúiseach do bhainistiú éiceachóras mara domhanda [5, 6]. Is saincheist thábhachtach í seo i bhfianaise na dtionchar eacnamaíoch, éiceolaíoch agus cothaitheach atá ag go leor speiceas mara. Tá sé seo fíor go háirithe maidir le débhlaoscaigh atá ina gcónaí sna réigiúin pholacha, áit a bhfuil éifeachtaí CK níos láithrí agus níos déine [6, 7]. Go deimhin, úsáidtear débhlaoscaigh ar nós Mytilus spp. go forleathan chun monatóireacht a dhéanamh ar éifeachtaí CC ar éiceachórais mhuirí. Ní haon ionadh é gur forbraíodh líon réasúnta mór bithmharcóirí chun monatóireacht a dhéanamh ar a sláinte, agus cur chuige dhá shraith á úsáid go minic lena n-áirítear bithmharcóirí feidhmiúla bunaithe ar ghníomhaíocht einsímeach nó ar fheidhmeanna ceallacha amhail inmharthanacht cille agus gníomhaíocht fagaicíteach [8]. Áirítear leis na modhanna seo freisin tomhas tiúchan táscairí brú sonracha a charnaíonn i bhfíocháin bhoga tar éis ionsú méideanna móra uisce farraige. Mar sin féin, cuireann an cumas scagacháin ard agus an córas imshruthaithe leathoscailte atá ag débhlaoscaigh deis ar fáil bithmharcóirí hemolymph nua a fhorbairt ag baint úsáide as coincheap na bithóipse leachta (LB), cur chuige simplí agus íosta-ionrach maidir le bainistíocht othar. samplaí fola [9, 10]. Cé gur féidir roinnt cineálacha móilíní imshruthaithe a fháil i LB daonna, tá an coincheap seo bunaithe go príomha ar anailís seicheamhú DNA ar blúirí DNA eachtarcheallach imshruthaithe (ccfDNA) i bplasma. Go deimhin, tá a fhios go bhfuil DNA imshruthaithe i bplasma daonna ó lár an 20ú haois [11], ach níor tháinig diagnóis chliniciúil bunaithe ar ccfDNA chun cinn ach le blianta beaga anuas. Tá láithreacht na blúirí DNA seo atá ag scaipeadh sa chóras mar gheall ar scaoileadh éighníomhach DNA géanómach (núicléach agus miteacoindreach) tar éis bhás cille. I ndaoine sláintiúla, bíonn tiúchan ccfDNA íseal de ghnáth (<10 ng/mL) ach is féidir é a mhéadú 5–10 n-uaire in othair atá ag fulaingt ó phaiteolaíochtaí éagsúla nó atá faoi strus, rud a fhágann damáiste fíocháin. I ndaoine sláintiúla, bíonn tiúchan ccfDNA íseal de ghnáth (<10 ng/mL) ach is féidir é a mhéadú 5–10 n-uaire in othair atá ag fulaingt ó phaiteolaíochtaí éagsúla nó atá faoi strus, rud a fhágann damáiste fíocháin. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в раЅьшаться в раЅььься в раЅььься в 5–10 различной патологией agus подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. I ndaoine sláintiúla, bíonn tiúchan cccDNA íseal de ghnáth (<10 ng/mL), ach is féidir leis méadú 5–10 n-uaire in othair a bhfuil paiteolaíochtaí éagsúla orthu nó atá faoi strus a mbíonn damáiste fíocháin mar thoradh air.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL;在 健康个体中, ccfdna 的 浓度较低 （（<10 ng/ml）但在各种病理或承受 可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-1па различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. De ghnáth bíonn tiúchan ccfDNA íseal (<10 ng/ml) i ndaoine sláintiúla, ach is féidir iad a mhéadú 5-10 n-uaire in othair a bhfuil paiteolaíochtaí nó strus éagsúla orthu, rud a fhágann damáiste fíocháin.Athraíonn méid blúirí ccfDNA go forleathan, ach is gnách go mbíonn sé idir 150 agus 200 bp. [12]. Is féidir anailís ar ccfDNA féin-dhíorthaithe, i.e., ccfDNA ó chealla óstacha gnáth nó claochlaithe, a úsáid chun athruithe géiniteacha agus eipiginéiteacha atá i láthair sa ghéanóm núicléach agus/nó miteacoindreach a bhrath, rud a chabhraíonn le cliniceoirí teiripí sonracha atá dírithe ar mhóilíneacha a roghnú [13]. Mar sin féin, is féidir ccfDNA a fháil ó fhoinsí eachtracha amhail ccfDNA ó chealla féatais le linn toirchis nó ó orgáin thrasphlandaithe [14,15,16,17]. Is foinse thábhachtach faisnéise é ccfDNA freisin chun aigéid núicléacha gníomhaire ionfhabhtaigh (eachtrannach) a bhrath, rud a cheadaíonn braiteadh neamh-ionrach ar ionfhabhtuithe forleathana nach n-aithnítear le cultúir fola, ag seachaint bithóipse ionrach fíocháin ionfhabhtaithe [18]. Léirigh staidéir le déanaí go deimhin go bhfuil foinse shaibhir faisnéise i bhfuil an duine ar féidir í a úsáid chun pataiginí víreasacha agus baictéaracha a aithint, agus gur de bhunadh eachtrach atá thart ar 1% den ccfDNA a fhaightear i bplasma an duine [19]. Léiríonn na staidéir seo gur féidir bithéagsúlacht mhicribhitheam imshruthaithe orgánaigh a mheas trí úsáid a bhaint as anailís ccfDNA. Mar sin féin, go dtí le déanaí, níor úsáideadh an coincheap seo ach i ndaoine agus, ar scála níos lú, i veirteabraigh eile [20, 21].
Sa pháipéar seo, úsáidimid an poitéinseal LB chun anailís a dhéanamh ar ccfDNA Aulacomya atra, speiceas theas a fhaightear go coitianta in Oileáin Kerguelen fho-Antartacha, grúpa oileán ar bharr ardchlár mór a cruthaíodh 35 milliún bliain ó shin. brúchtadh bolcánach. Ag baint úsáide as córas turgnamhach in vitro, fuarthas amach go nglacann diúilicíní blúirí DNA in uisce na farraige go tapa agus go dtéann siad isteach san urrann hemolymph. Léirigh seicheamhú gunna gráin go bhfuil blúirí DNA dá bhunús féin agus neamh-fhéin i ccfDNA hemolymph diúilicíní, lena n-áirítear baictéir shiombóiseacha agus blúirí DNA ó bhithóim atá tipiciúil d'éiceachórais chósta mhuirí bholcánacha fuara. Tá seichimh víreasacha i ccfDNA hemolymph freisin a dhíorthaítear ó víris le raonta óstacha éagsúla. Fuaireamar blúirí DNA freisin ó ainmhithe ilcheallacha amhail iasc cnámhach, bundúin mara, algaí agus feithidí. Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar gur féidir coincheap LB a chur i bhfeidhm go rathúil ar inveirteabraigh mhuirí chun stór saibhir geanómach a ghiniúint in éiceachórais mhuirí.
Bailíodh diúilicíní gorma fásta (55-70 mm ar fhad) Mytilus platensis (M. platensis) agus Aulacomya atra (A. atra) ó chladaí creagacha idirthaoideacha Port-au-France (049°21.235 D, 070°13.490 O.). Oileáin Kerguelen i mí na Nollag 2018. Fuarthas diúilicíní gorma fásta eile (Mytilus spp.) ó sholáthraí tráchtála (PEI Mussel King Inc., Oileán an Phrionsa Éadbhard, Ceanada) agus cuireadh iad i umar aeraithe teochtrialaithe (4°C) ina raibh 10–20 L de sháile saorga 32‰. (salann mara saorga Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAM). I ngach turgnamh, tomhaiseadh fad agus meáchan na sliogán aonair.
Tá prótacal rochtana oscailte saor in aisce don chlár seo ar fáil ar líne (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Go hachomair, bailíodh hemolimfe LB ó matáin fhuadaitheora mar a thuairiscítear [22]. Glanadh an hemolimfe trí lártheifneoiriú ag 1200 × g ar feadh 3 nóiméad, reoiteadh an forshnáithín (-20 ° C) go dtí go n-úsáidfí é. Chun cfDNA a leithlisiú agus a íonú, díreoiteadh agus próiseáladh samplaí (1.5-2.0 ml) ag baint úsáide as an trealamh cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) de réir threoracha an mhonaróra. Stóráladh ccfDNA ag -80 ° C go dtí go ndearnadh anailís bhreise air. I roinnt turgnaimh, leithlisíodh agus íonaíodh ccfDNA ag baint úsáide as an Trealamh Imscrúdaitheora DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Ceanada). Rinneadh an DNA íonaithe a chainníochtú ag baint úsáide as measúnacht chaighdeánach PicoGreen. Rinneadh anailís ar dháileadh blúirí an ccfDNA leithlisithe trí leictreafóiréis ribeach ag baint úsáide as bithanailíseoir Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ag baint úsáide as Trealamh DNA Íogaireachta Ard. Rinneadh an anailís ag baint úsáide as 1 µl den sampla ccfDNA de réir threoracha an mhonaróra.
Chun blúirí ccfDNA hemolymph a sheicheamhú, d'ullmhaigh Genome Québec (Montreal, Québec, Ceanada) leabharlanna gunna gráin ag baint úsáide as trealamh Illumina DNA Mix den trealamh Illumina MiSeq PE75. Baineadh úsáid as oiriúntóir caighdeánach (BioO). Tá comhaid sonraí amha ar fáil ó Chartlann Léamha Seicheamh NCBI (SRR8924808 agus SRR8924809). Rinneadh measúnú ar cháilíocht na léitheoireachta bunúsach ag baint úsáide as FastQC [23]. Baineadh úsáid as Trimmomatic [24] le haghaidh oiriúntóirí gearrtha agus léamha droch-chaighdeáin. Rinneadh léamha gunna gráin le foircinn phéireáilte a chumasc le FLASH i léamha aonair níos faide le forluí íosta de 20 bp chun mí-oiriúntaí a sheachaint [25]. Rinneadh léamha cumasctha a anótáil le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí Tacsanomaíochta NCBI débhlaoscach (luach e < 1e−3 agus homalógacht 90%), agus rinneadh masc ar sheichimh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26]. Rinneadh léamha cumasctha a anótáil le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí Tacsanomaíochta NCBI débhlaoscach (luach e < 1e−3 agus homalógacht 90%), agus rinneadh masc ar sheichimh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN сиспользованием базы данных таксономиы моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 agus 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложност использованием DUST [26]. Rinneadh léamha comhthiomsaithe a anótáil le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíochta débhlaoscach NCBI (luach e < 1e-3 agus homalógacht 90%), agus rinneadh masc seicheamh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26].NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数 [D 2005]进行低复杂度序列的掩蔽。使用双壳类 ncbi 分类 (（<1e-3和 90% 同源）用用用注释 合并读源 2， deannaigh进行复杂度序列的。。。。 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN сиспользованием таксономической базы базы двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 agus 90% гомологии), а маскирование последовательностей жо зомические выполнено с использованием DUST [26]. Rinneadh léamha comhthiomsaithe a anótáil le BLASTN ag baint úsáide as bunachar sonraí tacsanomaíoch débhlaoscach NCBI (luach e <1e-3 agus homalógacht 90%), agus rinneadh masc seicheamh ísealchasta ag baint úsáide as DUST [26].Roinneadh na léamha ina dhá ghrúpa: gaolmhar le seichimh dhébhlaoscacha (ar a dtugtar féinléamha anseo) agus neamhghaolmhar (neamhfhéinléamha). Cuireadh dhá ghrúpa le chéile ar leithligh ag baint úsáide as MEGAHIT chun contigs a ghiniúint [27]. Idir an dá linn, rinneadh dáileadh tacsanomaíoch léamha micribhithe eachtrannach a aicmiú ag baint úsáide as Kraken2 [28] agus léiríodh go grafach é le cairt phí Krona ar Galaxy [29, 30]. Cinneadh gurb iad na kmers is fearr ná kmers-59 ó na turgnaimh réamhchéime. Ansin aithníodh féin-chomhsheasmhacha trí ailíniú le BLASTN (bunachar sonraí NCBI débhlaoscach, luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%) le haghaidh anótála deiridh. Ansin aithníodh féin-chomhsheasmhacha trí ailíniú le BLASTN (bunachar sonraí NCBI débhlaoscach, luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%) le haghaidh anótála deiridh. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворыковкаты значение e < 1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Ansin, aithníodh féin-choinsíneachtaí trí mheaitseáil i gcoinne BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, luach e <1e-10 agus homalógacht 60%) le haghaidh anótála deiridh.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， agus 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库， agus 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 agus гомология 60%). Ansin, aithníodh féin-choinsíneachtaí le haghaidh anótála deiridh trí mheaitseáil i gcoinne BLASTN (bunachar sonraí débhlaoscach NCBI, luach e <1e-10 agus homalógacht 60%). Ag an am céanna, rinneadh nótaí a chur ar chomhthionóil ghrúpa neamhfhéin le BLASTN (bunachar sonraí nt NCBI, luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%). Ag an am céanna, rinneadh nótaí a chur ar chomhthionóil ghrúpa neamhfhéin le BLASTN (bunachar sonraí nt NCBI, luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI < 1 e-1 гомология 60%). Ag an am céanna, rinneadh nótaí a chur ar chomhthionóil ghrúpa eachtracha le BLASTN (bunachar sonraí NT NCBI, luach e <1e-10 agus homalógacht 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库， agus 值< 1e-10和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库， agus 值< 1e-10和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (банЋ нотированы спомощью BLASTN значение e < 1e-10 и гомология 60%). Ag an am céanna, rinneadh nótaí a chur ar chomhthionóil ghrúpa neamh-fhéinghrúpa le BLASTN (bunachar sonraí nt NCBI, luach e <1e-10 agus homalógacht 60%). Rinneadh BLASTX ar chontigí neamhfhéin freisin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéine nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%). Rinneadh BLASTX ar chontigí neamhfhéin freisin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéine nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e−10 agus homalógacht 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах сиспользованием баз данных белка nr на на понтигах использованием баз данных белка nr agus RefЇен <1e-10 agus гомология 60%). Rinneadh BLASTX ar chontigí neamh-fhéin freisin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéine nr agus RefSeq NCBI (luach e < 1e-10 agus homalógacht 60%).还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怉还使用nr 和RefSeq蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e值< 1e-10和怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怼怉 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr NCи RefSeq (1 e- 1 и гомология 60%). Rinneadh BLASTX ar chontigí neamh-fhéin freisin ag baint úsáide as bunachair shonraí próitéine nr agus RefSeq NCBI (luach e <1e-10 agus homalógacht 60%).Is ionann linnte BLASTN agus BLASTX de chontigí neamh-fhéin-chointigí agus na contigí deiridh (féach an comhad Forlíontach).
Tá na tosaitheoirí a úsáideadh le haghaidh PCR liostaithe i dTábla S1. Baineadh úsáid as polaiméaráis DNA Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) chun géinte sprice ccfDNA a aimpliú. Baineadh úsáid as na coinníollacha imoibrithe seo a leanas: dínádúrú ag 95°C ar feadh 3 nóiméad, 95°C ar feadh 1 nóiméad, teocht annealaithe socraithe ar feadh 1 nóiméad, fadú ag 72°C ar feadh 1 nóiméad, 35 timthriall, agus ar deireadh 72°C laistigh de 10 nóiméad. . Scaradh táirgí PCR trí leictreafóiréis i nglóthacha agaróise (1.5%) ina raibh SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Ceanada) ag 95 V.
Rinneadh diúilicíní (Mytilus spp.) a oiriúnú i 500 ml d'uisce farraige ocsaiginithe (32 PSU) ar feadh 24 uair an chloig ag 4°C. Cuireadh DNA plasmíde ina raibh iontráil a ionchódaíonn seicheamh cDNA galectin-7 daonna (uimhir iontrála NCBI L07769) leis an bhfialán ag tiúchan deiridh de 190 μg/μl. Ba iad na diúilicíní a goradh faoi na coinníollacha céanna gan DNA a chur leis an umar rialaithe. Bhí DNA gan diúilicíní sa tríú umar rialaithe. Chun cáilíocht an DNA san uisce farraige a mhonatóiriú, tógadh samplaí uisce farraige (20 μl; trí athrá) ó gach umar ag an am a léiríodh. Chun inrianaitheacht DNA plasmíde, bailíodh diúilicíní LB ag na hamanna a léiríodh agus rinneadh anailís orthu le qPCR agus ddPCR. Mar gheall ar an cion ard salainn atá in uisce na farraige, caolaíodh aliquots in uisce de cháilíocht PCR (1:10) roimh na measúnuithe PCR go léir.
Rinneadh PCR braoiníní digiteacha (ddPCR) ag baint úsáide as prótacal BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Ceanada). Bain úsáid as an bpróifíl teochta chun an teocht is fearr a chinneadh (Tábla S1). Gineadh na braoiníní ag baint úsáide as gineadóir braoiníní QX200 (BioRad). Rinneadh ddPCR mar seo a leanas: 95°C ar feadh 5 nóiméad, 50 timthriall de 95°C ar feadh 30 soicind agus teocht annealaithe ar leith ar feadh 1 nóiméad agus 72°C ar feadh 30 soicind, 4°C ar feadh 5 nóiméad agus 90°C laistigh de 5 nóiméad. Tomhaiseadh líon na mbraoiníní agus na n-imoibrithe dearfacha (líon na gcóipeanna/µl) ag baint úsáide as léitheoir braoiníní QX200 (BioRad). Diúltaíodh do shamplaí a raibh níos lú ná 10,000 braoinín iontu. Níor rialaíodh patrún gach uair a ritheadh ​​ddPCR.
Rinneadh qPCR ag baint úsáide as Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, an Astráil) agus tosaitheoirí sonracha LGALS7. Rinneadh na PCRanna cainníochtúla go léir i 20 µl ag baint úsáide as an QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Cuireadh tús le qPCR le goradh 15 nóiméad ag 95°C agus ina dhiaidh sin 40 timthriall ag 95°C ar feadh 10 soicind agus ag 60°C ar feadh 60 soicind le bailiú sonraí amháin. Gineadh cuar leá ag baint úsáide as tomhais leanúnacha ag 95°C ar feadh 5 soicind, 65°C ar feadh 60 soicind, agus 97°C ag deireadh an qPCR. Rinneadh gach qPCR faoi thrí, seachas samplaí rialaithe.
Ós rud é go bhfuil diúilicíní aitheanta as a ráta scagacháin ard, rinneamar imscrúdú ar dtús an bhféadfaidís blúirí DNA atá i láthair in uisce na farraige a scagadh agus a choinneáil. Bhí suim againn freisin an gcruann na blúirí seo ina gcóras limfeach leathoscailte. Réitigh muid an cheist seo go turgnamhach trí chinniúint blúirí DNA intuaslagtha a chuirtear le tancanna diúilicíní gorma a rianú. Chun rianú blúirí DNA a éascú, d'úsáideamar DNA plasmíde coigríche (ní féin) ina raibh an géin galectin-7 daonna. Rianaíonn ddPCR blúirí DNA plasmíde in uisce na farraige agus i ndiúilicíní. Léiríonn ár dtorthaí, má fhan méid na mblúirí DNA in uisce na farraige réasúnta tairiseach le himeacht ama (suas le 7 lá) in éagmais diúilicíní, ansin i láthair diúilicíní imíonn an leibhéal seo beagnach go hiomlán laistigh de 8 n-uaire an chloig (Fíor 1a,b). Braitheadh ​​blúirí de DNA eisigineach go héasca laistigh de 15 nóiméad i sreabhán intravalvular agus hemolymph (Fíor 1c). D'fhéadfaí na blúirí seo a bhrath fós suas le 4 huaire an chloig tar éis nochta. Tá an ghníomhaíocht scagacháin seo i leith blúirí DNA inchomparáide le gníomhaíocht scagacháin baictéar agus algaí [31]. Tugann na torthaí seo le fios gur féidir le diúilicíní DNA coigríche a scagadh agus a charnadh ina n-urrann sreabhach.
Tiúchain choibhneasta DNA plasmíde in uisce farraige i láthair (A) nó as láthair (B) diúilicíní, arna dtomhas le ddPCR. In A, léirítear na torthaí mar chéatadáin, agus teorainneacha na mboscaí ag léiriú an 75ú agus an 25ú peircintíl. Taispeántar an cuar logartamach feistithe i ndath dearg, agus léiríonn an limistéar atá scáthaithe i liath an t-eatramh muiníne 95%. I B, léiríonn an líne dhearg an meán agus léiríonn an líne ghorm an t-eatramh muiníne 95% don tiúchan. C Carnadh DNA plasmíde i hemolimfe agus i sreabhán comhla diúilicíní ag amanna éagsúla tar éis DNA plasmíde a chur leis. Cuirtear na torthaí i láthair mar chóipeanna absalóideacha braite/mL (±SE).
Ansin, rinneamar imscrúdú ar bhunús ccfDNA i ndiúilicíní a bailíodh ó leapacha diúilicíní ar Oileáin Kerguelen, grúpa oileán iargúlta a bhfuil tionchar antrapaigineach teoranta acu. Chun na críche seo, rinneadh cccDNA ó hemolymphs diúilicíní a aonrú agus a íonú trí mhodhanna a úsáidtear go coitianta chun cccDNA daonna a íonú [32, 33]. Fuaireamar amach go bhfuil meántiúchan ccfDNA hemolymph i ndiúilicíní sa raon micreagram íseal in aghaidh an ml hemolymph (féach Tábla S2, Faisnéis Fhorlíontach). Tá an raon tiúchan seo i bhfad níos mó ná mar atá i ndaoine sláintiúla (nanagram íseal in aghaidh an mhillilítear), ach i gcásanna neamhchoitianta, in othair ailse, is féidir leis an leibhéal ccfDNA roinnt micreagram in aghaidh an mhillilítear a bhaint amach [34, 35]. Léirigh anailís ar dháileadh méide ccfDNA hemolymph go bhfuil éagsúlacht mhór i méid na blúirí seo, idir 1000 bp agus 1000 bp suas le 5000 bp (Fíor 2). Fuarthas torthaí comhchosúla ag baint úsáide as an QIAamp Investigator Kit atá bunaithe ar shilice, modh a úsáidtear go coitianta san eolaíocht fhóiréinseach chun DNA geanómach a leithlisiú agus a íonú go tapa ó shamplaí DNA ísealtiúchana, lena n-áirítear ccfDNA [36].
Leictreafóireagram ccfDNA ionadaíoch de hemolimfe diúilicíní. Bainte amach le NucleoSnap Plasma Kit (barr) agus QIAamp DNA Investigator Kit. B Plota veidhlín a thaispeánann dáileadh tiúchan ccfDNA hemolimfe (±SE) i ndiúilicíní. Léiríonn na línte dubha agus dearga an meán agus an chéad agus an tríú ceathrú, faoi seach.
Tá foinse eachtrach ag thart ar 1% de ccfDNA i ndaoine agus i bpríomhaigh [21, 37]. I bhfianaise chóras imshruthaithe leathoscailte na mblaoscach, uisce farraige saibhir i miocróib, agus dáileadh méide ccfDNA na ndiúilicíní, rinneamar hipitéis go bhféadfadh linn shaibhir agus éagsúil de DNA miocróbach a bheith i ccfDNA hemolymph diúilicíní. Chun an hipitéis seo a thástáil, rinneamar seicheamhú ar ccfDNA hemolymph ó shamplaí Aulacomya atra a bailíodh ó Oileáin Kerguelen, rud a thug breis is 10 milliún léamh, agus 97.6% díobh sin tar éis rialú cáilíochta a rith. Ansin rinneadh na léamha a aicmiú de réir foinsí féin agus neamhfhéin ag baint úsáide as bunachair shonraí BLASTN agus NCBI (Fíor S1, Faisnéis Fhorlíontach).
I ndaoine, is féidir DNA núicléach agus miteacoindreach araon a scaoileadh isteach sa tsruth fola [38]. Mar sin féin, sa staidéar seo, ní raibh sé indéanta cur síos mionsonraithe a dhéanamh ar DNA géanómach núicléach na ndiúilicíní, ós rud é nach bhfuil seicheamhú ná cur síos déanta ar ghéanóm A. atra. Mar sin féin, bhíomar in ann roinnt blúirí ccfDNA dár mbunús féin a aithint ag baint úsáide as an leabharlann débhlaoscach (Fíor S2, Faisnéis Fhorlíontach). Dheimhnigh muid freisin láithreacht blúirí DNA dár mbunús féin trí aimpliú PCR dírithe ar na géinte A. atra sin a seicheamhaíodh (Fíor 3). Ar an gcaoi chéanna, ós rud é go bhfuil géanóm miteacoindreach A. atra ar fáil i mbunachair shonraí poiblí, is féidir fianaise a fháil ar láithreacht blúirí ccfDNA miteacoindreach i hemolymph A. atra. Deimhníodh láithreacht blúirí DNA miteacoindreach trí aimpliú PCR (Fíor 3).
Bhí géinte miteacoindreacha éagsúla i láthair i hemolimfe A. atra (poncanna dearga – uimhir stoic: SRX5705969) agus M. platensis (poncanna gorma – uimhir stoic: SRX5705968) aimplithe le PCR. Fíor oiriúnaithe ó Breton et al., 2011 B Aimpliú an fhorshnáithín hemolimfe ó A. atra Stóráilte ar pháipéar FTA. Bain úsáid as polltóir 3 mm chun é a chur go díreach leis an bhfeadán PCR ina bhfuil an meascán PCR.
I bhfianaise an ábhair mhiocróbaigh fhlúirseach atá in uisce na farraige, dhírigh muid ar dtús ar shaintréithe seichimh DNA mhiocróbach i hemolymph. Chun seo a dhéanamh, úsáidimid dhá straitéis éagsúla. Bhain an chéad straitéis úsáid as Kraken2, clár aicmithe seicheamh bunaithe ar algartam ar féidir leis seichimh mhiocróbacha a aithint le cruinneas inchomparáide le BLAST agus uirlisí eile [28]. Cinneadh gur de bhunadh baictéarach a bhí níos mó ná 6719 léamh, agus gur ó archaea agus víris a tháinig 124 agus 64 díobh, faoi seach (Fíor 4). Ba iad Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), agus Bacteroidetes (17%) na blúirí DNA baictéaracha ba flúirseach (Fíor 4a). Tá an dáileadh seo comhsheasmhach le staidéir roimhe seo ar mhicribhitheam na ndiúilicíní gorma mara [39, 40]. Ba iad Gammaproteobacteria an príomhaicme Proteobacteria (44%), lena n-áirítear go leor Vibrionales (Fíor 4b). Dheimhnigh an modh ddPCR go raibh blúirí DNA Vibrio i láthair i ccfDNA hemolymph A. atra (Fíor 4c) [41]. Chun tuilleadh eolais a fháil faoi bhunús baictéarach ccfDNA, glacadh cur chuige breise (Fíor S2, Faisnéis Fhorlíontach). Sa chás seo, cuireadh léamha a raibh forluí orthu le chéile mar léamha péireáilte agus aicmíodh iad mar féinbhunadh (débhlaoscaigh) nó neamhfhéinbhunadh ag baint úsáide as BLASTN agus luach e de 1e−3 agus teorainn le homalógacht >90%. Sa chás seo, cuireadh léamha a raibh forluí orthu le chéile mar léamha péireáilte agus aicmíodh iad mar féinbhunadh (débhlaoscaigh) nó neamhfhéinbhunadh ag baint úsáide as BLASTN agus luach e de 1e−3 agus teorainn le homalógacht >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения спарными концами и быликиан собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значение по происхождению с использованием BLASTN и значение гомологией > 90%. Sa chás seo, bailíodh léamha forluiteacha mar léamha péireáilte agus aicmíodh iad mar dhúchasacha (débhlaoscacha) nó neamhbhunaidh ag baint úsáide as BLASTN agus luach e de 1e-3 agus gearradh siar le homalógacht >90%.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN和1e-3的e值和>90%和>同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下, 重叠读数组装为配末端读数，使用使用使璔 的用 1-3和> 90% 同源性 的分类 自身 （双 壳类） 非自身。。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения спарными концами и классифиц собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием знаѹагению использованием знаѹагением значению гомологии> 90%. Sa chás seo, bailíodh léamha forluiteacha mar léamha péireáilte agus aicmíodh iad mar léamha féin (débhlaoscaigh) nó neamhbhunaidh ag baint úsáide as luachanna e BLASTN agus 1e-3 agus tairseach homalaíochta >90%.Ós rud é nach bhfuil seicheamhú déanta ar gheanóm A. atra go fóill, bhain muid úsáid as straitéis tionóil de novo tionólaí MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Aithníodh 147,188 contigs san iomlán mar bhlaoscaigh spleácha (débhlaoscaigh). Ansin pléascadh na contigs seo le luachanna-e de 1e-10 ag baint úsáide as BLASTN agus BLASTX. Chuir an straitéis seo ar ár gcumas 482 blúire neamh-dhébhlaoscach atá i láthair i ccfDNA A. atra a aithint. Fuarthas níos mó ná leath (57%) de na blúirí DNA seo ó bhaictéir, go príomha ó shiombiontaí geolbhaigh, lena n-áirítear siombiontaí sulfotrófacha, agus ó shiombiontaí geolbhaigh Solemya velum (Fíor 5).
Flúirse choibhneasta ag leibhéal an chineáil. B Éagsúlacht mhiocróbach dhá phríomhfhíleam (Firmicutes agus Proteobacteria). Aimpliú ionadaíoch ar ddPCR C Vibrio spp. A. Blúirí den ghéin 16S rRNA (gorm) i dtrí hemolimfe atra.
Rinneadh anailís ar 482 contig bailithe san iomlán. Próifíl ghinearálta ar dháileadh tacsanomaíoch anótálacha contig meitagéinómacha (prócarótaigh agus eocarótaigh). B Dáileadh mionsonraithe ar blúirí DNA baictéarach arna sainaithint ag BLASTN agus BLASTX.
Léirigh anailís Kraken2 freisin go raibh blúirí DNA archaeal i ccfDNA na ndiúilicíní, lena n-áirítear blúirí DNA de chuid Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), agus Thaurmarcheota (11%) (Fíor 6a). Níor cheart go mbeadh iontas ar bith ann go raibh blúirí DNA díorthaithe ó Euryarchaeota agus Crenarchaeota, a fuarthas roimhe seo i bpobal miocróbach diúilicíní California [42]. Cé go mbíonn Euryarchaeota bainteach go minic le dálaí foircneacha, aithnítear anois go bhfuil Euryarchaeota agus Crenarcheota araon i measc na bprócaróit is coitianta sa timpeallacht chrióigineach mhuirí [43, 44]. Ní haon ionadh é go bhfuil miocrorgánaigh meatáinigineacha i ndiúilicíní, i bhfianaise na dtuairiscí le déanaí ar sceitheanna meatáin fairsinge ó sceitheanna bun ar Ardchlár Kerguelen [45] agus táirgeadh miocróbach meatáin féideartha a breathnaíodh amach ó chósta Oileáin Kerguelen [46].
Ansin, dhírigh ár n-aird ar léamha ó víris DNA. Chomh fada agus is eol dúinn, is é seo an chéad staidéar lasmuigh den sprioc ar ábhar víris diúilicíní. Mar a bhíothas ag súil leis, fuaireamar blúirí DNA de bhaictéarafagaigh (Caudovirales) (Fíor 6b). Mar sin féin, tagann an DNA víreasach is coitianta ó fhíleam núicléaicítovíris, ar a dtugtar an víreas mór DNA cíteaplasmach núicléach (NCLDV) freisin, a bhfuil an géanóm is mó aige d'aon víreas. Laistigh den fhíleam seo, baineann formhór na seichimh DNA leis na teaghlaigh Mimimidoviridae (58%) agus Poxviridae (21%), a bhfuil veirteabraigh agus artrapóid ina n-óstach nádúrtha, agus baineann cuid bheag de na seichimh DNA seo le algaí víreolaíocha aitheanta. Ionfhabhtaíonn sé algaí eocarótacha mara. Fuarthas na seichimh freisin ón víreas Pandora, an víreas ollmhór leis an méid géanóim is mó d'aon ghéineas víreasach aitheanta. Is suimiúil go raibh raon na n-óstach ar a dtugtar a bheith ionfhabhtaithe leis an víreas, mar a chinntear trí sheicheamhú hemolymph ccfDNA, sách mór (Fíor S3, Faisnéis Fhorlíontach). Áirítear leis víris a ionfhabhtaíonn feithidí ar nós Baculoviridae agus Iridoviridae, chomh maith le víris a ionfhabhtaíonn aiméibe, algaí agus veirteabraigh. Fuaireamar seichimh freisin a mheaitseálann géanóm Pithovirus sibericum. Aonraíodh pitovíris (ar a dtugtar “víris zombaí” freisin) den chéad uair ó shíor-shruth 30,000 bliain d’aois sa tSibéir [47]. Dá bhrí sin, tá ár dtorthaí comhsheasmhach le tuarascálacha roimhe seo a léiríonn nach bhfuil gach speiceas nua-aimseartha de na víris seo imithe in éag [48] agus go bhféadfadh na víris seo a bheith i láthair in éiceachórais mhuirí fo-Artacha iargúlta.
Ar deireadh, rinneamar tástáil féachaint an bhféadfaimis blúirí DNA a aimsiú ó ainmhithe ilcheallacha eile. Aithníodh 482 contigs eachtracha san iomlán le BLASTN agus BLASTX le leabharlanna nt, nr agus RefSeq (géanómacha agus próitéine). Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil DNA cnámha cnámhacha i réim i measc na mblúirí eachtracha de ccfDNA ainmhithe ilcheallacha (Fíor 5). Fuarthas blúirí DNA ó fheithidí agus ó speicis eile freisin. Níor aithníodh cuid réasúnta mór de na blúirí DNA, b'fhéidir mar gheall ar easpa ionadaíochta líon mór speiceas mara i mbunachair shonraí geanómacha i gcomparáid le speicis talún [49].
Sa pháipéar seo, cuirimid coincheap an LB i bhfeidhm maidir le diúilicíní, ag argóint gur féidir le seicheamhú lámhaigh ccfDNA hemolymph léargas a thabhairt ar chomhdhéanamh éiceachóras mara cósta. Go háirithe, fuarthas amach 1) go bhfuil tiúchain réasúnta ard (leibhéil micreagram) de bhlúirí DNA atá i gcúrsaíocht réasúnta mór (~1-5 kb) i hemolymph diúilicíní; 2) go bhfuil na blúirí DNA seo neamhspleách agus neamh-neamhspleách araon 3) I measc fhoinsí eachtracha na mblúirí DNA seo, fuarthas DNA baictéarach, arcaeal agus víreasach, chomh maith le DNA ainmhithe ilcheallacha eile; 4) Tarlaíonn carnadh na mblúirí ccfDNA eachtracha seo san hemolymph go tapa agus go gcuireann sé le gníomhaíocht scagacháin inmheánach na ndiúilicíní. Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar go bhfuil foinse eolais shaibhir ach neamhiniúchta sa choincheap LB, a cuireadh i bhfeidhm go príomha i réimse na bithleighis go dtí seo, ar féidir í a úsáid chun tuiscint níos fearr a fháil ar an idirghníomhaíocht idir speicis fairtheora agus a dtimpeallacht.
Chomh maith le príomhaigh, tá tuairiscí ar leithlisiú ccfDNA i mamaigh, lena n-áirítear lucha, madraí, cait, agus capaill [50, 51, 52]. Mar sin féin, chomh fada agus is eol dúinn, is é ár staidéar an chéad cheann a thuairiscigh braiteadh agus seicheamhú ccfDNA i speicis mhuirí a bhfuil córas cúrsaíochta oscailte acu. Féadfaidh an ghné anatamaíoch seo agus an cumas scagacháin seo atá ag diúilicíní, ar a laghad i bpáirt, míniú a thabhairt ar na tréithe méide difriúla atá ag blúirí DNA atá ag scaipeadh i gcomparáid le speicis eile. I ndaoine, is blúirí beaga iad formhór na mblúirí DNA atá ag scaipeadh san fhuil, idir 150 agus 200 bp, le buaic uasta de 167 bp [34, 53]. Tá cuid bheag ach suntasach de na blúirí DNA idir 300 agus 500 bp ar mhéid, agus tá thart ar 5% níos faide ná 900 bp. [54]. Is é an chúis atá leis an dáileadh méide seo ná go dtarlaíonn príomhfhoinse ccfDNA sa phlasma mar thoradh ar bhás cille, bíodh sé mar gheall ar bhás cille nó mar gheall ar neacróis cealla hematopoietic atá ag scaipeadh i ndaoine sláintiúla nó mar gheall ar apoptosis cealla meall in othair ailse (ar a dtugtar DNA meall atá ag scaipeadh). , ctDNA). Bhí dáileadh méide ccfDNA hemolymph a fuair muid i ndiúilicíní idir 1000 agus 5000 bp, rud a thugann le fios go bhfuil bunús difriúil ag ccfDNA diúilicíní. Is hipitéis loighciúil í seo, ós rud é go bhfuil córas soithíoch leathoscailte ag diúilicíní agus go maireann siad i dtimpeallachtaí uisceacha mara ina bhfuil tiúchain arda de DNA géanómach miocróbach. Déanta na fírinne, léirigh ár dturgnaimh saotharlainne ag baint úsáide as DNA eisigineach go mbailíonn diúilicíní blúirí DNA in uisce na farraige, ar a laghad tar éis cúpla uair an chloig déantar iad a dhíghrádú tar éis ionsú ceallach agus/nó a scaoileadh agus/nó a stóráil in eagraíochtaí éagsúla. I bhfianaise thearcacht na gcealla (idir phrócarótach agus eocarótach), laghdóidh úsáid urranna intravalvular méid an ccfDNA ó fhoinsí féin chomh maith le ó fhoinsí eachtracha. Agus tábhacht na himdhíonachta dúchasach débhlaoscach agus an líon mór fagaicítí atá ag scaipeadh i gcúrsaíocht á gcur san áireamh, rinneamar hipitéis bhreise go bhfuil fiú ccfDNA coigríche saibhrithe le fagaicítí atá ag scaipeadh i gcúrsaíocht a charnaíonn DNA coigríche nuair a ionghabhtar miocrorgánaigh agus/nó smionagar ceallach. Le chéile, léiríonn ár dtorthaí gur stór uathúil faisnéise móilíní é ccfDNA hemolimfe débhlaoscach agus neartaíonn sé a stádas mar speiceas fairtheora.
Léiríonn ár sonraí gur féidir le seicheamhú agus anailís blúirí ccfDNA hemolymph díorthaithe ó bhaictéir faisnéis thábhachtach a sholáthar faoin bhflóra baictéarach óstach agus na baictéir atá i láthair san éiceachóras muirí máguaird. Nocht teicnící seicheamhú urchar seichimh den bhaictéar commensal A. atra geolbhach a bheadh ​​​​caillte dá mba rud é go raibh modhanna traidisiúnta aitheantais rRNA 16S in úsáid, mar gheall ar chlaonadh leabharlainne tagartha go páirteach. Déanta na fírinne, léirigh ár n-úsáid de shonraí LB a bailíodh ó M. platensis sa chiseal diúilicíní céanna ag Kerguelen go raibh comhdhéanamh na siombiontach baictéarach a bhaineann le geolbhaigh mar an gcéanna do na speicis diúilicíní araon (Fíor S4, Faisnéis Fhorlíontach). D’fhéadfadh an chosúlacht seo idir dhá dhiúilicín atá difriúil ó thaobh géineolaíochta de comhdhéanamh na bpobal baictéarach i dtaiscí fuara, sulfaracha agus bolcánacha Kerguelen a léiriú [55, 56, 57, 58]. Tá leibhéil níos airde de mhiocrorgánaigh laghdaithe sulfair curtha síos go maith agus diúilicíní á mbaint ó cheantair chósta bith-thurbacha [59], amhail cósta Port-au-France. Féidearthacht eile is ea go bhféadfadh tionchar a bheith ag tarchur cothrománach ar fhlóra na ndiúilicíní comhchoiteanna [60, 61]. Tá gá le tuilleadh taighde chun an gaol idir an timpeallacht mhuirí, dromchla urlár na farraige, agus comhdhéanamh na mbaictéar siombóiseach i ndiúilicíní a chinneadh. Tá na staidéir seo ar siúl faoi láthair.
Is iad fad agus tiúchan ccfDNA hemolymph, a éascaíocht íonúcháin, agus an t-ardchaighdeán chun seicheamhú tapa gunna gráin a cheadú cuid de na buntáistí iomadúla a bhaineann le ccfDNA diúilicíní a úsáid chun bithéagsúlacht in éiceachórais chósta mhuirí a mheas. Tá an cur chuige seo thar a bheith éifeachtach chun pobail víreasacha (víróim) a shainiú in éiceachóras ar leith [62, 63]. Murab ionann agus baictéir, arcaea, agus eocarótaigh, níl géinte atá caomhnaithe go fileaginéiteach i ngéanóim víreasacha amhail seichimh 16S. Léiríonn ár dtorthaí gur féidir bithóipsí leachtacha ó speicis tháscacha amhail diúilicíní a úsáid chun líon réasúnta mór blúirí víris ccfDNA a aithint ar a dtugtar go n-ionfhabhtaíonn siad óstaigh a chónaíonn de ghnáth in éiceachórais mhuirí chósta. Áirítear leis seo víris ar a dtugtar go n-ionfhabhtaíonn siad protozoa, artrapóid, feithidí, plandaí, agus víris bhaictéaracha (m.sh., baictéarfagaigh). Fuarthas dáileadh comhchosúil nuair a scrúdaíomar víreas ccfDNA hemolymph diúilicíní gorma (M. platensis) a bailíodh sa chiseal diúilicíní céanna ag Kerguelen (Tábla S2, Faisnéis Fhorlíontach). Is cur chuige nua é seicheamhú gunna gráin ccfDNA atá ag dul i méid i staidéar víreas daoine nó speiceas eile [21, 37, 64]. Tá an cur chuige seo thar a bheith úsáideach chun víris DNA dé-shnáithe a staidéar, ós rud é nach bhfuil aon ghéin aonair caomhnaithe i measc na víreas DNA dé-shnáithe go léir, rud a léiríonn an rang víris is éagsúla agus is leithne i mBaltimore [65]. Cé nach bhfuil formhór na víris seo rangaithe agus go bhféadfadh víris ó chuid anaithnid den domhan víreasach a bheith iontu [66], fuarthas amach go dtiteann víris agus raonta óstach na miúilicíní A. atra agus M. platensis idir an dá speiceas ar an gcaoi chéanna (féach figiúr S3, faisnéis bhreise). Ní ​​haon ionadh an chosúlacht seo, mar d'fhéadfadh sé easpa roghnaíochta a léiriú i nglacadh DNA atá i láthair sa timpeallacht. Tá gá le staidéir amach anseo ag baint úsáide as RNA íonaithe faoi láthair chun an víreas RNA a thréithriú.
Inár staidéar, d'úsáideamar píblíne an-dian a oiriúnaíodh ó obair Kowarski agus a chomhghleacaithe [37], a d'úsáid scriosadh dhá chéim de léamha comhthiomsaithe agus contigs roimh agus tar éis tionól ccfDNA dúchasach, rud a d'eascair cion ard de léamha gan mhapáil. Dá bhrí sin, ní féidir linn a chur as an áireamh go bhféadfadh a mbunús féin a bheith ag cuid de na léamha gan mhapáil seo fós, go príomha toisc nach bhfuil géanóm tagartha againn don speiceas diúilicíní seo. D'úsáideamar an píblíne seo freisin toisc go raibh imní orainn faoi na ciméirí idir léamha féin agus léamha neamhfhéin agus na faid léitheoireachta a ghineann an Illumina MiSeq PE75. Cúis eile leis an gcuid is mó de na léamha gan chairt ná nach bhfuil cuid mhór de na miocróib mhuirí, go háirithe i gceantair iargúlta ar nós Kerguelen, anótáilte. D'úsáideamar Illumina MiSeq PE75, ag glacadh leis go bhfuil faid blúire ccfDNA cosúil le ccfDNA daonna. I gcás staidéir amach anseo, i bhfianaise ár dtorthaí a léiríonn go bhfuil léamha níos faide ag ccfDNA hemolymph ná mar atá ag daoine agus/nó mamaigh, molaimid ardán seicheamhaithe a úsáid atá níos oiriúnaí do blúirí ccfDNA níos faide. Cuirfidh an cleachtas seo go mór le héascaíocht níos mó tásca a aithint le haghaidh anailíse níos doimhne. Dá bhfaighfí seicheamh iomlán géanóim núicléach A. atra, nach bhfuil ar fáil faoi láthair, bheadh ​​sé go mór le hidirdhealú a dhéanamh idir ccfDNA agus foinsí féin agus foinsí neamhfhéin. Ós rud é go bhfuil ár dtaighde dírithe ar an bhféidearthacht coincheap na bithóipse leachta a chur i bhfeidhm ar dhiúilicíní, tá súil againn, de réir mar a úsáidfear an coincheap seo i dtaighde amach anseo, go bhforbrófar uirlisí agus píblínte nua chun acmhainneacht an mhodha seo a mhéadú chun éagsúlacht mhiocróbach diúilicíní agus éiceachóras mara a staidéar.
Mar bhithmharcóir cliniciúil neamh-ionrach, tá leibhéil arda ccfDNA i bplasma daonna bainteach le galair éagsúla, damáiste fíocháin, agus coinníollacha struis [67,68,69]. Tá an méadú seo bainteach le scaoileadh blúirí DNA dá mbunús féin tar éis damáiste fíocháin. Phléamar an cheist seo trí úsáid a bhaint as strus teasa géar, inar nochtadh diúilicíní go hachomair do theocht 30 °C. Rinneamar an anailís seo ar thrí chineál éagsúla diúilicíní i dtrí thurgnamh neamhspleácha. Mar sin féin, ní bhfuaireamar aon athrú ar leibhéil ccfDNA tar éis strus teasa géar (féach Fíor S5, faisnéis bhreise). D’fhéadfadh an fionnachtain seo a mhíniú, ar a laghad i bpáirt, an fhíric go bhfuil córas imshruthaithe leathoscailte ag diúilicíní agus go gcarnaíonn siad méideanna móra DNA coigríche mar gheall ar a ngníomhaíocht scagacháin ard. Ar an láimh eile, d’fhéadfadh diúilicíní, cosúil le go leor inveirteabrach, a bheith níos frithsheasmhaí i gcoinne damáiste fíocháin de bharr struis, rud a chuireann srian ar scaoileadh ccfDNA ina n-hemolymph [70, 71].
Go dtí seo, dhírigh anailís DNA ar bhithéagsúlacht in éiceachórais uisceacha go príomha ar mheiteabharachódú DNA comhshaoil ​​(eDNA). Mar sin féin, is gnách go mbíonn an modh seo teoranta in anailís bhithéagsúlachta nuair a úsáidtear tosaitheoirí. Seachnaíonn úsáid seicheamhú gunna gráin teorainneacha PCR agus an roghnú claonta tacair tosaitheoirí. Dá bhrí sin, ar bhealach, tá ár modh níos gaire don mhodh seicheamhú gunna gráin eDNA ard-tréchur a úsáideadh le déanaí, atá in ann DNA ilroinnte a sheicheamhú go díreach agus beagnach gach orgánach a anailísiú [72, 73]. Mar sin féin, tá roinnt saincheisteanna bunúsacha ann a dhéanann idirdhealú idir LB agus modhanna caighdeánacha eDNA. Ar ndóigh, is é an príomhdhifríocht idir eDNA agus LB ná úsáid óstach scagaire nádúrtha. Tuairiscíodh úsáid speiceas mara ar nós spúinsí agus débhlaoscaigh (Dresseina spp.) mar scagaire nádúrtha chun eDNA a staidéar [74, 75]. Mar sin féin, úsáideadh bithóipsí fíocháin as ar baineadh DNA. Ní gá bithóipse fíocháin, trealamh speisialaithe agus uaireanta costasach agus lóistíocht a bhaineann le eDNA nó bithóipse fíocháin le haghaidh anailíse ar ccfDNA ó LB. Déanta na fírinne, thuairiscigh muid le déanaí gur féidir ccfDNA ó LB a stóráil agus a anailísiú le tacaíocht FTA gan slabhra fuar a choinneáil, rud atá ina dhúshlán mór do thaighde i gceantair iargúlta [76]. Tá eastóscadh ccfDNA ó bhithóipsí leachtacha simplí freisin agus soláthraíonn sé DNA ardchaighdeáin le haghaidh seicheamhú gunna gráin agus anailís PCR. Is buntáiste mór é seo i bhfianaise cuid de na teorainneacha teicniúla a bhaineann le hanailís eDNA [77]. Tá simplíocht agus costas íseal an mhodha samplála oiriúnach go háirithe do chláir monatóireachta fadtéarmacha. Chomh maith lena gcumas scagacháin ard, is gné aitheanta eile de dhébhlaoscaigh comhdhéanamh ceimiceach mucopolyaccharide a múcas, rud a chuireann ionsú víris chun cinn [78, 79]. Fágann sé seo gur scagaire nádúrtha idéalach iad débhlaoscaigh chun bithéagsúlacht agus tionchar an athraithe aeráide in éiceachóras uisceach ar leith a shainiú. Cé gur féidir láithreacht blúirí DNA díorthaithe ón óstach a fheiceáil mar theorainn den mhodh i gcomparáid le eDNA, tá an costas a bhaineann le ccfDNA dúchasach den sórt sin a bheith agat i gcomparáid le eDNA intuigthe ag an am céanna don mhéid ollmhór faisnéise atá ar fáil do staidéir sláinte fritháireamh an óstaigh. Áirítear leis seo láithreacht seichimh víreasacha atá comhtháite i ngéanóm an óstaigh óstaigh. Tá sé seo thar a bheith tábhachtach do dhiúilicíní, i bhfianaise láithreacht retrovíris leoicéimeacha a tharchuirtear go cothrománach i nduibheagáin [80, 81]. Buntáiste eile a bhaineann le LB thar eDNA ná go mbaintear leas as gníomhaíocht fagaicíteach na gcealla fola atá ag scaipeadh sa hemolymph, a shlogann miocrorgánaigh (agus a ngéanóim). Is í fagaicítóis príomhfheidhm na gcealla fola i nduibheagáin [82]. Ar deireadh, baineann an modh leas as cumas ard scagacháin na ndiúilicíní (meán 1.5 l/u d'uisce farraige) agus cúrsaíocht dhá lá, rud a mhéadaíonn meascadh sraitheanna éagsúla d'uisce farraige, rud a ligeann gabháil eDNA heitrealógach. [83, 84]. Dá bhrí sin, is bealach suimiúil é anailís ccfDNA diúilicíní i bhfianaise thionchair chothaitheacha, eacnamaíocha agus chomhshaoil ​​​​na ndiúilicíní. Cosúil le hanailís LB a bhailítear ó dhaoine, osclaíonn an modh seo an fhéidearthacht freisin athruithe géiniteacha agus eipiginéiteacha i DNA an óstaigh a thomhas mar fhreagairt ar shubstaintí eisigineacha. Mar shampla, is féidir teicneolaíochtaí seicheamhaithe tríú glúin a shamhlú chun anailís meitileála ar fud an ghéanóim a dhéanamh i ccfDNA dúchasach ag baint úsáide as seicheamhú nana-phorach. Ba cheart an próiseas seo a éascú mar gheall ar an bhfíric go bhfuil fad na mblúirí ccfDNA diúilicíní comhoiriúnach go hidéalach le hardáin seicheamhaithe fad-léithe a cheadaíonn anailís meitileála DNA ar fud an ghéanóim ó rith seicheamhaithe aonair gan gá le claochluithe ceimiceacha.85,86] Is féidearthacht spéisiúil í seo, mar a léiríodh go léiríonn patrúin meitileála DNA freagairt do strus comhshaoil ​​​​agus go mairfidh siad thar go leor glúnta. Dá bhrí sin, is féidir leis léargas luachmhar a sholáthar ar na meicníochtaí bunúsacha a rialaíonn freagairt tar éis nochtadh d'athrú aeráide nó do thruailleáin [87]. Mar sin féin, níl úsáid LB gan teorainneacha. Ní gá a rá, éilíonn sé seo láithreacht speiceas táscaire san éiceachóras. Mar a luadh thuas, éilíonn úsáid LB chun bithéagsúlacht éiceachórais ar leith a mheas píblíne bithfhaisnéise dian a chuireann san áireamh láithreacht blúirí DNA ón bhfoinse. Fadhb mhór eile is ea infhaighteacht géanóm tagartha do speicis mhuirí. Táthar ag súil go n-éascóidh tionscnaimh ar nós Thionscadal Géanóim na Mamach Mara agus tionscadal Fish10k a bunaíodh le déanaí [88] anailís den sórt sin amach anseo. Tá cur i bhfeidhm choincheap LB ar orgánaigh mhuirí a bheathaíonn trí scagairí comhoiriúnach freisin leis na dul chun cinn is déanaí i dteicneolaíocht seicheamhaithe, rud a fhágann go bhfuil sé an-oiriúnach d'fhorbairt bithmharcóirí il-óm chun faisnéis thábhachtach a sholáthar faoi shláinte gnáthóga mara mar fhreagairt ar strus comhshaoil.
Tá sonraí seicheamhú géanóim taiscthe i gCartlann Léitheoireachta Seicheamh NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 faoi Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Tionchar an athraithe aeráide ar shaol na mara agus ar éiceachórais. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Breithnigh na tionchair chomhcheangailte a bhíonn ag an athrú aeráide agus strusóirí áitiúla eile ar an timpeallacht mhuirí. timpeallacht eolaíoch ghinearálta. 2021;755:142564.
Carela F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Eolaíocht an chéad cheann de Mhárta. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Míníonn an chaoinfhulaingt teasa laghdaithe faoi dhálaí struis teasa athchleachtacha an ráta ard báis i measc diúilicíní gorma sa samhradh. Tuarascáil eolaíoch 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Athruithe le déanaí i minicíocht, cúiseanna agus fairsinge básanna ainmhithe. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. D’fhéadfadh go mbeadh mais-mhortlaíocht Pinna nobilis mar thoradh ar phataiginí iomadúla neamhspeicis-shonracha. Saol. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Tionchar féideartha an athraithe aeráide ar ghalair zó-nóiseacha Artacha. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Diúilicíní gorma (Mytilus edulis spp.) mar orgánaigh chomharthaíochta i monatóireacht truaillithe cósta: athbhreithniú. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Comhtháthú bithóipse leachta i gcóireáil ailse. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Aibiú bithóipse leachtach: Ceadaíonn sé do DNA an meall scaipeadh. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Aigéid núicléacha i plasma daonna. Miontuairiscí cruinnithe fhochuideachtaí Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ról nua do DNA saor ó chealla mar mharcóir móilíneach le haghaidh cóireála ailse. Cainníochtú anailíse bithmhólaí. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tagann bithóipse leachtach isteach sa chlinic – saincheisteanna cur chun feidhme agus dúshláin amach anseo. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW agus daoine eile. Tá ADN féatais i láthair i bplasma agus i séiream máthar. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Staidéar ar chúrsa an toirchis agus a dheacrachtaí ag baint úsáide as RNA eachtarcheallach atá i gcúrsaíocht i bhfuil na mban le linn toirchis. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Bithóipse leachtach: úsáidtear DNA saor ó chealla deontóra chun léasanna allógéineacha a bhrath i ngraft duáin. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nuálaíochtaí i ndiagnóisic réamhbhreithe: seicheamhú géanóim plasma máthar. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Brath tapa pataiginí le seicheamhú meitigéineomach an chéad ghlúin eile ar shreabháin choirp ionfhabhtaithe. Nat Medicine. 2021;27:115-24.