Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Flytende biopsi (LB) er et konsept som raskt vinner popularitet innen biomedisinsk feltet. Konseptet er hovedsakelig basert på deteksjon av fragmenter av sirkulerende ekstracellulært DNA (ccfDNA), som hovedsakelig frigjøres som små fragmenter etter celledød i ulike vev. En liten andel av disse fragmentene stammer fra fremmede vev eller organismer. I nåværende arbeid har vi anvendt dette konseptet på blåskjell, en sentinelart kjent for sin høye filtreringskapasitet for sjøvann. Vi bruker blåskjellenes evne til å fungere som naturlige filtre for å fange opp miljø-DNA-fragmenter fra en rekke kilder for å gi informasjon om biologisk mangfold i marine kystøkosystemer. Resultatene våre viser at blåskjellhemolymfen inneholder DNA-fragmenter som varierer sterkt i størrelse, fra 1 til 5 kb. Haglgeværsekvensering viste at et stort antall DNA-fragmenter er av fremmed mikrobiell opprinnelse. Blant dem fant vi DNA-fragmenter fra bakterier, arkea og virus, inkludert virus kjent for å infisere en rekke verter som vanligvis finnes i kystnære marine økosystemer. Avslutningsvis viser studien vår at konseptet LB brukt på blåskjell representerer en rik, men ennå uutforsket kilde til kunnskap om mikrobielt mangfold i marine kystøkosystemer.
Virkningen av klimaendringer (CC) på det biologiske mangfoldet i marine økosystemer er et raskt voksende forskningsområde. Global oppvarming forårsaker ikke bare viktige fysiologiske stressfaktorer, men flytter også de evolusjonære grensene for den termiske stabiliteten til marine organismer, noe som påvirker habitatet til en rekke arter og får dem til å søke etter gunstigere forhold [1, 2]. I tillegg til å påvirke det biologiske mangfoldet til metazoer, forstyrrer CC den delikate balansen mellom vert-mikrobielle interaksjoner. Denne mikrobielle dysbakteriose utgjør en alvorlig trussel mot marine økosystemer, da den gjør marine organismer mer utsatt for smittsomme patogener [3, 4]. Det antas at SS spiller en viktig rolle i massedød, noe som er et alvorlig problem for forvaltningen av globale marine økosystemer [5, 6]. Dette er et viktig problem gitt de økonomiske, økologiske og ernæringsmessige konsekvensene av mange marine arter. Dette gjelder spesielt for muslinger som lever i polarområdene, hvor effektene av CK er mer umiddelbare og alvorlige [6, 7]. Faktisk er muslinger som Mytilus spp. mye brukt til å overvåke effektene av CC på marine økosystemer. Ikke overraskende har et relativt stort antall biomarkører blitt utviklet for å overvåke helsen deres, ofte ved bruk av en todelt tilnærming som involverer funksjonelle biomarkører basert på enzymatisk aktivitet eller cellulære funksjoner som cellelevedyktighet og fagocytisk aktivitet [8]. Disse metodene inkluderer også måling av konsentrasjonen av spesifikke trykkindikatorer som akkumuleres i bløtvev etter absorpsjon av store mengder sjøvann. Imidlertid gir den høye filtreringskapasiteten og det halvåpne sirkulasjonssystemet hos muslinger en mulighet til å utvikle nye hemolymfebiomarkører ved bruk av konseptet med flytende biopsi (LB), en enkel og minimalt invasiv tilnærming til pasientbehandling av blodprøver [9, 10]. Selv om flere typer sirkulerende molekyler kan finnes i humane LB, er dette konseptet primært basert på DNA-sekvenseringsanalyse av sirkulerende ekstracellulære DNA (ccfDNA)-fragmenter i plasma. Faktisk har tilstedeværelsen av sirkulerende DNA i humant plasma vært kjent siden midten av 1900-tallet [11], men det er først i de senere år at fremveksten av høykapasitetssekvenseringsmetoder har ført til klinisk diagnose basert på ccfDNA. Tilstedeværelsen av disse sirkulerende DNA-fragmentene skyldes delvis passiv frigjøring av genomisk DNA (kjerne- og mitokondrielt) etter celledød. Hos friske individer er konsentrasjonen av ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan økes 5–10 ganger hos pasienter som lider av ulike patologier eller er utsatt for stress, noe som resulterer i vevsskade. Hos friske individer er konsentrasjonen av ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan økes 5–10 ganger hos pasienter som lider av ulike patologier eller er utsatt for stress, noe som resulterer i vevsskade. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/mл), но может повышаться в 5–10 сразуся в 5–10 år патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos friske mennesker er konsentrasjonen av cccDNA normalt lav (<10 ng/ml), men den kan øke 5–10 ganger hos pasienter med ulike patologier eller under stress som fører til vevsskade.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng / ml在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刖 扊理 刖 扊中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 расично патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-konsentrasjoner er vanligvis lave (<10 ng/ml) hos friske individer, men kan økes 5–10 ganger hos pasienter med ulike patologier eller stress, noe som resulterer i vevsskade.Størrelsen på ccfDNA-fragmenter varierer mye, men varierer vanligvis fra 150 til 200 bp. [12]. Analyse av selvavledet ccfDNA, dvs. ccfDNA fra normale eller transformerte vertsceller, kan brukes til å oppdage genetiske og epigenetiske endringer i det nukleære og/eller mitokondrielle genomet, og dermed hjelpe klinikere med å velge spesifikke molekylært målrettede terapier [13]. Imidlertid kan ccfDNA utvinnes fra fremmede kilder, som ccfDNA fra føtale celler under graviditet eller fra transplanterte organer [14,15,16,17]. ccfDNA er også en viktig informasjonskilde for å oppdage tilstedeværelsen av nukleinsyrer fra et smittsomt agens (fremmed), noe som tillater ikke-invasiv deteksjon av utbredte infeksjoner som ikke identifiseres av blodkulturer, og unngår invasiv biopsi av infisert vev [18]. Nyere studier har faktisk vist at menneskeblod inneholder en rik kilde til informasjon som kan brukes til å identifisere virale og bakterielle patogener, og at omtrent 1 % av ccfDNA som finnes i menneskelig plasma er av fremmed opprinnelse [19]. Disse studiene viser at den biologiske mangfoldet i en organismes sirkulerende mikrobiom kan vurderes ved hjelp av ccfDNA-analyse. Inntil nylig ble imidlertid dette konseptet utelukkende brukt hos mennesker og i mindre grad hos andre virveldyr [20, 21].
I denne artikkelen bruker vi LB-potensialet til å analysere ccfDNA til Aulacomya atra, en sørlig art som vanligvis finnes på de subantarktiske Kerguelenøyene, en gruppe øyer på toppen av et stort platå som ble dannet for 35 millioner år siden. Ved hjelp av et in vitro-eksperimentelt system fant vi at DNA-fragmenter i sjøvann raskt tas opp av blåskjell og kommer inn i hemolymfe-rommet. Haglesekvensering har vist at blåskjells hemolymfe-ccfDNA inneholder DNA-fragmenter av egen og ikke-selvopprinnelse, inkludert symbiotiske bakterier og DNA-fragmenter fra biomer typiske for kalde vulkanske marine kystøkosystemer. Hemolymfe-ccfDNA inneholder også virussekvenser avledet fra virus med forskjellige vertsområder. Vi fant også DNA-fragmenter fra flercellede dyr som beinfisk, sjøanemoner, alger og insekter. Avslutningsvis viser studien vår at LB-konseptet kan brukes med hell på marine virvelløse dyr for å generere et rikt genomisk repertoar i marine økosystemer.
Voksne (55–70 mm lange) Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) ble samlet inn fra de tidevannslignende strendene i Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 Ø). Kerguelenøyene i desember 2018. Andre voksne blåskjell (Mytilus spp.) ble anskaffet fra en kommersiell leverandør (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) og plassert i en temperaturkontrollert (4 °C) luftet tank som inneholdt 10–20 liter 32‰ kunstig saltlake (kunstig havsalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). For hvert eksperiment ble lengden og vekten av de individuelle skjellene målt.
En gratis, åpen tilgangsprotokoll for dette programmet er tilgjengelig på nett (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kort fortalt ble LB-hemolymfe samlet inn fra abduktormuskler som beskrevet [22]. Hemolymfen ble klarnet ved sentrifugering ved 1200 × g i 3 minutter, og supernatanten ble frosset (-20 °C) inntil bruk. For isolering og rensing av cfDNA ble prøver (1,5–2,0 ml) tint og behandlet ved hjelp av NucleoSnap cfDNA-settet (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) i henhold til produsentens instruksjoner. ccfDNA ble lagret ved -80 °C inntil videre analyse. I noen eksperimenter ble ccfDNA isolert og renset ved hjelp av QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Renset DNA ble kvantifisert ved hjelp av en standard PicoGreen-analyse. Fragmentfordelingen av det isolerte ccfDNA-et ble analysert ved kapillærelektroforese ved bruk av en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) med et High Sensitivity DNA Kit. Analysen ble utført med 1 µl av ccfDNA-prøven i henhold til produsentens instruksjoner.
For sekvensering av hemolymfe ccfDNA-fragmenter fremstilte Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) shotgun-biblioteker ved hjelp av Illumina DNA Mix-settet fra Illumina MiSeq PE75-settet. En standardadapter (BioO) ble brukt. Rådatafiler er tilgjengelige fra NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809). Grunnleggende lesekvalitet ble vurdert ved hjelp av FastQC [23]. Trimmomatic [24] har blitt brukt for klipping av adaptere og avlesninger av dårlig kvalitet. Shotgun-avlesninger med parede ender ble FLASH-slått sammen til lengre enkeltavlesninger med en minimumsoverlapping på 20 bp for å unngå uoverensstemmelser [25]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av en NCBI-taksonomidatabase for muslinger (e-verdi < 1e−3 og 90 % homologi), og maskering av lavkomplekse sekvenser ble utført ved bruk av DUST [26]. Sammenslåtte avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av en NCBI-taksonomidatabase for muslinger (e-verdi < 1e−3 og 90 % homologi), og maskering av lavkomplekse sekvenser ble utført ved bruk av DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии BINCова (nedsatt e < 1e-3 og 90 % гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельном с ис. Samlede avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av NCBIs taksonomidatabase for muslinger (e-verdi < 1e-3 og 90 % homologi), og lavkompleks sekvensmaskering ble utført ved bruk av DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿幕[2]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2 ， du 2.进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных малстых молуNCор (nedsatt e <1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельоль с исп6]. Samlede avlesninger ble annotert med BLASTN ved bruk av NCBIs taksonomiske database for muslinger (e-verdi <1e-3 og 90 % homologi), og sekvensmaskering med lav kompleksitet ble utført ved bruk av DUST [26].Avlesningene ble delt inn i to grupper: relaterte til muslingsekvenser (her kalt selvavlesninger) og urelaterte (ikke-selvavlesninger). To grupper ble satt sammen separat ved hjelp av MEGAHIT for å generere contigs [27]. I mellomtiden ble den taksonomiske fordelingen av fremmede mikrobiomavlesninger klassifisert ved hjelp av Kraken2 [28] og grafisk representert av et Krona-kakediagram på Galaxy [29, 30]. De optimale kmerene ble bestemt til å være kmer-59 fra våre foreløpige eksperimenter. Selvkontiger ble deretter identifisert ved tilpasning med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi) for en endelig annotering. Selvkontiger ble deretter identifisert ved tilpasning med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi) for en endelig annotering. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлыю, з BINC м <1e-10 og гомология 60%) for окончательной аннотации. Selvkontiger ble deretter identifisert ved matching mot BLASTN (NCBI toskalldatabase, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi) for endelig annotering.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги for окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BiNC двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 og гомология 60%). Selvkontiger ble deretter identifisert for endelig annotering ved å matche mot BLASTN (NCBI toskallsdatabase, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi). Parallelt ble ikke-selvgruppekontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi). Parallelt ble ikke-selvgruppekontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (på grunnlag av NCBI, 1. januar 10. januar 60 %). Parallelt ble fremmede gruppekontiger annotert med BLASTN (NT NCBI-database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组羇〠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныNC) <1e-10 og гомология 60 %). Parallelt ble ikke-selvgruppekontiger annotert med BLASTN (nt NCBI-database, e-verdi <1e-10 og 60 % homologi). BLASTX ble også utført på ikke-selv-contigs ved bruk av nr- og RefSeq-protein-NCBI-databasene (e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi). BLASTX ble også utført på ikke-selv-contigs ved bruk av nr- og RefSeq-protein-NCBI-databasene (e-verdi < 1e−10 og 60 % homologi). BLASTX er tilgjengelig for несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr. и RefSeq NCBI (f. 1e-1. гомология 60 %). BLASTX ble også utført på ikke-selv-contigs ved bruk av nr- og RefSeq NCBI-proteindatabasene (e-verdi < 1e-10 og 60 % homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (september <1e-1) гомология 60 %). BLASTX ble også utført på ikke-selv-contigs ved bruk av nr- og RefSeq NCBI-proteindatabasene (e-verdi <1e-10 og 60 % homologi).BLASTN- og BLASTX-poolene av ikke-selv-contigs representerer de endelige contigs (se tilleggsfil).
Primerne som ble brukt til PCR er listet opp i tabell S1. Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ble brukt til å amplifisere ccfDNA-målgenene. Følgende reaksjonsbetingelser ble brukt: denaturering ved 95 °C i 3 minutter, 95 °C i 1 minutt, innstilt annealingtemperatur i 1 minutt, forlengelse ved 72 °C i 1 minutt, 35 sykluser og til slutt 72 °C innen 10 minutter. PCR-produktene ble separert ved elektroforese i agarosegeler (1,5 %) som inneholdt SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ved 95 V.
Blåskjell (Mytilus spp.) ble akklimatisert i 500 ml oksygenert sjøvann (32 PSU) i 24 timer ved 4 °C. Plasmid-DNA som inneholdt et innskudd som koder for den humane galectin-7 cDNA-sekvensen (NCBI-tiltredelsesnummer L07769) ble tilsatt ampullen i en sluttkonsentrasjon på 190 μg/μl. Blåskjell inkubert under de samme forholdene uten DNA-tilsetning var kontrollen. Den tredje kontrolltanken inneholdt DNA uten blåskjell. For å overvåke kvaliteten på DNA i sjøvann ble sjøvannsprøver (20 μl; tre repetisjoner) tatt fra hver tank til angitt tid. For sporbarhet av plasmid-DNA ble LB-blåskjell høstet til angitt tid og analysert med qPCR og ddPCR. På grunn av det høye saltinnholdet i sjøvann ble alikvoter fortynnet i vann av PCR-kvalitet (1:10) før alle PCR-analyser.
Digital dråpe-PCR (ddPCR) ble utført ved hjelp av BioRad QX200-protokollen (Mississauga, Ontario, Canada). Bruk temperaturprofilen til å bestemme den optimale temperaturen (tabell S1). Dråper ble generert ved hjelp av en QX200 dråpegenerator (BioRad). ddPCR ble utført som følger: 95 °C i 5 minutter, 50 sykluser på 95 °C i 30 sekunder og en gitt annealingtemperatur i 1 minutt og 72 °C i 30 sekunder, 4 °C i 5 minutter og 90 °C innen 5 minutter. Antall dråper og positive reaksjoner (antall kopier/µl) ble målt ved hjelp av en QX200 dråpeavleser (BioRad). Prøver med mindre enn 10 000 dråper ble avvist. Mønsterkontroll ble ikke utført hver gang ddPCR ble kjørt.
qPCR ble utført ved bruk av Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) og LGALS7-spesifikke primere. Alle kvantitative PCR-er ble utført i 20 µl ved bruk av QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR ble startet med en 15 minutters inkubasjon ved 95 °C etterfulgt av 40 sykluser ved 95 °C i 10 sekunder og ved 60 °C i 60 sekunder med én datainnsamling. Smeltekurver ble generert ved bruk av suksessive målinger ved 95 °C i 5 sekunder, 65 °C i 60 sekunder og 97 °C på slutten av qPCR-en. Hver qPCR ble utført i triplikat, med unntak av kontrollprøvene.
Siden blåskjell er kjent for sin høye filtreringshastighet, undersøkte vi først om de kunne filtrere og holde på DNA-fragmenter som finnes i sjøvann. Vi var også interessert i om disse fragmentene akkumuleres i deres halvåpne lymfesystem. Vi løste dette problemet eksperimentelt ved å spore skjebnen til løselige DNA-fragmenter som ble tilsatt blåskjelltanker. For å lette sporing av DNA-fragmenter brukte vi fremmed (ikke selv) plasmid-DNA som inneholdt det humane galectin-7-genet. ddPCR sporer plasmid-DNA-fragmenter i sjøvann og blåskjell. Resultatene våre viser at hvis mengden DNA-fragmenter i sjøvann forble relativt konstant over tid (opptil 7 dager) i fravær av blåskjell, forsvant dette nivået nesten fullstendig innen 8 timer i nærvær av blåskjell (fig. 1a, b). Fragmenter av eksogent DNA ble lett oppdaget innen 15 minutter i intravalvulær væske og hemolymfe (fig. 1c). Disse fragmentene kunne fortsatt oppdages opptil 4 timer etter eksponering. Denne filtreringsaktiviteten med hensyn til DNA-fragmenter er sammenlignbar med filtreringsaktiviteten til bakterier og alger [31]. Disse resultatene tyder på at blåskjell kan filtrere og akkumulere fremmed DNA i væskerommene sine.
Relative konsentrasjoner av plasmid-DNA i sjøvann i nærvær (A) eller fravær (B) av blåskjell, målt med ddPCR. I A er resultatene uttrykt som prosentandeler, der rammene i boksene representerer 75. og 25. persentil. Den tilpassede logaritmiske kurven er vist i rødt, og området skyggelagt i grått representerer 95 % konfidensintervallet. I B representerer den røde linjen gjennomsnittet og den blå linjen representerer 95 % konfidensintervallet for konsentrasjonen. C Akkumulering av plasmid-DNA i hemolymfen og klaffevæsken hos blåskjell på forskjellige tidspunkter etter tilsetning av plasmid-DNA. Resultatene presenteres som absolutte kopier detektert/ml (±SE).
Deretter undersøkte vi opprinnelsen til ccfDNA i blåskjell samlet fra blåskjellbanker på Kerguelenøyene, en avsidesliggende øygruppe med begrenset menneskeskapt påvirkning. For dette formålet ble cccDNA fra blåskjellhemolymfer isolert og renset ved hjelp av metoder som vanligvis brukes til å rense menneskelig cccDNA [32, 33]. Vi fant at gjennomsnittlige hemolymfe-ccfDNA-konsentrasjoner i blåskjell er i det lave mikrogram per ml hemolymfeområdet (se tabell S2, tilleggsinformasjon). Dette konsentrasjonsområdet er mye større enn hos friske mennesker (lave nanogram per milliliter), men i sjeldne tilfeller, hos kreftpasienter, kan nivået av ccfDNA nå flere mikrogram per milliliter [34, 35]. En analyse av størrelsesfordelingen til hemolymfe-ccfDNA viste at disse fragmentene varierer sterkt i størrelse, fra 1000 bp til 1000 bp og opptil 5000 bp (fig. 2). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av det silikabaserte QIAamp Investigator Kit, en metode som ofte brukes i rettsmedisin for raskt å isolere og rense genomisk DNA fra DNA-prøver med lav konsentrasjon, inkludert ccfDNA [36].
Representativt ccfDNA-elektroforegram av blåskjellhemolymfe. Ekstrahert med NucleoSnap Plasma Kit (øverst) og QIAamp DNA Investigator Kit. B Fiolinplott som viser fordelingen av hemolymfe-ccfDNA-konsentrasjoner (±SE) i blåskjell. De svarte og røde linjene representerer medianen og henholdsvis første og tredje kvartil.
Omtrent 1 % av ccfDNA hos mennesker og primater har en fremmed kilde [21, 37]. Gitt det halvåpne sirkulasjonssystemet til muslinger, mikrobielt rikt sjøvann og størrelsesfordelingen til blåskjell-ccfDNA, antok vi at blåskjell-hemolymfe-ccfDNA kan inneholde et rikt og mangfoldig basseng av mikrobielt DNA. For å teste denne hypotesen sekvenserte vi hemolymfe-ccfDNA fra Aulacomya atra-prøver samlet fra Kerguelenøyene, noe som ga over 10 millioner avlesninger, hvorav 97,6 % bestod kvalitetskontroll. Avlesningene ble deretter klassifisert i henhold til egen- og ikke-egenkilder ved hjelp av BLASTN- og NCBI-muslingdatabasene (fig. S1, tilleggsinformasjon).
Hos mennesker kan både kjerne- og mitokondrielt DNA frigjøres i blodet [38]. I denne studien var det imidlertid ikke mulig å beskrive det kjernegenomiske DNAet til blåskjell i detalj, gitt at A. atra-genomet ikke er sekvensert eller beskrevet. Vi var imidlertid i stand til å identifisere en rekke ccfDNA-fragmenter av vår egen opprinnelse ved hjelp av muslingbiblioteket (fig. S2, tilleggsinformasjon). Vi bekreftet også tilstedeværelsen av DNA-fragmenter av vår egen opprinnelse ved rettet PCR-amplifisering av de A. atra-genene som ble sekvensert (fig. 3). På samme måte, gitt at mitokondriegenomet til A. atra er tilgjengelig i offentlige databaser, kan man finne bevis for tilstedeværelsen av mitokondrielle ccfDNA-fragmenter i hemolymfen til A. atra. Tilstedeværelsen av mitokondrielle DNA-fragmenter ble bekreftet ved PCR-amplifisering (fig. 3).
Ulike mitokondrielle gener var tilstede i hemolymfen til A. atra (røde prikker – varenr.: SRX5705969) og M. platensis (blå prikker – varenr.: SRX5705968) amplifisert ved PCR. Figur tilpasset fra Breton et al., 2011 B Amplifisering av hemolymfesupernatant fra A. atra Lagret på FTA-papir. Bruk en 3 mm dorn til å tilsette direkte til PCR-røret som inneholder PCR-blandingen.
Gitt det rikelige mikrobielle innholdet i sjøvann, fokuserte vi først på karakterisering av mikrobielle DNA-sekvenser i hemolymfe. For å gjøre dette bruker vi to forskjellige strategier. Den første strategien brukte Kraken2, et algoritmebasert sekvensklassifiseringsprogram som kan identifisere mikrobielle sekvenser med en nøyaktighet som er sammenlignbar med BLAST og andre verktøy [28]. Mer enn 6719 avlesninger ble bestemt å være av bakteriell opprinnelse, mens 124 og 64 var fra henholdsvis arkea og virus (fig. 4). De mest tallrike bakterielle DNA-fragmentene var Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) og Bacteroidetes (17 %) (fig. 4a). Denne fordelingen er i samsvar med tidligere studier av det marine blåskjell-mikrobiomet [39, 40]. Gammaproteobakterier var hovedklassen av Proteobacteria (44 %), inkludert mange Vibrionales (fig. 4b). ddPCR-metoden bekreftet tilstedeværelsen av Vibrio DNA-fragmenter i ccfDNA til A. atra-hemolymfen (fig. 4c) [41]. For å få mer informasjon om den bakterielle opprinnelsen til ccfDNA ble det tatt en tilleggsmetode (fig. S2, tilleggsinformasjon). I dette tilfellet ble overlappende avlesninger satt sammen som parvise avlesninger og klassifisert som av selv- (muslinger) eller ikke-selv-opprinnelse ved bruk av BLASTN og en e-verdi på 1e−3 og en grenseverdi med >90 % homologi. I dette tilfellet ble overlappende avlesninger satt sammen som parvise avlesninger og klassifisert som av selv- (muslinger) eller ikke-selv-opprinnelse ved bruk av BLASTN og en e-verdi på 1e−3 og en grenseverdi med >90 % homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиов (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения 9% 0%. I dette tilfellet ble overlappende avlesninger samlet inn som parvise avlesninger og klassifisert som native (toskall) eller ikke-originale ved bruk av BLASTN og e-verdi på 1e-3 og grenseverdi med >90 % homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和叠3 皒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焚 使焚 的 焚 甌值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 и порог. I dette tilfellet ble overlappende avlesninger samlet inn som parvise avlesninger og klassifisert som egne (muslinger) eller ikke-originale ved bruk av e BLASTN- og 1e-3-verdier og en homologiterskel >90 %.Siden A. atra-genomet ennå ikke er sekvensert, brukte vi de novo-assemblingsstrategien til MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assembleren. Totalt 147 188 contigs har blitt identifisert som avhengige (muslinger) av opprinnelse. Disse contigs ble deretter eksplodert med e-verdier på 1e-10 ved bruk av BLASTN og BLASTX. Denne strategien tillot oss å identifisere 482 ikke-muslingfragmenter som finnes i A. atra ccfDNA. Mer enn halvparten (57 %) av disse DNA-fragmentene ble hentet fra bakterier, hovedsakelig fra gjellesymbionter, inkludert sulfotrofe symbionter, og fra gjellesymbionten Solemya velum (fig. 5).
Relativ forekomst på typenivå. B Mikrobielt mangfold av to hovedfyla (Firmicutes og Proteobacteria). Representativ amplifisering av ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenter av 16S rRNA-genet (blått) i tre atra-hemolymfer.
Totalt 482 innsamlede contigs ble analysert. Generell profil av den taksonomiske fordelingen av metagenomiske contig-annotasjoner (prokaryoter og eukaryoter). B Detaljert fordeling av bakterielle DNA-fragmenter identifisert av BLASTN og BLASTX.
Kraken2-analyse viste også at blåskjell-ccfDNA inneholdt arkeiske DNA-fragmenter, inkludert DNA-fragmenter fra Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) og Thaurmarcheota (11 %) (fig. 6a). Tilstedeværelsen av DNA-fragmenter avledet fra Euryarchaeota og Crenarchaeota, som tidligere ble funnet i det mikrobielle samfunnet av kaliforniske blåskjell, burde ikke komme som noen overraskelse [42]. Selv om Euryarchaeota ofte er assosiert med ekstreme forhold, er det nå anerkjent at både Euryarchaeota og Crenarcheota er blant de vanligste prokaryotene i det marine kryogene miljøet [43, 44]. Tilstedeværelsen av metanogene mikroorganismer i blåskjell er ikke overraskende, gitt nylige rapporter om omfattende metanlekkasjer fra bunnlekkasjer på Kerguelen-platået [45] og mulig mikrobiell metanproduksjon observert utenfor kysten av Kerguelen-øyene [46].
Vår oppmerksomhet flyttet seg deretter til avlesninger fra DNA-virus. Så vidt vi vet, er dette den første off-target-studien av virusinnholdet i blåskjell. Som forventet fant vi DNA-fragmenter av bakteriofager (Caudovirales) (fig. 6b). Imidlertid kommer det vanligste virale DNA-et fra en rekke av nukleocytovirus, også kjent som det nukleære cytoplasmatiske store DNA-viruset (NCLDV), som har det største genomet av alle virus. Innenfor denne rekken tilhører de fleste DNA-sekvensene familiene Mimimidoviridae (58 %) og Poxviridae (21 %), hvis naturlige verter inkluderer virveldyr og leddyr, mens en liten andel av disse DNA-sekvensene tilhører kjente virologiske alger. Infiserer marine eukaryote alger. Sekvensene ble også hentet fra Pandora-viruset, kjempeviruset med den største genomstørrelsen av alle kjente virusslekter. Interessant nok var utvalget av verter som er kjent for å være infisert med viruset, bestemt ved hemolymfe ccfDNA-sekvensering, relativt stort (figur S3, tilleggsinformasjon). Det inkluderer virus som infiserer insekter som Baculoviridae og Iridoviridae, samt virus som infiserer amøber, alger og virveldyr. Vi fant også sekvenser som samsvarer med Pithovirus sibericum-genomet. Pitovirus (også kjent som «zombievirus») ble først isolert fra 30 000 år gammel permafrost i Sibir [47]. Dermed er resultatene våre i samsvar med tidligere rapporter som viser at ikke alle moderne arter av disse virusene er utryddet [48], og at disse virusene kan være tilstede i avsidesliggende subarktiske marine økosystemer.
Til slutt testet vi for å se om vi kunne finne DNA-fragmenter fra andre flercellede dyr. Totalt 482 fremmede contigs ble identifisert av BLASTN og BLASTX med nt-, nr- og RefSeq-biblioteker (genomiske og proteinbaserte). Resultatene våre viser at blant de fremmede fragmentene av ccfDNA fra flercellede dyr dominerer DNA fra bein (fig. 5). DNA-fragmenter fra insekter og andre arter er også funnet. En relativt stor del av DNA-fragmentene er ikke identifisert, muligens på grunn av underrepresentasjon av et stort antall marine arter i genomiske databaser sammenlignet med terrestriske arter [49].
I denne artikkelen anvender vi LB-konseptet på blåskjell, og argumenterer for at ccfDNA-sekvensering av hemolymfe kan gi innsikt i sammensetningen av marine kystøkosystemer. Spesielt fant vi at 1) blåskjellhemolymfe inneholder relativt høye konsentrasjoner (mikrogramnivåer) av relativt store (~1-5 kb) sirkulerende DNA-fragmenter; 2) disse DNA-fragmentene er både uavhengige og ikke-uavhengige; 3) Blant de fremmede kildene til disse DNA-fragmentene fant vi bakterielt, arkealt og viralt DNA, samt DNA fra andre flercellede dyr; 4) Akkumuleringen av disse fremmede ccfDNA-fragmentene i hemolymfen skjer raskt og bidrar til den interne filtreringsaktiviteten til blåskjell. Avslutningsvis viser studien vår at LB-konseptet, som så langt hovedsakelig har blitt brukt innen biomedisin, koder for en rik, men uutforsket kunnskapskilde som kan brukes til å bedre forstå samspillet mellom sentinelarter og deres miljø.
I tillegg til primater er det rapportert om ccfDNA-isolering hos pattedyr, inkludert mus, hunder, katter og hester [50, 51, 52]. Men så vidt vi vet, er vår studie den første som rapporterer deteksjon og sekvensering av ccfDNA hos marine arter med et åpent sirkulasjonssystem. Denne anatomiske egenskapen og filtreringsevnen hos blåskjell kan, i det minste delvis, forklare de forskjellige størrelsesegenskapene til sirkulerende DNA-fragmenter sammenlignet med andre arter. Hos mennesker er de fleste DNA-fragmentene som sirkulerer i blodet små fragmenter som varierer i størrelse fra 150 til 200 bp, med en maksimal topp på 167 bp [34, 53]. En liten, men betydelig andel av DNA-fragmentene er mellom 300 og 500 bp i størrelse, og omtrent 5 % er lengre enn 900 bp. [54]. Årsaken til denne størrelsesfordelingen er at hovedkilden til ccfDNA i plasma skjer som et resultat av celledød, enten på grunn av celledød eller på grunn av nekrose av sirkulerende hematopoietiske celler hos friske individer, eller på grunn av apoptose av tumorceller hos kreftpasienter (kjent som sirkulerende tumor-DNA, ctDNA). Størrelsesfordelingen av hemolymfe-ccfDNA som vi fant i blåskjell varierte fra 1000 til 5000 bp, noe som tyder på at blåskjell-ccfDNA har en annen opprinnelse. Dette er en logisk hypotese, siden blåskjell har et halvåpent karsystem og lever i marine akvatiske miljøer som inneholder høye konsentrasjoner av mikrobielt genomisk DNA. Faktisk har våre laboratorieeksperimenter med eksogent DNA vist at blåskjell akkumulerer DNA-fragmenter i sjøvann, i hvert fall etter noen få timer degraderes de etter cellulært opptak og/eller frigjøres og/eller lagres i forskjellige organisasjoner. Gitt sjeldenheten til celler (både prokaryote og eukaryote), vil bruk av intravalvulære rom redusere mengden ccfDNA fra egne kilder så vel som fra utenlandske kilder. Med tanke på viktigheten av medfødt immunitet hos muslinger og det store antallet sirkulerende fagocytter, antok vi videre at selv fremmed ccfDNA er anriket med sirkulerende fagocytter som akkumulerer fremmed DNA ved inntak av mikroorganismer og/eller cellulært avfall. Samlet sett viser resultatene våre at ccfDNA fra hemolymfen hos muslinger er et unikt lager av molekylær informasjon og forsterker deres status som en vaktpostart.
Våre data indikerer at sekvensering og analyse av bakterieavledede hemolymfe-ccfDNA-fragmenter kan gi nøkkelinformasjon om vertsbakteriefloraen og bakteriene som er tilstede i det omkringliggende marine økosystemet. Skuddsekvenseringsteknikker har avdekket sekvenser av den kommensale bakterien A. atra gill som ville blitt oversett hvis konvensjonelle 16S rRNA-identifikasjonsmetoder hadde blitt brukt, delvis på grunn av en referansebiblioteksskjevhet. Faktisk viste vår bruk av LB-data samlet fra M. platensis i det samme blåskjelllaget ved Kerguelen at sammensetningen av gjelleassosierte bakterielle symbionter var den samme for begge blåskjellartene (fig. S4, tilleggsinformasjon). Denne likheten mellom to genetisk forskjellige blåskjell kan gjenspeile sammensetningen av bakteriesamfunn i de kalde, svovelholdige og vulkanske avsetningene i Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Høyere nivåer av svovelreduserende mikroorganismer har blitt godt beskrevet ved høsting av blåskjell fra bioturberte kystområder [59], som kysten av Port-au-France. En annen mulighet er at den kommensale blåskjellfloraen kan være påvirket av horisontal overføring [60, 61]. Mer forskning er nødvendig for å bestemme sammenhengen mellom det marine miljøet, havbunnsoverflaten og sammensetningen av symbiotiske bakterier i blåskjell. Disse studiene pågår for tiden.
Lengden og konsentrasjonen av hemolymfe ccfDNA, den enkle rensingsmetoden og den høye kvaliteten som muliggjør rask shotgun-sekvensering er noen av de mange fordelene ved å bruke blåskjell-ccfDNA for å vurdere biologisk mangfold i marine kystøkosystemer. Denne tilnærmingen er spesielt effektiv for å karakterisere virussamfunn (viromer) i et gitt økosystem [62, 63]. I motsetning til bakterier, arkea og eukaryoter inneholder ikke virusgenomer fylogenetisk konserverte gener som 16S-sekvenser. Resultatene våre indikerer at flytende biopsier fra indikatorarter som blåskjell kan brukes til å identifisere relativt store antall ccfDNA-virusfragmenter som er kjent for å infisere verter som vanligvis bebor kystnære marine økosystemer. Dette inkluderer virus som er kjent for å infisere protozoer, leddyr, insekter, planter og bakterievirus (f.eks. bakteriofager). En lignende fordeling ble funnet da vi undersøkte hemolymfe ccfDNA-viromet til blåskjell (M. platensis) samlet i det samme blåskjelllaget ved Kerguelen (tabell S2, tilleggsinformasjon). Haglgeværsekvensering av ccfDNA er virkelig en ny tilnærming som får momentum i studiet av viromet til mennesker eller andre arter [21, 37, 64]. Denne tilnærmingen er spesielt nyttig for å studere dobbelttrådet DNA-virus, siden ingen enkelt gen er bevart blant alle dobbelttrådet DNA-virus, som representerer den mest mangfoldige og brede klassen av virus i Baltimore [65]. Selv om de fleste av disse virusene forblir uklassifiserte og kan inkludere virus fra en helt ukjent del av virusverdenen [66], fant vi at viromene og vertsområdene til blåskjellene A. atra og M. platensis faller mellom de to artene på samme måte (se figur S3, tilleggsinformasjon). Denne likheten er ikke overraskende, da den kan gjenspeile mangel på selektivitet i opptak av DNA som finnes i miljøet. Fremtidige studier med renset RNA er for tiden nødvendige for å karakterisere RNA-viromet.
I vår studie brukte vi en svært grundig prosesseringsplattform tilpasset arbeidet til Kowarski og kolleger [37], som brukte en totrinns sletting av samlede avlesninger og contigs før og etter sammenstilling av nativt ccfDNA, noe som resulterte i en høy andel umartlagte avlesninger. Derfor kan vi ikke utelukke at noen av disse umartlagte avlesningene fortsatt kan ha sin egen opprinnelse, først og fremst fordi vi ikke har et referansegenom for denne blåskjellarten. Vi brukte også denne prosesseringsplattformen fordi vi var bekymret for kimærene mellom selv- og ikke-selv-avlesninger og leselengdene generert av Illumina MiSeq PE75. En annen grunn til de fleste ikke-kartlagte avlesningene er at mye av de marine mikrobene, spesielt i avsidesliggende områder som Kerguelen, ikke har blitt annotert. Vi brukte Illumina MiSeq PE75, under antagelse av ccfDNA-fragmentlengder som ligner på menneskelig ccfDNA. For fremtidige studier, gitt resultatene våre som viser at hemolymfe-ccfDNA har lengre avlesninger enn mennesker og/eller pattedyr, anbefaler vi å bruke en sekvenseringsplattform som er mer egnet for lengre ccfDNA-fragmenter. Denne praksisen vil gjøre det mye enklere å identifisere flere indikasjoner for dypere analyse. Å innhente den for øyeblikket utilgjengelige komplette A. atra-kjernegenomsekvensen vil også i stor grad legge til rette for å skille ccfDNA fra selv- og ikke-selvkilder. Gitt at forskningen vår har fokusert på muligheten for å anvende konseptet med flytende biopsi på blåskjell, håper vi at når dette konseptet brukes i fremtidig forskning, vil nye verktøy og rørledninger bli utviklet for å øke potensialet til denne metoden for å studere det mikrobielle mangfoldet i blåskjell i det marine økosystemet.
Som en ikke-invasiv klinisk biomarkør er forhøyede nivåer av ccfDNA i menneskers plasma assosiert med ulike sykdommer, vevsskader og stressforhold [67,68,69]. Denne økningen er assosiert med frigjøring av DNA-fragmenter av egen opprinnelse etter vevsskade. Vi undersøkte dette problemet ved hjelp av akutt varmestress, der blåskjell ble kortvarig utsatt for en temperatur på 30 °C. Vi utførte denne analysen på tre forskjellige typer blåskjell i tre uavhengige eksperimenter. Vi fant imidlertid ingen endring i ccfDNA-nivåer etter akutt varmestress (se figur S5, ytterligere informasjon). Denne oppdagelsen kan i det minste delvis forklare det faktum at blåskjell har et halvåpent sirkulasjonssystem og akkumulerer store mengder fremmed DNA på grunn av deres høye filtreringsaktivitet. På den annen side kan blåskjell, som mange virvelløse dyr, være mer motstandsdyktige mot stressindusert vevsskade, og dermed begrense frigjøringen av ccfDNA i hemolymfen deres [70, 71].
Til dags dato har DNA-analyse av biologisk mangfold i akvatiske økosystemer hovedsakelig fokusert på metastrekoding av miljø-DNA (eDNA). Denne metoden er imidlertid vanligvis begrenset i analyse av biologisk mangfold når primere brukes. Bruken av shotgun-sekvensering omgår begrensningene til PCR og det partiske utvalget av primersett. Dermed er vår metode på en måte nærmere den nylig brukte høykapasitets eDNA Shotgun-sekvenseringsmetoden, som er i stand til å direkte sekvensere fragmentert DNA og analysere nesten alle organismer [72, 73]. Det er imidlertid en rekke grunnleggende problemer som skiller LB fra standard eDNA-metoder. Hovedforskjellen mellom eDNA og LB er selvfølgelig bruken av naturlige filterverter. Bruken av marine arter som svamper og muslinger (Dresseina spp.) som et naturlig filter for å studere eDNA har blitt rapportert [74, 75]. Dreissenas studie brukte imidlertid vevsbiopsier som DNA ble ekstrahert fra. Analyse av ccfDNA fra LB krever ikke vevsbiopsi, spesialisert og noen ganger dyrt utstyr og logistikk forbundet med eDNA eller vevsbiopsi. Faktisk rapporterte vi nylig at ccfDNA fra LB kan lagres og analyseres med FTA-støtte uten å opprettholde en kaldkjede, noe som er en stor utfordring for forskning i avsidesliggende områder [76]. Ekstraksjon av ccfDNA fra flytende biopsier er også enkel og gir DNA av høy kvalitet for shotgun-sekvensering og PCR-analyse. Dette er en stor fordel gitt noen av de tekniske begrensningene knyttet til eDNA-analyse [77]. Enkelheten og de lave kostnadene ved prøvetakingsmetoden er også spesielt egnet for langsiktige overvåkingsprogrammer. I tillegg til deres høye filtreringsevne, er en annen velkjent egenskap ved muslinger den kjemiske mukopolysakkarid-sammensetningen i slimet deres, som fremmer absorpsjon av virus [78, 79]. Dette gjør muslinger til et ideelt naturlig filter for å karakterisere biologisk mangfold og virkningen av klimaendringer i et gitt akvatisk økosystem. Selv om tilstedeværelsen av vertsavledede DNA-fragmenter kan sees på som en begrensning av metoden sammenlignet med eDNA, er kostnadene forbundet med å ha et slikt naturlig ccfDNA sammenlignet med eDNA samtidig forståelige for den enorme mengden informasjon som er tilgjengelig for helsestudier som er kompensert for verten. Dette inkluderer tilstedeværelsen av virussekvenser integrert i vertsorganismens genom. Dette er spesielt viktig for blåskjell, gitt tilstedeværelsen av horisontalt overførte leukemiske retrovirus hos muslinger [80, 81]. En annen fordel med LB fremfor eDNA er at det utnytter den fagocytiske aktiviteten til sirkulerende blodceller i hemolymfen, som oppsluker mikroorganismer (og deres genomer). Fagocytose er hovedfunksjonen til blodceller hos muslinger [82]. Til slutt utnytter metoden den høye filtreringskapasiteten til blåskjell (gjennomsnittlig 1,5 l/t sjøvann) og to-dagers sirkulasjon, som øker blandingen av forskjellige lag med sjøvann, noe som tillater fangst av heterologt eDNA. [83, 84]. Dermed er ccfDNA-analyse av blåskjell en interessant vei gitt de ernæringsmessige, økonomiske og miljømessige påvirkningene av blåskjell. I likhet med analysen av LB samlet fra mennesker, åpner denne metoden også for muligheten for å måle genetiske og epigenetiske endringer i verts-DNA som respons på eksogene stoffer. For eksempel kan tredjegenerasjons sekvenseringsteknologier tenkes for å utføre genomomfattende metyleringsanalyse i nativt ccfDNA ved bruk av nanoporesekvensering. Denne prosessen bør forenkles av det faktum at lengden på blåskjell-ccfDNA-fragmentene er ideelt kompatibel med sekvenseringsplattformer med lang avlesning som tillater genomomfattende DNA-metyleringsanalyse fra en enkelt sekvenseringskjøring uten behov for kjemiske transformasjoner.85,86] Dette er en interessant mulighet, da det har blitt vist at DNA-metyleringsmønstre reflekterer en respons på miljøstress og vedvarer over mange generasjoner. Derfor kan det gi verdifull innsikt i de underliggende mekanismene som styrer respons etter eksponering for klimaendringer eller forurensende stoffer [87]. Bruken av LB er imidlertid ikke uten begrensninger. Det sier seg selv at dette krever tilstedeværelse av indikatorarter i økosystemet. Som nevnt ovenfor krever bruk av LB for å vurdere biologisk mangfold i et gitt økosystem også en streng bioinformatisk rørledning som tar hensyn til tilstedeværelsen av DNA-fragmenter fra kilden. Et annet stort problem er tilgjengeligheten av referansegenomer for marine arter. Det er håp om at initiativer som Marine Mammal Genomes Project og det nylig etablerte Fish10k-prosjektet [88] vil legge til rette for slik analyse i fremtiden. Anvendelsen av LB-konseptet på marine filterlevende organismer er også kompatibel med de nyeste fremskrittene innen sekvenseringsteknologi, noe som gjør det godt egnet for utvikling av multi-ohm biomarkører for å gi viktig informasjon om helsen til marine habitater som respons på miljøstress.
Genomsekvenseringsdata er lagret i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimaendringers påvirkning på marint liv og økosystemer. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Vurder de kombinerte virkningene av klimaendringer og andre lokale stressfaktorer på havmiljøet. general scientific environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Vitenskap fra første mars. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Redusert varmetoleranse under repeterende varmestressforhold forklarer den høye sommerdødeligheten hos blåskjell. Vitenskapelig rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Nylige endringer i hyppigheten, årsakene og omfanget av dyredødsfall. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Flere ikke-artsspesifikke patogener kan ha forårsaket massedødelighet av Pinna nobilis. Liv. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensiell innvirkning av klimaendringer på zoonotiske sykdommer i Arktis. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blåskjell (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer i overvåking av kystforurensning: en oversikt. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrering av flytende biopsi i kreftbehandling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Modning av flytende biopsi: Tillater tumor-DNA å sirkulere. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyrer i humant plasma. Møtereferat fra Soc Biols datterselskaper. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny rolle for cellefritt DNA som en molekylær markør for kreftbehandling. Kvantifisering av biomolar analyse. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flytende biopsi kommer inn i klinikken – implementeringsproblemer og fremtidige utfordringer. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW og andre. Foster-DNA finnes i mors plasma og serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie av svangerskapsforløpet og dets komplikasjoner ved bruk av sirkulerende ekstracellulært RNA i blodet til kvinner under graviditet. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Flytende biopsi: donorcellefritt DNA brukes til å oppdage allogene lesjoner i et nyretransplantat. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovasjoner innen prenatal diagnostikk: genomsekvensering av maternelt plasma. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Rask patogenpåvisning med neste generasjons metagenomisk sekvensering av infiserte kroppsvæsker. Nat Medicine. 2021;27:115-24.