Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్ప్లోరర్లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్ను రెండర్ చేస్తాము.
లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) అనేది బయోమెడికల్ రంగంలో వేగంగా ప్రాచుర్యం పొందుతున్న ఒక భావన. ఈ భావన ప్రధానంగా, వివిధ కణజాలాలలో కణ మరణం తర్వాత చిన్న చిన్న ముక్కలుగా విడుదలయ్యే, ప్రసరణలో ఉండే కణబాహ్య DNA (ccfDNA) శకలాలను గుర్తించడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఈ శకలాలలో ఒక చిన్న భాగం ఇతర (విదేశీ) కణజాలాలు లేదా జీవుల నుండి ఉద్భవిస్తుంది. ప్రస్తుత పరిశోధనలో, అధిక సముద్రపు నీటి వడపోత సామర్థ్యానికి ప్రసిద్ధి చెందిన ఒక సూచిక జాతి అయిన మస్సెల్స్కు మేము ఈ భావనను వర్తింపజేశాము. సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యం గురించి సమాచారాన్ని అందించడానికి, వివిధ వనరుల నుండి పర్యావరణ DNA శకలాలను సంగ్రహించేందుకు సహజ వడపోతలుగా పనిచేసే మస్సెల్స్ సామర్థ్యాన్ని మేము ఉపయోగించుకున్నాము. మా ఫలితాలు మస్సెల్ హిమోలింఫ్లో 1 నుండి 5 kb వరకు పరిమాణంలో బాగా తేడా ఉన్న DNA శకలాలు ఉన్నాయని చూపిస్తున్నాయి. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా అధిక సంఖ్యలో DNA శకలాలు విదేశీ సూక్ష్మజీవుల మూలానికి చెందినవని తేలింది. వాటిలో, తీరప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో సాధారణంగా కనిపించే వివిధ రకాల ఆతిథేయులకు సోకే వైరస్లతో సహా, బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు వైరస్ల నుండి వచ్చిన DNA శకలాలను మేము కనుగొన్నాము. ముగింపుగా, మస్సెల్స్కు వర్తింపజేసిన LB భావన, సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలోని సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం గురించి ఇంతవరకు అన్వేషించబడని ఒక గొప్ప జ్ఞాన వనరును సూచిస్తుందని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థల జీవవైవిధ్యంపై వాతావరణ మార్పు (CC) ప్రభావం అనేది వేగంగా అభివృద్ధి చెందుతున్న పరిశోధనా రంగం. గ్లోబల్ వార్మింగ్ ముఖ్యమైన శారీరక ఒత్తిళ్లను కలిగించడమే కాకుండా, సముద్ర జీవుల ఉష్ణ స్థిరత్వం యొక్క పరిణామ పరిమితులను కూడా పెంచుతుంది, అనేక జాతుల ఆవాసాలను ప్రభావితం చేస్తుంది, వాటిని మరింత అనుకూలమైన పరిస్థితుల కోసం వెతకడానికి ప్రేరేపిస్తుంది [1, 2]. మెటాజోవన్ల జీవవైవిధ్యాన్ని ప్రభావితం చేయడంతో పాటు, వాతావరణ మార్పు (CC) ఆతిథేయ-సూక్ష్మజీవుల పరస్పర చర్యల యొక్క సున్నితమైన సమతుల్యతను దెబ్బతీస్తుంది. ఈ మైక్రోబియల్ డైస్బాక్టీరియోసిస్ సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థలకు తీవ్రమైన ముప్పును కలిగిస్తుంది, ఎందుకంటే ఇది సముద్ర జీవులను అంటువ్యాధి కారకాలకు మరింత సున్నితంగా చేస్తుంది [3, 4]. సామూహిక మరణాలలో వాతావరణ మార్పులు (SS) ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయని నమ్ముతారు, ఇది ప్రపంచ సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థల నిర్వహణకు తీవ్రమైన సమస్య [5, 6]. అనేక సముద్ర జాతులపై ఆర్థిక, పర్యావరణ మరియు పోషక ప్రభావాలను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే ఇది ఒక ముఖ్యమైన సమస్య. ధ్రువ ప్రాంతాలలో నివసించే ద్వికవాట జీవులకు ఇది ప్రత్యేకంగా వర్తిస్తుంది, ఇక్కడ వాతావరణ మార్పుల ప్రభావాలు మరింత తక్షణమే మరియు తీవ్రంగా ఉంటాయి [6, 7]. వాస్తవానికి, మైటిలస్ spp. వంటి ద్వికవాట జీవులు. సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థలపై వాతావరణ మార్పుల (CC) ప్రభావాలను పర్యవేక్షించడానికి ఇవి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడతాయి. ఆశ్చర్యకరంగా, వాటి ఆరోగ్యాన్ని పర్యవేక్షించడానికి సాపేక్షంగా పెద్ద సంఖ్యలో బయోమార్కర్లు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి, తరచుగా ఎంజైమాటిక్ చర్య లేదా కణ జీవశక్తి మరియు ఫాగోసైటిక్ చర్య వంటి సెల్యులార్ విధుల ఆధారంగా క్రియాత్మక బయోమార్కర్లను కలిగి ఉన్న రెండు-అంచెల విధానాన్ని ఉపయోగిస్తాయి [8]. ఈ పద్ధతులలో పెద్ద మొత్తంలో సముద్రపు నీటిని గ్రహించిన తర్వాత మృదు కణజాలాలలో పేరుకుపోయే నిర్దిష్ట పీడన సూచికల సాంద్రతను కొలవడం కూడా ఉంటుంది. అయితే, ద్వికవాట జీవుల యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యం మరియు పాక్షిక-బహిరంగ ప్రసరణ వ్యవస్థ, రోగి నిర్వహణకు ఒక సరళమైన మరియు కనిష్టంగా హాని కలిగించే విధానమైన లిక్విడ్ బయాప్సీ (LB) భావనను ఉపయోగించి కొత్త హిమోలింఫ్ బయోమార్కర్లను అభివృద్ధి చేయడానికి ఒక అవకాశాన్ని అందిస్తాయి. రక్త నమూనాలు [9, 10]. మానవ LBలో అనేక రకాల ప్రసరణ అణువులను కనుగొనగలిగినప్పటికీ, ఈ భావన ప్రధానంగా ప్లాస్మాలోని ప్రసరణ ఎక్స్ట్రాసెల్యులార్ DNA (ccfDNA) శకలాల DNA సీక్వెన్సింగ్ విశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటుంది. వాస్తవానికి, మానవ ప్లాస్మాలో ప్రసరించే DNA ఉనికి 20వ శతాబ్దం మధ్యకాలం నుండి తెలిసినప్పటికీ [11], ఇటీవలి సంవత్సరాలలో మాత్రమే హై-త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతుల ఆవిర్భావం ccfDNA ఆధారంగా క్లినికల్ డయాగ్నసిస్కు దారితీసింది. ఈ ప్రసరించే DNA శకలాలు ఉండటానికి కారణం పాక్షికంగా కణ మరణం తర్వాత జన్యుసంబంధ DNA (న్యూక్లియర్ మరియు మైటోకాండ్రియల్) నిష్క్రియాత్మకంగా విడుదల కావడమే. ఆరోగ్యవంతులలో, ccfDNA గాఢత సాధారణంగా తక్కువగా (<10 ng/mL) ఉంటుంది, కానీ వివిధ వ్యాధులతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో ఇది 5–10 రెట్లు పెరిగి, కణజాల నష్టానికి దారితీయవచ్చు. ఆరోగ్యవంతులలో, ccfDNA గాఢత సాధారణంగా తక్కువగా (<10 ng/mL) ఉంటుంది, కానీ వివిధ వ్యాధులతో బాధపడుతున్న లేదా ఒత్తిడికి గురైన రోగులలో ఇది 5–10 రెట్లు పెరిగి, కణజాల నష్టానికి దారితీయవచ్చు. У здоровых людей контрация вккДНК в нерме низкая (<10 ng/ml), NO MOJET POVYSHATUS IN 5-10 в 5-10 రజ్లిచ్నోయ్ పటొలాగ్ లేదా పోడ్వెర్గషూషియస్ స్ట్రెస్సూ, ప్రివోడియాషెము క్ పోవ్రేగ్డేనియు త్కానీ. ఆరోగ్యవంతులలో, cccDNA గాఢత సాధారణంగా తక్కువగా ఉంటుంది (<10 ng/mL), కానీ వివిధ వ్యాధులు ఉన్న రోగులలో లేదా కణజాల నష్టానికి దారితీసే ఒత్తిడికి లోనైనప్పుడు ఇది 5–10 రెట్లు పెరగవచ్చు.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织患在 健康 个体 中, ccfdna中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组 织。。损伤కోన్సాంట్రాసియి ccfDNA నిస్కీయే (<10 ng/ml) మీ జ్డోరోవిచ్ లిడియేట్, 5-10వ తేదీలోపు రాస్లిచ్నిమి పాటోలాజియామి లేదా స్ట్రెస్సోమ్, చ్టో ప్రివోడిట్ కె పోవ్రెగ్డెనియు త్కానీ. ఆరోగ్యవంతులలో ccfDNA గాఢతలు సాధారణంగా తక్కువగా (<10 ng/ml) ఉంటాయి, కానీ వివిధ వ్యాధులు లేదా ఒత్తిడి ఉన్న రోగులలో ఇవి 5-10 రెట్లు పెరిగి కణజాల నష్టానికి దారితీయవచ్చు.ccfDNA శకలాల పరిమాణం విస్తృతంగా మారుతుంది, కానీ సాధారణంగా 150 నుండి 200 bp వరకు ఉంటుంది. [12]. స్వీయ-ఉత్పన్న ccfDNA, అంటే, సాధారణ లేదా రూపాంతరం చెందిన హోస్ట్ కణాల నుండి ccfDNA విశ్లేషణను, కేంద్రక మరియు/లేదా మైటోకాండ్రియల్ జన్యువులో ఉన్న జన్యు మరియు ఎపిజెనెటిక్ మార్పులను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు, తద్వారా వైద్యులు నిర్దిష్ట అణు-లక్షిత చికిత్సలను ఎంచుకోవడంలో సహాయపడుతుంది [13]. అయితే, గర్భధారణ సమయంలో పిండ కణాల నుండి లేదా మార్పిడి చేసిన అవయవాల నుండి ccfDNA వంటి బాహ్య వనరుల నుండి కూడా ccfDNAను పొందవచ్చు [14,15,16,17]. ఒక అంటు ఏజెంట్ (బాహ్య) యొక్క న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల ఉనికిని గుర్తించడానికి ccfDNA కూడా ఒక ముఖ్యమైన సమాచార వనరు, ఇది రక్త కల్చర్ల ద్వారా గుర్తించబడని విస్తృతమైన అంటువ్యాధులను నాన్-ఇన్వాసివ్ పద్ధతిలో గుర్తించడానికి అనుమతిస్తుంది, తద్వారా సోకిన కణజాలం యొక్క ఇన్వాసివ్ బయాప్సీని నివారిస్తుంది [18]. ఇటీవలి అధ్యయనాలు మానవ రక్తంలో వైరల్ మరియు బాక్టీరియల్ వ్యాధికారకాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగపడే గొప్ప సమాచార వనరు ఉందని, మరియు మానవ ప్లాస్మాలో కనిపించే ccfDNAలో సుమారు 1% బాహ్య మూలం నుండి వచ్చినదని చూపించాయి [19]. ఈ అధ్యయనాలు ఒక జీవి యొక్క ప్రసరణ మైక్రోబయోమ్ యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని ccfDNA విశ్లేషణను ఉపయోగించి అంచనా వేయవచ్చని ప్రదర్శిస్తాయి. అయితే, ఇటీవలి వరకు, ఈ భావన ప్రత్యేకంగా మానవులలో మరియు కొంతవరకు ఇతర సకశేరుకాలలో ఉపయోగించబడింది [20, 21].
ఈ పత్రంలో, 35 మిలియన్ సంవత్సరాల క్రితం అగ్నిపర్వత విస్ఫోటనం వలన ఏర్పడిన ఒక పెద్ద పీఠభూమిపై ఉన్న ద్వీపాల సమూహమైన సబ్-అంటార్కిటిక్ కెర్గులెన్ దీవులలో సాధారణంగా కనిపించే దక్షిణ జాతి అయిన ఆలాకోమ్యా అత్రా యొక్క ccfDNAను విశ్లేషించడానికి మేము LB పొటెన్షియల్ను ఉపయోగిస్తాము. ఒక ఇన్ విట్రో ప్రయోగాత్మక వ్యవస్థను ఉపయోగించి, సముద్రపు నీటిలోని DNA శకలాలు మస్సెల్స్ ద్వారా త్వరగా గ్రహించబడి, వాటి హిమోలింఫ్ భాగంలోకి ప్రవేశిస్తాయని మేము కనుగొన్నాము. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా మస్సెల్ హిమోలింఫ్ ccfDNAలో వాటి స్వంత మరియు ఇతర మూలాల DNA శకలాలు ఉన్నాయని తేలింది. వీటిలో సహజీవన బ్యాక్టీరియా మరియు శీతల అగ్నిపర్వత సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలకు విలక్షణమైన బయోమ్ల నుండి వచ్చిన DNA శకలాలు కూడా ఉన్నాయి. హిమోలింఫ్ ccfDNAలో విభిన్న అతిధేయ శ్రేణులు కలిగిన వైరస్ల నుండి ఉద్భవించిన వైరల్ సీక్వెన్సులు కూడా ఉన్నాయి. ఎముకలు గల చేపలు, సముద్రపు అనెమోన్లు, శైవలాలు మరియు కీటకాలు వంటి బహుకణ జీవుల నుండి వచ్చిన DNA శకలాలను కూడా మేము కనుగొన్నాము. ముగింపుగా, సముద్ర జీవావరణ వ్యవస్థలలో సమృద్ధమైన జన్యు సంపదను సృష్టించడానికి, సముద్ర అకశేరుకాలకు LB భావనను విజయవంతంగా వర్తింపజేయవచ్చని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
డిసెంబర్ 2018లో, కెర్గులెన్ దీవులలోని పోర్ట్-ఓ-ఫ్రాన్స్ (049°21.235 S, 070°13.490 E) యొక్క ఆటుపోట్ల మధ్య ఉండే రాతి తీరాల నుండి వయోజన (55-70 మి.మీ. పొడవు) మైటిలస్ ప్లాటెన్సిస్ (M. ప్లాటెన్సిస్) మరియు ఔలాకోమ్యా అట్రా (A. అట్రా)లను సేకరించారు. ఇతర వయోజన నీలి మస్సెల్స్ను (మైటిలస్ spp.) ఒక వాణిజ్య సరఫరాదారు (PEI మస్సెల్ కింగ్ ఇంక్., ప్రిన్స్ ఎడ్వర్డ్ ఐలాండ్, కెనడా) నుండి పొంది, 10–20 లీటర్ల 32‰ కృత్రిమ ఉప్పునీరు (రీఫ్ క్రిస్టల్, ఇన్స్టంట్ ఓషన్, వర్జీనియా, USA) ఉన్న, ఉష్ణోగ్రత నియంత్రిత (4°C) మరియు గాలి ప్రసరణ గల ట్యాంక్లో ఉంచారు. ప్రతి ప్రయోగంలో, ఒక్కో గవ్వ యొక్క పొడవు మరియు బరువును కొలిచారు.
ఈ ప్రోగ్రామ్ కోసం ఉచిత ఓపెన్ యాక్సెస్ ప్రోటోకాల్ ఆన్లైన్లో అందుబాటులో ఉంది (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). క్లుప్తంగా, [22]లో వివరించిన విధంగా అబ్డక్టర్ కండరాల నుండి LB హిమోలింఫ్ సేకరించబడింది. హిమోలింఫ్ను 3 నిమిషాల పాటు 1200×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా స్పష్టం చేయబడింది, సూపర్నాటెంట్ను ఉపయోగించే వరకు స్తంభింపజేయబడింది (-20°C). cfDNA యొక్క ఐసోలేషన్ మరియు ప్యూరిఫికేషన్ కోసం, నమూనాలను (1.5-2.0 ml) కరిగించి, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం న్యూక్లియోస్నాప్ cfDNA కిట్ (మాచెరీ-నాగెల్, బెత్లెహెన్, PA) ఉపయోగించి ప్రాసెస్ చేయబడ్డాయి. తదుపరి విశ్లేషణ వరకు ccfDNA -80°C వద్ద నిల్వ చేయబడింది. కొన్ని ప్రయోగాలలో, QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్ (QIAGEN, టొరంటో, ఒంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి ccfDNA ఐసోలేట్ చేయబడింది మరియు శుద్ధి చేయబడింది. శుద్ధి చేయబడిన DNA ఒక ప్రామాణిక పికోగ్రీన్ అస్సే ఉపయోగించి పరిమాణీకరించబడింది. వేరుచేసిన ccfDNA యొక్క ఖండాల పంపిణీని, హై సెన్సిటివిటీ DNA కిట్ను ఉపయోగించి, అజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ (అజిలెంట్ టెక్నాలజీస్ ఇంక్., శాంటా క్లారా, CA) ద్వారా కేశనాళిక ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ ద్వారా విశ్లేషించారు. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం 1 µl ccfDNA నమూనాను ఉపయోగించి ఈ పరీక్షను నిర్వహించారు.
హెమోలింఫ్ ccfDNA ఫ్రాగ్మెంట్ల సీక్వెన్సింగ్ కోసం, జెనోమ్ క్యూబెక్ (మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) వారు ఇల్యూమినా MiSeq PE75 కిట్లోని ఇల్యూమినా DNA మిక్స్ కిట్ను ఉపయోగించి షాట్గన్ లైబ్రరీలను తయారుచేశారు. ఒక ప్రామాణిక అడాప్టర్ (BioO) ఉపయోగించబడింది. రా డేటా ఫైల్స్ NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ (SRR8924808 మరియు SRR8924809) నుండి అందుబాటులో ఉన్నాయి. ఫాస్ట్క్యూసి [23] ఉపయోగించి ప్రాథమిక రీడింగ్ నాణ్యతను అంచనా వేశారు. అడాప్టర్లను మరియు నాణ్యత తక్కువగా ఉన్న రీడ్లను క్లిప్ చేయడానికి ట్రిమ్మోమాటిక్ [24] ఉపయోగించబడింది. మిస్మ్యాచ్లను నివారించడానికి [25], పెయిర్డ్ ఎండ్లతో ఉన్న షాట్గన్ రీడ్లను కనీసం 20 bp ఓవర్ల్యాప్తో పొడవైన సింగిల్ రీడ్లుగా ఫ్లాష్ మెర్జ్ చేశారు. విలీనం చేయబడిన రీడ్లను బైవాల్వ్ NCBI టాక్సోనమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించారు మరియు తక్కువ-క్లిష్టత గల సీక్వెన్స్ల మాస్కింగ్ DUST [26] ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. విలీనం చేయబడిన రీడ్లను బైవాల్వ్ NCBI టాక్సోనమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e−3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించారు మరియు తక్కువ-క్లిష్టత గల సీక్వెన్స్ల మాస్కింగ్ DUST [26] ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. ఆబ్జెడినెన్సీ బ్లాస్ట్ఎన్ఎస్ఐఎస్పోల్జోవానియం బాజీ డాన్టివస్ ట్యాక్సోనోమిస్ моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% గోమోలాగి), మాస్కిరోవానీ పోస్లెడోవాటెల్నోస్టే నైజ్కోయ్ స్లోగ్నోస్టి బైలో వైపోల్నెనో [ఇస్పోల్26]D. పూల్డ్ రీడ్స్ను NCBI బైవాల్వ్ టాక్సోనమీ డేటాబేస్ (e విలువ < 1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించారు మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ సంక్లిష్టత సీక్వెన్స్ మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది.使用双壳类NCBI进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ఆబ్జెడినెన్సీ టెక్నీషియన్ బైలీ ఆన్నోటిరోవానీ స్ పోమోష్యూ BLASTN సిస్పోల్జోవానియమ్ టాక్సోనోమిచెస్కోయ్ బ్యాగ్స్ డేట్ మోలిస్క్ ఎన్సిబిఐ (ప్రసిద్ధి ఇ <1e-3 మరియు 90% గామోలాగ్లు), మాస్కిరోవానీ పోస్లెడోవాటెల్నోస్ట్ నైజ్కోయ్ స్లోజ్నోస్ట్ బిలో వైపోల్నెనో డి.62 పూల్డ్ రీడ్స్ను NCBI బైవాల్వ్ టాక్సోనమిక్ డేటాబేస్ (e విలువ <1e-3 మరియు 90% హోమోలజీ) ఉపయోగించి BLASTNతో వ్యాఖ్యానించారు మరియు DUST [26] ఉపయోగించి తక్కువ సంక్లిష్టత సీక్వెన్స్ మాస్కింగ్ నిర్వహించబడింది.రీడ్లను రెండు గ్రూపులుగా విభజించారు: బైవాల్వ్ సీక్వెన్స్లకు సంబంధించినవి (ఇక్కడ సెల్ఫ్-రీడ్స్ అని పిలుస్తారు) మరియు సంబంధం లేనివి (నాన్-సెల్ఫ్-రీడ్స్). కాంటిగ్లను రూపొందించడానికి ఈ రెండు గ్రూపులను MEGAHIT ఉపయోగించి విడివిడిగా అసెంబుల్ చేశారు [27]. ఇంతలో, ఏలియన్ మైక్రోబయోమ్ రీడ్ల టాక్సోనమిక్ పంపిణీని Kraken2 [28] ఉపయోగించి వర్గీకరించారు మరియు Galaxy [29, 30]లో క్రోనా పై చార్ట్ ద్వారా గ్రాఫికల్గా సూచించారు. మా ప్రాథమిక ప్రయోగాల నుండి సరైన kmers, kmers-59 అని నిర్ధారించబడింది. తుది వ్యాఖ్యానం కోసం, BLASTN (బైవాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో అలైన్మెంట్ ద్వారా సెల్ఫ్ కాంటిగ్లను గుర్తించారు. తుది వ్యాఖ్యానం కోసం, BLASTN (బైవాల్వ్ NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో అలైన్మెంట్ ద్వారా సెల్ఫ్ కాంటిగ్లను గుర్తించారు. గ్యాటెమ్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కాంటిగి బైలీ ఇడెంటిఫిషైరోవానీ పుటేమ్ సోపోస్టావ్లేనియా స్ బ్లాస్ట్న్ (బాజా డానిక్స్ డైవ్స్టవ్ NCBI, значение e <1e-10 и గోమోలాజియా 60%) తుది వ్యాఖ్యానం కోసం BLASTN (NCBI బైవాల్వ్ డేటాబేస్, e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో సరిపోల్చడం ద్వారా సెల్ఫ్-కాంటిగ్లను గుర్తించారు.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% గ్యాటెమ్ బైలీ ఐడెంటిఫికేషన్స్ సోబ్స్ట్వెన్నియే కోంటిగి డిలియా ఒకోన్చాటెల్నోయ్ అనోటాషియస్ పుటేమ్ సోపోస్టవ్స్ దానయ్య NCBI నుండి двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). ఆ తర్వాత, BLASTN (NCBI బైవాల్వ్ డేటాబేస్, e విలువ <1e-10 మరియు 60% హోమోలజీ)తో సరిపోల్చడం ద్వారా తుది అనోటేషన్ కోసం సెల్ఫ్-కాంటిగ్లను గుర్తించారు. సమాంతరంగా, నాన్సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్లు BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి. సమాంతరంగా, నాన్సెల్ఫ్ గ్రూప్ కాంటిగ్లు BLASTN (nt NCBI డేటాబేస్, e విలువ < 1e−10 మరియు 60% హోమోలజీ) తో వ్యాఖ్యానించబడ్డాయి. పరాల్లెల్నో చుజెరోడ్ని గ్రుప్పోవై కాంటిగి బైలీ అనోటిరోవానీ స్ పోమోష్యూ BLASTN (బాజా డాన్సీ
PCR కోసం ఉపయోగించిన ప్రైమర్లు పట్టిక S1లో జాబితా చేయబడ్డాయి. ccfDNA లక్ష్య జన్యువులను విస్తరించడానికి Taq DNA పాలిమరేస్ (బయో బేసిక్ కెనడా, మార్ఖమ్, ON) ఉపయోగించబడింది. ఈ క్రింది చర్య పరిస్థితులు ఉపయోగించబడ్డాయి: 3 నిమిషాల పాటు 95°C వద్ద డీనాటరేషన్, 1 నిమిషం పాటు 95°C, 1 నిమిషం పాటు సెట్ అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత, 1 నిమిషం పాటు 72°C వద్ద ఎలాంగేషన్, 35 సైకిల్స్, మరియు చివరగా 10 నిమిషాలలోపు 72°C. PCR ఉత్పత్తులు 95 V వద్ద SYBRTM సేఫ్ DNA జెల్ స్టెయిన్ (ఇన్విట్రోజెన్, బర్లింగ్టన్, ON, కెనడా) కలిగిన అగరోస్ జెల్స్ (1.5%)లో ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి.
మస్సెల్స్ను (మైటిలస్ spp.) 4°C వద్ద 24 గంటల పాటు 500 ml ఆక్సిజన్ కలిపిన సముద్రపు నీటిలో (32 PSU) అలవాటు చేశారు. మానవ గాలెక్టిన్-7 cDNA సీక్వెన్స్ను (NCBI యాక్సెషన్ నంబర్ L07769) ఎన్కోడ్ చేసే ఇన్సర్ట్ను కలిగి ఉన్న ప్లాస్మిడ్ DNAను 190 μg/μl తుది గాఢతతో వయల్కు జోడించారు. DNA జోడించకుండా అదే పరిస్థితులలో ఇంక్యుబేట్ చేసిన మస్సెల్స్ నియంత్రణ సమూహంగా ఉన్నాయి. మూడవ నియంత్రణ ట్యాంక్లో మస్సెల్స్ లేకుండా DNA ఉంది. సముద్రపు నీటిలోని DNA నాణ్యతను పర్యవేక్షించడానికి, సూచించిన సమయంలో ప్రతి ట్యాంక్ నుండి సముద్రపు నీటి నమూనాలను (20 μl; మూడు పునరావృత్తులు) తీసుకున్నారు. ప్లాస్మిడ్ DNA ట్రేసబిలిటీ కోసం, సూచించిన సమయాల్లో LB మస్సెల్స్ను సేకరించి, qPCR మరియు ddPCR ద్వారా విశ్లేషించారు. సముద్రపు నీటిలో ఉప్పు శాతం ఎక్కువగా ఉన్నందున, అన్ని PCR పరీక్షలకు ముందు నమూనాలను PCR నాణ్యత గల నీటిలో (1:10) పలుచబరిచారు.
బయోరాడ్ QX200 ప్రోటోకాల్ (మిస్సిసాగా, అంటారియో, కెనడా) ఉపయోగించి డిజిటల్ డ్రాప్లెట్ PCR (ddPCR) నిర్వహించబడింది. సరైన ఉష్ణోగ్రతను నిర్ధారించడానికి ఉష్ణోగ్రత ప్రొఫైల్ను ఉపయోగించండి (పట్టిక S1). QX200 డ్రాప్ జెనరేటర్ (బయోరాడ్) ఉపయోగించి చుక్కలు ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. ddPCR ఈ క్రింది విధంగా నిర్వహించబడింది: 5 నిమిషాల పాటు 95°C, 50 సైకిల్స్ పాటు 30 సెకన్ల పాటు 95°C మరియు 1 నిమిషం పాటు నిర్దిష్ట అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత, 30 సెకన్ల పాటు 72°C, 5 నిమిషాల పాటు 4°C మరియు 5 నిమిషాలలోపు 90°C. చుక్కల సంఖ్య మరియు పాజిటివ్ రియాక్షన్లను (కాపీల సంఖ్య/µl) QX200 డ్రాప్ రీడర్ (బయోరాడ్) ఉపయోగించి కొలవబడ్డాయి. 10,000 కంటే తక్కువ చుక్కలు ఉన్న నమూనాలు తిరస్కరించబడ్డాయి. ప్రతిసారీ ddPCR నిర్వహించినప్పుడు ప్యాటర్న్ కంట్రోల్ చేయబడలేదు.
రోటర్-జీన్® 3000 (కార్బెట్ రీసెర్చ్, సిడ్నీ, ఆస్ట్రేలియా) మరియు LGALS7 నిర్దిష్ట ప్రైమర్లను ఉపయోగించి qPCR నిర్వహించబడింది. అన్ని క్వాంటిటేటివ్ PCRలు క్వాంటిఫాస్ట్ SYBR గ్రీన్ PCR కిట్ (QIAGEN) ఉపయోగించి 20 µlలో నిర్వహించబడ్డాయి. qPCR 95°C వద్ద 15 నిమిషాల ఇంక్యుబేషన్తో ప్రారంభించబడింది, ఆ తర్వాత 40 సైకిల్స్ పాటు 95°C వద్ద 10 సెకన్లు మరియు 60°C వద్ద 60 సెకన్ల పాటు ఒక డేటా సేకరణతో కొనసాగించబడింది. 95°C వద్ద 5 సెకన్లు, 65°C వద్ద 60 సెకన్లు, మరియు qPCR చివరిలో 97°C వద్ద వరుస కొలతలను ఉపయోగించి మెల్టింగ్ కర్వ్లు రూపొందించబడ్డాయి. కంట్రోల్ నమూనాలు మినహా, ప్రతి qPCR మూడుసార్లు నిర్వహించబడింది.
మస్సెల్స్ వాటి అధిక వడపోత రేటుకు ప్రసిద్ధి చెందినందున, అవి సముద్రపు నీటిలో ఉన్న DNA శకలాలను వడపోసి, నిలుపుకోగలవా అని మేము మొదట పరిశోధించాము. ఈ శకలాలు వాటి పాక్షికంగా తెరిచి ఉన్న శోషరస వ్యవస్థలో పేరుకుపోతాయా అనే దానిపై కూడా మాకు ఆసక్తి ఉంది. బ్లూ మస్సెల్ ట్యాంకులకు జోడించిన కరిగే DNA శకలాల గమనాన్ని గుర్తించడం ద్వారా మేము ఈ సమస్యను ప్రయోగాత్మకంగా పరిష్కరించాము. DNA శకలాలను గుర్తించడాన్ని సులభతరం చేయడానికి, మేము మానవ గాలెక్టిన్-7 జన్యువును కలిగి ఉన్న బాహ్య (స్వీయ కాదు) ప్లాస్మిడ్ DNAను ఉపయోగించాము. ddPCR సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్స్లోని ప్లాస్మిడ్ DNA శకలాలను గుర్తిస్తుంది. మా ఫలితాలు ఏమి చూపిస్తున్నాయంటే, మస్సెల్స్ లేనప్పుడు సముద్రపు నీటిలోని DNA శకలాల పరిమాణం కాలక్రమేణా (7 రోజుల వరకు) సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉంటే, మస్సెల్స్ ఉన్నప్పుడు ఈ స్థాయి 8 గంటలలోపు దాదాపు పూర్తిగా అదృశ్యమైంది (పటం 1a,b). బాహ్య DNA శకలాలు ఇంట్రావాల్వ్యులర్ ద్రవం మరియు హిమోలింఫ్లో 15 నిమిషాలలోపు సులభంగా గుర్తించబడ్డాయి (పటం 1c). ఈ శకలాలను బహిర్గతం అయిన 4 గంటల వరకు కూడా గుర్తించగలిగారు. DNA శకలాలకు సంబంధించి ఈ వడపోత చర్య బాక్టీరియా మరియు ఆల్గేల వడపోత చర్యతో పోల్చదగినది [31]. ఈ ఫలితాలు మస్సెల్స్ వాటి ద్రవ భాగాలలో విదేశీ DNA ను వడపోసి, సేకరించగలవని సూచిస్తున్నాయి.
మస్సెల్స్ ఉన్నప్పుడు (A) లేదా లేనప్పుడు (B) సముద్రపు నీటిలో ప్లాస్మిడ్ DNA యొక్క సాపేక్ష గాఢతలను ddPCR ద్వారా కొలవడం జరిగింది. A లో, ఫలితాలు శాతాలలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి, బాక్సుల అంచులు 75వ మరియు 25వ పర్సంటైల్లను సూచిస్తాయి. అమర్చిన లాగరిథమిక్ వక్రరేఖ ఎరుపు రంగులో చూపబడింది, మరియు బూడిద రంగులో షేడ్ చేయబడిన ప్రాంతం 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తుంది. B లో, ఎరుపు గీత సగటును మరియు నీలం గీత గాఢతకు 95% విశ్వాస విరామాన్ని సూచిస్తాయి. C ప్లాస్మిడ్ DNA ను జోడించిన తర్వాత వివిధ సమయాల్లో మస్సెల్స్ యొక్క హిమోలింఫ్ మరియు వాల్వ్యులర్ ద్రవంలో ప్లాస్మిడ్ DNA పేరుకుపోవడం. ఫలితాలు గుర్తించబడిన సంపూర్ణ కాపీలు/mL (±SE) గా ప్రదర్శించబడ్డాయి.
తరువాత, మేము పరిమిత మానవ ప్రభావం కలిగిన మారుమూల ద్వీపాల సమూహమైన కెర్గులెన్ దీవులలోని మస్సెల్ పడకల నుండి సేకరించిన మస్సెల్స్లో ccfDNA యొక్క మూలాన్ని పరిశోధించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మానవ cccDNAను శుద్ధి చేయడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతుల ద్వారా మస్సెల్ హిమోలింఫ్ల నుండి cccDNAను వేరుచేసి శుద్ధి చేయబడింది [32, 33]. మస్సెల్స్లో సగటు హిమోలింఫ్ ccfDNA సాంద్రతలు ప్రతి ml హిమోలింఫ్కు తక్కువ మైక్రోగ్రాముల పరిధిలో ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (టేబుల్ S2, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్ చూడండి). ఈ సాంద్రతల పరిధి ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో కంటే (ప్రతి మిల్లీలీటర్కు తక్కువ నానోగ్రాములు) చాలా పెద్దది, కానీ అరుదైన సందర్భాల్లో, క్యాన్సర్ రోగులలో, ccfDNA స్థాయి ప్రతి మిల్లీలీటర్కు అనేక మైక్రోగ్రాములకు చేరుకుంటుంది [34, 35]. హిమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీ విశ్లేషణలో ఈ శకలాలు పరిమాణంలో 1000 bp నుండి 1000 bp వరకు మరియు 5000 bp వరకు విస్తృతంగా మారుతాయని తేలింది (Fig. 2). సిలికా ఆధారిత QIAamp ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్ను ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి, ఇది ఫోరెన్సిక్ సైన్స్లో ccfDNA [36]తో సహా తక్కువ సాంద్రత గల DNA నమూనాల నుండి జన్యు DNAని వేగంగా వేరుచేయడానికి మరియు శుద్ధి చేయడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతి.
మస్సెల్ హిమోలింఫ్ యొక్క ప్రాతినిధ్య ccfDNA ఎలక్ట్రోఫోరోగ్రామ్. న్యూక్లియోస్నాప్ ప్లాస్మా కిట్ (పైన) మరియు QIAamp DNA ఇన్వెస్టిగేటర్ కిట్తో సంగ్రహించబడింది. B మస్సెల్స్లో హిమోలింఫ్ ccfDNA గాఢతల (±SE) పంపిణీని చూపే వయోలిన్ ప్లాట్. నలుపు మరియు ఎరుపు గీతలు వరుసగా మధ్యస్థం మరియు మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్స్ను సూచిస్తాయి.
మానవులు మరియు ప్రైమేట్లలోని ccfDNAలో సుమారు 1% బాహ్య మూలాన్ని కలిగి ఉంటుంది [21, 37]. ద్వికవాట జీవుల యొక్క పాక్షిక-బహిరంగ ప్రసరణ వ్యవస్థ, సూక్ష్మజీవులు అధికంగా ఉండే సముద్రపు నీరు మరియు మస్సెల్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీని పరిగణనలోకి తీసుకుని, మస్సెల్ హిమోలింఫ్ ccfDNAలో సమృద్ధిగా మరియు విభిన్నమైన సూక్ష్మజీవుల DNA ఉండవచ్చని మేము ఊహించాము. ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి, మేము కెర్గులెన్ దీవుల నుండి సేకరించిన Aulacomya atra నమూనాల నుండి హిమోలింఫ్ ccfDNAను సీక్వెన్స్ చేశాము, దీని ఫలితంగా 10 మిలియన్లకు పైగా రీడ్లు వచ్చాయి, వాటిలో 97.6% నాణ్యతా నియంత్రణలో ఉత్తీర్ణత సాధించాయి. ఆ తర్వాత, BLASTN మరియు NCBI ద్వికవాట డేటాబేస్లను ఉపయోగించి, ఈ రీడ్లను స్వీయ మరియు అస్వీయ మూలాల ప్రకారం వర్గీకరించాము (Fig. S1, అనుబంధ సమాచారం).
మానవులలో, కేంద్రక మరియు మైటోకాండ్రియల్ DNA రెండూ రక్తప్రవాహంలోకి విడుదల చేయబడతాయి [38]. అయితే, A. atra జన్యువును క్రమబద్ధీకరించడం లేదా వివరించడం జరగనందున, ప్రస్తుత అధ్యయనంలో మస్సెల్స్ యొక్క కేంద్రక జన్యు DNAను వివరంగా వివరించడం సాధ్యం కాలేదు. అయినప్పటికీ, మేము బైవాల్వ్ లైబ్రరీని ఉపయోగించి మా స్వంత మూలానికి చెందిన అనేక ccfDNA శకలాలను గుర్తించగలిగాము (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం). క్రమబద్ధీకరించబడిన ఆ A. atra జన్యువుల యొక్క డైరెక్టెడ్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ ద్వారా మా స్వంత మూలానికి చెందిన DNA శకలాల ఉనికిని కూడా మేము నిర్ధారించాము (Fig. 3). అదేవిధంగా, A. atra యొక్క మైటోకాండ్రియల్ జన్యువు పబ్లిక్ డేటాబేస్లలో అందుబాటులో ఉన్నందున, A. atra యొక్క హిమోలింఫ్లో మైటోకాండ్రియల్ ccfDNA శకలాల ఉనికికి సంబంధించిన ఆధారాలను కనుగొనవచ్చు. PCR యాంప్లిఫికేషన్ ద్వారా మైటోకాండ్రియల్ DNA శకలాల ఉనికి నిర్ధారించబడింది (Fig. 3).
PCR ద్వారా విస్తరించబడిన A. atra (ఎర్ర చుక్కలు – స్టాక్ నంబర్: SRX5705969) మరియు M. platensis (నీలి చుక్కలు – స్టాక్ నంబర్: SRX5705968) యొక్క హిమోలింఫ్లో వివిధ మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యువులు ఉన్నాయి. పటం బ్రెటన్ మరియు ఇతరులు, 2011 నుండి స్వీకరించబడింది. B. FTA పేపర్పై నిల్వ చేయబడిన A. atra నుండి హిమోలింఫ్ సూపర్నాటెంట్ యొక్క విస్తరణ. PCR మిశ్రమాన్ని కలిగి ఉన్న PCR ట్యూబ్కు నేరుగా జోడించడానికి 3 mm పంచ్ను ఉపయోగించండి.
సముద్రపు నీటిలో సూక్ష్మజీవులు సమృద్ధిగా ఉన్నందున, మేము ప్రారంభంలో హిమోలింఫ్లోని సూక్ష్మజీవుల DNA శ్రేణుల లక్షణాలను గుర్తించడంపై దృష్టి పెట్టాము. దీని కోసం, మేము రెండు వేర్వేరు వ్యూహాలను ఉపయోగించాము. మొదటి వ్యూహంలో క్రాకెన్2 (Kraken2) ను ఉపయోగించాము, ఇది ఒక అల్గారిథం-ఆధారిత శ్రేణి వర్గీకరణ ప్రోగ్రామ్, ఇది BLAST మరియు ఇతర సాధనాలతో పోల్చదగిన ఖచ్చితత్వంతో సూక్ష్మజీవుల శ్రేణులను గుర్తించగలదు [28]. 6719 కంటే ఎక్కువ రీడ్లు బ్యాక్టీరియా మూలానికి చెందినవిగా నిర్ధారించబడ్డాయి, అయితే 124 మరియు 64 వరుసగా ఆర్కియా మరియు వైరస్ల నుండి వచ్చాయి (Fig. 4). అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న బ్యాక్టీరియా DNA శకలాలు ఫర్మికుట్స్ (46%), ప్రోటియోబాక్టీరియా (27%), మరియు బాక్టెరాయిడెట్స్ (17%) (Fig. 4a). ఈ పంపిణీ సముద్రపు నీలి మస్సెల్ మైక్రోబయోమ్ యొక్క మునుపటి అధ్యయనాలతో స్థిరంగా ఉంది [39, 40]. గామాప్రోటియోబాక్టీరియా ప్రోటియోబాక్టీరియా యొక్క ప్రధాన తరగతి (44%), ఇందులో అనేక వైబ్రియోనేల్స్ ఉన్నాయి (Fig. 4b). ddPCR పద్ధతి A. atra హిమోలింఫ్ యొక్క ccfDNAలో విబ్రియో DNA శకలాలు ఉన్నాయని నిర్ధారించింది (Fig. 4c) [41]. ccfDNA యొక్క బ్యాక్టీరియా మూలం గురించి మరింత సమాచారం పొందడానికి, అదనపు విధానం తీసుకోబడింది (Fig. S2, అనుబంధ సమాచారం). ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్లను పెయిర్డ్-ఎండ్ రీడ్లుగా సమీకరించి, BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువ మరియు >90% హోమోలజీ కటాఫ్ను ఉపయోగించి వాటిని స్వీయ (బైవాల్వ్లు) లేదా అస్వీయ మూలంగా వర్గీకరించారు. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందిన రీడ్లను పెయిర్డ్-ఎండ్ రీడ్లుగా సమీకరించి, BLASTN మరియు 1e−3 యొక్క e విలువ మరియు >90% హోమోలజీ కటాఫ్ను ఉపయోగించి వాటిని స్వీయ (బైవాల్వ్లు) లేదా అస్వీయ మూలంగా వర్గీకరించారు. నేను ఏటమ్ స్లుచై పెరెక్రివ్యూషియస్ బైలీ సోబ్రాని కాక్ ఛేనియ స్ పార్నిమి కోన్సామి మరియు బైలీ క్లాస్సి собstvennыe (ప్రత్యేకమైన మొలిస్కి) లేదా చుజీ పో ప్రోయిషోగ్డెనియమ్ సిస్పోల్జోవానియమ్ BLASTN మరియు ప్రఖ్యాతి మరియు 1e-3 మరియు гомологией> 90%. ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్లను పెయిర్డ్-ఎండెడ్ రీడ్లుగా సేకరించి, BLASTN మరియు 1e-3 యొక్క e విలువ మరియు >90% హోమోలజీ కటాఫ్ను ఉపయోగించి స్థానిక (బైవాల్వ్) లేదా అసలైనవి కానివిగా వర్గీకరించారు.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。మీరు和> 90% 同源性 的 分类 自身 В В В В В том случае перекрывующеся чтения були собраны как чтения с parnыmy konshami and класифицы సోబ్స్ట్వెన్ని (దృవీకరణ మోలిస్కి) లేదా ఇతర విషయాలు ఈ సందర్భంలో, అతివ్యాప్తి చెందుతున్న రీడ్లను పెయిర్డ్-ఎండెడ్ రీడ్లుగా సేకరించి, eBLASTN మరియు 1e-3 విలువలు మరియు >90% హోమోలజీ థ్రెషోల్డ్ను ఉపయోగించి వాటిని స్వంతమైనవి (బైవాల్వ్లు) లేదా అసలైనవి కానివిగా వర్గీకరించారు.A. atra జన్యువు ఇంకా సీక్వెన్స్ చేయబడనందున, మేము MEGAHIT నెక్స్ట్ జనరేషన్ సీక్వెన్సింగ్ (NGS) అసెంబ్లర్ యొక్క డి నోవో అసెంబ్లీ వ్యూహాన్ని ఉపయోగించాము. మొత్తం 147,188 కాంటిగ్లు ఆధారిత (బైవాల్వ్లు) మూలానికి చెందినవిగా గుర్తించబడ్డాయి. ఈ కాంటిగ్లను తరువాత BLASTN మరియు BLASTX ఉపయోగించి 1e-10 e-విలువలతో ఎక్స్ప్లోడ్ చేయబడ్డాయి. ఈ వ్యూహం A. atra ccfDNAలో ఉన్న 482 నాన్-బైవాల్వ్ ఫ్రాగ్మెంట్లను గుర్తించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. ఈ DNA ఫ్రాగ్మెంట్లలో సగానికి పైగా (57%) బ్యాక్టీరియా నుండి, ప్రధానంగా గిల్ సింబయాంట్ల నుండి, సల్ఫోట్రోఫిక్ సింబయాంట్లతో సహా, మరియు గిల్ సింబయాంట్ సోలెమ్యా వెలమ్ నుండి పొందబడ్డాయి (పటం 5).
రకం స్థాయిలో సాపేక్ష సమృద్ధి. బి. రెండు ప్రధాన ఫైలాల (ఫిర్మికుట్స్ మరియు ప్రోటియోబాక్టీరియా) సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యం. ddPCR యొక్క ప్రాతినిధ్య విస్తరణ. సి. విబ్రియో spp. ఎ. మూడు అట్రా హిమోలింఫ్లలో 16S rRNA జన్యువు (నీలం) యొక్క శకలాలు.
మొత్తం 482 సేకరించిన కాంటిగ్లను విశ్లేషించారు. మెటాజెనోమిక్ కాంటిగ్ ఉల్లేఖనాల (ప్రోకార్యోట్లు మరియు యూకార్యోట్లు) వర్గీకరణ పంపిణీ యొక్క సాధారణ ప్రొఫైల్. బి. BLASTN మరియు BLASTX ద్వారా గుర్తించబడిన బాక్టీరియల్ DNA శకలాల వివరణాత్మక పంపిణీ.
Kraken2 విశ్లేషణలో మస్సెల్ ccfDNAలో ఆర్కియల్ DNA శకలాలు ఉన్నాయని కూడా తేలింది, వీటిలో యూరియార్కియోటా (65%), క్రెనార్కియోటా (24%), మరియు థౌర్మార్కియోటా (11%) యొక్క DNA శకలాలు ఉన్నాయి (Fig. 6a). గతంలో కాలిఫోర్నియన్ మస్సెల్స్ యొక్క సూక్ష్మజీవుల సముదాయంలో కనుగొనబడిన యూరియార్కియోటా మరియు క్రెనార్కియోటా నుండి ఉద్భవించిన DNA శకలాల ఉనికి ఆశ్చర్యం కలిగించకూడదు [42]. యూరియార్కియోటా తరచుగా తీవ్రమైన పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉన్నప్పటికీ, యూరియార్కియోటా మరియు క్రెనార్కియోటా రెండూ సముద్ర క్రయోజెనిక్ వాతావరణంలో అత్యంత సాధారణ ప్రోకార్యోట్లలో ఉన్నాయని ఇప్పుడు గుర్తించబడింది [43, 44]. కెర్గులెన్ పీఠభూమిపై అడుగుభాగంలో లీకుల నుండి విస్తృతమైన మీథేన్ లీకేజీల గురించి ఇటీవలి నివేదికలు [45] మరియు కెర్గులెన్ దీవుల తీరంలో గమనించిన సూక్ష్మజీవుల మీథేన్ ఉత్పత్తి [46] దృష్ట్యా, మస్సెల్స్లో మీథేనోజెనిక్ సూక్ష్మజీవుల ఉనికి ఆశ్చర్యం కలిగించదు.
ఆ తర్వాత మా దృష్టి DNA వైరస్ల నుండి వచ్చిన రీడింగ్ల వైపు మళ్లింది. మాకు తెలిసినంతవరకు, మస్సెల్స్లోని వైరస్ కంటెంట్పై ఇది మొట్టమొదటి ఆఫ్-టార్గెట్ అధ్యయనం. ఊహించినట్లుగానే, మేము బాక్టీరియోఫేజ్ల (కాడోవిరాలెస్) DNA శకలాలను కనుగొన్నాము (పటం 6బి). అయితే, అత్యంత సాధారణ వైరల్ DNA, న్యూక్లియోసైటోవైరస్ల ఫైలమ్ నుండి వచ్చింది, దీనిని న్యూక్లియర్ సైటోప్లాస్మిక్ లార్జ్ DNA వైరస్ (NCLDV) అని కూడా పిలుస్తారు, ఇది ఏ వైరస్లోనైనా అతిపెద్ద జన్యువును కలిగి ఉంటుంది. ఈ ఫైలమ్లో, చాలా DNA సీక్వెన్సులు మిమిమిడోవిరిడే (58%) మరియు పాక్స్విరిడే (21%) కుటుంబాలకు చెందినవి, వీటి సహజ ఆతిథేయులలో సకశేరుకాలు మరియు ఆర్థ్రోపాడ్లు ఉన్నాయి, అయితే ఈ DNA సీక్వెన్సులలో ఒక చిన్న భాగం తెలిసిన వైరలాజికల్ ఆల్గేకు చెందినవి. ఇది సముద్ర యూకారియోటిక్ ఆల్గేకు సోకుతుంది. తెలిసిన ఏ వైరల్ జాతిలోనైనా అతిపెద్ద జన్యు పరిమాణం కలిగిన దిగ్గజ వైరస్ అయిన పండోరా వైరస్ నుండి కూడా సీక్వెన్సులు పొందబడ్డాయి. ఆసక్తికరంగా, హిమోలింఫ్ ccfDNA సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా వైరస్ సోకినట్లు తెలిసిన ఆతిథేయుల పరిధి చాలా పెద్దదిగా ఉంది (చిత్రం S3, అనుబంధ సమాచారం). ఇందులో బాకులోవిరిడే మరియు ఇరిడోవిరిడే వంటి కీటకాలకు సోకే వైరస్లు, అలాగే అమీబా, శైవలాలు మరియు సకశేరుకాలకు సోకే వైరస్లు ఉన్నాయి. మేము పిథోవైరస్ సైబీరికం జన్యువుతో సరిపోలే సీక్వెన్సులను కూడా కనుగొన్నాము. పిటోవైరస్లను ("జోంబీ వైరస్లు" అని కూడా పిలుస్తారు) మొదట సైబీరియాలోని 30,000 సంవత్సరాల పురాతన పెర్మాఫ్రాస్ట్ నుండి వేరు చేశారు [47]. అందువల్ల, ఈ వైరస్ల యొక్క అన్ని ఆధునిక జాతులు అంతరించిపోలేదని [48] మరియు ఈ వైరస్లు మారుమూల సబార్కిటిక్ సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో ఉండవచ్చని చూపే మునుపటి నివేదికలతో మా ఫలితాలు ఏకీభవిస్తున్నాయి.
చివరగా, ఇతర బహుకణ జంతువుల నుండి DNA శకలాలను కనుగొనగలమో లేదో చూడటానికి మేము పరీక్షించాము. nt, nr మరియు RefSeq లైబ్రరీలతో (జన్యు మరియు ప్రోటీన్) BLASTN మరియు BLASTX ద్వారా మొత్తం 482 విదేశీ కాంటిగ్లు గుర్తించబడ్డాయి. మా ఫలితాలు బహుకణ జంతువుల ccfDNA యొక్క విదేశీ శకలాలలో ఎముకల DNA ప్రబలంగా ఉందని చూపిస్తున్నాయి (Fig. 5). కీటకాలు మరియు ఇతర జాతుల నుండి DNA శకలాలు కూడా కనుగొనబడ్డాయి. భూమిపై నివసించే జాతులతో పోలిస్తే జన్యు డేటాబేస్లలో పెద్ద సంఖ్యలో సముద్ర జాతులు తక్కువగా ప్రాతినిధ్యం వహించడం వల్ల కావచ్చు [49], DNA శకలాలలో సాపేక్షంగా పెద్ద భాగం గుర్తించబడలేదు.
ఈ పత్రంలో, మేము మస్సెల్స్కు LB భావనను వర్తింపజేస్తూ, హిమోలింఫ్ ccfDNA షాట్ సీక్వెన్సింగ్ సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థల కూర్పుపై అంతర్దృష్టిని అందించగలదని వాదిస్తున్నాము. ముఖ్యంగా, మేము కనుగొన్నది ఏమిటంటే 1) మస్సెల్ హిమోలింఫ్లో సాపేక్షంగా పెద్ద (~1-5 kb) ప్రసరించే DNA శకలాలు అధిక సాంద్రతలలో (మైక్రోగ్రామ్ స్థాయిలలో) ఉంటాయి; 2) ఈ DNA శకలాలు స్వతంత్రమైనవి మరియు స్వతంత్రం కానివి కూడా; 3) ఈ DNA శకలాల యొక్క బాహ్య వనరులలో, మేము బాక్టీరియల్, ఆర్కియల్ మరియు వైరల్ DNAతో పాటు ఇతర బహుకణ జంతువుల DNAను కనుగొన్నాము; 4) హిమోలింఫ్లో ఈ బాహ్య ccfDNA శకలాల చేరడం వేగంగా జరుగుతుంది మరియు ఇది మస్సెల్స్ యొక్క అంతర్గత వడపోత కార్యకలాపానికి దోహదపడుతుంది. ముగింపుగా, ఇప్పటివరకు ప్రధానంగా బయోమెడిసిన్ రంగంలో మాత్రమే వర్తింపజేయబడిన LB భావన, సెంటినెల్ జాతులు మరియు వాటి పర్యావరణం మధ్య పరస్పర చర్యను మరింత బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి ఉపయోగపడే, అన్వేషించబడని గొప్ప జ్ఞాన వనరును కలిగి ఉందని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది.
ప్రైమేట్లతో పాటు, ఎలుకలు, కుక్కలు, పిల్లులు మరియు గుర్రాలతో సహా క్షీరదాలలో ccfDNA ఐసోలేషన్ నివేదించబడింది [50, 51, 52]. అయితే, మాకు తెలిసినంతవరకు, బహిరంగ ప్రసరణ వ్యవస్థ కలిగిన సముద్ర జాతులలో ccfDNA యొక్క గుర్తింపు మరియు సీక్వెన్సింగ్ను నివేదించిన మొదటి అధ్యయనం మాదే. మస్సెల్స్ యొక్క ఈ శరీర నిర్మాణ లక్షణం మరియు వడపోత సామర్థ్యం, ఇతర జాతులతో పోలిస్తే ప్రసరించే DNA శకలాల యొక్క విభిన్న పరిమాణ లక్షణాలను కనీసం పాక్షికంగానైనా వివరించవచ్చు. మానవులలో, రక్తంలో ప్రసరించే చాలా DNA శకలాలు 150 నుండి 200 bp పరిమాణంలో ఉండే చిన్న శకలాలు, గరిష్టంగా 167 bp వద్ద ఉంటాయి [34, 53]. DNA శకలాలలో ఒక చిన్న కానీ ముఖ్యమైన భాగం 300 మరియు 500 bp పరిమాణంలో ఉంటాయి, మరియు సుమారు 5% 900 bp కంటే పొడవుగా ఉంటాయి [54]. ఈ పరిమాణ పంపిణీకి కారణం ఏమిటంటే, ప్లాస్మాలోని ccfDNA యొక్క ప్రధాన మూలం కణ మరణం ఫలితంగా ఏర్పడుతుంది. ఇది ఆరోగ్యవంతులలో ప్రసరణలో ఉన్న హెమటోపోయిటిక్ కణాల కణ మరణం లేదా నెక్రోసిస్ కారణంగా, లేదా క్యాన్సర్ రోగులలో కణితి కణాల అపోప్టోసిస్ (దీనిని సర్క్యులేటింగ్ ట్యూమర్ DNA, ctDNA అని పిలుస్తారు) కారణంగా సంభవిస్తుంది. మస్సెల్స్లో మేము కనుగొన్న హిమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పరిమాణ పంపిణీ 1000 నుండి 5000 bp వరకు ఉంది, ఇది మస్సెల్ ccfDNA భిన్నమైన మూలాన్ని కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది. ఇది ఒక తార్కిక పరికల్పన, ఎందుకంటే మస్సెల్స్కు పాక్షికంగా తెరిచి ఉన్న వాస్కులర్ వ్యవస్థ ఉంటుంది మరియు అవి అధిక సాంద్రతలో మైక్రోబియల్ జెనోమిక్ DNA ఉన్న సముద్రపు నీటి వాతావరణంలో నివసిస్తాయి. వాస్తవానికి, ఎక్సోజెనస్ DNAని ఉపయోగించి మేము చేసిన ప్రయోగశాల ప్రయోగాలు, మస్సెల్స్ సముద్రపు నీటిలో DNA శకలాలను పోగుచేసుకుంటాయని చూపించాయి. కనీసం కొన్ని గంటల తర్వాత, అవి కణాలచే గ్రహించబడిన తర్వాత క్షీణించి, విడుదల చేయబడి, లేదా వివిధ సంస్థలలో నిల్వ చేయబడతాయి. ప్రోకార్యోటిక్ మరియు యూకార్యోటిక్ కణాలు రెండూ చాలా అరుదుగా లభించడం వల్ల, కవాటాలలోని గదులను ఉపయోగించడం వలన సొంత వనరుల నుండి, అలాగే ఇతర వనరుల నుండి వచ్చే ccfDNA పరిమాణం తగ్గుతుంది. ద్వికవాట జీవుల సహజ రోగనిరోధక శక్తి యొక్క ప్రాముఖ్యతను మరియు వాటిలో అధిక సంఖ్యలో ప్రసరించే ఫాగోసైట్లను పరిగణనలోకి తీసుకుని, సూక్ష్మజీవులు మరియు/లేదా కణ శిథిలాలను మింగినప్పుడు ఇతర DNAను పోగుచేసుకునే ప్రసరించే ఫాగోసైట్లలోనే ఇతర ccfDNA కూడా అధికంగా ఉంటుందని మేము మరింతగా ఊహించాము. మొత్తంగా చూస్తే, మా ఫలితాలు ద్వికవాట జీవుల హిమోలింఫ్లోని ccfDNA అణు సమాచారానికి ఒక ప్రత్యేకమైన నిధి అని చూపిస్తున్నాయి మరియు వాటిని ఒక సంరక్షక జాతిగా బలపరుస్తున్నాయి.
మా డేటా ప్రకారం, బ్యాక్టీరియా నుండి ఉత్పన్నమైన హిమోలింఫ్ ccfDNA శకలాల సీక్వెన్సింగ్ మరియు విశ్లేషణ, హోస్ట్ బ్యాక్టీరియా ఫ్లోరా మరియు చుట్టుపక్కల ఉన్న సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలో ఉన్న బ్యాక్టీరియా గురించి కీలక సమాచారాన్ని అందించగలవు. షాట్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతులు, రిఫరెన్స్ లైబ్రరీ బయాస్ కారణంగా, సాంప్రదాయ 16S rRNA గుర్తింపు పద్ధతులను ఉపయోగించి ఉంటే గుర్తించబడని A. atra గిల్ యొక్క సహజీవన బ్యాక్టీరియా సీక్వెన్సులను వెల్లడి చేశాయి. వాస్తవానికి, కెర్గులెన్లోని అదే మస్సెల్ పొరలో M. platensis నుండి సేకరించిన LB డేటాను మేము ఉపయోగించడం ద్వారా, రెండు మస్సెల్ జాతులలోనూ గిల్-సంబంధిత బ్యాక్టీరియా సింబయాంట్ల కూర్పు ఒకే విధంగా ఉందని తేలింది (Fig. S4, సప్లిమెంటరీ ఇన్ఫర్మేషన్). జన్యుపరంగా విభిన్నమైన ఈ రెండు మస్సెల్స్లోని సారూప్యత, కెర్గులెన్లోని చల్లని, గంధక, మరియు అగ్నిపర్వత నిక్షేపాలలో ఉన్న బ్యాక్టీరియా సముదాయాల కూర్పును ప్రతిబింబించవచ్చు [55, 56, 57, 58]. పోర్ట్-ఓ-ఫ్రాన్స్ తీరం వంటి జీవక్రియలకు గురైన తీరప్రాంతాల నుండి మస్సెల్స్ను సేకరించేటప్పుడు సల్ఫర్ను తగ్గించే సూక్ష్మజీవుల అధిక స్థాయిలు బాగా వివరించబడ్డాయి [59]. మరొక అవకాశం ఏమిటంటే, సహజీవనం చేసే మస్సెల్ వృక్షజాలం క్షితిజ సమాంతర ప్రసారం ద్వారా ప్రభావితం కావచ్చు [60, 61]. సముద్ర పర్యావరణం, సముద్రపు అడుగుభాగం ఉపరితలం మరియు మస్సెల్స్లోని సహజీవన బ్యాక్టీరియా కూర్పు మధ్య సంబంధాన్ని నిర్ధారించడానికి మరింత పరిశోధన అవసరం. ఈ అధ్యయనాలు ప్రస్తుతం కొనసాగుతున్నాయి.
సముద్ర తీర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి మస్సెల్ ccfDNAను ఉపయోగించడం వల్ల కలిగే అనేక ప్రయోజనాలలో కొన్ని: హిమోలింఫ్ ccfDNA యొక్క పొడవు మరియు సాంద్రత, దానిని శుద్ధి చేయడంలో సౌలభ్యం, మరియు వేగవంతమైన షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ను అనుమతించే అధిక నాణ్యత. ఈ విధానం ఒక నిర్దిష్ట పర్యావరణ వ్యవస్థలో వైరల్ కమ్యూనిటీలను (వైరోమ్లను) వర్గీకరించడానికి ప్రత్యేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది [62, 63]. బ్యాక్టీరియా, ఆర్కియా మరియు యూకారియోట్ల వలె కాకుండా, వైరల్ జీనోమ్లు 16S సీక్వెన్సుల వంటి ఫైలోజెనెటికల్గా సంరక్షించబడిన జన్యువులను కలిగి ఉండవు. మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నది ఏమిటంటే, మస్సెల్స్ వంటి సూచిక జాతుల నుండి తీసుకున్న లిక్విడ్ బయాప్సీలను, సాధారణంగా తీరప్రాంత సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థలలో నివసించే అతిధేయులకు సోకే ccfDNA వైరస్ శకలాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు. ఇందులో ప్రోటోజోవా, ఆర్థ్రోపాడ్లు, కీటకాలు, మొక్కలకు సోకే వైరస్లు మరియు బ్యాక్టీరియల్ వైరస్లు (ఉదాహరణకు, బ్యాక్టీరియోఫేజ్లు) ఉన్నాయి. కెర్గులెన్లోని అదే మస్సెల్ పొరలో సేకరించిన నీలి మస్సెల్స్ (M. platensis) యొక్క హిమోలింఫ్ ccfDNA వైరోమ్ను మేము పరిశీలించినప్పుడు కూడా ఇలాంటి పంపిణీనే కనుగొన్నాము (పట్టిక S2, అనుబంధ సమాచారం). ccfDNA యొక్క షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ అనేది నిజానికి మానవులు లేదా ఇతర జాతుల వైరోమ్ అధ్యయనంలో ఊపందుకుంటున్న ఒక కొత్త విధానం [21, 37, 64]. ఈ విధానం డబుల్-స్ట్రాండెడ్ DNA వైరస్లను అధ్యయనం చేయడానికి ప్రత్యేకంగా ఉపయోగపడుతుంది, ఎందుకంటే బాల్టిమోర్లో అత్యంత వైవిధ్యమైన మరియు విస్తృతమైన వైరస్ల వర్గానికి ప్రాతినిధ్యం వహించే అన్ని డబుల్-స్ట్రాండెడ్ DNA వైరస్లలో ఏ ఒక్క జన్యువు కూడా స్థిరంగా ఉండదు [65]. ఈ వైరస్లలో చాలా వరకు వర్గీకరించబడనప్పటికీ మరియు వైరల్ ప్రపంచంలోని పూర్తిగా తెలియని భాగం నుండి వైరస్లను కలిగి ఉండవచ్చు [66], A. atra మరియు M. platensis అనే మస్సెల్స్ యొక్క వైరోమ్లు మరియు హోస్ట్ శ్రేణులు ఈ రెండు జాతుల మధ్య ఒకే విధంగా ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి S3, అదనపు సమాచారం చూడండి). ఈ సారూప్యత ఆశ్చర్యకరమైనది కాదు, ఎందుకంటే ఇది పర్యావరణంలో ఉన్న DNAను గ్రహించడంలో ఎంపిక లేకపోవడాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. RNA వైరమ్ను వర్గీకరించడానికి, శుద్ధి చేసిన RNAను ఉపయోగించి భవిష్యత్ అధ్యయనాలు ప్రస్తుతం అవసరం.
మా అధ్యయనంలో, మేము కోవార్స్కీ మరియు సహోద్యోగుల [37] పని నుండి స్వీకరించబడిన చాలా కఠినమైన పైప్లైన్ను ఉపయోగించాము, వారు స్థానిక ccfDNA యొక్క అసెంబ్లీకి ముందు మరియు తరువాత పూల్డ్ రీడ్లు మరియు కాంటిగ్ల యొక్క రెండు-దశల తొలగింపును ఉపయోగించారు, దీని ఫలితంగా మ్యాప్ చేయని రీడ్ల నిష్పత్తి ఎక్కువగా ఉంది. అందువల్ల, ఈ మ్యాప్ చేయని రీడ్లలో కొన్ని ఇప్పటికీ వాటి స్వంత మూలాన్ని కలిగి ఉండవచ్చనే విషయాన్ని మేము తోసిపుచ్చలేము, ప్రధానంగా ఈ మస్సెల్ జాతికి మా వద్ద రిఫరెన్స్ జీనోమ్ లేదు. మేము ఈ పైప్లైన్ను ఉపయోగించడానికి మరో కారణం ఏమిటంటే, స్వీయ మరియు అస్వీయ రీడ్ల మధ్య కైమెరాల గురించి మరియు ఇల్యూమినా MiSeq PE75 ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన రీడ్ పొడవుల గురించి మాకు ఆందోళనగా ఉంది. మ్యాప్ చేయని రీడింగ్లు అధికంగా ఉండటానికి మరొక కారణం ఏమిటంటే, చాలా సముద్ర సూక్ష్మజీవులు, ముఖ్యంగా కెర్గులెన్ వంటి మారుమూల ప్రాంతాలలో, ఇంకా వ్యాఖ్యానించబడలేదు. మేము మానవ ccfDNA మాదిరిగానే ccfDNA ఫ్రాగ్మెంట్ పొడవులను ఊహించి ఇల్యూమినా MiSeq PE75ని ఉపయోగించాము. మానవులు మరియు/లేదా క్షీరదాల కంటే హిమోలింఫ్ ccfDNA పొడవైన రీడ్లను కలిగి ఉందని మా ఫలితాలు చూపిస్తున్నందున, భవిష్యత్ అధ్యయనాల కోసం, పొడవైన ccfDNA శకలాలకు మరింత అనువైన సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్ఫారమ్ను ఉపయోగించమని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈ పద్ధతి లోతైన విశ్లేషణ కోసం మరిన్ని సూచనలను గుర్తించడాన్ని చాలా సులభతరం చేస్తుంది. ప్రస్తుతం అందుబాటులో లేని పూర్తి A. atra న్యూక్లియర్ జీనోమ్ సీక్వెన్స్ను పొందడం కూడా, స్వీయ మరియు అస్వీయ మూలాల నుండి ccfDNAను వేరు చేయడాన్ని బాగా సులభతరం చేస్తుంది. మస్సెల్స్కు లిక్విడ్ బయాప్సీ భావనను వర్తింపజేసే అవకాశంపై మా పరిశోధన దృష్టి సారించినందున, భవిష్యత్ పరిశోధనలో ఈ భావనను ఉపయోగించినప్పుడు, మస్సెల్స్ యొక్క సూక్ష్మజీవుల వైవిధ్యాన్ని అధ్యయనం చేయడానికి ఈ పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని పెంచడానికి కొత్త సాధనాలు మరియు పైప్లైన్లు అభివృద్ధి చేయబడతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము. సముద్ర పర్యావరణ వ్యవస్థ.
ఒక నాన్-ఇన్వాసివ్ క్లినికల్ బయోమార్కర్గా, మానవ ప్లాస్మాలో పెరిగిన ccfDNA స్థాయిలు వివిధ వ్యాధులు, కణజాల నష్టం మరియు ఒత్తిడి పరిస్థితులతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి [67,68,69]. కణజాల నష్టం తర్వాత దాని స్వంత మూలానికి చెందిన DNA శకలాలు విడుదల కావడంతో ఈ పెరుగుదల ముడిపడి ఉంటుంది. మేము ఈ సమస్యను తీవ్రమైన ఉష్ణ ఒత్తిడిని ఉపయోగించి పరిష్కరించాము, దీనిలో మస్సెల్స్ను క్లుప్తంగా 30 °C ఉష్ణోగ్రతకు గురిచేశాము. మేము ఈ విశ్లేషణను మూడు వేర్వేరు రకాల మస్సెల్స్పై మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో నిర్వహించాము. అయితే, తీవ్రమైన ఉష్ణ ఒత్తిడి తర్వాత ccfDNA స్థాయిలలో మేము ఎటువంటి మార్పును కనుగొనలేదు (మూర్తి S5, అదనపు సమాచారం చూడండి). ఈ ఆవిష్కరణ, కనీసం పాక్షికంగానైనా, మస్సెల్స్కు సెమీ-ఓపెన్ సర్క్యులేటరీ సిస్టమ్ ఉండటం మరియు వాటి అధిక ఫిల్టరింగ్ యాక్టివిటీ కారణంగా పెద్ద మొత్తంలో విదేశీ DNAను పోగుచేసుకోవడం అనే వాస్తవాన్ని వివరించవచ్చు. మరోవైపు, అనేక అకశేరుకాల వలె, మస్సెల్స్ ఒత్తిడి-ప్రేరిత కణజాల నష్టానికి మరింత నిరోధకతను కలిగి ఉండవచ్చు, తద్వారా వాటి హిమోలింఫ్లో ccfDNA విడుదలను పరిమితం చేస్తాయి [70, 71].
ఇప్పటి వరకు, జల పర్యావరణ వ్యవస్థలలో జీవవైవిధ్యం యొక్క DNA విశ్లేషణ ప్రధానంగా పర్యావరణ DNA (eDNA) మెటాబార్కోడింగ్పై దృష్టి సారించింది. అయితే, ప్రైమర్లను ఉపయోగించినప్పుడు ఈ పద్ధతి సాధారణంగా జీవవైవిధ్య విశ్లేషణలో పరిమితంగా ఉంటుంది. షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ వాడకం PCR యొక్క పరిమితులను మరియు ప్రైమర్ సెట్ల పక్షపాత ఎంపికను అధిగమిస్తుంది. అందువల్ల, ఒక రకంగా, మా పద్ధతి ఇటీవల ఉపయోగించిన హై-త్రూపుట్ eDNA షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతికి దగ్గరగా ఉంది, ఇది విచ్ఛిన్నమైన DNAను నేరుగా సీక్వెన్స్ చేయగలదు మరియు దాదాపు అన్ని జీవులను విశ్లేషించగలదు [72, 73]. అయితే, ప్రామాణిక eDNA పద్ధతుల నుండి LBని వేరుచేసే అనేక ప్రాథమిక సమస్యలు ఉన్నాయి. వాస్తవానికి, eDNA మరియు LB మధ్య ప్రధాన వ్యత్యాసం సహజ ఫిల్టర్ హోస్ట్ల వాడకం. eDNAను అధ్యయనం చేయడానికి స్పాంజ్లు మరియు బైవాల్వ్లు (డ్రెస్సీనా spp.) వంటి సముద్ర జాతులను సహజ ఫిల్టర్గా ఉపయోగించినట్లు నివేదించబడింది [74, 75]. అయితే, డ్రెయిసెనా అధ్యయనంలో కణజాల బయాప్సీలను ఉపయోగించారు, వాటి నుండి DNAను సంగ్రహించారు. LB నుండి ccfDNA విశ్లేషణకు కణజాల బయాప్సీ, ప్రత్యేకమైన మరియు కొన్నిసార్లు ఖరీదైన పరికరాలు మరియు eDNA లేదా కణజాల బయాప్సీతో సంబంధం ఉన్న లాజిస్టిక్స్ అవసరం లేదు. వాస్తవానికి, మారుమూల ప్రాంతాలలో పరిశోధనకు ఒక పెద్ద సవాలు అయిన కోల్డ్ చైన్ను నిర్వహించకుండానే, LB నుండి ccfDNAను FTA మద్దతుతో నిల్వ చేసి విశ్లేషించవచ్చని మేము ఇటీవల నివేదించాము [76]. లిక్విడ్ బయాప్సీల నుండి ccfDNAను సంగ్రహించడం కూడా సులభం మరియు షాట్గన్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు PCR విశ్లేషణ కోసం అధిక నాణ్యత గల DNAను అందిస్తుంది. eDNA విశ్లేషణతో సంబంధం ఉన్న కొన్ని సాంకేతిక పరిమితులను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే ఇది ఒక గొప్ప ప్రయోజనం [77]. నమూనా సేకరణ పద్ధతి యొక్క సరళత మరియు తక్కువ ఖర్చు దీర్ఘకాలిక పర్యవేక్షణ కార్యక్రమాలకు కూడా ప్రత్యేకంగా అనుకూలంగా ఉంటుంది. వాటి అధిక వడపోత సామర్థ్యంతో పాటు, ద్వికవాట జీవుల యొక్క మరొక ప్రసిద్ధ లక్షణం వాటి శ్లేష్మంలోని రసాయన మ్యూకోపాలిసాకరైడ్ కూర్పు, ఇది వైరస్ల శోషణను ప్రోత్సహిస్తుంది [78, 79]. ఇది ఒక నిర్దిష్ట జల పర్యావరణ వ్యవస్థలో జీవవైవిధ్యాన్ని మరియు వాతావరణ మార్పుల ప్రభావాన్ని వర్గీకరించడానికి ద్వికవాట జీవులను ఒక ఆదర్శవంతమైన సహజ వడపోతగా చేస్తుంది. eDNAతో పోలిస్తే హోస్ట్-ఉత్పన్న DNA శకలాలు ఉండటం ఈ పద్ధతికి ఒక పరిమితిగా కనిపించినప్పటికీ, ఆరోగ్య అధ్యయనాల కోసం అందుబాటులో ఉన్న విస్తారమైన సమాచారం దృష్ట్యా, eDNAతో పోలిస్తే అటువంటి స్థానిక ccfDNAను కలిగి ఉండటంతో ముడిపడి ఉన్న ఖర్చు ఏకకాలంలో అర్థమయ్యేదే. హోస్ట్ యొక్క జన్యువులో విలీనం చేయబడిన వైరల్ సీక్వెన్సులు ఉండటం కూడా ఇందులో భాగంగా ఉంటుంది. ద్వికవాట జీవులలో అడ్డంగా సంక్రమించే లుకేమిక్ రెట్రోవైరస్లు ఉండటం వలన [80, 81], మస్సెల్స్కు ఇది ప్రత్యేకంగా ముఖ్యమైనది. eDNAతో పోలిస్తే LBకి ఉన్న మరో ప్రయోజనం ఏమిటంటే, ఇది హిమోలింఫ్లో ప్రసరించే రక్త కణాల ఫాగోసైటిక్ చర్యను ఉపయోగించుకుంటుంది, ఇది సూక్ష్మజీవులను (మరియు వాటి జన్యువులను) కబళిస్తుంది. ఫాగోసైటోసిస్ అనేది ద్వికవాట జీవులలో రక్త కణాల ప్రధాన విధి [82]. చివరగా, ఈ పద్ధతి మస్సెల్స్ యొక్క అధిక వడపోత సామర్థ్యాన్ని (సగటున గంటకు 1.5 లీటర్ల సముద్రపు నీరు) మరియు రెండు రోజుల ప్రసరణను సద్వినియోగం చేసుకుంటుంది, ఇవి సముద్రపు నీటి యొక్క వివిధ పొరల మిశ్రమాన్ని పెంచుతాయి, తద్వారా భిన్నజాతి eDNAను సంగ్రహించడానికి వీలు కల్పిస్తాయి. [83, 84]. అందువల్ల, మస్సెల్స్ యొక్క పోషక, ఆర్థిక మరియు పర్యావరణ ప్రభావాలను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, మస్సెల్ ccfDNA విశ్లేషణ ఒక ఆసక్తికరమైన మార్గం. మానవుల నుండి సేకరించిన LB విశ్లేషణ మాదిరిగానే, ఈ పద్ధతి కూడా బాహ్య పదార్థాలకు ప్రతిస్పందనగా హోస్ట్ DNAలో జన్యు మరియు ఎపిజెనెటిక్ మార్పులను కొలిచే అవకాశాన్ని తెరుస్తుంది. ఉదాహరణకు, నానోపోర్ సీక్వెన్సింగ్ను ఉపయోగించి స్థానిక ccfDNAలో జీనోమ్-వ్యాప్త మిథైలేషన్ విశ్లేషణను నిర్వహించడానికి మూడవ తరం సీక్వెన్సింగ్ సాంకేతికతలను ఊహించవచ్చు. రసాయన పరివర్తనల అవసరం లేకుండా ఒకే సీక్వెన్సింగ్ రన్ నుండి జీనోమ్-వ్యాప్త DNA మిథైలేషన్ విశ్లేషణను అనుమతించే లాంగ్-రీడ్ సీక్వెన్సింగ్ ప్లాట్ఫారమ్లతో మస్సెల్ ccfDNA శకలాల పొడవు ఆదర్శంగా అనుకూలంగా ఉండటం ఈ ప్రక్రియను సులభతరం చేస్తుంది.85,86] ఇది ఒక ఆసక్తికరమైన అవకాశం, ఎందుకంటే DNA మిథైలేషన్ నమూనాలు పర్యావరణ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనను ప్రతిబింబిస్తాయని మరియు అనేక తరాల పాటు కొనసాగుతాయని చూపబడింది. అందువల్ల, వాతావరణ మార్పు లేదా కాలుష్య కారకాలకు గురైన తర్వాత ప్రతిస్పందనను నియంత్రించే అంతర్లీన యంత్రాంగాలపై ఇది విలువైన అంతర్దృష్టిని అందించగలదు [87]. అయితే, LB వాడకానికి పరిమితులు లేకపోలేదు. చెప్పనవసరం లేదు, దీనికి పర్యావరణ వ్యవస్థలో సూచిక జాతుల ఉనికి అవసరం. పైన పేర్కొన్నట్లుగా, ఇచ్చిన పర్యావరణ వ్యవస్థ యొక్క జీవవైవిధ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి LBని ఉపయోగించడానికి, మూలం నుండి DNA శకలాల ఉనికిని పరిగణనలోకి తీసుకునే కఠినమైన బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ పైప్లైన్ కూడా అవసరం. సముద్ర జాతుల కోసం రిఫరెన్స్ జీనోమ్ల లభ్యత మరొక ప్రధాన సమస్య. మెరైన్ క్షీరద జీనోమ్ల ప్రాజెక్ట్ మరియు ఇటీవల స్థాపించబడిన Fish10k ప్రాజెక్ట్ [88] వంటి కార్యక్రమాలు భవిష్యత్తులో ఇటువంటి విశ్లేషణను సులభతరం చేస్తాయని ఆశిస్తున్నారు. సముద్ర ఫిల్టర్-ఫీడింగ్ జీవులకు LB భావన యొక్క అనువర్తనం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీలోని తాజా పురోగతులకు కూడా అనుకూలంగా ఉంటుంది, ఇది పర్యావరణ ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందనగా సముద్ర ఆవాసాల ఆరోగ్యం గురించి ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందించడానికి మల్టీ-ఓమ్ బయోమార్కర్ల అభివృద్ధికి బాగా సరిపోతుంది.
జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ డేటా NCBI సీక్వెన్స్ రీడ్ ఆర్కైవ్ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 లో బయోప్రాజెక్ట్స్ SRR8924808 క్రింద నిక్షిప్తం చేయబడింది.
బ్రియర్లీ AS, కింగ్స్ఫోర్డ్ MJ సముద్ర జీవరాశి మరియు పర్యావరణ వ్యవస్థలపై వాతావరణ మార్పు ప్రభావం. కోల్ బయాలజీ. 2009; 19: P602–P614.
గిస్సీ ఇ, మానేయా ఇ, మజారిస్ ఎడి, ఫ్రాషెట్టి ఎస్, అల్ంపానిడౌ వి, బెవిలాక్వా ఎస్, మరియు ఇతరులు. సముద్ర పర్యావరణంపై వాతావరణ మార్పు మరియు ఇతర స్థానిక ఒత్తిడి కారకాల సంయుక్త ప్రభావాలను పరిగణించండి. జనరల్ సైంటిఫిక్ ఎన్విరాన్మెంట్. 2021;755:142564.
కారెల్లా F, Antuofermo E, ఫరీనా S, సలాతి F, మందాస్ D, ప్రాడో P, మరియు ఇతరులు. ) మార్చి మొదటి సైన్స్. 2020;7:48.
సెరోంట్ ఎల్, నికాస్ట్రో సిఆర్, జార్డి జిఐ, గోబెర్విల్లే ఇ. పునరావృత ఉష్ణ ఒత్తిడి పరిస్థితులలో తగ్గిన ఉష్ణ సహనం నీలి మస్సెల్స్ యొక్క అధిక వేసవి మరణాలను వివరిస్తుంది. సైంటిఫిక్ రిపోర్ట్ 2019; 9:17498.
ఫే SB, సిపియెల్స్కీ AM, నస్లే S, సెర్వాంటెస్-యోషిడా K, హ్వాన్ JL, హ్యూబర్ ER, మరియు ఇతరులు. జంతు మరణాల సంభవం, కారణాలు మరియు పరిధిలో ఇటీవలి మార్పులు. ప్రొసీడింగ్స్ ఆఫ్ ది నేషనల్ అకాడమీ ఆఫ్ సైన్సెస్ ఆఫ్ ది యునైటెడ్ స్టేట్స్ ఆఫ్ అమెరికా. 2015;112:1083-8.
స్కార్పా ఎఫ్, సన్నా డి, అజ్జేనా ఐ, ముగెట్టి డి, సెరుటి ఎఫ్, హోస్సేని ఎస్, మరియు ఇతరులు. బహుళ జాతులేతర-నిర్దిష్ట వ్యాధికారకాలు పిన్నా నోబిలిస్ యొక్క సామూహిక మరణాలకు కారణం కావచ్చు. జీవితం. 2020;10:238.
బ్రాడ్లీ M, కౌట్స్ SJ, జెంకిన్స్ E, ఓ'హారా TM. ఆర్కిటిక్ జూనోటిక్ వ్యాధులపై వాతావరణ మార్పు యొక్క సంభావ్య ప్రభావం. ఇంటర్నేషనల్ జర్నల్ ఆఫ్ సర్కంపొలార్ హెల్త్. 2005; 64:468–77.
బేయర్ జె., గ్రీన్ ఎన్ డబ్ల్యూ, బ్రూక్స్ ఎస్., అల్లన్ ఐ జె, రూస్ ఎ., గోమెజ్ టి. మరియు ఇతరులు. తీరప్రాంత కాలుష్య పర్యవేక్షణలో సంకేత జీవులుగా నీలి మస్సెల్స్ (మైటిలస్ ఎడులిస్ ఎస్పిపి.): ఒక సమీక్ష. మార్ ఎన్విరాన్ రెస్ 2017; 130:338-65.
సిరవేగ్నా జి, మార్సోని ఎస్, సీనా ఎస్, బార్డెల్లి ఎ. క్యాన్సర్ చికిత్సలో లిక్విడ్ బయాప్సీ ఏకీకరణ. నాట్ రివ్ క్లీన్ ఆంకాలజీ. 2017; 14:531–48.
వాన్ JCM, మాస్సీ C, గార్సియా-కోర్బాచో J, మౌలియర్ F, బ్రెంటన్ JD, కాల్డాస్ C, మరియు ఇతరులు. లిక్విడ్ బయాప్సీ పరిపక్వత: కణితి DNA ప్రసరణకు అనుమతిస్తుంది. నాట్ రెవ్ క్యాన్సర్. 2017;17:223–38.
మాండెల్ పి., మెటాయిస్ పి. మానవ ప్లాస్మాలో న్యూక్లిక్ ఆమ్లాలు. సొసైటీ ఫర్ బయాలజీ అనుబంధ సంస్థల సమావేశ నిమిషాలు. 1948; 142:241-3.
బ్రోంఖోర్స్ట్ AJ, ఉంగెరర్ W, హోల్డెన్రీడర్ S. క్యాన్సర్ చికిత్సకు మాలిక్యులర్ మార్కర్గా సెల్-ఫ్రీ DNA యొక్క కొత్త పాత్ర. బయోమోలార్ విశ్లేషణ యొక్క పరిమాణీకరణ. 2019;17:100087.
ఇగ్నాటియాడిస్ M., స్లెడ్జ్ GW, జెఫ్రీ SS లిక్విడ్ బయాప్సీ క్లినిక్లోకి ప్రవేశిస్తుంది – అమలు సమస్యలు మరియు భవిష్యత్ సవాళ్లు. నాట్ రివ్ క్లిన్ ఆంకాలజీ. 2021; 18:297–312.
లో YM, కార్బెట్టా N., చాంబర్లైన్ PF, రాయ్ W., సార్జెంట్ IL, రెడ్మాన్ CW మరియు ఇతరులు. తల్లి ప్లాస్మా మరియు సీరమ్లో పిండం DNA ఉంటుంది. లాన్సెట్. 1997; 350:485-7.
ముఫర్రే MN, వాంగ్ RJ, షా GM, స్టీవెన్సన్ DK, క్వేక్ SR గర్భధారణ సమయంలో మహిళల రక్తంలో ప్రసరించే ఎక్స్ట్రాసెల్యులార్ RNAని ఉపయోగించి గర్భధారణ గమనం మరియు దాని సమస్యలపై అధ్యయనం. డోపెడియాట్రిక్స్. 2020;8:605219.
ఒల్లెరిచ్ M, షెర్వుడ్ K, కియోన్ P, షుట్జ్ E, బెక్ J, స్టెగ్బాయర్ J, మరియు ఇతరులు. లిక్విడ్ బయాప్సీ: మూత్రపిండ మార్పిడిలో అలోజెనిక్ గాయాలను గుర్తించడానికి దాత కణ-రహిత DNA ఉపయోగించబడుతుంది. నాట్ రెవ్ నెఫ్రాల్. 2021; 17:591–603.
జువాన్ FC, లో YM ప్రినేటల్ డయాగ్నొస్టిక్స్లో ఆవిష్కరణలు: మాతృ ప్లాస్మా జన్యు శ్రేణి క్రమ విశ్లేషణ. అన్నా MD. 2016;67:419-32.
గు W, డెంగ్ X, లీ M, సుకు YD, అరెవలో S, స్ట్రైక్ D, మరియు ఇతరులు. సోకిన శరీర ద్రవాల నెక్స్ట్-జనరేషన్ మెటాజెనోమిక్ సీక్వెన్సింగ్తో వేగవంతమైన వ్యాధికారక గుర్తింపు. నాట్ మెడిసిన్. 2021;27:115-24.
పోస్ట్ చేసిన సమయం: ఆగస్టు-14-2022
