Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Biopsia likidoa (LB) biomedikuntza arloan azkar ospea hartzen ari den kontzeptua da. Kontzeptua batez ere zirkulazioan dagoen DNA estrazelularraren (ccfDNA) zatien detekzioan oinarritzen da, eta hauek ehun askotan zelula hil ondoren zati txiki gisa askatzen dira. Zati horien zati txiki bat ehun edo organismo arrotzetatik dator. Oraingo lanean, kontzeptu hau muskuiluei aplikatu diegu, itsasoko ura iragazteko gaitasun handiagatik ezaguna den zaindari espezie bati. Muskuiluek iragazki natural gisa jarduteko duten gaitasuna erabiltzen dugu hainbat iturritatik ingurumeneko DNA zatiak harrapatzeko, itsas kostaldeko ekosistemen biodibertsitateari buruzko informazioa emateko. Gure emaitzek erakusten dute muskuiluaren hemolinfak tamaina handiko DNA zatiak dituela, 1 eta 5 kb artekoak. Eskopeta sekuentziazioak erakutsi zuen DNA zati kopuru handi bat jatorri mikrobiano arrotzekoa dela. Horien artean, bakterioen, arkeoen eta birusen DNA zatiak aurkitu genituen, itsas kostaldeko ekosistemetan ohikoak diren ostalari ugari infektatzen dituzten birusak barne. Ondorioz, gure ikerketak erakusten du muskuiluei aplikatutako LB kontzeptua itsas kostaldeko ekosistemen mikrobio-dibertsitateari buruzko ezagutza iturri aberatsa baina oraindik esploratu gabea dela.
Klima-aldaketak (KK) itsas ekosistemen biodibertsitatean duen eragina ikerketa-arlo azkar hazten ari da. Berotze globalak ez ditu estres fisiologiko garrantzitsuak eragiten bakarrik, baita itsas organismoen egonkortasun termikoaren eboluzio-mugak ere bultzatzen ditu, hainbat espezieren habitata kaltetuz, baldintza onuragarriagoak bilatzera bultzatuz [1, 2]. Metazooen biodibertsitatean eragiteaz gain, KK-k ostalariaren eta mikrobioen arteko elkarrekintzen oreka delikatua hausten du. Disbakteriosi mikrobiano honek mehatxu larria dakar itsas ekosistementzat, itsas organismoak patogeno infekziosoekiko sentikorragoak bihurtzen baititu [3, 4]. Uste da SS-k zeregin garrantzitsua dutela heriotz masiboetan, eta hori arazo larria da itsas ekosistema globalen kudeaketarako [5, 6]. Gai garrantzitsua da hau, itsas espezie askoren eragin ekonomiko, ekologiko eta nutrizionalak kontuan hartuta. Hori bereziki egia da eskualde polarretan bizi diren bibalbioentzat, non KK-ren ondorioak berehalakoagoak eta larriagoak diren [6, 7]. Izan ere, Mytilus spp. bezalako bibalbioak asko erabiltzen dira KK-k itsas ekosistemetan dituen ondorioak kontrolatzeko. Ez da harritzekoa biomarkatzaile kopuru nahiko handia garatu izana haien osasuna kontrolatzeko, askotan bi mailako ikuspegi bat erabiliz, jarduera entzimatikoan edo funtzio zelularretan oinarritutako biomarkatzaile funtzionalak barne hartzen dituztenak, hala nola zelulen bideragarritasuna eta jarduera fagozitikoa [8]. Metodo hauek itsasoko ur kantitate handiak xurgatu ondoren ehun bigunetan pilatzen diren presio-adierazle espezifikoen kontzentrazioaren neurketa ere barne hartzen dute. Hala ere, bibalbioen iragazketa-ahalmen handiak eta zirkulazio-sistema erdi-irekiak aukera ematen dute hemolinfa biomarkatzaile berriak garatzeko, biopsia likidoaren (LB) kontzeptua erabiliz, pazienteen kudeaketarako ikuspegi sinple eta gutxien inbaditzailea dena. odol-laginak [9, 10]. Zirkulazioan dauden molekula mota batzuk aurki daitezkeen arren gizakien LB-an, kontzeptu hau batez ere plasman zirkulazioan dagoen DNA estrazelularra (ccfDNA) zatien DNA sekuentziazioaren analisian oinarritzen da. Izan ere, gizakien plasman zirkulazioan dagoen DNAren presentzia XX. mendearen erdialdetik ezagutzen da [11], baina azken urteotan bakarrik ekarri du sekuentziazio-metodo handien etorrerak ccfDNA-n oinarritutako diagnostiko klinikoa. Zirkulazioan dauden DNA zati hauen presentzia, neurri batean, DNA genomikoaren (nukleoaren eta mitokondrioaren) askapen pasiboaren ondorioz gertatzen da, zelularen heriotzaren ondoren. Pertsona osasuntsuetan, ccfDNAren kontzentrazioa normalean baxua da (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia dituzten edo estresa jasaten duten pazienteetan, eta horrek ehunen kalteak eragiten ditu. Pertsona osasuntsuetan, ccfDNAren kontzentrazioa normalean baxua da (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia dituzten edo estresa jasaten duten pazienteetan, eta horrek ehunen kalteak eragiten ditu. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться повышаться 10 в больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. Pertsona osasuntsuetan, cccDNAren kontzentrazioa normalean baxua da (<10 ng/mL), baina 5-10 aldiz handitu daiteke hainbat patologia dituzten edo ehunen kalteak eragiten dituen estrespean dauden pazienteetan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滄炣在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 掅理 或 扅理 或 扅中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличен10 увеличены пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA kontzentrazioak normalean baxuak dira (<10 ng/ml) pertsona osasuntsuetan, baina 5-10 aldiz handitu daitezke hainbat patologia edo estresa dituzten pazienteetan, eta horrek ehunen kalteak eragiten ditu.ccfDNA zatien tamaina oso aldakorra da, baina normalean 150 eta 200 bp artekoa da. [12]. Auto-eratorritako ccfDNAren analisia, hau da, ostalari-zelula normal edo eraldatuetatik datorren ccfDNA, erabil daiteke genoma nuklearrean eta/edo mitokondrialean dauden aldaketa genetikoak eta epigenetikoak detektatzeko, eta horrela, klinikoei terapia molekular espezifikoak hautatzen laguntzen die [13]. Hala ere, ccfDNA iturri arrotzetatik lor daiteke, hala nola haurdunaldian zehar fetu-zeluletatik edo transplantatutako organoetatik lortutako ccfDNA [14,15,16,17]. ccfDNA informazio-iturri garrantzitsua da, halaber, agente infekzioso baten (arrotz) azido nukleikoen presentzia detektatzeko, eta horrek odol-kulturen bidez identifikatu ez diren infekzio zabalduen detekzio ez-inbaditzailea ahalbidetzen du, ehun infektatuaren biopsia inbaditzailea saihestuz [18]. Azken ikerketek erakutsi dute giza odolak informazio-iturri aberatsa duela, birus- eta bakterio-patogenoak identifikatzeko erabil daitekeena, eta giza plasman aurkitzen den ccfDNAren % 1 inguru jatorri arrotzekoa dela [19]. Ikasketa hauek erakusten dute organismo baten zirkulazioan dagoen mikrobiomaren biodibertsitatea ccfDNA analisi bidez ebaluatu daitekeela. Hala ere, duela gutxi arte, kontzeptu hau gizakietan soilik erabiltzen zen eta, neurri txikiagoan, beste ornodun batzuetan [20, 21].
Artikulu honetan, LB potentziala erabiliko dugu Aulacomya atra-ren ccfDNA aztertzeko, duela 35 milioi urte sortutako goi-ordoki handi baten gainean dauden Kerguelen uharte subantartiaretan aurkitzen den hegoaldeko espezie bat. Sumendi erupzioa. In vitro sistema esperimental bat erabiliz, ikusi dugu itsasoko uretan dauden DNA zatiak muskuiluek azkar xurgatzen dituztela eta hemolinfa konpartimentuan sartzen direla. Eskopeta sekuentziazioak erakutsi du muskuiluaren hemolinfa ccfDNA-k berezko eta jatorri ez-autodun DNA zatiak dituela, besteak beste, bakterio sinbiotikoak eta itsas kostaldeko ekosistema bolkaniko hotzetan ohikoak diren biometako DNA zatiak. Hemolinfa ccfDNA-k ostalari-eremu desberdinak dituzten birusetatik eratorritako birus-sekuentziak ere baditu. Animalia multizelularretatik ere aurkitu ditugu DNA zatiak, hala nola arrain hezurtsuetatik, itsas anemonetatik, algetatik eta intsektuetatik. Ondorioz, gure ikerketak erakusten du LB kontzeptua itsas ornogabeetan arrakastaz aplika daitekeela itsas ekosistemetan errepertorio genomiko aberatsa sortzeko.
Mytilus platensis (M. platensis) eta Aulacomya atra (A. atra) helduak (55-70 mm luze) Port-au-Franceko (049°21.235 S, 070°13.490 E) itsasarteko kostalde harritsuetan bildu ziren. Kerguelen uharteak, 2018ko abenduan. Beste muskuilu urdin heldu batzuk (Mytilus spp.) hornitzaile komertzial batetik lortu ziren (PEI Mussel King Inc., Eduardo Printzearen uhartea, Kanada) eta tenperatura kontrolatuko (4 °C) aireztatutako depositu batean jarri ziren, 10-20 L gatzun artifizial 32‰-rekin (Reef Crystal itsas gatz artifiziala, Instant Ocean, Virginia, AEB). Esperimentu bakoitzerako, maskor bakoitzaren luzera eta pisua neurtu ziren.
Programa honetarako doako sarbide irekiko protokolo bat eskuragarri dago online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Laburbilduz, LB hemolinfa abduktore muskuluetatik bildu zen [22] deskribatutako moduan. Hemolinfa 1200 × g-tan zentrifugatuz argitu zen 3 minutuz, gainnadantea izoztu zen (-20 °C) erabili arte. cfDNA isolatzeko eta purifikatzeko, laginak (1,5-2,0 ml) desizoztu eta NucleoSnap cfDNA kit-a erabiliz prozesatu ziren (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA), fabrikatzailearen argibideen arabera. ccfDNA -80 °C-tan gorde zen analisi gehiago egin arte. Esperimentu batzuetan, ccfDNA isolatu eta purifikatu zen QIAamp DNA Investigator Kit-a erabiliz (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Purifikatutako DNA PicoGreen analisi estandar bat erabiliz kuantifikatu zen. Isolatutako ccfDNAren zatien banaketa kapilar elektroforesi bidez aztertu zen, Agilent 2100 bioanalizatzaile bat erabiliz (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA), sentikortasun handiko DNA kit bat erabiliz. Saiakuntza ccfDNA laginaren 1 µl erabiliz egin zen, fabrikatzailearen argibideen arabera.
Hemolinfako ccfDNA zatien sekuentziaziorako, Génome Québec-ek (Montreal, Quebec, Kanada) shotgun liburutegiak prestatu zituen Illumina MiSeq PE75 kitaren Illumina DNA Mix kit-a erabiliz. Egokitzaile estandar bat (BioO) erabili zen. Datu gordinak fitxategiak NCBI Sequence Read Archive-n daude eskuragarri (SRR8924808 eta SRR8924809). Oinarrizko irakurketaren kalitatea FastQC [23] erabiliz ebaluatu zen. Trimmomatic [24] erabili da egokitzaileen mozketa eta kalitate txarreko irakurketetarako. Mutur parekatuak zituzten shotgun irakurketak FLASH bidez batu ziren irakurketa bakar luzeagoetan, gutxienez 20 bp-ko gainjartzearekin, desadostasunak saihesteko [25]. Irakurketa batuek BLASTNrekin anotazioa egin zuten NCBI Taxonomia datu-base bibalbio bat erabiliz (e balioa < 1e−3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun txikiko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26]. Irakurketa batuek BLASTNrekin anotazioa egin zuten NCBI Taxonomia datu-base bibalbio bat erabiliz (e balioa < 1e−3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun txikiko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных танных тамикием двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 eta % 90 гомологии), а маскирование последовательй ностельй сложности было выполнено с использованием HAUTSA [26]. Irakurketa multzokatuak BLASTNrekin anotatu ziren NCBI bibalbioen taxonomiaren datu-basea erabiliz (e balioa < 1e-3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun txikiko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和% 90 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数诌数，，D进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 % 90 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 du （并 读数 屮 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой бханкой двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 eta % 90 гомологии), а маскирование последовательй ностель сложности было выполнено с использованием HAUTSA [26]. Irakurketa multzokatuak BLASTNrekin anotatu ziren NCBI bibalbioen datu-base taxonomikoa erabiliz (e balioa <1e-3 eta % 90eko homologia), eta konplexutasun txikiko sekuentzien maskaratzea DUST erabiliz egin zen [26].Irakurketak bi taldetan banatu ziren: bibalbioen sekuentziekin erlazionatuak (hemen auto-irakurketak deituak) eta erlazionatu gabekoak (auto-irakurketak ez direnak). Bi talde bereizita muntatu ziren MEGAHIT erabiliz kontigak sortzeko [27]. Bitartean, mikrobioma arrotzen irakurketen banaketa taxonomikoa Kraken2 erabiliz sailkatu zen [28] eta grafikoki irudikatu zen Galaxy-n Krona diagrama zirkular batekin [29, 30]. Gure aurretiazko esperimentuetatik kmer optimoak kmers-59 zirela zehaztu zen. Auto-kontigak identifikatu ziren BLASTNrekin lerrokatuz (bibalbioen NCBI datu-basea, e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia) azken anotazio bat egiteko. Auto-kontigak identifikatu ziren BLASTNrekin lerrokatuz (bibalbioen NCBI datu-basea, e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia) azken anotazio bat egiteko. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытх двхуставо моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60% для окончательной аннотации. Auto-kontigak identifikatu ziren BLASTNrekin (NCBI bibalbioen datu-basea, e balioa <1e-10 eta % 60ko homologia) alderatuz azken anotazioa egiteko.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем совенные контиги для окончательной аннотации путем сол BLAS данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология % 60). Auto-kontigak identifikatu ziren azken anotaziorako BLASTN-rekin (NCBI bibalbioen datu-basea, e balioa <1e-10 eta % 60ko homologia) parekatuz. Aldi berean, talde ez-autonomoen kontigak BLASTNrekin anotatu ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia). Aldi berean, talde ez-autonomoen kontigak BLASTNrekin anotatu ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных, e баннных <1e-10 eta гомология % 60). Aldi berean, kanpoko talde-kontigak BLASTNrekin anotatu ziren (NT NCBI datu-basea, e balioa <1e-10 eta % 60ko homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 同源性）注释非自身组釤。组釤。羾平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和% 60 同源性）注释非自身组釤。组釤。羾 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью помощью BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология % 60). Aldi berean, talde ez-autonomoen kontigak BLASTNrekin anotatu ziren (nt NCBI datu-basea, e balioa <1e-10 eta % 60ko homologia). BLASTX kontig ez-autonomoetan ere egin zen nr eta RefSeq proteina NCBI datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia). BLASTX kontig ez-autonomoetan ere egin zen nr eta RefSeq proteina NCBI datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e−10 eta % 60ko homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq nr. e <1e-10 и гомология % 60). BLASTX kontig ez-auto-kontigioetan ere egin zen nr eta RefSeq NCBI proteinen datu-baseak erabiliz (e balioa < 1e-10 eta % 60ko homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧０ 性） 性还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧０ 性） 性 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC e nr BI (Ref. <1e-10 eta гомология % 60). BLASTX kontig ez-auto-kontigioetan ere egin zen nr eta RefSeq NCBI proteinen datu-baseak erabiliz (e balioa <1e-10 eta % 60ko homologia).Auto-kontigak ez diren BLASTN eta BLASTX multzoek azken kontigak adierazten dituzte (ikus fitxategi osagarria).
PCRrako erabilitako primerrak S1 taulan zerrendatzen dira. Taq DNA polimerasa (Bio Basic Canada, Markham, ON) erabili zen ccfDNA gene diana anplifikatzeko. Erreakzio-baldintza hauek erabili ziren: desnaturalizazioa 95 °C-tan 3 minutuz, 95 °C-tan minutu 1ez, tenperatura finkoa minutu 1ez, luzapena 72 °C-tan minutu 1ez, 35 ziklo eta, azkenik, 72 °C-tan 10 minututan. . PCR produktuak elektroforesi bidez bereizi ziren agarosa geletan (% 1,5), SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) 95 V-tan zutenetan.
Muskuiluak (Mytilus spp.) 500 ml itsasoko ur oxigenatuan (32 PSU) aklimatatu ziren 24 orduz 4 °C-tan. Giza galektina-7 cDNA sekuentzia kodetzen duen txertaketa bat duen plasmido DNA (NCBI sarbide zenbakia L07769) gehitu zitzaion fialei 190 μg/μl-ko azken kontzentrazioan. DNA gehitu gabe baldintza berdinetan inkubatutako muskuiluak izan ziren kontrola. Hirugarren kontrol-tangak muskuilurik gabeko DNA zuen. Itsasoko uretan DNAren kalitatea kontrolatzeko, itsasoko ur laginak (20 μl; hiru errepikapen) hartu ziren tanke bakoitzetik adierazitako unean. Plasmido DNAren trazabilitatea egiteko, LB muskuiluak adierazitako uneetan bildu eta qPCR eta ddPCR bidez aztertu ziren. Itsasoko uraren gatz eduki handia dela eta, alikuotak PCR kalitateko uretan diluitu ziren (1:10) PCR analisi guztiak egin aurretik.
Tanta digitalaren PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokoloa erabiliz egin zen (Mississauga, Ontario, Kanada). Erabili tenperatura-profila tenperatura optimoa zehazteko (S1 taula). Tantak QX200 tanta-sortzaile bat (BioRad) erabiliz sortu ziren. ddPCR honela egin zen: 95 °C 5 minutuz, 95 °C-ko 50 ziklo 30 segundoz eta errekuntza-tenperatura jakin bat 1 minutuz eta 72 °C 30 segundoz, 4 °C 5 minutuz eta 90 °C 5 minututan. Tanta kopurua eta erreakzio positiboen kopurua (kopia/µl kopurua) QX200 tanta-irakurgailu bat (BioRad) erabiliz neurtu ziren. 10.000 tanta baino gutxiago zituzten laginak baztertu ziren. Eredu-kontrola ez zen egin ddPCR exekutatzen zen bakoitzean.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) eta LGALS7 primer espezifikoak erabiliz egin zen. PCR kuantitatibo guztiak 20 µl-tan egin ziren QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) erabiliz. qPCR 15 minutuko inkubazio batekin hasi zen 95 °C-tan, ondoren 40 ziklo egin ziren 95 °C-tan 10 segundoz eta 60 °C-tan 60 segundoz, datu bilketa bakarrarekin. Urtze-kurbak sortu ziren 95 °C-tan 5 segundoz, 65 °C-tan 60 segundoz eta qPCRaren amaieran 97 °C-tan egindako neurketa jarraituak erabiliz. qPCR bakoitza hirukoiztuta egin zen, kontrol-laginak izan ezik.
Muskuiluak iragazketa-tasa handiagatik ezagunak direnez, lehenik eta behin ikertu genuen ea itsasoko uretan dauden DNA zatiak iragazi eta atxiki zitzaketen. Era berean, interesatu zitzaigun ea zati horiek haien sistema linfatiko erdi-irekian pilatzen diren. Arazo hau esperimentalki konpondu genuen muskuilu urdinen deposituetan gehitutako DNA zati disolbagarrien patua jarraituz. DNA zatien jarraipena errazteko, galektina-7 gene humanoa duen plasmido DNA arrotza (ez autoa) erabili genuen. ddPCR-k plasmido DNA zatiak jarraitzen ditu itsasoko uretan eta muskuiluetan. Gure emaitzek erakusten dute itsasoko uretan DNA zatien kopurua denboran zehar nahiko konstante mantentzen bazen (7 egun arte) muskuilurik ezean, orduan muskuiluen aurrean maila hori ia erabat desagertzen zela 8 orduko epean (1a,b irudiak). DNA exogenoaren zatiak erraz detektatu ziren 15 minutuko epean balbula intra-fluidoan eta hemolinfan (1c irudia). Zati hauek esposizioaren ondorengo 4 ordura arte detektatu zitezkeen oraindik. DNA zatiekiko iragazketa-jarduera hau bakterioen eta algen iragazketa-jardueraren parekoa da [31]. Emaitza hauek iradokitzen dute muskuiluek DNA arrotza iragazi eta metatu dezaketela beren fluido-konpartimentuetan.
Itsasoko uretan plasmido DNAren kontzentrazio erlatiboak muskuiluen presentzian (A) edo gabezian (B), ddPCR bidez neurtuta. A-n, emaitzak ehunekotan adierazten dira, laukitxoen ertzek pertzentilaren 75. eta 25. kopurua adierazten dutelarik. Doitutako kurba logaritmikoa gorriz ageri da, eta grisez itzaldutako eremuak % 95eko konfiantza-tartea adierazten du. B-n, lerro gorriak batez bestekoa adierazten du eta lerro urdinak kontzentraziorako % 95eko konfiantza-tartea. C Plasmido DNAren metaketa muskuiluen hemolinfan eta balbula-fluidoan plasmido DNA gehitu ondoren une desberdinetan. Emaitzak detektatutako kopia absolutu/mL gisa aurkezten dira (±SE).
Ondoren, Kerguelen uharteetako muskuilu-oheetatik bildutako muskuiluetan ccfDNAren jatorria ikertu genuen, eragin antropogeniko mugatua duen uharte urrun batean. Horretarako, muskuilu-hemolinfako cccDNA isolatu eta purifikatu zen giza cccDNA purifikatzeko ohiko metodoen bidez [32, 33]. Ikusi genuen muskuiluetan hemolinfako ccfDNAren batez besteko kontzentrazioak mikrogramo baxuetan daudela ml hemolinfa bakoitzeko (ikus S2 taula, Informazio osagarria). Kontzentrazio-tarte hau askoz handiagoa da pertsona osasuntsuetan baino (nanogramo baxuak mililitro bakoitzeko), baina kasu bakanetan, minbizia duten pazienteetan, ccfDNAren maila mililitro bakoitzeko hainbat mikrogramotara irits daiteke [34, 35]. Hemolinfako ccfDNAren tamaina-banaketaren analisi batek erakutsi zuen zati hauek tamaina aldetik asko aldatzen direla, 1000 bp-tik 1000 bp-ra eta 5000 bp-ra bitartekoak (2. irudia). Emaitza antzekoak lortu ziren silizean oinarritutako QIAamp Investigator Kit erabiliz, zientzia forentsean erabili ohi den metodo bat DNA genomikoa azkar isolatu eta arazteko kontzentrazio baxuko DNA laginetatik, ccfDNA barne [36].
Muskuilu-hemolinfaren ccfDNA elektroforegrama adierazgarria. NucleoSnap Plasma Kit-arekin (goian) eta QIAamp DNA Investigator Kit-arekin aterata. B Biolin-diagrama, muskuiluetan hemolinfaren ccfDNA kontzentrazioen banaketa (±SE) erakusten duena. Lerro beltz eta gorriek mediana eta lehenengo eta hirugarren kuartilak adierazten dituzte, hurrenez hurren.
Gizakietan eta primateetan dagoen ccfDNAren % 1 inguruk jatorri arrotza du [21, 37]. Bibalbioen zirkulazio-sistema erdi-irekia, itsasoko ura mikrobianoetan aberatsa eta muskuiluaren ccfDNAren tamaina-banaketa kontuan hartuta, hipotesi hau egin genuen: muskuiluaren hemolinfako ccfDNAk DNA mikrobianoaren multzo aberats eta anitza izan dezake. Hipotesi hau probatzeko, Kerguelen uharteetan bildutako Aulacomya atra laginetatik hemolinfako ccfDNA sekuentziatu genuen, 10 milioi irakurketa baino gehiago lortuz, eta horien % 97,6k kalitate-kontrola gainditu zuten. Irakurketak, ondoren, iturri propioen eta ez-propioen arabera sailkatu ziren BLASTN eta NCBI bibalbioen datu-baseak erabiliz (S1 irudia, informazio osagarria).
Gizakietan, DNA nuklearra eta mitokondriala askatu daitezke odolera [38]. Hala ere, egungo ikerketan, ezin izan da muskuiluen DNA genomiko nuklearra zehatz-mehatz deskribatu, A. atra genoma ez baita sekuentziatu edo deskribatu. Hala ere, gure jatorriko hainbat ccfDNA zati identifikatu ahal izan ditugu bibalbio liburutegia erabiliz (S2 irudia, Informazio Osagarria). Gure jatorriko DNA zatien presentzia ere baieztatu dugu sekuentziatutako A. atra gene horien PCR anplifikazio zuzenduaren bidez (3. irudia). Era berean, A. atraren mitokondrio-genoma datu-base publikoetan eskuragarri dagoenez, A. atraren hemolinfan mitokondrio-ccfDNA zatien presentziaren frogak aurki daitezke. Mitokondrio-DNA zatien presentzia PCR anplifikazio bidez baieztatu zen (3. irudia).
Hainbat mitokondrio-gene zeuden A. atra-ren hemolinfan (puntu gorriak - stock zenbakia: SRX5705969) eta M. platensis-en (puntu urdinak - stock zenbakia: SRX5705968), PCR bidez anplifikatuta. Breton et al., 2011 B-tik egokitutako irudia. A. atra-ren hemolinfa-gainjarioaren anplifikazioa. FTA paperean gordeta. Erabili 3 mm-ko zulagailu bat zuzenean PCR nahasketa duen PCR hodira gehitzeko.
Itsasoko uretan mikrobioen edukia ugaria denez, hasieran hemolinfako DNA mikrobianoen sekuentzien karakterizazioan zentratu ginen. Horretarako, bi estrategia desberdin erabili ditugu. Lehenengo estrategiak Kraken2 erabili zuen, algoritmoetan oinarritutako sekuentzien sailkapen programa bat, BLAST eta beste tresna batzuekin pareko zehaztasunarekin sekuentzia mikrobianoak identifikatu ditzakeena [28]. 6719 irakurketa baino gehiago jatorri bakterianokoak zirela zehaztu zen, eta 124 eta 64 arkea eta birusenak ziren, hurrenez hurren (4. irudia). DNA bakteriano zati ugarienak Firmicutes (% 46), Proteobacteria (% 27) eta Bacteroidetes (% 17) izan ziren (4a irudia). Banaketa hau itsas muskuilu urdinaren mikrobiomaren aurreko ikerketekin bat dator [39, 40]. Gammaproteobacteria izan zen Proteobacteria klase nagusia (% 44), Vibrionales asko barne (4b irudia). ddPCR metodoak Vibrio DNA zatien presentzia baieztatu zuen A. atra hemolinfaren ccfDNA-n (4c irudia) [41]. ccfDNA-ren jatorri bakterianoari buruzko informazio gehiago lortzeko, beste hurbilketa bat egin zen (S2 irudia, informazio osagarria). Kasu honetan, gainjarritako irakurketak mutur parekatuko irakurketa gisa bildu ziren eta jatorri propioko (bibalbioak) edo ez-propioko gisa sailkatu ziren BLASTN erabiliz, 1e−3 e balio batekin eta %90eko homologia baino gehiagoko ebakidura batekin. Kasu honetan, gainjarritako irakurketak mutur parekatuko irakurketa gisa bildu ziren eta jatorri propioko (bibalbioak) edo ez-propioko gisa sailkatu ziren BLASTN erabiliz, 1e−3 e balio batekin eta %90eko homologia baino gehiagoko ebakidura batekin. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием зованием зованием Происхождению отсечения с гомологией> %90. Kasu honetan, gainjarritako irakurketak parekatuta bildu ziren eta natibo (bibalbio) edo ez-original gisa sailkatu ziren BLASTN eta 1e-3 e balioa eta %90eko homologia baino gehiagoko mozketa erabiliz.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值%90同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 blast值 和> % 90 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и класы класы и класы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использовани e BLAS 1e-3 eta порога гомологии> % 90. Kasu honetan, gainjarritako irakurketak parekatuta bildu ziren eta berezko (bibalbioak) edo ez-jatorrizko gisa sailkatu ziren e BLASTN eta 1e-3 balioak eta %90etik gorako homologia atalasea erabiliz.A. atraren genoma oraindik sekuentziatu ez denez, MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) muntatzailearen de novo muntaketa estrategia erabili dugu. Guztira 147.188 kontig identifikatu dira jatorriaren menpeko (bibalbio) gisa. Kontig hauek 1e-10 e-balioekin lehertu dira BLASTN eta BLASTX erabiliz. Estrategia honek A. atraren ccfDNA-n dauden 482 bibalbio ez diren zati identifikatzea ahalbidetu digu. DNA zati horien erdia baino gehiago (% 57) bakterioetatik lortu dira, batez ere zakatz-sinbionteetatik, sulfotrofo sinbionteak barne, eta Solemya velum zakatz-sinbionteetatik (5. irudia).
Ugaritasun erlatiboa mota mailan. B Bi filum nagusiren (Firmicutes eta Proteobacteria) mikrobio-dibertsitatea. ddPCRren anplifikazio adierazgarria C Vibrio spp. A. 16S rRNA genearen zatiak (urdina) hiru atra hemolinfatan.
Guztira bildutako 482 kontig aztertu ziren. Kontig metagenomikoen anotazioen (prokariotoak eta eukariotoak) banaketa taxonomikoaren profil orokorra. B BLASTN eta BLASTX bidez identifikatutako bakterioen DNA zatien banaketa zehatza.
Kraken2 analisiak ere erakutsi zuen muskuiluaren ccfDNAk arkeoen DNA zatiak zituela, besteak beste, Euryarchaeota (% 65), Crenarchaeota (% 24) eta Thaurmarcheota (% 11) DNA zatiak (6a irudia). Kaliforniako muskuiluen komunitate mikrobianoan lehenago aurkitutako Euryarchaeota eta Crenarchaeota-tik eratorritako DNA zatien presentzia ez litzateke harritzekoa izan behar [42]. Euryarchaeota askotan muturreko baldintzekin lotzen den arren, orain onartzen da Euryarchaeota eta Crenarcheota itsas ingurune kriogenikoko prokarioto ohikoenen artean daudela [43, 44]. Muskuiluetan mikroorganismo metanogenikoen presentzia ez da harritzekoa, Kerguelen goi-ordokiko hondoko ihesetatik datozen metano-ihes zabalen berri eman berri dutelako [45] eta Kerguelen uharteen kostaldean ikusi den metano-ekoizpen mikrobiano posiblea kontuan hartuta [46].
Ondoren, gure arreta DNA birusen irakurketetara aldatu zen. Dakigunez, hau da muskuiluen birus edukiaren lehen ikerketa kanpokoa. Espero bezala, bakteriofagoen (Caudovirales) DNA zatiak aurkitu genituen (6b irudia). Hala ere, birus DNA ohikoena nukleozitobirusen filum batetik dator, DNA nuklear zitoplasmatiko handiko birus (NCLDV) bezala ere ezagutzen dena, eta birus guztien artean genoma handiena duena. Filum honen barruan, DNA sekuentzia gehienak Mimimidoviridae (% 58) eta Poxviridae (% 21) familietakoak dira, eta haien ostalari naturalen artean ornodunak eta artropodoak daude, eta DNA sekuentzia horien zati txiki bat alga birologiko ezagunei dagokie. Itsas alga eukariotoak infektatzen ditu. Sekuentziak Pandora birusetik ere lortu ziren, ezagutzen diren birus generoen artean genoma handiena duen birus erraldoitik. Interesgarria da, hemolinfa ccfDNA sekuentziazioak zehaztutako birusarekin infektatuta dauden ostalarien sorta nahiko handia zela (S3 irudia, Informazio osagarria). Baculoviridae eta Iridoviridae bezalako intsektuak infektatzen dituzten birusak barne hartzen ditu, baita amebak, algak eta ornodunak infektatzen dituzten birusak ere. Pithovirus sibericum genomarekin bat datozen sekuentziak ere aurkitu ditugu. Pitobirusak («zonbi birusak» bezala ere ezagunak) lehen aldiz Siberiako 30.000 urteko permafrost-etik isolatu ziren [47]. Beraz, gure emaitzak bat datoz aurreko txostenekin, birus horien espezie moderno guztiak ez daudela desagertuta erakusten dutenekin [48] eta birus hauek itsas ekosistema subartiko urrunetan egon daitezkeela.
Azkenik, beste animalia zelulanitzen DNA zatiak aurki genitzakeen ikusteko probak egin genituen. Guztira 482 kontig arrotz identifikatu ziren BLASTN eta BLASTX bidez, nt, nr eta RefSeq liburutegiekin (genomikoak eta proteikoak). Gure emaitzek erakusten dute animalia zelulanitzen ccfDNAren zati arrotzen artean, hezur-hezurren DNA nagusi dela (5. irudia). Intsektuen eta beste espezie batzuen DNA zatiak ere aurkitu dira. DNA zatien zati handi samarra ez da identifikatu, agian itsas espezie kopuru handi bat gutxiegi ordezkatuta dagoelako datu-base genomikoetan, lurreko espezieekin alderatuta [49].
Artikulu honetan, LB kontzeptua muskuiluei aplikatzen diegu, hemolinfaren ccfDNA sekuentziazioak itsas kostaldeko ekosistemen osaerari buruzko informazioa eman dezakeela argudiatuz. Bereziki, honako hau aurkitu dugu: 1) muskuiluaren hemolinfak zirkulazioan dauden DNA zati nahiko handien (~1-5 kb) kontzentrazio nahiko altuak (mikrogramo mailak) dituela; 2) DNA zati hauek independenteak eta ez-independenteak direla; 3) DNA zati horien iturri arrotzen artean, bakterioen, arkeoen eta birusen DNA aurkitu dugu, baita beste animalia multizelular batzuen DNA ere; 4) ccfDNA zati arrotz hauen hemolinfan metaketa azkar gertatzen da eta muskuiluen barne iragazketa jardueran laguntzen du. Ondorioz, gure ikerketak erakusten du orain arte biomedikuntzaren arloan batez ere aplikatu den LB kontzeptuak ezagutza iturri aberatsa baina esploratu gabea kodetzen duela, zaindari espezieen eta haien ingurunearen arteko elkarrekintza hobeto ulertzeko erabil daitekeena.
Primateez gain, ccfDNAren isolamendua ugaztunetan ere jakinarazi da, besteak beste, saguetan, txakurretan, katuetan eta zaldietan [50, 51, 52]. Hala ere, dakigunez, gure ikerketa da zirkulazio-sistema irekia duten itsas espezieetan ccfDNAren detekzioa eta sekuentziazioa jakinarazten duen lehena. Muskuiluen ezaugarri anatomiko eta iragazteko gaitasun honek, neurri batean behintzat, azal dezake zirkulazioan dauden DNA zatien tamaina-ezaugarri desberdinak beste espezieekin alderatuta. Gizakietan, odolean zirkulatzen duten DNA zati gehienak 150 eta 200 bp arteko tamaina duten zati txikiak dira, 167 bp-ko gailur maximoarekin [34, 53]. DNA zatien zati txiki baina esanguratsu batek 300 eta 500 bp arteko tamaina du, eta % 5 inguru 900 bp baino luzeagoak dira [54]. Tamaina banaketa honen arrazoia da plasman ccfDNAren iturri nagusia zelulen heriotzaren ondorioz gertatzen dela, bai zelulen heriotzagatik, bai pertsona osasuntsuetan zirkulazioan dauden zelula hematopoietikoen nekrosiagatik, edo minbizi gaixoetan tumore-zelulen apoptosiagatik (zirkulazioan dauden tumore-DNA bezala ezagutzen da, ctDNA). Muskuiluetan aurkitu dugun hemolinfako ccfDNAren tamaina banaketa 1000 eta 5000 bp artekoa zen, eta horrek iradokitzen du muskuiluaren ccfDNAk jatorri desberdina duela. Hipotesi logikoa da hau, muskuiluek sistema baskular erdi-irekia baitute eta DNA genomiko mikrobianoaren kontzentrazio handiak dituzten itsasoko ingurune akuatikoetan bizi baitira. Izan ere, DNA exogenoa erabiliz egindako gure laborategiko esperimentuek erakutsi dute muskuiluek DNA zatiak metatzen dituztela itsasoko uretan, gutxienez ordu batzuk igaro ondoren zelulen xurgapenaren ondoren degradatzen direla eta/edo askatzen eta/edo hainbat antolamendutan gordetzen direla. Zelulen arraroa kontuan hartuta (bai prokariotoak bai eukariotoak), balbula barruko konpartimentuen erabilerak auto-iturrietatik eta kanpoko iturrietatik datorren ccfDNAren kopurua murriztuko du. Bibalbioen immunitate innatoaren garrantzia eta zirkulazioan dauden fagozito kopuru handia kontuan hartuta, hipotesi gehiago egin genuen ccfDNA arrotza ere fagozito zirkulatzaileetan aberastu egiten dela, eta hauek DNA arrotza metatzen dutela mikroorganismoak eta/edo zelula-hondakinak irenstean. Gure emaitzek, oro har, erakusten dute bibalbioen hemolinfako ccfDNA informazio molekularraren biltegi paregabea dela eta zaindari espezie gisa duten egoera indartzen duela.
Gure datuek adierazten dute bakterioetatik eratorritako hemolinfa ccfDNA zatien sekuentziazioak eta analisiak informazio gakoa eman dezaketela ostalariaren bakterio-florari eta inguruko itsas ekosisteman dauden bakterioei buruz. Sekuentziazio-teknikek A. atra gill bakterio komentsalen sekuentziak agerian utzi dituzte, eta sekuentziak galdu egingo lirateke ohiko 16S rRNA identifikazio-metodoak erabili izan balira, neurri batean erreferentzia-liburutegiaren alborapen baten ondorioz. Izan ere, Kergueleneko muskuilu-geruza berean M. platensis-etik bildutako LB datuak erabiltzeak erakutsi du zakatzekin lotutako bakterio-sinbionteen konposizioa berdina zela bi muskuilu-espezieentzat (S4 irudia, Informazio Osagarria). Bi muskuilu genetikoki desberdinen antzekotasun honek Kergueleneko gordailu hotz, sufretsu eta bolkanikoetako bakterio-komunitateen konposizioa islatu dezake [55, 56, 57, 58]. Sufrea murrizten duten mikroorganismoen maila altuagoak ondo deskribatu dira kostaldeko eremu bioturbatuetatik muskuiluak biltzean [59], hala nola Port-au-Franceko kostaldetik. Beste aukera bat da muskuilu-flora komentsala transmisio horizontalak eragin dezakeela [60, 61]. Ikerketa gehiago behar dira itsas ingurunearen, itsas hondoaren gainazalaren eta muskuiluetako bakterio sinbiotikoen osaeraren arteko korrelazioa zehazteko. Ikerketa hauek martxan daude gaur egun.
Hemolinfa ccfDNAren luzera eta kontzentrazioa, purifikatzeko erraztasuna eta sekuentziazio azkarra ahalbidetzeko kalitate handia dira itsas kostaldeko ekosistemetan biodibertsitatea ebaluatzeko muskuilu ccfDNA erabiltzearen abantaila askoren artean. Ikuspegi hau bereziki eraginkorra da ekosistema jakin bateko birus-komunitateak (biromak) karakterizatzeko [62, 63]. Bakterioek, arkeoek eta eukariotoek ez bezala, birus-genomek ez dituzte 16S sekuentziak bezalako gene filogenetikoki kontserbatuak. Gure emaitzek adierazten dute muskuiluak bezalako adierazle-espezieen biopsia likidoak erabil daitezkeela kostaldeko itsas ekosistemetan normalean bizi diren ostalariak infektatzen dituzten ccfDNA birus-zati kopuru nahiko handiak identifikatzeko. Honen barruan sartzen dira protozooak, artropodoak, intsektuak, landareak eta bakterio-birusak (adibidez, bakteriofagoak) infektatzen dituzten birusak. Banaketa antzekoa aurkitu zen Kerguelen-eko muskuilu-geruza berean bildutako muskuilu urdinen (M. platensis) hemolinfa ccfDNA biroma aztertu genuenean (S2 taula, informazio osagarria). CCFDNAren sekuentziazio eskopetaduna gizakien edo beste espezie batzuen biromaren ikerketan indarra hartzen ari den ikuspegi berri bat da, hain zuzen ere [21, 37, 64]. Ikuspegi hau bereziki erabilgarria da DNA bikoitzeko birusak aztertzeko, ez baita gene bakar bat ere kontserbatzen DNA bikoitzeko birus guztien artean, Baltimoreko birusen klaserik anitzena eta zabalena ordezkatuz [65]. Birus horietako gehienak sailkatu gabe daude oraindik eta birusen munduaren zati guztiz ezezagun bateko birusak izan ditzakete [66], baina A. atra eta M. platensis muskuiluen biromak eta ostalarien eremuak bi espezieen artean daudela ikusi dugu, era berean (ikus S3 irudia, informazio gehigarria). Antzekotasun hau ez da harritzekoa, ingurumenean dagoen DNAren xurgapenean selektibitate falta islatu dezakeelako. RNA purifikatua erabiliz etorkizuneko ikerketak behar dira RNA biroma karakterizatzeko.
Gure ikerketan, Kowarski eta lankideen [37] lanetik egokitutako bide-lerro oso zorrotz bat erabili dugu, zeinek irakurketa eta kontig multzokatuak bi urratsetan ezabatzen zituzten ccfDNA natiboa muntatu aurretik eta ondoren, eta horrek irakurketa mapatu gabeen proportzio handia eragin du. Beraz, ezin dugu baztertu irakurketa mapatu gabe horietako batzuek jatorri propioa izan dezaketela, batez ere muskuilu espezie honetarako erreferentziazko genomarik ez dugulako. Bide-lerro hau erabili dugu, halaber, irakurketa propioen eta ez-autoen arteko kimerak eta Illumina MiSeq PE75-ek sortutako irakurketa-luzerak kezkatzen ginelako. Irakurketa gehienen artean mapatu gabe egotearen beste arrazoi bat da itsas mikrobio asko, batez ere Kerguelen bezalako urruneko eremuetan, ez direla anotatuak izan. Illumina MiSeq PE75 erabili dugu, ccfDNA zatien luzera gizakien ccfDNAren antzekoa dela suposatuz. Etorkizuneko ikerketetarako, gure emaitzek hemolinfako ccfDNAk gizakiek eta/edo ugaztunenek baino irakurketa luzeagoak dituela erakusten dutenez, ccfDNA zati luzeagoetarako egokiagoa den sekuentziazio-plataforma bat erabiltzea gomendatzen dugu. Praktika honek askoz errazagoa egingo du analisi sakonagoetarako zantzu gehiago identifikatzea. Gaur egun eskuragarri ez dagoen A. atraren nukleoaren genoma sekuentzia osoa lortzeak asko erraztuko luke ccfDNAren bereizketa iturri propioetatik eta ez-propioetatik. Gure ikerketa biopsia likidoaren kontzeptua muskuiluetan aplikatzeko aukeran zentratu denez, espero dugu kontzeptu hau etorkizuneko ikerketetan erabiltzen den heinean, tresna eta bide berriak garatuko direla metodo honen potentziala handitzeko muskuiluen aniztasun mikrobianoa aztertzeko. itsas ekosistema.
Biomarkatzaile kliniko ez-inbaditzaile gisa, ccfDNAren plasma-maila altuak gizakien plasman hainbat gaixotasunekin, ehunen kalteekin eta estres-baldintzekin lotuta daude [67,68,69]. Igoera hau ehunen kalteen ondoren bere jatorriko DNA zatien askapenarekin lotuta dago. Arazo hau bero-estres akutua erabiliz jorratu genuen, non muskuiluak 30 °C-ko tenperaturan laburki jarri ziren. Analisi hau hiru muskuilu mota ezberdinetan egin genuen hiru esperimentu independentetan. Hala ere, ez genuen ccfDNA mailetan aldaketarik aurkitu bero-estres akutuaren ondoren (ikus S5 irudia, informazio gehigarria). Aurkikuntza honek azal dezake, neurri batean behintzat, muskuiluek zirkulazio-sistema erdi-irekia dutela eta DNA arrotz kantitate handiak metatzen dituztela iragazketa-jarduera handia dela eta. Bestalde, muskuiluak, ornogabe askok bezala, estresak eragindako ehunen kalteen aurrean erresistenteagoak izan daitezke, eta horrela ccfDNAren askapena mugatu egiten da haien hemolinfan [70, 71].
Orain arte, ur-ekosistemetako biodibertsitatearen DNAren analisiak batez ere ingurumen-DNAren (eDNA) metabarkodetzean zentratu da. Hala ere, metodo hau normalean mugatua da biodibertsitatearen analisietan primerrak erabiltzen direnean. Shotgun sekuentziazioaren erabilerak PCRren mugak eta primer multzoen hautaketa alboratuak saihesten ditu. Beraz, zentzu batean, gure metodoa duela gutxi erabilitako eDNA Shotgun sekuentziazio handiko metodotik gertuago dago, zeinak DNA zatikatua zuzenean sekuentziatzeko eta ia organismo guztiak aztertzeko gai den [72, 73]. Hala ere, oinarrizko hainbat arazo daude LB eDNA metodo estandarretatik bereizten dutenak. Jakina, eDNAren eta LBren arteko desberdintasun nagusia iragazki naturalen ostalarien erabilera da. Itsas espezieak, hala nola belakiak eta bibalbioak (Dresseina spp.), eDNA aztertzeko iragazki natural gisa erabiltzea jakinarazi da [74, 75]. Hala ere, Dreissenaren ikerketak ehunen biopsiak erabili zituen, eta horietatik DNA erauzi zen. LBtik ccfDNAren analisiak ez du ehunen biopsia, eDNArekin edo ehunen biopsiarekin lotutako ekipamendu eta logistika espezializaturik eta batzuetan garestirik behar. Izan ere, duela gutxi jakinarazi genuen LB-ko ccfDNA FTA euskarriarekin gorde eta aztertu daitekeela kate hotz bat mantendu gabe, eta hori erronka handia da urruneko eremuetako ikerketarako [76]. Biopsia likidoetatik ccfDNA erauztea ere erraza da eta kalitate handiko DNA ematen du eskopeta sekuentziaziorako eta PCR analisietarako. Abantaila handia da hau, eDNA analisiarekin lotutako muga tekniko batzuk kontuan hartuta [77]. Laginketa-metodoaren sinpletasuna eta kostu baxua ere bereziki egokia da epe luzeko jarraipen-programetarako. Iragazketa-gaitasun handiaz gain, bibalbioen beste ezaugarri ezagun bat haien mukiaren mukopolisakaridoen konposizio kimikoa da, birusen xurgapena sustatzen duena [78, 79]. Horrek bibalbioak iragazki natural aproposa bihurtzen ditu biodibertsitatea eta klima-aldaketak ur-ekosistema jakin batean duen eragina karakterizatzeko. Ostalariaren DNA zatien presentzia metodoaren mugatzat har daitekeen arren eDNArekin alderatuta, eDNArekin alderatuta ccfDNA natibo hori edukitzeak dakarren kostua ulergarria da aldi berean osasun-azterketetarako eskuragarri dagoen informazio kopuru handia kontuan hartuta. offset host. Honen barruan sartzen da ostalariaren genoman integratutako birus-sekuentzien presentzia. Hau bereziki garrantzitsua da muskuiluentzat, bibalbioetan horizontalki transmititzen diren leuzemia-erretrobirusak daudela kontuan hartuta [80, 81]. LB-k eDNA-rekin alderatuta duen beste abantaila bat hemolinfan zirkulatzen duten odol-zelulen fagozito-jarduera ustiatzen duela da, mikroorganismoak (eta haien genomak) irensten dituena. Fagozitosia da bibalbioetako odol-zelulen funtzio nagusia [82]. Azkenik, metodoak muskuiluen iragazketa-ahalmen handia (batez beste itsasoko uraren 1,5 l/h) eta bi eguneko zirkulazioa aprobetxatzen ditu, itsasoko uraren geruza desberdinen nahasketa handitzen baitute, eDNA heterologoa harrapatzea ahalbidetuz. [83, 84]. Beraz, muskuiluaren ccfDNA analisia bide interesgarria da, muskuiluen eragin nutrizionalak, ekonomikoak eta ingurumenekoak kontuan hartuta. Gizakiengandik jasotako LB-ren analisiaren antzera, metodo honek aukera ematen du ostalariaren DNAn substantzia exogenoei erantzunez gertatzen diren aldaketa genetikoak eta epigenetikoak neurtzeko. Adibidez, hirugarren belaunaldiko sekuentziazio-teknologiak aurreikus daitezke ccfDNA natiboetan genoma osoko metilazio-analisia egiteko, nanoporoen sekuentziazioa erabiliz. Prozesu hau erraztu beharko litzateke muskuiluaren ccfDNA zatien luzera idealki bateragarria delako sekuentziazio-plataformekin, zeinek DNAren metilazio-analisi genoma osokoa ahalbidetzen baitute sekuentziazio-exekuzio bakar batetik, eraldaketa kimikorik behar izan gabe.85,86] Aukera interesgarria da hau, frogatu baita DNAren metilazio-ereduek ingurumen-estresarekiko erantzuna islatzen dutela eta belaunaldi askotan zehar irauten dutela. Beraz, ikuspegi baliotsua eman dezake klima-aldaketaren edo kutsatzaileen eraginpean egon ondoren erantzuna gobernatzen duten mekanismoei buruz [87]. Hala ere, LBren erabilera ez dago mugarik gabe. Esan beharrik ez dago horrek adierazle-espezieen presentzia eskatzen duela ekosisteman. Goian aipatu bezala, LB erabiltzeak ekosistema jakin baten biodibertsitatea ebaluatzeko bioinformatika-hodi zorrotz bat ere eskatzen du, iturriko DNA zatien presentzia kontuan hartzen duena. Beste arazo nagusi bat itsas espezieen erreferentzia-genomen eskuragarritasuna da. Espero da Itsas Ugaztunen Genomaren Proiektua eta duela gutxi sortutako Fish10k proiektua [88] bezalako ekimenek etorkizunean analisi hori erraztuko dutela. LB kontzeptua itsas iragazki bidez elikatzen diren organismoei aplikatzea sekuentziazio teknologiaren azken aurrerapenekin ere bateragarria da, eta, ondorioz, oso egokia da ohm anitzeko biomarkatzaileak garatzeko, itsas habitaten osasunari buruzko informazio garrantzitsua emateko ingurumen-estresari erantzunez.
Genomaren sekuentziazioaren datuak NCBI Sequence Read Archive-n gordailatu dira https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 izenpean.
Brierley AS, Kingsford MJ Klima-aldaketaren eragina itsas bizitzan eta ekosistemetan. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Klima-aldaketaren eta beste tokiko estres-faktore batzuen eragin konbinatuak itsas ingurunean kontuan hartu. ingurune zientifiko orokorra. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Martxoaren lehengo zientzia. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Beroarekiko tolerantzia murriztua bero-estres errepikakorraren baldintzetan azaltzen du muskuilu urdinen udako hilkortasun handia. Txosten zientifikoa 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, etab. Animalien heriotzen maiztasunean, kausetan eta hedaduran izandako aldaketa berriak. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Espezieak ez diren hainbat patogenok Pinna nobilis-en hilkortasun masiboa eragin izana. Bizitza. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Klima-aldaketak Artikoko gaixotasun zoonotikoetan izan dezakeen eragin potentziala. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Muskuilu urdinak (Mytilus edulis spp.) kostaldeko kutsaduraren monitorizazioan seinale-organismo gisa: berrikuspena. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Biopsia likidoaren integrazioa minbiziaren tratamenduan. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Biopsia likidoaren heltzea: tumorearen DNA zirkulatzea ahalbidetzen du. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Azido nukleikoak giza plasman. Soc Biol filialen bileren aktak. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Zelula gabeko DNAren eginkizun berria minbiziaren tratamendurako markatzaile molekular gisa. Biomolar analisiaren kuantifikazioa. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsia likidoa klinikara sartzen da – inplementazio arazoak eta etorkizuneko erronkak. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW eta beste batzuk. Fetuaren DNA amaren plasman eta serumean dago. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Haurdunaldiaren bilakaeraren eta haren konplikazioen azterketa, haurdunaldian zehar emakumeen odolean zirkulatzen ari den zelulaz kanpoko RNA erabiliz. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsia likidoa: emailearen zelularik gabeko DNA erabiltzen da giltzurruneko txertaketa batean lesio alogenikoak detektatzeko. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Berrikuntzak jaio aurreko diagnostikoan: amaren plasmaren genomaren sekuentziazioa. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Patogenoen detekzio azkarra gorputz-fluido infektatuen hurrengo belaunaldiko sekuentziazio metagenomikoaren bidez. Nat Medicine. 2021;27:115-24.