Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Nestebiopsia (LB) on nopeasti suosiota kasvattava konsepti biolääketieteen alalla. Konsepti perustuu pääasiassa kiertävän solunulkoisen DNA:n (ccfDNA) fragmenttien havaitsemiseen, jotka vapautuvat pääasiassa pieninä fragmentteina solukuoleman jälkeen eri kudoksissa. Pieni osa näistä fragmenteista on peräisin vieraista kudoksista tai organismeista. Nykyisessä työssämme olemme soveltaneet tätä konseptia simpukoihin, jotka ovat vartijalajeja, jotka tunnetaan korkeasta meriveden suodatuskyvystään. Käytämme simpukoiden kykyä toimia luonnollisina suodattimina kerätäksemme ympäristön DNA-fragmentteja useista lähteistä ja tarjotaksemme tietoa rannikkoekosysteemien biologisesta monimuotoisuudesta. Tuloksemme osoittavat, että simpukoiden hemolymfa sisältää DNA-fragmentteja, joiden koko vaihtelee suuresti, 1–5 kb. Haulikkosekvensointi osoitti, että suuri osa DNA-fragmenteista on peräisin vieraista mikrobiperäisistä. Niiden joukosta löysimme DNA-fragmentteja bakteereista, arkeoneista ja viruksista, mukaan lukien virukset, joiden tiedetään tartuttavan useita rannikkomeriekosysteemeissä yleisesti esiintyviä isäntiä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että simpukoihin sovellettaessa LB-käsitettä on rikas mutta vielä tutkimaton tietolähde meren rannikkoekosysteemien mikrobien monimuotoisuudesta.
Ilmastonmuutoksen vaikutus meriekosysteemien biodiversiteettiin on nopeasti kasvava tutkimusalue. Ilmaston lämpeneminen ei ainoastaan ​​aiheuta merkittäviä fysiologisia stressitekijöitä, vaan myös venyttää merieliöiden lämpöstabiilisuuden evolutiivisia rajoja, mikä vaikuttaa useiden lajien elinympäristöön ja saa ne etsimään suotuisampia olosuhteita [1, 2]. Metazoanien biodiversiteettiin vaikuttamisen lisäksi merieliöiden ja mikrobien välinen herkkä tasapaino häiritsee isännän ja mikrobien välistä vuorovaikutusta. Tämä mikrobien dysbakterioosi on vakava uhka meriekosysteemeille, koska se tekee merieliöistä alttiimpia tartuntatauteja aiheuttaville taudinaiheuttajille [3, 4]. Uskotaan, että suolahapoilla on tärkeä rooli massakuolemissa, mikä on vakava ongelma maailmanlaajuisten meriekosysteemien hoidossa [5, 6]. Tämä on tärkeä kysymys, kun otetaan huomioon monien merilajien taloudelliset, ekologiset ja ravitsemukselliset vaikutukset. Tämä pätee erityisesti napa-alueilla eläviin simpukoihin, joissa merikalastuksen vaikutukset ovat välittömämpiä ja vakavampia [6, 7]. Itse asiassa simpukoita, kuten Mytilus spp., käytetään laajalti merikalastuksen vaikutusten seurantaan meriekosysteemeihin. Ei ole yllättävää, että suhteellisen suuri määrä biomarkkereita on kehitetty niiden terveydentilan seuraamiseksi, usein käyttämällä kaksiportaista lähestymistapaa, johon kuuluvat funktionaaliset biomarkkerit, jotka perustuvat entsymaattiseen aktiivisuuteen tai solutoimintoihin, kuten solujen elinkykyyn ja fagosyyttiseen aktiivisuuteen [8]. Näihin menetelmiin kuuluu myös tiettyjen paineindikaattoreiden pitoisuuden mittaus, jotka kertyvät pehmytkudoksiin suurten merivesimäärien imeytymisen jälkeen. Simpukoiden korkea suodatuskapasiteetti ja puoliavoin verenkiertojärjestelmä tarjoavat kuitenkin mahdollisuuden kehittää uusia hemolymfabiomarkkereita käyttämällä nestemäisen biopsian (LB) käsitettä, joka on yksinkertainen ja minimaalisesti invasiivinen lähestymistapa potilaan hoitoon. Simpukoiden verinäytteistä löytyy useita erityyppisiä verenkierrossa olevia molekyylejä [9, 10]. Vaikka ihmisen LB:stä löytyy useita erityyppisiä verenkierrossa olevia molekyylejä, tämä käsite perustuu ensisijaisesti verenkierrossa olevien solunulkoisten DNA-fragmenttien (ccfDNA) DNA-sekvensointianalyysiin plasmassa. Itse asiassa verenkierrossa olevan DNA:n esiintyminen ihmisen plasmassa on tunnettu 1900-luvun puolivälistä lähtien [11], mutta vasta viime vuosina suurtehoisten sekvensointimenetelmien tulo on johtanut ccfDNA:han perustuvaan kliiniseen diagnoosiin. Näiden verenkierrossa olevien DNA-fragmenttien läsnäolo johtuu osittain genomisen DNA:n (ydin- ja mitokondrio-) passiivisesta vapautumisesta solukuoleman jälkeen. Terveillä yksilöillä ccfDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta se voi nousta 5–10-kertaiseksi potilailla, jotka kärsivät erilaisista sairauksista tai altistuvat stressille, mikä johtaa kudosvaurioihin. Terveillä yksilöillä ccfDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta se voi nousta 5–10-kertaiseksi potilailla, jotka kärsivät erilaisista sairauksista tai altistuvat stressille, mikä johtaa kudosvaurioihin. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разнрачы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Terveillä ihmisillä cccDNA:n pitoisuus on normaalisti alhainen (<10 ng/ml), mutta se voi nousta 5–10-kertaiseksi potilailla, joilla on erilaisia ​​sairauksia tai jotka ovat stressaantuneet ja kudosvaurioita aiheuttavan stressin alaisena.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍㼌从而寄致瀍在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 戏 承 壎 或中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 праценто различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-pitoisuudet ovat yleensä alhaiset (<10 ng/ml) terveillä henkilöillä, mutta ne voivat nousta 5–10-kertaisiksi potilailla, joilla on erilaisia ​​patologioita tai stressiä, mikä johtaa kudosvaurioihin.ccfDNA-fragmenttien koko vaihtelee suuresti, mutta yleensä se on 150–200 bp. [12]. Itse johdetun ccfDNA:n, eli normaaleista tai transformoituneista isäntäsoluista peräisin olevan ccfDNA:n, analysointia voidaan käyttää tuma- ja/tai mitokondrioiden genomissa esiintyvien geneettisten ja epigeneettisten muutosten havaitsemiseen, mikä auttaa lääkäreitä valitsemaan spesifisiä molekyylikohdennettuja hoitoja [13]. CcfDNA:ta voidaan kuitenkin saada vieraista lähteistä, kuten sikiösoluista raskauden aikana tai siirretyistä elimistä peräisin olevasta ccfDNA:sta [14,15,16,17]. ccfDNA on myös tärkeä tietolähde tartuntataudinaiheuttajan (vieraan) nukleiinihappojen havaitsemiseksi, mikä mahdollistaa veriviljelyissä tunnistamattomien laajalle levinneiden infektioiden ei-invasiivisen havaitsemisen, välttäen tartunnan saaneen kudoksen invasiivisen biopsian [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat todellakin osoittaneet, että ihmisveri sisältää runsaasti tietoa, jota voidaan käyttää virus- ja bakteeripatogeenien tunnistamiseen, ja että noin 1 % ihmisen plasmasta löydetystä ccfDNA:sta on vierasta alkuperää [19]. Nämä tutkimukset osoittavat, että organismin verenkierrossa olevan mikrobiomin biologista monimuotoisuutta voidaan arvioida ccfDNA-analyysin avulla. Tätä konseptia käytettiin kuitenkin viime aikoihin asti yksinomaan ihmisillä ja vähäisemmässä määrin muilla selkärankaisilla [20, 21].
Tässä artikkelissa käytämme LB-potentiaalia analysoidaksemme Aulacomya atran ccfDNA:ta. Aulacomya atra on eteläinen laji, jota esiintyy yleisesti subantarktisilla Kerguelenin saarilla, saariryhmällä laajalla tasangolla, joka muodostui 35 miljoonaa vuotta sitten tulivuorenpurkauksen jälkeen. Käyttämällä in vitro -kokeellista järjestelmää havaitsimme, että simpukat ottavat nopeasti merivedessä olevat DNA-fragmentit sisäänsä hemolymfiosastoon. Haulikon sekvensointi on osoittanut, että simpukan hemolymfin ccfDNA sisältää omaa ja ei-omaista alkuperää olevia DNA-fragmentteja, mukaan lukien symbioottisia bakteereja ja DNA-fragmentteja kylmille vulkaanisille meren rannikkoekosysteemeille tyypillisistä bioomeista. Hemolymfin ccfDNA sisältää myös virussekvenssejä, jotka ovat peräisin viruksista, joilla on eri isäntäalueita. Löysimme myös DNA-fragmentteja monisoluisista eläimistä, kuten luukaloista, merivuokoista, levistä ja hyönteisistä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että LB-konseptia voidaan soveltaa onnistuneesti meriselkärangattomiin rikkaan genomikokoelman luomiseksi meriekosysteemeissä.
Aikuisia (55–70 mm pitkiä) Mytilus platensis (M. platensis) ja Aulacomya atra (A. atra) -simpukoita kerättiin Port-au-Francen (049°21.235 S, 070°13.490 E) Kerguelenin saarten vuorovesialueen kalliorannoilta joulukuussa 2018. Muut aikuiset sinisimpukat (Mytilus spp.) hankittiin kaupalliselta toimittajalta (PEI Mussel King Inc., Prinssi Edwardin saari, Kanada) ja sijoitettiin lämpötilasäädeltyyn (4 °C) ilmastettuun säiliöön, joka sisälsi 10–20 litraa 32 ‰ keinotekoista suolavettä (keinotekoinen merisuola, Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Jokaista koetta varten mitattiin yksittäisten simpukoiden pituus ja paino.
Tämän ohjelman ilmainen avoimen saatavuuden protokolla on saatavilla verkossa (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Lyhyesti sanottuna LB-hemolymfa kerättiin abduktorilihaksista kuvatulla tavalla [22]. Hemolymfa kirkastettiin sentrifugoimalla 1200 × g:ssä 3 minuutin ajan, ja supernatantti pakastettiin (-20 °C) käyttöön asti. cfDNA:n eristämistä ja puhdistamista varten näytteet (1,5–2,0 ml) sulatettiin ja käsiteltiin NucleoSnap cfDNA -kitillä (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ccfDNA:ta säilytettiin -80 °C:ssa jatkoanalyyseihin asti. Joissakin kokeissa ccfDNA eristettiin ja puhdistettiin käyttämällä QIAamp DNA Investigator Kit -kittiä (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Puhdistettu DNA kvantifioitiin käyttämällä standardia PicoGreen-määritystä. Eristetyn ccfDNA:n fragmenttijakauma analysoitiin kapillaarielektroforeesilla käyttäen Agilent 2100 -bioanalysaattoria (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ja High Sensitivity DNA Kit -pakkausta. Määritys suoritettiin käyttämällä 1 µl ccfDNA-näytettä valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Hemolymfasolujen ccfDNA-fragmenttien sekvensointia varten Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) valmisti haulikkokirjastoja käyttäen Illumina MiSeq PE75 -pakkauksen Illumina DNA Mix -pakkausta. Käytettiin standardia adapteria (BioO). Raakadatatiedostot ovat saatavilla NCBI Sequence Read Archive -arkistosta (SRR8924808 ja SRR8924809). Peruslukemisen laatu arvioitiin FastQC:llä [23]. Trimmomaticia [24] on käytetty adapterien leikkaamiseen ja heikkolaatuisiin lukuihin. Parillisten päiden omaavat haulikkolukemat yhdistettiin FLASH-muodossa pidemmiksi yksittäisiksi lukuiksi, joiden päällekkäisyys oli vähintään 20 bp, jotta vältetään yhteensopimattomuudet [25]. Yhdistetyt lukemat annotoitiin BLASTN-ohjelmalla käyttäen simpukoiden NCBI-taksonomiatietokantaa (e-arvo < 1e−3 ja 90 %:n homologia), ja matalan kompleksisuuden omaavien sekvenssien peittäminen suoritettiin DUST-ohjelmalla [26]. Yhdistetyt lukemat annotoitiin BLASTN-ohjelmalla käyttäen simpukoiden NCBI-taksonomiatietokantaa (e-arvo < 1e−3 ja 90 %:n homologia), ja matalan kompleksisuuden omaavien sekvenssien peittäminen suoritettiin DUST-ohjelmalla [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуство NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнениено с иваспольнено с PÖLY [26]. Yhdistetyt lukemat annotoitiin BLASTN-annotaatiolla käyttäen NCBI:n simpukoiden taksonomiatietokantaa (e-arvo < 1e-3 ja 90 %:n homologia), ja matalan kompleksisuuden sekvenssimaskaus suoritettiin käyttämällä DUST-annotaatiota [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释吼并的读数 [使类数据库)进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读类 合并 读数 ]）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннытворхчств данных моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выспологии использованием DUST [26]. Yhdistetyt lukemat annotoitiin BLASTN-annotaatiolla käyttäen NCBI:n simpukoiden taksonomista tietokantaa (e-arvo <1e-3 ja 90 %:n homologia), ja matalan kompleksisuuden sekvenssimaskaus suoritettiin käyttämällä DUST-annotaatiota [26].Tulokset jaettiin kahteen ryhmään: simpukoiden sekvensseihin liittyvät (tässä itselukemat) ja toisiinsa liittymättömät (ei-itselukemat). Kaksi ryhmää koottiin erikseen käyttämällä MEGAHIT-ohjelmistoa kontigien luomiseksi [27]. Samaan aikaan vieraiden mikrobiomien lukujen taksonominen jakauma luokiteltiin käyttämällä Kraken2-ohjelmistoa [28] ja esitettiin graafisesti Krona-ympyrädiagrammilla Galaxy-alustalla [29, 30]. Optimaaliseksi kmeriksi määritettiin kmers-59 alustavien kokeidemme perusteella. Itsekontigit tunnistettiin sitten linjaamalla BLASTN:n (simpukoiden NCBI-tietokanta, e-arvo <1e−10 ja 60 % homologia) kanssa lopullista merkintää varten. Itsekontigit tunnistettiin sitten linjaamalla BLASTN:n (simpukoiden NCBI-tietokanta, e-arvo <1e−10 ja 60 % homologia) kanssa lopullista merkintää varten. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных, двустворюсмолчыNC значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Itsekontigit tunnistettiin sitten vertaamalla niitä BLASTN:ään (NCBI:n simpukkatietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 %:n homologia) lopullista annotaatiota varten.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ja гомология 60%). Itsekontigit tunnistettiin sitten lopullista annotointia varten vertaamalla niitä BLASTN:ään (NCBI:n simpukkatietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 %:n homologia). Rinnakkain ei-itse-ryhmäkontigit annotoitiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo < 1e−10 ja 60 % homologia). Rinnakkain ei-itse-ryhmäkontigit annotoitiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo < 1e−10 ja 60 % homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение 10 60 %). Samanaikaisesti vieraiden ryhmien kontigit annotoitiin BLASTN:llä (NT NCBI -tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参用平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参用 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннчхе <1e-10 ja гомология 60%). Rinnakkain ei-itse-ryhmäkontigit annotoitiin BLASTN:llä (nt NCBI-tietokanta, e-arvo <1e-10 ja 60 % homologia). BLASTX suoritettiin myös ei-itsekontiguille käyttäen nr- ja RefSeq-proteiinin NCBI-tietokantoja (e-arvo < 1e−10 ja 60 %:n homologia). BLASTX suoritettiin myös ei-itsekontiguille käyttäen nr- ja RefSeq-proteiinin NCBI-tietokantoja (e-arvo < 1e−10 ja 60 %:n homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знач1e) гомология 60%). BLASTX suoritettiin myös ei-itse-kontiguille käyttäen nr- ja RefSeq NCBI -proteiinitietokantoja (e-arvo < 1e-10 ja 60 % homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧ﺐ 傌源 倧 60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (знахомо0 60 %). BLASTX suoritettiin myös ei-itse-kontiguille käyttäen nr- ja RefSeq NCBI -proteiinitietokantoja (e-arvo <1e-10 ja 60 %:n homologia).BLASTN- ja BLASTX-ei-itsekontiguiden poolit edustavat lopullisia kontiguita (katso lisätiedosto).
PCR:ssä käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S1. Taq DNA-polymeraasia (Bio Basic Canada, Markham, ON) käytettiin ccfDNA-kohdegeenien monistamiseen. Käytettiin seuraavia reaktio-olosuhteita: denaturointi 95 °C:ssa 3 minuuttia, 95 °C:ssa 1 minuutti, asetettu hehkutuslämpötila 1 minuutiksi, elongaatio 72 °C:ssa 1 minuutti, 35 sykliä ja lopuksi 72 °C 10 minuutin kuluessa. PCR-tuotteet eroteltiin elektroforeesilla agaroosigeeleissä (1,5 %), jotka sisälsivät SYBRTM Safe DNA Gel Stain -väriä (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) 95 V:n jännitteellä.
Simpukoita (Mytilus spp.) totutettiin 500 ml:ssa hapetettua merivettä (32 PSU) 24 tunnin ajan 4 °C:ssa. Plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi ihmisen galektiini-7-cDNA-sekvenssiä koodaavan insertin (NCBI-talletusnumero L07769), lisättiin injektiopulloon lopullisena pitoisuutena 190 μg/μl. Kontrollina käytettiin simpukoita, joita inkuboitiin samoissa olosuhteissa ilman DNA:n lisäystä. Kolmas kontrollisäiliö sisälsi DNA:ta ilman simpukoita. Meriveden DNA:n laadun seuraamiseksi otettiin kustakin säiliöstä merivesinäytteitä (20 μl; kolme toistoa) ilmoitettuina ajankohtina. Plasmidi-DNA:n jäljitettävyyden varmistamiseksi LB-simpukat kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ja analysoitiin qPCR:llä ja ddPCR:llä. Meriveden korkean suolapitoisuuden vuoksi näytteet laimennettiin PCR-laatuisella vedellä (1:10) ennen kaikkia PCR-määrityksiä.
Digitaalinen pisara-PCR (ddPCR) suoritettiin BioRad QX200 -protokollalla (Mississauga, Ontario, Kanada). Käytä lämpötilaprofiilia optimaalisen lämpötilan määrittämiseen (taulukko S1). Pisarat luotiin QX200-pisarageneraattorilla (BioRad). ddPCR suoritettiin seuraavasti: 95 °C 5 minuutin ajan, 50 sykliä 95 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja annetussa hehkutuslämpötilassa 1 minuutin ajan ja 72 °C:ssa 30 sekunnin ajan, 4 °C:ssa 5 minuutin ajan ja 90 °C:ssa 5 minuutin kuluessa. Pisaroiden lukumäärä ja positiiviset reaktiot (kopioiden lukumäärä/µl) mitattiin QX200-pisaranlukijalla (BioRad). Alle 10 000 pisaraa sisältävät näytteet hylättiin. Kuvion tarkistusta ei suoritettu joka kerta, kun ddPCR suoritettiin.
qPCR suoritettiin käyttäen Rotor-Gene® 3000 -laitetta (Corbett Research, Sydney, Australia) ja LGALS7-spesifisiä alukkeita. Kaikki kvantitatiiviset PCR:t tehtiin 20 µl:ssa käyttäen QuantiFast SYBR Green PCR -pakkausta (QIAGEN). qPCR aloitettiin 15 minuutin inkuboinnilla 95 °C:ssa, minkä jälkeen suoritettiin 40 sykliä 95 °C:ssa 10 sekunnin ajan ja 60 °C:ssa 60 sekunnin ajan yhdellä tiedonkeruukerralla. Sulamiskäyrät luotiin peräkkäisillä mittauksilla 95 °C:ssa 5 sekunnin ajan, 65 °C:ssa 60 sekunnin ajan ja 97 °C:ssa qPCR:n lopussa. Jokainen qPCR suoritettiin kolmena rinnakkaisnäytteenä, lukuun ottamatta kontrollinäytteitä.
Koska simpukat tunnetaan korkeasta suodatusnopeudestaan, tutkimme ensin, pystyvätkö ne suodattamaan ja pidättämään merivedessä olevia DNA-fragmentteja. Meitä kiinnosti myös se, kerääntyvätkö nämä fragmentit niiden puoliavoimeen imusolmistoon. Ratkaisimme tämän ongelman kokeellisesti jäljittämällä sinisimpukkasäiliöihin lisättyjen liukoisten DNA-fragmenttien kohtaloa. DNA-fragmenttien jäljittämisen helpottamiseksi käytimme vierasta (ei omaa) plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi ihmisen galektiini-7-geenin. ddPCR jäljittää plasmidi-DNA-fragmentteja merivedessä ja simpukoissa. Tuloksemme osoittavat, että jos DNA-fragmenttien määrä merivedessä pysyi suhteellisen vakiona ajan kuluessa (jopa 7 päivään asti) simpukoiden puuttuessa, niin simpukoiden läsnä ollessa tämä taso katosi lähes kokonaan 8 tunnin kuluessa (kuva 1a, b). Eksogeenisen DNA:n fragmentit havaittiin helposti 15 minuutin kuluessa läppänesteessä ja hemolymfassa (kuva 1c). Näitä fragmentteja voitiin vielä havaita jopa 4 tuntia altistuksen jälkeen. Tämä DNA-fragmenttien suodatusaktiivisuus on verrattavissa bakteerien ja levien suodatusaktiivisuuteen [31]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että simpukat voivat suodattaa ja kerätä vierasta DNA:ta nesteosastoihinsa.
Plasmidi-DNA:n suhteelliset pitoisuudet merivedessä simpukoiden läsnä ollessa (A) tai poissa ollessa (B), mitattuna ddPCR:llä. A:ssa tulokset on ilmaistu prosentteina, ja laatikoiden reunat edustavat 75. ja 25. persentiiliä. Sovitettu logaritminen käyrä on esitetty punaisella ja harmaalla varjostettu alue edustaa 95 %:n luottamusväliä. B:ssä punainen viiva edustaa keskiarvoa ja sininen viiva 95 %:n luottamusväliä pitoisuudelle. C Plasmidi-DNA:n kertyminen simpukoiden hemolymfaan ja läppäviettiin eri aikoina plasmidi-DNA:n lisäämisen jälkeen. Tulokset esitetään absoluuttisina havaittuina kopioina/ml (±SE).
Seuraavaksi tutkimme ccfDNA:n alkuperää simpukoissa, jotka kerättiin Kerguelenin saarten simpukkaesiintymistä. Saaret ovat syrjäisiä saariryhmiä, joihin ihmisen vaikutus on ollut vähäistä. Tätä varten simpukoiden hemolymfistä peräisin oleva cccDNA eristettiin ja puhdistettiin ihmisen cccDNA:n puhdistamiseen yleisesti käytetyillä menetelmillä [32, 33]. Havaitsimme, että simpukoiden hemolymfien ccfDNA:n keskimääräiset pitoisuudet ovat alhaisella tasolla mikrogrammaa millilitraa kohden (katso taulukko S2, lisätiedot). Tämä pitoisuusalue on paljon suurempi kuin terveillä ihmisillä (alhainen nanogramma millilitraa kohden), mutta harvinaisissa tapauksissa syöpäpotilailla ccfDNA:n taso voi olla useita mikrogrammoja millilitraa kohden [34, 35]. Hemolymfien ccfDNA:n kokojakauman analyysi osoitti, että näiden fragmenttien koko vaihtelee suuresti, vaihdellen 1000 bp:stä aina 5000 bp:hen asti (kuva 2). Samankaltaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä piidioksidipohjaista QIAamp Investigator Kit -pakkausta, jota käytetään yleisesti oikeuslääketieteessä genomisen DNA:n nopeaan eristämiseen ja puhdistamiseen matalan pitoisuuden DNA-näytteistä, mukaan lukien ccfDNA [36].
Simpukan hemolymfan edustava ccfDNA-elektroforeesikuva. Uutettu NucleoSnap Plasma Kit -pakkauksella (ylhäällä) ja QIAamp DNA Investigator Kit -pakkauksella. B Viuludiagrammi, joka näyttää hemolymfassa olevien ccfDNA-pitoisuuksien jakauman (±SE). Musta ja punainen viiva edustavat vastaavasti mediaania sekä ensimmäistä ja kolmatta kvartiilia.
Noin 1 %:lla ihmisten ja kädellisten ccfDNA:sta on vieras lähde [21, 37]. Koska simpukoiden verenkiertoelimistö on puoliavoin, merivesi on mikrobipitoista ja simpukoiden ccfDNA:n kokoluokkajakauma on yleinen, oletimme, että simpukoiden hemolymfien ccfDNA saattaa sisältää rikkaan ja monipuolisen mikrobien DNA:n kokoelman. Tämän hypoteesin testaamiseksi sekvensoimme hemolymfien ccfDNA:n Kerguelenin saarilta kerätyistä Aulacomya atra -näytteistä, jolloin saatiin yli 10 miljoonaa luentaa, joista 97,6 % läpäisi laadunvalvonnan. Tulokset luokiteltiin sitten omiin ja ei-omiin lähteisiin käyttämällä BLASTN- ja NCBI-simpukkatietokantoja (kuva S1, lisätiedot).
Ihmisillä sekä tuman että mitokondrion DNA:ta voi vapautua verenkiertoon [38]. Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan ollut mahdollista kuvata yksityiskohtaisesti simpukoiden tuman genomista DNA:ta, koska A. atra -genomia ei ole sekvensoitu tai kuvattu. Pystyimme kuitenkin tunnistamaan useita omaa alkuperäämme olevia ccfDNA-fragmentteja käyttämällä simpukkakirjastoa (kuva S2, lisätiedot). Vahvistimme myös omaa alkuperäämme olevien DNA-fragmenttien läsnäolon suorittamalla sekvensoitujen A. atra -geenien suunnatun PCR-monistuksen (kuva 3). Vastaavasti, koska A. atran mitokondrion genomi on saatavilla julkisissa tietokannoissa, A. atran hemolymfasta voidaan löytää todisteita mitokondrioiden ccfDNA-fragmenttien esiintymisestä. Mitokondrioiden DNA-fragmenttien läsnäolo varmistettiin PCR-monistuksella (kuva 3).
PCR:llä monistetussa A. atran (punaiset pisteet – varastonumero: SRX5705969) ja M. platensisin (siniset pisteet – varastonumero: SRX5705968) hemolymfassa oli useita mitokondriogeenejä. Kuva mukautettu lähteestä Breton et al., 2011. B A. atran hemolymfasupernatantin monistaminen. Säilytetty FTA-paperilla. Lisää seos suoraan PCR-seosta sisältävään PCR-putkeen 3 mm:n rei'ittimellä.
Koska merivedessä on runsaasti mikrobia, keskityimme aluksi hemolymfan mikrobien DNA-sekvenssien karakterisointiin. Tätä varten käytimme kahta eri strategiaa. Ensimmäisessä strategiassa käytettiin Kraken2:ta, algoritmipohjaista sekvenssien luokitteluohjelmaa, joka pystyy tunnistamaan mikrobisekvenssejä BLAST:iin ja muihin työkaluihin verrattavalla tarkkuudella [28]. Yli 6719 luetusta sekvenssistä määritettiin olevan bakteeriperäistä, kun taas 124 ja 64 oli peräisin arkeoneista ja viruksista (kuva 4). Yleisimmät bakteerien DNA-fragmentit olivat Firmicutes-suvun (46 %), Proteobacteria-suvun (27 %) ja Bacteroidetes-suvun (17 %) syvimmistä simpukoista tehtyjen aiempien tutkimusten kanssa [39, 40]. Gammaproteobakteerit olivat proteobakteerien pääluokka (44 %), mukaan lukien monet Vibrionales-suvun bakteerit (kuva 4b). ddPCR-menetelmä vahvisti Vibrio-DNA-fragmenttien esiintymisen A. atra -hemolymfan ccfDNA:ssa (kuva 4c) [41]. Saadaksesi lisätietoja ccfDNA:n bakteeriperäisestä alkuperästä, käytettiin lisälähestymistapaa (kuva S2, lisätiedot). Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat koottiin parillisiksi lukemiksi ja luokiteltiin itse (simpukoiden) tai ei-itseperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e−3 ja raja-arvoa, jolla oli >90% homologia. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat koottiin parillisiksi lukemiksi ja luokiteltiin itse (simpukoiden) tai ei-itseperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e−3 ja raja-arvoa, jolla oli >90% homologia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиронваныц (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсеч homologia > 90 %. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat kerättiin pareittain ja luokiteltiin natiiveiksi (simpukoiksi) tai ei-alkuperäisiksi käyttämällä BLASTN:ää ja e-arvoa 1e-3 sekä raja-arvoa >90 %:n homologialla.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 璚1ne叠用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицирокныныны (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и порога и и поллюски homologia > 90 %. Tässä tapauksessa päällekkäiset lukemat kerättiin pareittain ja luokiteltiin omiksi (simpukoiksi) tai ei-alkuperäisiksi käyttämällä e BLASTN- ja 1e-3-arvoja ja homologiakynnystä >90 %.Koska A. atra -genomia ei ole vielä sekvensoitu, käytimme MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) -kokoojaohjelman de novo -kokoamisstrategiaa. Yhteensä 147 188 kontigia on tunnistettu alkuperältään riippuvaisiksi (simpukoiksi). Nämä kontigit räjäytettiin sitten e-arvoilla 1e-10 käyttäen BLASTN:ää ja BLASTX:ia. Tämän strategian avulla pystyimme tunnistamaan 482 ei-simpukoiden fragmenttia, joita esiintyy A. atra -ccfDNA:ssa. Yli puolet (57 %) näistä DNA-fragmenteista saatiin bakteereista, pääasiassa kidussymbionteista, mukaan lukien sulfotrofiset symbiontit, ja kidussymbionteista Solemya velum (kuva 5).
Suhteellinen runsaus tyyppitasolla. B Kahden pääjakson (Firmicutes ja Proteobacteria) mikrobien monimuotoisuus. ddPCR:n edustava amplifikaatio C Vibrio spp. A. 16S rRNA -geenin fragmentit (sininen) kolmessa atra-hemolymfissä.
Yhteensä 482 kerättyä kontigia analysoitiin. Metagenomisten kontigien annotaatioiden taksonomisen jakauman yleiskuvaus (prokaryootit ja eukaryootit). B BLASTN:llä ja BLASTX:lla tunnistettujen bakteerien DNA-fragmenttien yksityiskohtainen jakauma.
Kraken2-analyysi osoitti myös, että simpukan ccf-DNA sisälsi arkeonien DNA-fragmentteja, mukaan lukien Euryarchaeotan (65 %), Crenarchaeotan (24 %) ja Thaurmarcheotan (11 %) DNA-fragmentteja (kuva 6a). Euryarchaeotasta ja Crenarchaeotasta peräisin olevien DNA-fragmenttien esiintyminen, joita aiemmin löydettiin kalifornialaisten simpukoiden mikrobiyhteisöstä, ei pitäisi olla yllätys [42]. Vaikka Euryarchaeota yhdistetään usein äärimmäisiin olosuhteisiin, nyt tunnustetaan, että sekä Euryarchaeota että Crenarcheota ovat yleisimpiä prokaryootteja meren kryogeenisessä ympäristössä [43, 44]. Metanogeenisten mikro-organismien esiintyminen simpukoissa ei ole yllättävää, kun otetaan huomioon viimeaikaiset raportit laajoista metaanivuodoista Kerguelenin ylängön pohjavuodoista [45] ja mahdollinen mikrobien metaanin tuotanto, jota on havaittu Kerguelenin saarten rannikolla [46].
Huomiomme siirtyi sitten DNA-virusten lukemiin. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen muualla kuin kohdennetusti tehty tutkimus simpukoiden virussisällöstä. Kuten odotettua, löysimme bakteriofagien (Caudovirales) DNA-fragmentteja (kuva 6b). Yleisin virus-DNA on kuitenkin peräisin nukleosytovirusten pääjaksosta, joka tunnetaan myös nimellä tuman sytoplasminen suuri DNA-virus (NCLDV), jolla on kaikista viruksista suurin genomi. Tässä pääjaksossa useimmat DNA-sekvensseistä kuuluvat Mimimidoviridae (58 %) ja Poxviridae (21 %) -heimoihin, joiden luonnollisiin isäntiin kuuluvat selkärankaiset ja niveljalkaiset, kun taas pieni osa näistä DNA-sekvensseistä kuuluu tunnettuihin virologisiin leviin. Tartuttaa merieukaryoottilevää. Sekvenssit saatiin myös Pandora-viruksesta, jättiläisviruksesta, jolla on suurin genomikoko kaikista tunnetuista virussukuista. Mielenkiintoista on, että viruksen tartuttamien isäntien määrä hemolymfa ccfDNA-sekvensoinnin perusteella oli suhteellisen suuri (kuva S3, lisätiedot). Se sisältää viruksia, jotka tartuttavat hyönteisiä, kuten Baculoviridae ja Iridoviridae, sekä viruksia, jotka tartuttavat ameebaa, leviä ja selkärankaisia. Löysimme myös sekvenssejä, jotka vastaavat Pithovirus sibericum -genomia. Pitovirukset (tunnetaan myös nimellä "zombie-virukset") eristettiin ensimmäisen kerran 30 000 vuotta vanhasta ikiroudasta Siperiassa [47]. Tuloksemme ovat siis yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien kanssa, jotka osoittavat, että kaikki näiden virusten nykylajit eivät ole kuolleet sukupuuttoon [48] ja että näitä viruksia saattaa esiintyä syrjäisissä subarktisissa meriekosysteemeissä.
Lopuksi testasimme, voisimmeko löytää DNA-fragmentteja muista monisoluisista eläimistä. BLASTN- ja BLASTX-menetelmillä tunnistettiin yhteensä 482 vierasta kontigia nt-, nr- ja RefSeq-kirjastojen (genominen ja proteiini) avulla. Tuloksemme osoittavat, että monisoluisten eläinten ccfDNA:n vieraista fragmenteista luisten luiden DNA on vallitsevaa (kuva 5). Myös hyönteisten ja muiden lajien DNA-fragmentteja on löydetty. Suhteellisen suurta osaa DNA-fragmenteista ei ole tunnistettu, mahdollisesti johtuen suuren määrän merilajien aliedustuksesta genomitietokannoissa verrattuna maalla eläviin lajeihin [49].
Tässä artikkelissa sovellamme LB-konseptia simpukoihin ja väitämme, että hemolymfin ccfDNA-sekvensointi voi antaa tietoa meren rannikkoekosysteemien koostumuksesta. Havaitsimme erityisesti, että 1) simpukan hemolymfa sisältää suhteellisen suuria pitoisuuksia (mikrogrammatasolla) suhteellisen suuria (~1-5 kb) verenkierrossa olevia DNA-fragmentteja; 2) nämä DNA-fragmentit ovat sekä riippumattomia että ei-riippumattomia 3) Näiden DNA-fragmenttien vieraista lähteistä löysimme bakteerien, arkeonien ja virusten DNA:ta sekä muiden monisoluisten eläinten DNA:ta; 4) Näiden vieraiden ccfDNA-fragmenttien kertyminen hemolymfaan tapahtuu nopeasti ja edistää simpukoiden sisäistä suodatusaktiivisuutta. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että LB-käsite, jota on tähän mennessä sovellettu pääasiassa biolääketieteen alalla, koodaa rikkaan mutta tutkimattoman tietolähteen, jota voidaan käyttää sentinellilajien ja niiden ympäristön välisen vuorovaikutuksen ymmärtämiseen paremmin.
Kädellisten lisäksi ccfDNA:n eristämistä on raportoitu nisäkkäillä, kuten hiirillä, koirilla, kissoilla ja hevosilla [50, 51, 52]. Tietojemme mukaan tutkimuksemme on kuitenkin ensimmäinen, jossa raportoidaan ccfDNA:n havaitsemisesta ja sekvensoinnista merilajeissa, joilla on avoin verenkiertojärjestelmä. Tämä simpukoiden anatominen ominaisuus ja suodatuskyky voivat ainakin osittain selittää verenkierrossa olevien DNA-fragmenttien erilaiset koko-ominaisuudet verrattuna muihin lajeihin. Ihmisillä useimmat veressä kiertävät DNA-fragmentit ovat pieniä fragmentteja, joiden koko vaihtelee 150–200 bp:n välillä, ja maksimipiikin on 167 bp [34, 53]. Pieni mutta merkittävä osa DNA-fragmenteista on kooltaan 300–500 bp:n välillä, ja noin 5 % on yli 900 bp:n pituisia. [54]. Tämän kokojakauman syynä on se, että ccfDNA:n pääasiallinen lähde plasmassa on solukuoleman seurauksena, joko solukuoleman tai verenkierrossa olevien hematopoieettisten solujen nekroosin vuoksi terveillä yksilöillä tai kasvainsolujen apoptoosin vuoksi syöpäpotilailla (tunnetaan nimellä verenkierrossa oleva kasvain-DNA). , ctDNA). Simpukoista löytämämme hemolymfa ccfDNA:n kokojakauma vaihteli 1000:sta 5000 bp:hen, mikä viittaa siihen, että simpukoiden ccfDNA:lla on eri alkuperä. Tämä on looginen hypoteesi, koska simpukoilla on puoliavoin verisuonisto ja ne elävät merivesiympäristöissä, jotka sisältävät suuria pitoisuuksia mikrobien genomista DNA:ta. Itse asiassa laboratoriokokeemme, joissa käytettiin eksogeenistä DNA:ta, ovat osoittaneet, että simpukat keräävät DNA-fragmentteja meriveteen, ainakin muutaman tunnin kuluttua ne hajoavat solujen sisäänoton jälkeen ja/tai vapautuvat ja/tai varastoituvat erilaisiin organisaatioihin. Ottaen huomioon solujen (sekä prokaryoottisten että eukaryoottisten) harvinaisuuden, läppävimpuiden lokeroiden käyttö vähentää sekä omien lähteiden että vieraiden lähteiden ccfDNA:n määrää. Ottaen huomioon simpukoiden synnynnäisen immuniteetin tärkeyden ja suuren määrän verenkierrossa olevia fagosyyttejä, oletimme lisäksi, että jopa vieras ccfDNA on rikastunut verenkierrossa olevissa fagosyyteissä, jotka keräävät vierasta DNA:ta mikro-organismien ja/tai solujätteiden nauttimisen seurauksena. Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme osoittavat, että simpukoiden hemolymfin ccfDNA on ainutlaatuinen molekyylitiedon säilytyspaikka ja vahvistaa niiden asemaa vartijalajina.
Datamme osoittavat, että bakteereista peräisin olevien hemolymfasolujen ccfDNA-fragmenttien sekvensointi ja analysointi voivat tarjota keskeistä tietoa isäntäbakteerifloorasta ja ympäröivässä meriekosysteemissä esiintyvistä bakteereista. Sekvensointitekniikat ovat paljastaneet kommensaalibakteerin A. atra -kidussekvenssejä, jotka olisivat jääneet huomaamatta, jos olisi käytetty perinteisiä 16S rRNA -tunnistusmenetelmiä, osittain referenssikirjastoharhan vuoksi. Itse asiassa käyttämämme LB-data, joka oli kerätty M. platensis -bakteerista samasta Kerguelenin simpukkakerroksesta, osoitti, että kiduksiin liittyvien bakteeri-symbionttien koostumus oli sama molemmilla simpukkalajeilla (kuva S4, lisätiedot). Tämä kahden geneettisesti erilaisen simpukan samankaltaisuus voi heijastaa bakteeriyhteisöjen koostumusta Kerguelenin kylmissä, rikkipitoisissa ja vulkaanisissa esiintymissä [55, 56, 57, 58]. Korkeampia rikkiä vähentävien mikro-organismien määriä on kuvattu hyvin simpukoita korjattaessa bioturboituneilta rannikkoalueilta [59], kuten Port-au-Francen rannikolta. Toinen mahdollisuus on, että horisontaalinen siirtyminen voi vaikuttaa kommensaalisimpukoiden flooraan [60, 61]. Lisää tutkimusta tarvitaan meriympäristön, merenpohjan pinnan ja simpukoiden symbioottisten bakteerien koostumuksen välisen korrelaation määrittämiseksi. Nämä tutkimukset ovat parhaillaan käynnissä.
Hemolymfi ccfDNA:n pituus ja pitoisuus, sen helppo puhdistaminen ja korkea laatu, joka mahdollistaa nopean haulikkosekvensoinnin, ovat joitakin monista eduista, joita simpukoiden ccfDNA:n käytöllä arvioidaan meren rannikkoekosysteemien biologista monimuotoisuutta. Tämä lähestymistapa on erityisen tehokas virusyhteisöjen (viromien) karakterisoinnissa tietyssä ekosysteemissä [62, 63]. Toisin kuin bakteerit, arkeonit ja eukaryootit, virusgenomit eivät sisällä fylogeneettisesti säilyneitä geenejä, kuten 16S-sekvenssejä. Tuloksemme osoittavat, että indikaattorilajeista, kuten simpukoista, otettuja nestemäisiä biopsioita voidaan käyttää suhteellisen suuren määrän ccfDNA-virusfragmenttien tunnistamiseen, joiden tiedetään tartuttavan rannikkomeriekosysteemeissä tyypillisesti eläviä isäntiä. Tähän sisältyvät virukset, joiden tiedetään tartuttavan alkueläimiä, niveljalkaisia, hyönteisiä, kasveja ja bakteeriviruksia (esim. bakteriofageja). Samanlainen jakauma havaittiin, kun tutkimme Kerguelenin samasta simpukkakerroksesta kerätyn sinisimpukoiden (M. platensis) hemolymfi ccfDNA -viromia (taulukko S2, lisätiedot). ccfDNA:n haulikkosekvensointi on todellakin uusi lähestymistapa, joka on saamassa vauhtia ihmisten tai muiden lajien viromin tutkimuksessa [21, 37, 64]. Tämä lähestymistapa on erityisen hyödyllinen kaksijuosteisten DNA-virusten tutkimisessa, koska mikään yksittäinen geeni ei ole säilynyt kaikkien kaksijuosteisten DNA-virusten joukossa, jotka edustavat Baltimoressa monimuotoisinta ja laajinta virusluokkaa [65]. Vaikka useimmat näistä viruksista ovat edelleen luokittelemattomia ja saattavat sisältää viruksia täysin tuntemattomasta osasta virusmaailmaa [66], havaitsimme, että simpukoiden A. atra ja M. platensis viromit ja isäntäalueet sijoittuvat näiden kahden lajin väliin. Samoin (katso kuva S3, lisätietoja). Tämä samankaltaisuus ei ole yllättävä, koska se voi heijastaa selektiivisyyden puutetta ympäristössä olevan DNA:n otossa. Tulevia tutkimuksia, joissa käytetään puhdistettua RNA:ta, tarvitaan tällä hetkellä RNA-viromin karakterisoimiseksi.
Tutkimuksessamme käytimme erittäin tarkkaa prosessia, joka oli mukautettu Kowarskin ja kollegoiden [37] työstä. He käyttivät kaksivaiheista yhdistettyjen lukujen ja kontiguiden deleetiota ennen natiivin ccfDNA:n kokoamista ja sen jälkeen, mikä johti suureen osaan kartoittamattomia lukuja. Siksi emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että joillakin näistä kartoittamattomista lukuista saattaa olla oma alkuperänsä, pääasiassa siksi, että meillä ei ole referenssigenomia tälle simpukkalajille. Käytimme tätä prosessia myös siksi, että olimme huolissamme itse- ja ei-itse-lukujen välisistä kimeerista sekä Illumina MiSeq PE75:n tuottamista lukupituuksista. Toinen syy useimpiin kartoittamattomiin lukemiin on se, että suurta osaa merimikrobeista, erityisesti syrjäisillä alueilla, kuten Kerguelenissa, ei ole annotoitu. Käytimme Illumina MiSeq PE75:tä olettaen, että ccfDNA-fragmenttien pituudet ovat samanlaisia ​​kuin ihmisen ccfDNA:lla. Tulevia tutkimuksia varten, koska tuloksemme osoittavat, että hemolymfa-ccfDNA:lla on pidempiä lukuja kuin ihmisillä ja/tai nisäkkäillä, suosittelemme sekvensointialustan käyttöä, joka sopii paremmin pidemmille ccfDNA-fragmenteille. Tämä käytäntö helpottaa huomattavasti syvemmän analyysin indikaatioiden tunnistamista. Tällä hetkellä saatavilla olevan täydellisen A. atran ydingenomisekvenssin hankkiminen helpottaisi myös huomattavasti ccfDNA:n erottamista omasta ja ei-omasta lähteestä. Koska tutkimuksemme on keskittynyt nestebiopsian käsitteen soveltamismahdollisuuksiin simpukoissa, toivomme, että tämän käsitteen käytön myötä tulevassa tutkimuksessa kehitetään uusia työkaluja ja tutkimusprosesseja, jotka lisäävät tämän menetelmän potentiaalia simpukoiden mikrobien monimuotoisuuden tutkimisessa meriekosysteemissä.
Ei-invasiivisena kliinisenä biomarkkerina kohonneet ccfDNA:n pitoisuudet ihmisen plasmassa liittyvät erilaisiin sairauksiin, kudosvaurioihin ja stressitiloihin [67,68,69]. Tämä nousu liittyy DNA:n omaa alkuperää olevien DNA-fragmenttien vapautumiseen kudosvaurion jälkeen. Käsittelimme tätä ongelmaa käyttämällä akuuttia lämpöstressiä, jossa simpukat altistettiin lyhyesti 30 °C:n lämpötilalle. Suoritimme tämän analyysin kolmelle erityyppiselle simpukalle kolmessa itsenäisessä kokeessa. Emme kuitenkaan havainneet muutoksia ccfDNA-tasoissa akuutin lämpöstressin jälkeen (katso kuva S5, lisätietoja). Tämä löytö voi selittää ainakin osittain sen, että simpukoilla on puoliavoin verenkiertoelimistö ja ne keräävät suuria määriä vierasta DNA:ta korkean suodatusaktiivisuutensa vuoksi. Toisaalta simpukat, kuten monet selkärangattomat, saattavat olla vastustuskykyisempiä stressin aiheuttamille kudosvaurioille, mikä rajoittaa ccfDNA:n vapautumista hemolymfaansa [70, 71].
Tähän mennessä vesiekosysteemien biodiversiteetin DNA-analyysi on keskittynyt pääasiassa ympäristö-DNA:n (eDNA) metabarkoodaukseen. Tämä menetelmä on kuitenkin yleensä rajoittunut biodiversiteetin analysoinnissa, kun käytetään alukkeita. Haulikkosekvensoinnin käyttö kiertää PCR:n rajoitukset ja alukesarjojen puolueellisen valinnan. Siten menetelmämme on tavallaan lähempänä äskettäin käytettyä suuren läpimenon eDNA-haulikkosekvensointimenetelmää, joka pystyy sekvensoimaan suoraan fragmentoitunutta DNA:ta ja analysoimaan lähes kaikkia organismeja [72, 73]. LB:n ja tavanomaisten eDNA-menetelmien välillä on kuitenkin useita perustavanlaatuisia seikkoja. eDNA:n ja LB:n tärkein ero on luonnollisten suodatinisäntien käyttö. Merieläinlajien, kuten sienieläinten ja simpukoiden (Dresseina spp.), käyttöä luonnollisena suodattimena eDNA:n tutkimisessa on raportoitu [74, 75]. Dreissenan tutkimuksessa käytettiin kuitenkin kudosbiopsioita, joista DNA uutettiin. ccfDNA:n analysointi LB:stä ei vaadi kudosbiopsiaa, erikoistuneita ja joskus kalliita laitteita tai eDNA:han tai kudosbiopsiaan liittyvää logistiikkaa. Itse asiassa raportoimme äskettäin, että LB:stä peräisin olevaa ccfDNA:ta voidaan varastoida ja analysoida FTA-tuella ilman kylmäketjua, mikä on merkittävä haaste syrjäseuduilla tehtävälle tutkimukselle [76]. CcfDNA:n uuttaminen nestemäisistä biopsioista on myös yksinkertaista ja tarjoaa korkealaatuista DNA:ta haulikkosekvensointiin ja PCR-analyysiin. Tämä on suuri etu ottaen huomioon jotkin eDNA-analyysiin liittyvät tekniset rajoitukset [77]. Näytteenottomenetelmän yksinkertaisuus ja alhaiset kustannukset sopivat myös erityisen hyvin pitkäaikaisiin seurantaohjelmiin. Korkean suodatuskyvyn lisäksi simpukoiden toinen tunnettu ominaisuus on niiden liman kemiallinen mukopolysakkaridikoostumus, joka edistää virusten imeytymistä [78, 79]. Tämä tekee simpukoista ihanteellisen luonnollisen suodattimen biologisen monimuotoisuuden ja ilmastonmuutoksen vaikutusten karakterisointiin tietyssä vesiekosysteemissä. Vaikka isännästä peräisin olevien DNA-fragmenttien läsnäoloa voidaan pitää menetelmän rajoituksena verrattuna eDNA:han, tällaisen natiivin ccfDNA:n hankkimiseen liittyvät kustannukset verrattuna eDNA:han ovat samalla ymmärrettäviä, kun otetaan huomioon terveystutkimuksissa käytettävissä olevan tiedon valtava määrä. Tämä sisältää isäntäeläimen genomiin integroituneiden virussekvenssien läsnäolon. Tämä on erityisen tärkeää simpukoille, kun otetaan huomioon horisontaalisesti tarttuvien leukemiaretrovirusten esiintyminen simpukoissa [80, 81]. Toinen LB:n etu eDNA:han verrattuna on, että se hyödyntää verenkierrossa olevien verisolujen fagosyyttistä aktiivisuutta hemolymfassa, joka nielaisee mikro-organismeja (ja niiden genomeja). Fagosytoosi on verisolujen päätehtävä simpukoissa [82]. Lopuksi menetelmä hyödyntää simpukoiden korkeaa suodatuskapasiteettia (keskimäärin 1,5 l/h merivettä) ja kahden päivän kiertoa, jotka lisäävät meriveden eri kerrosten sekoittumista ja mahdollistavat heterologisen eDNA:n talteenoton. [83, 84]. Simpukoiden ccfDNA-analyysi on siis mielenkiintoinen tutkimuskohde, kun otetaan huomioon simpukoiden ravitsemukselliset, taloudelliset ja ympäristövaikutukset. Samoin kuin ihmisiltä kerätyn LB:n analyysi, tämä menetelmä avaa myös mahdollisuuden mitata isäntä-DNA:n geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia vasteena eksogeenisille aineille. Esimerkiksi kolmannen sukupolven sekvensointitekniikoita voidaan harkita genominlaajuisen metylaatioanalyysin suorittamiseksi natiivissa ccfDNA:ssa käyttäen nanohuokosekvensointia. Tätä prosessia helpottaa se, että simpukan ccfDNA-fragmenttien pituus on ihanteellisesti yhteensopiva pitkän lukuajan sekvensointialustojen kanssa, jotka mahdollistavat genominlaajuisen DNA-metylaatioanalyysin yhdestä sekvensointiajosta ilman kemiallisia muutoksia.85,86] Tämä on mielenkiintoinen mahdollisuus, sillä on osoitettu, että DNA:n metylaatiomallit heijastavat vastetta ympäristöstressiin ja säilyvät useiden sukupolvien ajan. Siksi se voi tarjota arvokasta tietoa taustalla olevista mekanismeista, jotka säätelevät vastetta ilmastonmuutokselle tai saasteille altistumisen jälkeen [87]. LB:n käyttö ei kuitenkaan ole rajoitukseton. On sanomattakin selvää, että tämä edellyttää indikaattorilajien läsnäoloa ekosysteemissä. Kuten edellä mainittiin, LB:n käyttö tietyn ekosysteemin biologisen monimuotoisuuden arvioimiseksi vaatii myös tarkkaa bioinformatiikan prosessia, joka ottaa huomioon DNA-fragmenttien läsnäolon lähteestä. Toinen merkittävä ongelma on merilajien referenssigenomien saatavuus. Toivotaan, että aloitteet, kuten merinisäkkäiden genomiprojekti ja äskettäin perustettu Fish10k-projekti [88], helpottavat tällaista analyysiä tulevaisuudessa. LB-konseptin soveltaminen suodattimen avulla ravintoa kerääviin meren eliöihin on myös yhteensopiva sekvensointitekniikan uusimpien edistysaskeleiden kanssa, mikä tekee siitä hyvin sopivan moniohmisten biomarkkereiden kehittämiseen, jotka tarjoavat tärkeää tietoa meren elinympäristöjen terveydestä vastauksena ympäristöstressiin.
Genomin sekvensointitiedot on talletettu NCBI:n sekvenssilukuarkistoon https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 nimellä Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ilmastonmuutoksen vaikutus merieliöstöön ja ekosysteemeihin. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ym. Tarkastellaan ilmastonmuutoksen ja muiden paikallisten stressitekijöiden yhteisvaikutuksia meriympäristöön. yleinen tieteellinen ympäristö. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et ai. ). Maaliskuun ensimmäisen tiede. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Heikentynyt lämmönsietokyky toistuvissa lämpöstressiolosuhteissa selittää sinisimpukoiden korkean kesäkuolleisuuden. Tieteellinen raportti 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER ym. Eläinkuolemien tiheyden, syiden ja laajuuden viimeaikaiset muutokset. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et ai. Useat ei-lajikohtaiset patogeenit ovat saattaneet aiheuttaa Pinna nobilisin massakuolleisuutta. Elämä. 2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Ilmastonmuutoksen mahdollinen vaikutus arktisiin zoonoosiin. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ym. Sinisimpukat (Mytilus edulis spp.) signaaliorganismeina rannikkoalueiden saasteiden seurannassa: katsaus. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Nestemäisen biopsian integrointi syövän hoitoon. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C ym. Nestemäisen biopsian kypsytys: Mahdollistaa kasvaimen DNA:n kiertämisen. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleiinihapot ihmisen plasmassa. Soc Biolin tytäryhtiöiden kokouspöytäkirjat. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Soluvapaan DNA:n uusi rooli molekyylimarkkerina syövän hoidossa. Biomolaarisen analyysin kvantifiointi. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Nestemäinen biopsia klinikalle – käyttöönottoon liittyviä kysymyksiä ja tulevaisuuden haasteita. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ja muut. Sikiön DNA:ta esiintyy äidin plasmassa ja seerumissa. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR. Raskauden kulun ja sen komplikaatioiden tutkimus raskaudenaikaisen naisen veressä kiertävän solunulkoisen RNA:n avulla. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, ym. Nestemäinen biopsia: luovuttajasoluvapaata DNA:ta käytetään allogeenisten leesioiden havaitsemiseen munuaissiirteessä. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM. Innovaatiot synnytystä edeltävässä diagnostiikassa: äidin plasman genomin sekvensointi. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D ym. Nopea patogeenien havaitseminen tartunnan saaneiden ruumiinnesteiden seuraavan sukupolven metagenomisekvensoinnin avulla. Nat Medicine. 2021;27:115-24.