Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
ബയോമെഡിക്കൽ മേഖലയിൽ അതിവേഗം പ്രചാരം നേടിക്കൊണ്ടിരിക്കുന്ന ഒരു ആശയമാണ് ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി (LB). വിവിധ കലകളിലെ കോശ മരണശേഷം ചെറിയ ശകലങ്ങളായി പുറത്തുവിടുന്ന രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡിഎൻഎ (ccfDNA) യുടെ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഈ ആശയം. ഈ ശകലങ്ങളുടെ ഒരു ചെറിയ അനുപാതം വിദേശ (വിദേശ) കലകളിൽ നിന്നോ ജീവികളിൽ നിന്നോ ഉത്ഭവിക്കുന്നു. നിലവിലെ പ്രവർത്തനത്തിൽ, ഉയർന്ന കടൽജല ശുദ്ധീകരണ ശേഷിക്ക് പേരുകേട്ട ഒരു സെന്റിനൽ ഇനമായ മസ്സലുകളിൽ ഈ ആശയം ഞങ്ങൾ പ്രയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട്. സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നതിന് വിവിധ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്ന് പാരിസ്ഥിതിക ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ പിടിച്ചെടുക്കുന്നതിന് പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറുകളായി പ്രവർത്തിക്കാനുള്ള മസ്സലുകളുടെ കഴിവ് ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. മസ്സൽ ഹീമോലിംഫിൽ 1 മുതൽ 5 kb വരെ വലുപ്പത്തിൽ വലിയ വ്യത്യാസമുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് കാണിക്കുന്നത് വലിയൊരു സംഖ്യ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വിദേശ സൂക്ഷ്മജീവി ഉത്ഭവമുള്ളതാണെന്ന്. അവയിൽ, ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയ, വൈറസുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, തീരദേശ സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സാധാരണയായി കാണപ്പെടുന്ന വിവിധ ഹോസ്റ്റുകളെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകൾ ഉൾപ്പെടെ. ഉപസംഹാരമായി, സമുദ്രതീര ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ സൂക്ഷ്മജീവി വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള അറിവിന്റെ സമ്പന്നമായ, എന്നാൽ ഇതുവരെ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാത്ത ഒരു ഉറവിടമാണ് മുത്തുച്ചിപ്പികളിൽ പ്രയോഗിക്കുന്ന എൽബി എന്ന ആശയം എന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവവൈവിധ്യത്തിൽ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ (CC) ആഘാതം അതിവേഗം വളരുന്ന ഒരു ഗവേഷണ മേഖലയാണ്. ആഗോളതാപനം പ്രധാനപ്പെട്ട ശാരീരിക സമ്മർദ്ദങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുക മാത്രമല്ല, സമുദ്ര ജീവികളുടെ താപ സ്ഥിരതയുടെ പരിണാമ പരിധികൾ ഉയർത്തുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് നിരവധി ജീവിവർഗങ്ങളുടെ ആവാസവ്യവസ്ഥയെ ബാധിക്കുകയും കൂടുതൽ അനുകൂലമായ സാഹചര്യങ്ങൾക്കായി തിരയാൻ അവരെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു [1, 2]. മെറ്റാസോവനുകളുടെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെ ബാധിക്കുന്നതിനൊപ്പം, CC ആതിഥേയ-സൂക്ഷ്മജീവി ഇടപെടലുകളുടെ സൂക്ഷ്മമായ സന്തുലിതാവസ്ഥയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. ഈ സൂക്ഷ്മജീവി ഡിസ്ബാക്ടീരിയോസിസ് സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയ്ക്ക് ഗുരുതരമായ ഭീഷണി ഉയർത്തുന്നു, കാരണം ഇത് സമുദ്രജീവികളെ പകർച്ചവ്യാധി രോഗകാരികൾക്ക് കൂടുതൽ ഇരയാക്കുന്നു [3, 4]. ആഗോള സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ മാനേജ്മെന്റിന് ഗുരുതരമായ പ്രശ്നമായ കൂട്ട മരണങ്ങളിൽ SS ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു [5, 6]. നിരവധി സമുദ്രജീവികളുടെ സാമ്പത്തിക, പാരിസ്ഥിതിക, പോഷക പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് ഒരു പ്രധാന പ്രശ്നമാണ്. CK യുടെ ഫലങ്ങൾ കൂടുതൽ ഉടനടിയും കഠിനവുമാണ് [6, 7] ധ്രുവപ്രദേശങ്ങളിൽ താമസിക്കുന്ന ബിവാൾവുകൾക്ക് ഇത് പ്രത്യേകിച്ചും സത്യമാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, മൈറ്റിലസ് എസ്‌പിപി പോലുള്ള ബിവാൾവുകൾ. സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ CC യുടെ സ്വാധീനം നിരീക്ഷിക്കാൻ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. അതിശയിക്കാനില്ല, അവയുടെ ആരോഗ്യം നിരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി താരതമ്യേന വലിയ എണ്ണം ബയോമാർക്കറുകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്, പലപ്പോഴും എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫങ്ഷണൽ ബയോമാർക്കറുകൾ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു ദ്വിതല സമീപനം ഉപയോഗിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ കോശ പ്രവർത്തനക്ഷമത, ഫാഗോസൈറ്റിക് പ്രവർത്തനം [8] പോലുള്ള കോശ പ്രവർത്തനങ്ങൾ. വലിയ അളവിൽ കടൽ വെള്ളം ആഗിരണം ചെയ്തതിനുശേഷം മൃദുവായ ടിഷ്യൂകളിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട മർദ്ദ സൂചകങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത അളക്കുന്നതും ഈ രീതികളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ബിവാൾവുകളുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറേഷൻ ശേഷിയും സെമി-ഓപ്പൺ രക്തചംക്രമണ സംവിധാനവും ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി (LB) എന്ന ആശയം ഉപയോഗിച്ച് പുതിയ ഹീമോലിംഫ് ബയോമാർക്കറുകൾ വികസിപ്പിക്കാനുള്ള അവസരം നൽകുന്നു, ഇത് രോഗി മാനേജ്മെന്റിനുള്ള ലളിതവും കുറഞ്ഞതുമായ ആക്രമണാത്മക സമീപനമാണ്. രക്ത സാമ്പിളുകൾ [9, 10]. മനുഷ്യ എൽബിയിൽ നിരവധി തരം രക്തചംക്രമണ തന്മാത്രകൾ കണ്ടെത്താൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഈ ആശയം പ്രാഥമികമായി പ്ലാസ്മയിലെ രക്തചംക്രമണമുള്ള എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡിഎൻഎ (ccfDNA) ശകലങ്ങളുടെ ഡിഎൻഎ സീക്വൻസിംഗ് വിശകലനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിൽ രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള ഡിഎൻഎയുടെ സാന്നിധ്യം 20-ാം നൂറ്റാണ്ടിന്റെ മധ്യം മുതൽ അറിയപ്പെടുന്നു [11], എന്നാൽ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സീക്വൻസിംഗ് രീതികളുടെ ആവിർഭാവം ccfDNA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ക്ലിനിക്കൽ രോഗനിർണയത്തിലേക്ക് നയിച്ചത് സമീപ വർഷങ്ങളിലാണ്. ഈ രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം കോശ മരണശേഷം ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ (ന്യൂക്ലിയർ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ) നിഷ്ക്രിയമായി പുറത്തുവിടുന്നതിന്റെ ഭാഗമാണ്. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ, ccfDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL), എന്നാൽ വിവിധ രോഗങ്ങളാൽ ബുദ്ധിമുട്ടുന്നവരോ സമ്മർദ്ദത്തിന് വിധേയരാകുന്നവരോ ആയ രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിച്ചേക്കാം, ഇത് ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാകും. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ, ccfDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL), എന്നാൽ വിവിധ രോഗങ്ങളാൽ ബുദ്ധിമുട്ടുന്നവരോ സമ്മർദ്ദത്തിന് വിധേയരാകുന്നവരോ ആയ രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിച്ചേക്കാം, ഇത് ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാകും. У здоровых людей контрация вккДНК в норме низкая (<10 ng/ml), നോ മൊജെത് പൊവ്യ്ത്സത്യ്വംയ്യ മാസം 5-10 റാസ്ലിച്ച്നോയ് പട്ടോലോഗി അല്ലെങ്കിൽ പൊദ്വെര്ഗയുസ്ഛ്യ്ഹ്സ്യ സ്ട്രെസ്സു, പ്രിവൊദ്യസ്ഛെമു കെ പൊവ്രെജ്ഹ്ദെനിയു തകനെയ്. ആരോഗ്യമുള്ള ആളുകളിൽ, cccDNA യുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/mL), എന്നാൽ വിവിധ രോഗങ്ങളുള്ള രോഗികളിലോ ടിഷ്യു നാശത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്ന സമ്മർദ്ദത്തിലോ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിക്കും.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织കൂടാതെ中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤损伤损伤 损损伤ccfDNA ഒബ്ыച്ച്നോ നൈസ്കി (<10 ng/ml) യു ഡോറോവിഷ് ലിഡേയ്, നോ മൊഗുത് ബ്ыത് ഉവെല്യ്ഛ്യ്വെത്സ്യ ഈ 5-10 റസ്ലിച്നിമി പാറ്റോളഗിയമി അല്ലെങ്കിൽ ലിസ്റ്റ്രെസ്സോം, ച്തൊ പ്രിവോഡിറ്റ് കെ പൊവ്രെജ്ഹ്ദെനിയു ത്കനെയ്. ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിൽ ccfDNA സാന്ദ്രത സാധാരണയായി കുറവാണ് (<10 ng/ml), എന്നാൽ വിവിധ രോഗങ്ങളോ സമ്മർദ്ദമോ ഉള്ള രോഗികളിൽ ഇത് 5-10 മടങ്ങ് വർദ്ധിക്കുകയും ടിഷ്യു നാശത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യും.ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ വലുപ്പം വ്യാപകമായി വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു, പക്ഷേ സാധാരണയായി 150 മുതൽ 200 bp വരെയാണ്. [12]. സ്വയം ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ccfDNA യുടെ വിശകലനം, അതായത്, സാധാരണ അല്ലെങ്കിൽ രൂപാന്തരപ്പെട്ട ഹോസ്റ്റ് കോശങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA, ന്യൂക്ലിയർ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനോമിൽ നിലവിലുള്ള ജനിതക, എപ്പിജെനെറ്റിക് മാറ്റങ്ങൾ കണ്ടെത്താൻ ഉപയോഗിക്കാം, അതുവഴി നിർദ്ദിഷ്ട തന്മാത്രാ-ലക്ഷ്യമിടുന്ന ചികിത്സകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ക്ലിനിക്കുകളെ സഹായിക്കുന്നു [13]. എന്നിരുന്നാലും, ഗർഭകാലത്ത് ഗര്ഭപിണ്ഡകോശങ്ങളിൽ നിന്നോ മാറ്റിവയ്ക്കപ്പെട്ട അവയവങ്ങളിൽ നിന്നോ ccfDNA പോലുള്ള വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്ന് ccfDNA ലഭിക്കും [14,15,16,17]. ഒരു പകർച്ചവ്യാധി ഏജന്റിന്റെ (വിദേശ) ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള വിവരങ്ങളുടെ ഒരു പ്രധാന ഉറവിടം കൂടിയാണ് ccfDNA, ഇത് രക്ത സംസ്കാരങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാത്ത വ്യാപകമായ അണുബാധകളെ ആക്രമണാത്മകമല്ലാത്ത രീതിയിൽ കണ്ടെത്താനും, രോഗബാധിതമായ ടിഷ്യുവിന്റെ ആക്രമണാത്മക ബയോപ്സി ഒഴിവാക്കാനും അനുവദിക്കുന്നു [18]. വൈറൽ, ബാക്ടീരിയൽ രോഗകാരികളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന വിവരങ്ങളുടെ സമ്പന്നമായ ഉറവിടം മനുഷ്യ രക്തത്തിൽ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്നും മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിൽ കാണപ്പെടുന്ന ccfDNA യുടെ ഏകദേശം 1% വിദേശ ഉത്ഭവമാണെന്നും സമീപകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് [19]. ccfDNA വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ജീവിയുടെ രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള സൂക്ഷ്മജീവിയുടെ ജൈവവൈവിധ്യം വിലയിരുത്താൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ പഠനങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, അടുത്ത കാലം വരെ, ഈ ആശയം മനുഷ്യരിൽ മാത്രമായി ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു, ഒരു പരിധിവരെ, മറ്റ് കശേരുക്കളിൽ [20, 21].
ഈ പ്രബന്ധത്തിൽ, 35 ദശലക്ഷം വർഷങ്ങൾക്ക് മുമ്പ് രൂപംകൊണ്ട ഒരു വലിയ പീഠഭൂമിക്ക് മുകളിലുള്ള ദ്വീപുകളുടെ ഒരു കൂട്ടമായ സബ്അന്റാർട്ടിക് കെർഗുലൻ ദ്വീപുകളിൽ സാധാരണയായി കാണപ്പെടുന്ന ഒരു തെക്കൻ ഇനമായ ഔലകോമിയ ആട്രയുടെ ccfDNA വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ LB സാധ്യത ഉപയോഗിക്കുന്നു. അഗ്നിപർവ്വത സ്ഫോടനം. ഒരു ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണ സംവിധാനം ഉപയോഗിച്ച്, കടൽവെള്ളത്തിലെ DNA ശകലങ്ങൾ ചിപ്പികൾ വേഗത്തിൽ എടുത്ത് ഹീമോലിംഫ് കമ്പാർട്ടുമെന്റിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് കാണിക്കുന്നത് മസൽ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA-യിൽ സഹജീവി ബാക്ടീരിയകളും തണുത്ത അഗ്നിപർവ്വത സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ സാധാരണ ബയോമുകളിൽ നിന്നുള്ള DNA ശകലങ്ങളും ഉൾപ്പെടെ അതിന്റേതായതും അല്ലാത്തതുമായ DNA ശകലങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു എന്നാണ്. വ്യത്യസ്ത ഹോസ്റ്റ് ശ്രേണികളുള്ള വൈറസുകളിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ വൈറൽ സീക്വൻസുകളും ഹീമോലിംഫ് ccfDNA-യിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. അസ്ഥി മത്സ്യം, കടൽ അനിമോണുകൾ, ആൽഗകൾ, പ്രാണികൾ തുടങ്ങിയ ബഹുകോശ ജീവികളിൽ നിന്നുള്ള DNA ശകലങ്ങളും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ഉപസംഹാരമായി, സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സമ്പന്നമായ ഒരു ജീനോമിക് ശേഖരം സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് സമുദ്ര അകശേരുക്കളിൽ LB ആശയം വിജയകരമായി പ്രയോഗിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
പോർട്ട്-ഔ-ഫ്രാൻസിലെ (049°21.235 S, 070°13.490 E .) വേലിയേറ്റമില്ലാത്ത പാറക്കെട്ടുകളുള്ള തീരങ്ങളിൽ നിന്നാണ് മുതിർന്നവ (55-70 mm നീളമുള്ള) മൈറ്റിലസ് പ്ലാറ്റെൻസിസ് (M. പ്ലാറ്റെൻസിസ്), ഔലകോമിയ ആട്ര (A. ആട്ര) എന്നിവ ശേഖരിച്ചത്. 2018 ഡിസംബറിൽ കെർഗുലൻ ദ്വീപുകൾ. മറ്റ് മുതിർന്ന നീല മസ്സലുകൾ (മൈറ്റിലസ് spp.) ഒരു വാണിജ്യ വിതരണക്കാരനിൽ നിന്ന് (PEI മസ്സൽ കിംഗ് ഇൻ‌കോർപ്പറേറ്റഡ്, പ്രിൻസ് എഡ്വേർഡ് ഐലൻഡ്, കാനഡ) ലഭിച്ചു, 32‰ കൃത്രിമ ഉപ്പുവെള്ളത്തിന്റെ 10–20 L അടങ്ങിയ താപനില നിയന്ത്രിത (4°C) വായുസഞ്ചാരമുള്ള ടാങ്കിൽ സ്ഥാപിച്ചു. (കൃത്രിമ കടൽ ഉപ്പ് റീഫ് ക്രിസ്റ്റൽ, ഇൻസ്റ്റന്റ് ഓഷ്യൻ, വിർജീനിയ, യുഎസ്എ). ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും, വ്യക്തിഗത ഷെല്ലുകളുടെ നീളവും ഭാരവും അളന്നു.
ഈ പ്രോഗ്രാമിനായുള്ള ഒരു സൗജന്യ ഓപ്പൺ ആക്‌സസ് പ്രോട്ടോക്കോൾ ഓൺലൈനിൽ ലഭ്യമാണ് (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). ചുരുക്കത്തിൽ, [22] വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, അബ്‌ഡക്റ്റർ പേശികളിൽ നിന്ന് എൽബി ഹീമോലിംഫ് ശേഖരിച്ചു. ഹീമോലിംഫിനെ 1200×g താപനിലയിൽ 3 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ശുദ്ധീകരിച്ചു, സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നത് വരെ (-20°C) മരവിപ്പിച്ചു. cfDNA യുടെ ഐസൊലേഷനും ശുദ്ധീകരണത്തിനും, നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, സാമ്പിളുകൾ (1.5-2.0 ml) ന്യൂക്ലിയോസ്നാപ്പ് cfDNA കിറ്റ് (മച്ചേരി-നാഗൽ, ബെത്‌ലെഹെൻ, PA) ഉപയോഗിച്ച് ഉരുക്കി പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു. കൂടുതൽ വിശകലനം വരെ ccfDNA -80°C ൽ സൂക്ഷിച്ചു. ചില പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, QIAamp DNA ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റ് (QIAGEN, ടൊറന്റോ, ഒന്റാറിയോ, കാനഡ) ഉപയോഗിച്ച് ccfDNA വേർതിരിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു. ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിക്കോഗ്രീൻ അസ്സേ ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ച DNA അളക്കൽ നടത്തി. ഒരു ഹൈ സെൻസിറ്റിവിറ്റി ഡിഎൻഎ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച്, എജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ (എജിലന്റ് ടെക്നോളജീസ് ഇൻകോർപ്പറേറ്റഡ്, സാന്താ ക്ലാര, കാലിഫോർണിയ) ഉപയോഗിച്ച് കാപ്പിലറി ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി ഒറ്റപ്പെട്ട സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎയുടെ ഫ്രാഗ്മെന്റ് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ വിശകലനം ചെയ്തു. നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎ സാമ്പിളിന്റെ 1 µl ഉപയോഗിച്ചാണ് പരിശോധന നടത്തിയത്.
ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ഫ്രാഗ്മെന്റുകളുടെ സീക്വൻസിങ്ങിനായി, ജീനോം ക്യൂബെക്ക് (മോൺട്രിയൽ, ക്യൂബെക്ക്, കാനഡ) ഇല്ലുമിന മിസെക് PE75 കിറ്റിന്റെ ഇല്ലുമിന ഡിഎൻഎ മിക്സ് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഷോട്ട്ഗൺ ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കി. ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് അഡാപ്റ്റർ (ബയോഒ) ഉപയോഗിച്ചു. റോ ഡാറ്റ ഫയലുകൾ എൻസിബിഐ സീക്വൻസ് റീഡ് ആർക്കൈവിൽ (SRR8924808, SRR8924809) നിന്ന് ലഭ്യമാണ്. ഫാസ്റ്റ്ക്യുസി [23] ഉപയോഗിച്ച് അടിസ്ഥാന വായനാ നിലവാരം വിലയിരുത്തി. ക്ലിപ്പിംഗ് അഡാപ്റ്ററുകൾക്കും മോശം ഗുണനിലവാരമുള്ള റീഡുകൾക്കും ട്രിമ്മോമാറ്റിക് [24] ഉപയോഗിച്ചു. പൊരുത്തക്കേടുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ ജോടിയാക്കിയ അറ്റങ്ങളുള്ള ഷോട്ട്ഗൺ റീഡുകൾ ഫ്ലാഷ് ലയിപ്പിച്ചു, കുറഞ്ഞത് 20 ബിപി ഓവർലാപ്പ് ഉള്ള ദൈർഘ്യമേറിയ സിംഗിൾ റീഡുകളിലേക്ക് പൊരുത്തക്കേടുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ [25]. ലയിപ്പിച്ച വായനകൾ ഒരു ബിവാൾവ് NCBI ടാക്സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (e മൂല്യം < 1e−3 ഉം 90% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ-കോംപ്ലക്സിറ്റി സീക്വൻസുകളുടെ മാസ്കിംഗ് നടത്തി [26]. ലയിപ്പിച്ച വായനകൾ ഒരു ബിവാൾവ് NCBI ടാക്സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (e മൂല്യം < 1e−3 ഉം 90% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ-കോംപ്ലക്സിറ്റി സീക്വൻസുകളുടെ മാസ്കിംഗ് നടത്തി [26]. ഒബ്ъഎദിനെംന്ыഎ ച്തെനിയ ബ്ыലി അനൊതിരൊവന്ы എസ് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ എസ് ഇസ്പോൾസോവനിഎമ് ബസ്ы ദന്ыഹ് തക്സൊനൊമിഎസ് മോളിസ്‌കോവ് എൻസിബിഐ (സാധാരണ ഇ <1ഇ-3 അല്ലെങ്കിൽ 90% ഗൊമോലോഗി), ഒരു മാസ്‌കിറോവണി പോസ്റ്റുകൾ പൊടിപടലങ്ങൾ [26]. പൂൾ ചെയ്ത റീഡുകൾ NCBI ബൈവാൾവ് ടാക്സോണമി ഡാറ്റാബേസ് (e മൂല്യം < 1e-3 ഉം 90% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ കോംപ്ലക്സിറ്റി സീക്വൻസ് മാസ്കിംഗ് നടത്തി [26].നിങ്ങൾ NCBI进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽ഒബ്ъഎദിനെംന്ыഎ ച്തെനിയ ബ്ыലി അനൊതിരൊവന്ы എസ് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ എസ് ഐസ്പോൾസോവനിഎമ് തക്സൊനൊമിഛെസ്കൊയ് ബസുകൾ ദാരുണമായി. മോളിസ്‌കോവ് എൻസിബിഐ (സാധാരണ ഇ <1ഇ-3 അല്ലെങ്കിൽ 90% ഗൊമോലോഗി), ഒരു മാസ്‌കിറോവണി പോസ്റ്റുകൾ പൊടിപടലങ്ങൾ [26]. NCBI ബൈവാൾവ് ടാക്സോണമിക് ഡാറ്റാബേസ് (e മൂല്യം <1e-3 ഉം 90% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN ഉപയോഗിച്ച് പൂൾ ചെയ്ത റീഡുകൾ വ്യാഖ്യാനിച്ചു, കൂടാതെ DUST ഉപയോഗിച്ച് ലോ കോംപ്ലക്സിറ്റി സീക്വൻസ് മാസ്കിംഗ് നടത്തി [26].റീഡുകളെ രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: ബിവാൾവ് സീക്വൻസുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടത് (ഇവിടെ സെൽഫ്-റീഡുകൾ എന്ന് വിളിക്കുന്നു) ബന്ധമില്ലാത്തതും (നോൺ-സെൽഫ്-റീഡുകൾ). കോണ്ടിഗുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി MEGAHIT ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളെ പ്രത്യേകം കൂട്ടിച്ചേർത്തു [27]. അതേസമയം, അന്യഗ്രഹ മൈക്രോബയോം റീഡുകളുടെ ടാക്സോണമിക് വിതരണം ക്രാക്കൻ2 [28] ഉപയോഗിച്ച് തരംതിരിച്ചു, ഗാലക്സിയിലെ ഒരു ക്രോണ പൈ ചാർട്ട് ഗ്രാഫിക്കായി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു [29, 30]. ഞങ്ങളുടെ പ്രാഥമിക പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് ഒപ്റ്റിമൽ കീമറുകൾ kmers-59 ആണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു. അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (ബൈവാൾവ് NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് അലൈൻമെന്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളെ പിന്നീട് തിരിച്ചറിഞ്ഞു. അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (ബൈവാൾവ് NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് അലൈൻമെന്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളെ പിന്നീട് തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ഗാതെം സോബ്സ്റ്റ്വെന്ыഎ കോണ്ടിഗി ബൈലി ഐഡൻ്റിഫിഷ്യൽ റോവൻ പുതെം സോപോസ്റ്റവ്ലെനിയ എസ് ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ NCBI, പ്രസിദ്ധീകരണ ഇ <1e-10 അല്ലെങ്കിൽ 60%) അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി BLASTN (NCBI ബൈവാൾവ് ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം <1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) യുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തി സെൽഫ്-കണ്ടിഗുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% ഗാതെം ബൈലി ഐഡൻ്റിഫിഷ്യൽ സോബ്‌സ്‌റ്റ്‌വെന്നി കോണ്ടിഗി ഡിലിയ ഒകൊൻചതെല്‌നോയ് അനോതസി പുതെം സോപോസ്‌റ്റ് dannыh NCBI ദ്ലയ ദ്വുസ്ത്വൊര്ചത്യ്ഹ് മൊല്ല്യുസ്കൊവ്, ജ്നഛെനിഎ ഇ <1e-10 അല്ലെങ്കിൽ ഗൊമൊലൊഗിഅ 60%). പിന്നീട് BLASTN (NCBI ബൈവാൾവ് ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം <1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) യുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തി അന്തിമ വ്യാഖ്യാനത്തിനായി സ്വയം-കണ്ടീഗുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. സമാന്തരമായി, നോൺസെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. സമാന്തരമായി, നോൺസെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. പറല്ലെൽനോ ചുജറോഡ്നി ഗ്രുപ്പോവ്യ് കോണ്ടിഗി ബൈലി അനോട്ടിറോവനി സ് പോമോസ്യു ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ (ബാസ ഡാനിഷ് എൻസിബിഐ, <എൻസിബിഐ, 10 ഗൊമോളോജിയ 60%). സമാന്തരമായി, വിദേശ ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകളെ BLASTN (NT NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം <1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群群 പരല്ലെൽനോ കോൺടിഗി, ഒത്നൊസ്യസ്ഛ്യ്മ്യ് അല്ല സൊബ്സ്ത്വെംനൊയ് ഗ്രുപ്പെ, ബ്ыലി അനൊത്തിരൊവന്ы ന് പൊമൊശ്ഛ്ജു ബ്ലെസ്ത്ബ്ന്ы значение e <1e-10 и гомология 60%). സമാന്തരമായി, നോൺ-സെൽഫ് ഗ്രൂപ്പ് കോണ്ടിഗുകൾ BLASTN (nt NCBI ഡാറ്റാബേസ്, e മൂല്യം <1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ചു. nr, RefSeq പ്രോട്ടീൻ NCBI ഡാറ്റാബേസുകൾ (e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് നോൺസെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി. nr, RefSeq പ്രോട്ടീൻ NCBI ഡാറ്റാബേസുകൾ (e മൂല്യം < 1e−10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് നോൺസെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി. BLASTX ടാക്‌ജെ ബൈൽ പ്രൊവെഡൻ ഓഫ് നെസമോസ്‌റ്റോയതെല്ന്ыഹ് കോൺട്ടിഗാഹ് സ് ഐസ്‌പോൾസോവനിം ബാസ് ഡാനിക് ബെൽക്ക എൻആർ-ബിഐസി 10 കൂടാതെ 60%). nr, RefSeq NCBI പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസുകൾ (e മൂല്യം < 1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 倌60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 倌60% BLASTX ടാക്‌ജെ വിപണനങ്ങൾ നെസമോസ്‌റ്റോയറ്റൽ കോൺട്ടിഗാഹ് സ് ഐസ്‌പോൾസോവനിം ബാസ് ഡാനിക് ബെൽക്ക എൻആർ & റെഫ്‌സെക് എൻസിബിഐ (1000 ഗൊമോളോജിയ 60%). nr, RefSeq NCBI പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസുകൾ (e മൂല്യം <1e-10 ഉം 60% ഹോമോളജിയും) ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-സെൽഫ് കോണ്ടിഗുകളിലും BLASTX നടത്തി.നോൺ-സെൽഫ്-കണ്ടിഗുകളുടെ BLASTN, BLASTX പൂളുകൾ അന്തിമകണ്ടിഗുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ഫയൽ കാണുക).
PCR-ന് ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൈമറുകൾ പട്ടിക S1-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. ccfDNA ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളെ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ Taq DNA പോളിമറേസ് (ബയോ ബേസിക് കാനഡ, മാർക്കം, ON) ഉപയോഗിച്ചു. ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രതിപ്രവർത്തന വ്യവസ്ഥകൾ ഉപയോഗിച്ചു: 3 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 95°C-ൽ ഡീനാറ്ററേഷൻ, 1 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 95°C, 1 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് അനീലിംഗ് താപനില സജ്ജമാക്കുക, 1 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 72°C-ൽ നീട്ടൽ, 35 സൈക്കിളുകൾ, ഒടുവിൽ 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 72°C. . 95 V-ൽ SYBRTM സേഫ് DNA ജെൽ സ്റ്റെയിൻ (ഇൻവിട്രോജൻ, ബർലിംഗ്ടൺ, ON, കാനഡ) അടങ്ങിയ അഗറോസ് ജെല്ലുകളിൽ (1.5%) ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വേർതിരിച്ചു.
4°C താപനിലയിൽ 500 മില്ലി ഓക്സിജൻ കലർന്ന കടൽവെള്ളത്തിൽ (32 PSU) 24 മണിക്കൂർ മുത്തുച്ചിപ്പികളെ പൊരുത്തപ്പെടുത്തി. മനുഷ്യ ഗാലക്റ്റിൻ-7 cDNA സീക്വൻസ് (NCBI ആക്‌സഷൻ നമ്പർ L07769) എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ഒരു ഇൻസേർട്ട് അടങ്ങിയ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ 190 μg/μl എന്ന അന്തിമ സാന്ദ്രതയിൽ വിയലിൽ ചേർത്തു. ഡിഎൻഎ ചേർക്കാതെ അതേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത മസ്സലുകളാണ് നിയന്ത്രണം. മൂന്നാമത്തെ കൺട്രോൾ ടാങ്കിൽ മുത്തുച്ചിപ്പികളില്ലാത്ത ഡിഎൻഎ ഉണ്ടായിരുന്നു. കടൽവെള്ളത്തിലെ ഡിഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന്, സൂചിപ്പിച്ച സമയത്ത് ഓരോ ടാങ്കിൽ നിന്നും കടൽവെള്ള സാമ്പിളുകൾ (20 μl; മൂന്ന് ആവർത്തനങ്ങൾ) എടുത്തു. പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ കണ്ടെത്തലിനായി, എൽബി മസ്സലുകൾ സൂചിപ്പിച്ച സമയങ്ങളിൽ വിളവെടുക്കുകയും qPCR, ddPCR എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. കടൽവെള്ളത്തിലെ ഉയർന്ന ഉപ്പിന്റെ അളവ് കാരണം, എല്ലാ PCR പരിശോധനകൾക്കും മുമ്പ് അലിക്വോട്ടുകൾ PCR ഗുണനിലവാരമുള്ള വെള്ളത്തിൽ (1:10) ലയിപ്പിച്ചു.
ബയോറാഡ് ക്യുഎക്സ്200 പ്രോട്ടോക്കോൾ (മിസിസാഗ, ഒന്റാറിയോ, കാനഡ) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡിജിറ്റൽ ഡ്രോപ്ലെറ്റ് പിസിആർ (ddPCR) നടത്തിയത്. ഒപ്റ്റിമൽ താപനില നിർണ്ണയിക്കാൻ താപനില പ്രൊഫൈൽ ഉപയോഗിക്കുക (പട്ടിക S1). ഒരു QX200 ഡ്രോപ്പ് ജനറേറ്റർ (ബയോറാഡ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡ്രോപ്പുകൾ സൃഷ്ടിച്ചത്. ddPCR ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നടത്തി: 5 മിനിറ്റിന് 95°C, 30 സെക്കൻഡിന് 95°C യുടെ 50 സൈക്കിളുകൾ, 1 മിനിറ്റിന് നൽകിയിരിക്കുന്ന അനീലിംഗ് താപനിലയും 30 സെക്കൻഡിന് 72°C, 5 മിനിറ്റിന് 4°C, 5 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 90°C. ഒരു QX200 ഡ്രോപ്പ് റീഡർ (ബയോറാഡ്) ഉപയോഗിച്ച് ഡ്രോപ്പുകളുടെ എണ്ണവും പോസിറ്റീവ് പ്രതികരണങ്ങളും (പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണം/µl) അളന്നു. 10,000 ഡ്രോപ്ലെറ്റുകളിൽ താഴെയുള്ള സാമ്പിളുകൾ നിരസിച്ചു. ddPCR പ്രവർത്തിപ്പിക്കുമ്പോഴെല്ലാം പാറ്റേൺ നിയന്ത്രണം നടത്തിയില്ല.
റോട്ടർ-ജീൻ® 3000 (കോർബറ്റ് റിസർച്ച്, സിഡ്‌നി, ഓസ്‌ട്രേലിയ), LGALS7 നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് qPCR നടത്തിയത്. ക്വാണ്ടിഫാസ്റ്റ് SYBR ഗ്രീൻ PCR കിറ്റ് (QIAGEN) ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-കളും 20 µl-ൽ നടത്തി. 95°C-ൽ 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷനോടെ qPCR ആരംഭിച്ചു, തുടർന്ന് 95°C-ൽ 10 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് 40 സൈക്കിളുകളും 60 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് 60°C-ലും ഒരു ഡാറ്റ ശേഖരണവും നടത്തി. 5 സെക്കൻഡിൽ 95°C, 60 സെക്കൻഡിൽ 65°C, qPCR-ന്റെ അവസാനം 97°C എന്നിവയിൽ തുടർച്ചയായ അളവുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉരുകൽ വക്രങ്ങൾ സൃഷ്ടിച്ചു. നിയന്ത്രണ സാമ്പിളുകൾ ഒഴികെ, ഓരോ qPCR-ഉം മൂന്ന് തവണയാണ് നടത്തിയത്.
മസ്സലുകൾ ഉയർന്ന ഫിൽട്രേഷൻ നിരക്കിന് പേരുകേട്ടതിനാൽ, കടൽവെള്ളത്തിലുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത് നിലനിർത്താൻ അവയ്ക്ക് കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ആദ്യം അന്വേഷിച്ചു. ഈ ശകലങ്ങൾ അവയുടെ സെമി-ഓപ്പൺ ലിംഫറ്റിക് സിസ്റ്റത്തിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുണ്ടോ എന്നതിലും ഞങ്ങൾക്ക് താൽപ്പര്യമുണ്ടായിരുന്നു. നീല മസ്സൽ ടാങ്കുകളിൽ ചേർക്കുന്ന ലയിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ വിധി കണ്ടെത്തുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ പരീക്ഷണാത്മകമായി ഈ പ്രശ്നം പരിഹരിച്ചു. ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ട്രാക്ക് ചെയ്യുന്നത് സുഗമമാക്കുന്നതിന്, മനുഷ്യ ഗാലക്റ്റിൻ-7 ജീൻ അടങ്ങിയ വിദേശ (സ്വയം അല്ല) പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. കടൽവെള്ളത്തിലും മസ്സലുകളിലും പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ddPCR കണ്ടെത്തുന്നു. മസ്സലുകളുടെ അഭാവത്തിൽ (7 ദിവസം വരെ) സമുദ്രജലത്തിലെ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ അളവ് താരതമ്യേന സ്ഥിരമായി തുടർന്നാൽ, മസ്സലുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ഈ നില 8 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ പൂർണ്ണമായും അപ്രത്യക്ഷമാകുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 1a,b). ഇൻട്രാവാൽവുലാർ ദ്രാവകത്തിലും ഹീമോലിമ്പിലും 15 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ബാഹ്യ ഡിഎൻഎയുടെ ശകലങ്ങൾ എളുപ്പത്തിൽ കണ്ടെത്താനാകും (ചിത്രം 1c). എക്സ്പോഷർ ചെയ്തതിന് ശേഷവും 4 മണിക്കൂർ വരെ ഈ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്താനാകും. ഡിഎൻഎ കഷണങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഈ ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനം ബാക്ടീരിയകളുടെയും ആൽഗകളുടെയും ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതാണ് [31]. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ചിപ്പികൾക്ക് അവയുടെ ദ്രാവക അറകളിൽ വിദേശ ഡിഎൻഎ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യാനും ശേഖരിക്കാനും കഴിയും എന്നാണ്.
മസ്സലുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ (A) അഭാവത്തിലോ (B) കടൽവെള്ളത്തിൽ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയുടെ ആപേക്ഷിക സാന്ദ്രത, ddPCR ഉപയോഗിച്ച് അളക്കുന്നു. A-യിൽ, ഫലങ്ങൾ ശതമാനങ്ങളായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, ബോക്സുകളുടെ അതിരുകൾ 75-ാമത്തെയും 25-ാമത്തെയും ശതമാനങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഘടിപ്പിച്ച ലോഗരിഥമിക് വക്രം ചുവപ്പിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ചാരനിറത്തിൽ ഷേഡുള്ള പ്രദേശം 95% കോൺഫിഡൻസ് ഇന്റർവെല്ലിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. B-യിൽ, ചുവന്ന രേഖ സാന്ദ്രതയുടെ ശരാശരിയെയും നീല രേഖ സാന്ദ്രതയുടെ 95% കോൺഫിഡൻസ് ഇന്റർവെല്ലിനെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. C പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ചേർത്തതിനുശേഷം വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങളിൽ മസ്സലുകളുടെ ഹീമോലിംഫിലും വാൽവുലാർ ദ്രാവകത്തിലും പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയുടെ ശേഖരണം. കണ്ടെത്തിയ കേവല പകർപ്പുകൾ/mL (±SE) ആയി ഫലങ്ങൾ അവതരിപ്പിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി, പരിമിതമായ നരവംശ സ്വാധീനമുള്ള ദ്വീപുകളുടെ ഒരു വിദൂര കൂട്ടമായ കെർഗുലൻ ദ്വീപുകളിലെ മസൽ കിടക്കകളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച മസ്സലുകളിലെ ccfDNA യുടെ ഉത്ഭവത്തെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. ഈ ആവശ്യത്തിനായി, മസ്സൽ ഹീമോലിമ്പുകളിൽ നിന്നുള്ള cccDNA യെ മനുഷ്യ cccDNA ശുദ്ധീകരിക്കാൻ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു [32, 33]. മസ്സലുകളിലെ ശരാശരി ഹീമോലിമ്പ് ccfDNA സാന്ദ്രത ml ഹീമോലിമ്പ് ശ്രേണിയിൽ കുറഞ്ഞ മൈക്രോഗ്രാമുകളിലാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (പട്ടിക S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ കാണുക). ആരോഗ്യമുള്ള ആളുകളേക്കാൾ ഈ സാന്ദ്രത ശ്രേണി വളരെ വലുതാണ് (മില്ലിലിറ്ററിന് കുറഞ്ഞ നാനോഗ്രാമുകൾ), എന്നാൽ അപൂർവ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, കാൻസർ രോഗികളിൽ, ccfDNA യുടെ അളവ് മില്ലിലിറ്ററിന് നിരവധി മൈക്രോഗ്രാമുകളിൽ എത്താം [34, 35]. ഹീമോലിമ്പ് ccfDNA യുടെ വലുപ്പ വിതരണത്തിന്റെ വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് ഈ ശകലങ്ങൾ 1000 bp മുതൽ 1000 bp വരെ വലുപ്പത്തിൽ വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നാണ്. 5000 bp വരെ (ചിത്രം 2). സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎ ഉൾപ്പെടെയുള്ള കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള ഡിഎൻഎ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ വേഗത്തിൽ വേർതിരിച്ചെടുക്കാനും ശുദ്ധീകരിക്കാനും ഫോറൻസിക് സയൻസിൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു രീതിയായ സിലിക്ക അധിഷ്ഠിത QIAamp ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ചും സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു [36].
മസ്സൽ ഹീമോലിമ്പിന്റെ പ്രതിനിധി ccfDNA ഇലക്ട്രോഫോറെഗ്രാം. ന്യൂക്ലിയോസ്നാപ്പ് പ്ലാസ്മ കിറ്റ് (മുകളിൽ), QIAamp DNA ഇൻവെസ്റ്റിഗേറ്റർ കിറ്റ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തത്. ബി മസ്സലുകളിലെ ഹീമോലിമ്പ് ccfDNA സാന്ദ്രതയുടെ (±SE) വിതരണം കാണിക്കുന്ന വയലിൻ പ്ലോട്ട്. കറുപ്പും ചുവപ്പും വരകൾ യഥാക്രമം മീഡിയനെയും ഒന്നും മൂന്നും ക്വാർട്ടൈലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
മനുഷ്യരിലും പ്രൈമേറ്റുകളിലും ഏകദേശം 1% ccfDNA യിൽ ഒരു വിദേശ സ്രോതസ്സുണ്ട് [21, 37]. ബിവാൾവുകളുടെ സെമി-ഓപ്പൺ രക്തചംക്രമണ സംവിധാനം, സൂക്ഷ്മജീവികളാൽ സമ്പന്നമായ കടൽജലം, മസ്സൽ ccfDNA യുടെ വലുപ്പ വിതരണം എന്നിവ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, മസ്സൽ ഹീമോലിമ്പ് ccfDNA യിൽ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ സമ്പന്നവും വൈവിധ്യപൂർണ്ണവുമായ ഒരു കൂട്ടം അടങ്ങിയിരിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിച്ചു. ഈ സിദ്ധാന്തം പരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി, കെർഗുലൻ ദ്വീപുകളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച ഔലകോമിയ ആട്രാ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ ഹീമോലിമ്പ് ccfDNA ക്രമീകരിച്ചു, ഇത് 10 ദശലക്ഷത്തിലധികം റീഡുകൾ നൽകി, അതിൽ 97.6% ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം പാസായി. തുടർന്ന് BLASTN, NCBI ബിവാൾവ് ഡാറ്റാബേസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സെൽഫ്, നോൺ-സെൽഫ് സ്രോതസ്സുകൾ അനുസരിച്ച് റീഡിംഗുകൾ തരംതിരിച്ചു (ചിത്രം S1, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ).
മനുഷ്യരിൽ, ന്യൂക്ലിയർ ഡിഎൻഎയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിഎൻ‌എയും രക്തപ്രവാഹത്തിലേക്ക് വിടാൻ കഴിയും [38]. എന്നിരുന്നാലും, ഈ പഠനത്തിൽ, എ. ആട്ര ജീനോം ക്രമീകരിച്ചിട്ടില്ല അല്ലെങ്കിൽ വിവരിച്ചിട്ടില്ലാത്തതിനാൽ, മസ്സലുകളുടെ ന്യൂക്ലിയർ ജീനോമിക് ഡി‌എൻ‌എയെക്കുറിച്ച് വിശദമായി വിവരിക്കാൻ കഴിഞ്ഞില്ല. എന്നിരുന്നാലും, ബിവാൾവ് ലൈബ്രറി ഉപയോഗിച്ച് നമ്മുടെ സ്വന്തം ഉത്ഭവത്തിന്റെ നിരവധി സിസിഎഫ്‌ഡി‌എൻ‌എ ശകലങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു (ചിത്രം എസ് 2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). ക്രമീകരിച്ച ആ എ. ആട്ര ജീനുകളുടെ നേരിട്ടുള്ള പി‌സി‌ആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വഴി നമ്മുടെ സ്വന്തം ഉത്ഭവത്തിന്റെ ഡി‌എൻ‌എ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യവും ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 3). അതുപോലെ, എ. ആട്രയുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനോം പൊതു ഡാറ്റാബേസുകളിൽ ലഭ്യമാണെന്നതിനാൽ, എ. ആട്രയുടെ ഹീമോലിംഫിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സിസിഎഫ്‌ഡി‌എൻ‌എ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യത്തിന് തെളിവുകൾ കണ്ടെത്താൻ കഴിയും. പി‌സി‌ആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വഴി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡി‌എൻ‌എ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 3).
PCR വഴി വർദ്ധിപ്പിച്ച A. atra (ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ - സ്റ്റോക്ക് നമ്പർ: SRX5705969), M. പ്ലാറ്റെൻസിസ് (നീല ഡോട്ടുകൾ - സ്റ്റോക്ക് നമ്പർ: SRX5705968) എന്നിവയുടെ ഹീമോലിമ്പിൽ വിവിധ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു. ബ്രെട്ടൺ തുടങ്ങിയവർ, 2011 ൽ നിന്ന് സ്വീകരിച്ച ചിത്രം B. A. atra യിൽ നിന്നുള്ള ഹീമോലിമ്പ് സൂപ്പർനേറ്റന്റിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ FTA പേപ്പറിൽ സൂക്ഷിച്ചിരിക്കുന്നു. PCR മിശ്രിതം അടങ്ങിയ PCR ട്യൂബിലേക്ക് നേരിട്ട് ചേർക്കാൻ 3 mm പഞ്ച് ഉപയോഗിക്കുക.
സമുദ്രജലത്തിലെ സമൃദ്ധമായ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ അളവ് കണക്കിലെടുത്ത്, ഹീമോലിമ്പിലെ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ ഡിഎൻഎ ശ്രേണികളുടെ സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിലാണ് ഞങ്ങൾ ആദ്യം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചത്. ഇതിനായി, ഞങ്ങൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത തന്ത്രങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആദ്യ തന്ത്രം, BLAST-ഉം മറ്റ് ഉപകരണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന കൃത്യതയോടെ സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ ശ്രേണികളെ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുന്ന അൽഗോരിതം അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ശ്രേണി വർഗ്ഗീകരണ പരിപാടിയായ ക്രാക്കൻ2 ഉപയോഗിച്ചു [28]. 6719-ലധികം റീഡുകൾ ബാക്ടീരിയ ഉത്ഭവമാണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു, അതേസമയം 124 ഉം 64 ഉം യഥാക്രമം ആർക്കിയയിൽ നിന്നും വൈറസുകളിൽ നിന്നുമുള്ളവയായിരുന്നു (ചിത്രം 4). ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ ബാക്ടീരിയൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഫിർമിക്യൂട്ട്സ് (46%), പ്രോട്ടിയോബാക്ടീരിയ (27%), ബാക്ടീരിയോയിഡെറ്റുകൾ (17%) (ചിത്രം 4a) എന്നിവയായിരുന്നു. ഈ വിതരണം മറൈൻ ബ്ലൂ മസൽ മൈക്രോബയോമിന്റെ മുൻ പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു [39, 40]. പ്രോട്ടിയോബാക്ടീരിയയുടെ പ്രധാന വിഭാഗം (44%) ആയിരുന്നു, ഇതിൽ നിരവധി വൈബ്രിയോണലുകൾ (ചിത്രം 4b) ഉൾപ്പെടുന്നു. എ. ആട്ര ഹീമോലിംഫിന്റെ ccfDNA യിൽ വിബ്രിയോ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം ddPCR രീതി സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 4c) [41]. ccfDNA യുടെ ബാക്ടീരിയ ഉത്ഭവത്തെക്കുറിച്ച് കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, ഒരു അധിക സമീപനം സ്വീകരിച്ചു (ചിത്രം S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പ് ചെയ്ത റീഡുകൾ പെയർ-എൻഡ് റീഡുകളായി കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും BLASTN ഉം 1e−3 ന്റെ e മൂല്യവും >90% ഹോമോളജിയുള്ള ഒരു കട്ട്ഓഫും ഉപയോഗിച്ച് സെൽഫ് (ബൈവാൾവ്സ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-സെൽഫ് ഒറിജിൻ ആയി തരംതിരിക്കുകയും ചെയ്തു. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പ് ചെയ്ത റീഡുകൾ പെയർ-എൻഡ് റീഡുകളായി കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും BLASTN ഉം 1e−3 ന്റെ e മൂല്യവും >90% ഹോമോളജിയുള്ള ഒരു കട്ട്ഓഫും ഉപയോഗിച്ച് സെൽഫ് (ബൈവാൾവ്സ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-സെൽഫ് ഒറിജിൻ ആയി തരംതിരിക്കുകയും ചെയ്തു. എടോം സ്ലുച്ചാ പെരെക്ര്യ്വയുത്സ്യ ഛതെനിയ ബ്ыലി സോബ്രാന്ы കാക് ച്തെനിയ എസ് പര്നിമി കൊന്സാമി ആൻഡ് ബൈലി ക്ലാസികൾ സൊബ്സ്ത്വെംന്ыഎ (ദ്വുസ്ത്വൊര്ഛത്ыഎ മൊല്ല്യുസ്കി) അല്ലെങ്കിൽ ചുഷി പോ പ്രൊയ്ഷൊജ്ദെനിയു എസ് ഇസ്പോൾസോവാനിയം ബ്ലാസ്റ്റ്എൻ-3 എച്. സെ ഗോമോളോജിയ 90%. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പിംഗ് റീഡുകൾ ജോഡി-എൻഡ് റീഡുകളായി ശേഖരിച്ചു, കൂടാതെ 1e-3 ന്റെ BLASTN, e മൂല്യം, >90% ഹോമോളജി ഉള്ള കട്ട്ഓഫ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് നേറ്റീവ് (ബൈവാൾവ്) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-ഒറിജിനൽ എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിച്ചു.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。കൂടാതെ和> 90% 同源性 的 分类 自身 В эതൊമ് സ്ലുഛെ പെരെക്ര്ыവയുസ്ഛ്യെസ്യ ബ്ыല്യ് സോബ്രാന്ы കാക് ച്തെനിയ എസ് പര്നിമി കൊന്സാമി ആൻഡ് ക്ലഷ്യ്ഛെസ്ക്യ്ഹ് സൊബ്സ്ത്വെംന്ыഎ (ദ്വുസ്ത്വൊര്ഛത്യെ മൊല്ല്യുസ്കി) അല്ലെങ്കിൽ നെസൊബ്സ്ത്വെംന്ыഎ പോ പ്രൊയ്ശൊദ്യ്നിയു എസ് ഇസ്പോൾസോവനിം ബിഎസ്ത്-3 порога гомологии> 90%. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓവർലാപ്പിംഗ് റീഡുകൾ ജോടിയാക്കിയ-അവസാന റീഡുകളായി ശേഖരിക്കുകയും e BLASTN, 1e-3 മൂല്യങ്ങളും ഒരു ഹോമോളജി ത്രെഷോൾഡ് > 90% ഉം ഉപയോഗിച്ച് സ്വന്തം (ബൈവാൾവ്സ്) അല്ലെങ്കിൽ ഒറിജിനൽ അല്ലാത്തവ എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.എ. ആട്രാ ജീനോം ഇതുവരെ ക്രമീകരിച്ചിട്ടില്ലാത്തതിനാൽ, ഞങ്ങൾ MEGAHIT നെക്സ്റ്റ് ജനറേഷൻ സീക്വൻസിംഗ് (NGS) അസംബ്ലറിന്റെ ഡി നോവോ അസംബ്ലി തന്ത്രം ഉപയോഗിച്ചു. ആകെ 147,188 കോണ്ടിഗുകൾ ഉത്ഭവത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള (ബൈവാൾവുകൾ) ആയി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്. BLASTN, BLASTX എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 1e-10 ന്റെ ഇ-മൂല്യങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഈ കോണ്ടിഗുകൾ പൊട്ടിത്തെറിച്ചു. എ. ആട്രാ ccfDNA യിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന 482 നോൺ-ബൈവാൾവ് ശകലങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ ഈ തന്ത്രം ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളിൽ പകുതിയിലധികവും (57%) ബാക്ടീരിയകളിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത്, പ്രധാനമായും സൾഫോട്രോഫിക് സിംബിയന്റുകൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഗിൽ സിംബിയന്റുകളിൽ നിന്നും, ഗിൽ സിംബിയന്റുകളായ സോലെമ്യ വെലം (ചിത്രം 5).
തരം തലത്തിൽ ആപേക്ഷിക സമൃദ്ധി. ബി രണ്ട് പ്രധാന ഫൈലകളുടെ (ഫിർമിക്യൂട്ട്സ്, പ്രോട്ടിയോബാക്ടീരിയ) സൂക്ഷ്മജീവി വൈവിധ്യം. ഡിഡിപിസിആറിന്റെ പ്രതിനിധി ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സി വിബ്രിയോ സ്പീഷീസ് എ. മൂന്ന് ആട്രാ ഹീമോലിംഫുകളിലെ 16 എസ് ആർആർഎൻഎ ജീനിന്റെ (നീല) ശകലങ്ങൾ.
ശേഖരിച്ച 482 കോണ്ടിഗുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. മെറ്റാജെനോമിക് കോണ്ടിഗ് അനോട്ടേഷനുകളുടെ (പ്രോകാരിയോട്ടുകളും യൂക്കാരിയോട്ടുകളും) ടാക്സോണമിക് വിതരണത്തിന്റെ പൊതുവായ പ്രൊഫൈൽ. BLASTN ഉം BLASTX ഉം തിരിച്ചറിഞ്ഞ ബാക്ടീരിയൽ DNA ശകലങ്ങളുടെ വിശദമായ വിതരണം.
ക്രാക്കൻ2 വിശകലനത്തിൽ മസൽ ccfDNA യിൽ ആർക്കിയൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി, അതിൽ യൂറിയാർക്കിയോട്ട (65%), ക്രെനാർക്കിയോട്ട (24%), തൗർമർച്ചോട്ട (11%) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 6a). കാലിഫോർണിയൻ മസൽസിന്റെ സൂക്ഷ്മജീവി സമൂഹത്തിൽ മുമ്പ് കണ്ടെത്തിയിരുന്ന യൂറിയാർക്കിയോട്ട, ക്രെനാർക്കിയോട്ട എന്നിവയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം അതിശയിക്കേണ്ടതില്ല [42]. യൂറിയാർക്കിയോട്ട പലപ്പോഴും അങ്ങേയറ്റത്തെ അവസ്ഥകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെങ്കിലും, സമുദ്ര ക്രയോജനിക് പരിതസ്ഥിതിയിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ പ്രോകാരിയോട്ടുകളിൽ യൂറിയാർക്കിയോട്ടയും ക്രെനാർക്കിയോട്ടയും ഉൾപ്പെടുന്നുവെന്ന് ഇപ്പോൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് [43, 44]. കെർഗുലൻ പീഠഭൂമിയിലെ അടിഭാഗത്തെ ചോർച്ചകളിൽ നിന്നുള്ള വ്യാപകമായ മീഥെയ്ൻ ചോർച്ചയും കെർഗുലൻ ദ്വീപുകളുടെ തീരത്ത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട സൂക്ഷ്മജീവി മീഥെയ്ൻ ഉൽപാദനവും [46] ഉണ്ടെന്ന സമീപകാല റിപ്പോർട്ടുകൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, മസൽസിലെ മെത്തനോജെനിക് സൂക്ഷ്മാണുക്കളുടെ സാന്നിധ്യം അതിശയിപ്പിക്കുന്നതല്ല.
പിന്നീട് ഞങ്ങളുടെ ശ്രദ്ധ ഡിഎൻഎ വൈറസുകളിൽ നിന്നുള്ള വായനകളിലേക്ക് തിരിഞ്ഞു. ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, മസ്സലുകളുടെ വൈറസ് ഉള്ളടക്കത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ആദ്യത്തെ ഓഫ്-ടാർഗെറ്റ് പഠനമാണിത്. പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, ബാക്ടീരിയോഫേജുകളുടെ (കോഡോവൈറലുകൾ) ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 6b). എന്നിരുന്നാലും, ഏറ്റവും സാധാരണമായ വൈറൽ ഡിഎൻഎ ന്യൂക്ലിയോസൈറ്റോവൈറസുകളുടെ ഒരു ഫൈലത്തിൽ നിന്നാണ് വരുന്നത്, ഇത് ന്യൂക്ലിയർ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ലാർജ് ഡിഎൻഎ വൈറസ് (NCLDV) എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഇതിന് ഏതൊരു വൈറസിന്റെയും ഏറ്റവും വലിയ ജീനോം ഉണ്ട്. ഈ ഫൈലത്തിനുള്ളിൽ, മിക്ക ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളും മിമിമിഡോവൈറിഡേ (58%), പോക്സ്വിരിഡേ (21%) എന്നീ കുടുംബങ്ങളിൽ പെടുന്നു, അവയുടെ സ്വാഭാവിക ഹോസ്റ്റുകളിൽ കശേരുക്കളും ആർത്രോപോഡുകളും ഉൾപ്പെടുന്നു, അതേസമയം ഈ ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളുടെ ഒരു ചെറിയ അനുപാതം അറിയപ്പെടുന്ന വൈറോളജിക്കൽ ആൽഗകളുടേതാണ്. മറൈൻ യൂക്കറിയോട്ടിക് ആൽഗകളെ ബാധിക്കുന്നു. അറിയപ്പെടുന്ന ഏതൊരു വൈറൽ ജനുസ്സിലെയും ഏറ്റവും വലിയ ജീനോം വലുപ്പമുള്ള ഭീമൻ വൈറസായ പണ്ടോറ വൈറസിൽ നിന്നും സീക്വൻസുകൾ ലഭിച്ചു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഹീമോലിംഫ് സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎ സീക്വൻസിംഗ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന വൈറസ് ബാധിച്ചതായി അറിയപ്പെടുന്ന ഹോസ്റ്റുകളുടെ ശ്രേണി താരതമ്യേന വലുതായിരുന്നു (ചിത്രം എസ് 3, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). ഇതിൽ ബാക്കുലോവൈറിഡേ, ഇറിഡോവൈറിഡേ തുടങ്ങിയ പ്രാണികളെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകളും അമീബ, ആൽഗ, കശേരുക്കൾ എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്ന വൈറസുകളും ഉൾപ്പെടുന്നു. പിത്തോവൈറസ് സൈബറിക്കം ജീനോമുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ശ്രേണികളും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. സൈബീരിയയിലെ 30,000 വർഷം പഴക്കമുള്ള പെർമാഫ്രോസ്റ്റിൽ നിന്നാണ് പിറ്റോവൈറസുകൾ ("സോംബി വൈറസുകൾ" എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) ആദ്യമായി വേർതിരിച്ചെടുത്തത് [47]. അതിനാൽ, ഈ വൈറസുകളുടെ എല്ലാ ആധുനിക സ്പീഷീസുകളും വംശനാശം സംഭവിച്ചിട്ടില്ലെന്നും [48] വിദൂര സബാർട്ടിക് സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ ഈ വൈറസുകൾ ഉണ്ടാകാമെന്നും കാണിക്കുന്ന മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
ഒടുവിൽ, മറ്റ് ബഹുകോശ ജീവികളിൽ നിന്നുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്താൻ കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. nt, nr, RefSeq ലൈബ്രറികൾ (ജീനോമിക്, പ്രോട്ടീൻ) ഉപയോഗിച്ച് BLASTN, BLASTX എന്നിവ മൊത്തം 482 വിദേശ കോണ്ടിഗുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ബഹുകോശ ജീവികളിലെ ccfDNA യുടെ വിദേശ ശകലങ്ങളിൽ, അസ്ഥി അസ്ഥികളുടെ ഡിഎൻഎ പ്രബലമാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 5). പ്രാണികളിൽ നിന്നും മറ്റ് ജീവികളിൽ നിന്നുമുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളും കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്. ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ ഒരു വലിയ ഭാഗം തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടില്ല, ഒരുപക്ഷേ കരയിലെ ജീവികളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ജീനോമിക് ഡാറ്റാബേസുകളിൽ ധാരാളം സമുദ്ര ജീവിവർഗങ്ങളുടെ പ്രാതിനിധ്യം കുറവായതിനാലാകാം [49].
ഈ പ്രബന്ധത്തിൽ, ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ഷോട്ട് സീക്വൻസിംഗ് സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ഘടനയെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുമെന്ന് വാദിച്ചുകൊണ്ട്, എൽബി ആശയം ചിപ്പികൾക്ക് ബാധകമാക്കുന്നു. പ്രത്യേകിച്ചും, 1) മസൽ ഹീമോലിമ്പിൽ താരതമ്യേന വലിയ (~1-5 kb) രക്തചംക്രമണമുള്ള ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ താരതമ്യേന ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (മൈക്രോഗ്രാം അളവ്) അടങ്ങിയിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി; 2) ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ സ്വതന്ത്രവും സ്വതന്ത്രമല്ലാത്തതുമാണ് 3) ഈ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ, ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയൽ, വൈറൽ ഡിഎൻഎ, മറ്റ് ബഹുകോശ ജീവികളുടെ ഡിഎൻഎ എന്നിവയും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി; 4) ഹീമോലിമ്പിൽ ഈ വിദേശ ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ ശേഖരണം വേഗത്തിൽ സംഭവിക്കുകയും മസ്സലുകളുടെ ആന്തരിക ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന് സംഭാവന നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. ഉപസംഹാരമായി, ഇതുവരെ പ്രധാനമായും ബയോമെഡിസിൻ മേഖലയിൽ പ്രയോഗിച്ചിട്ടുള്ള എൽബി എന്ന ആശയം, സെന്റിനൽ സ്പീഷീസുകളും അവയുടെ പരിസ്ഥിതിയും തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന സമ്പന്നവും എന്നാൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാത്തതുമായ ഒരു അറിവിന്റെ ഉറവിടത്തെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
പ്രൈമേറ്റുകൾക്ക് പുറമേ, എലികൾ, നായ്ക്കൾ, പൂച്ചകൾ, കുതിരകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള സസ്തനികളിലും ccfDNA ഒറ്റപ്പെടൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് [50, 51, 52]. എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, തുറന്ന രക്തചംക്രമണ സംവിധാനമുള്ള സമുദ്ര ജീവികളിൽ ccfDNA കണ്ടെത്തലും ക്രമവും ആദ്യമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തത് ഞങ്ങളുടെ പഠനമാണ്. മസ്സലുകളുടെ ഈ ശരീരഘടന സവിശേഷതയും ഫിൽട്ടറിംഗ് കഴിവും, കുറഞ്ഞത് ഭാഗികമായെങ്കിലും, മറ്റ് ജീവിവർഗങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള DNA ശകലങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്ത വലുപ്പ സവിശേഷതകൾ വിശദീകരിക്കാം. മനുഷ്യരിൽ, രക്തത്തിൽ പ്രചരിക്കുന്ന മിക്ക DNA ശകലങ്ങളും 150 മുതൽ 200 bp വരെ വലുപ്പമുള്ള ചെറിയ ശകലങ്ങളാണ്. പരമാവധി പീക്ക് 167 bp ആണ് [34, 53]. DNA ശകലങ്ങളുടെ ചെറുതും എന്നാൽ പ്രധാനപ്പെട്ടതുമായ ഒരു ഭാഗം 300 നും 500 bp നും ഇടയിലാണ്, ഏകദേശം 5% 900 bp യിൽ കൂടുതൽ നീളമുള്ളതാണ് [54]. ഈ വലുപ്പ വിതരണത്തിന് കാരണം, പ്ലാസ്മയിലെ ccfDNA യുടെ പ്രധാന ഉറവിടം കോശ മരണത്തിന്റെ ഫലമായാണ് സംഭവിക്കുന്നത് എന്നതാണ്, ഒന്നുകിൽ കോശ മരണം മൂലമോ, ആരോഗ്യമുള്ള വ്യക്തികളിലെ രക്തചംക്രമണത്തിലുള്ള ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് കോശങ്ങളുടെ നെക്രോസിസ് മൂലമോ അല്ലെങ്കിൽ കാൻസർ രോഗികളിൽ ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ അപ്പോപ്റ്റോസിസ് മൂലമോ (ctDNA എന്നറിയപ്പെടുന്നു) മൂലമോ ആണ്. മസ്സലുകളിൽ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യുടെ വലുപ്പ വിതരണം 1000 മുതൽ 5000 bp വരെയാണ്, ഇത് മസ്സൽ ccfDNA യ്ക്ക് വ്യത്യസ്തമായ ഉത്ഭവമുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മസ്സലുകൾക്ക് സെമി-ഓപ്പൺ വാസ്കുലർ സിസ്റ്റം ഉള്ളതിനാലും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലുള്ള മൈക്രോബയൽ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയ സമുദ്ര ജല പരിതസ്ഥിതികളിൽ ജീവിക്കുന്നതിനാലും ഇത് ഒരു ലോജിക്കൽ സിദ്ധാന്തമാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, ബാഹ്യ ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് മസ്സലുകൾ കടൽവെള്ളത്തിൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ശേഖരിക്കുന്നു എന്നാണ്, കുറഞ്ഞത് കുറച്ച് മണിക്കൂറുകൾക്ക് ശേഷം അവ കോശ സ്ഖലനം കഴിഞ്ഞ്/അല്ലെങ്കിൽ പുറത്തുവിടുകയും/അല്ലെങ്കിൽ വിവിധ ഓർഗനൈസേഷനുകളിൽ സൂക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തതിന് ശേഷം അവ വിഘടിക്കുന്നു. കോശങ്ങളുടെ (പ്രോകാരിയോട്ടിക്, യൂക്കറിയോട്ടിക്) അപൂർവത കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ഇൻട്രാവാൽവുലാർ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകളുടെ ഉപയോഗം സ്വയം സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നും വിദേശ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുമുള്ള ccfDNA യുടെ അളവ് കുറയ്ക്കും. ബിവാൾവ് സഹജമായ പ്രതിരോധശേഷിയുടെ പ്രാധാന്യവും രക്തചംക്രമണ ഫാഗോസൈറ്റുകളുടെ വലിയ എണ്ണവും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, സൂക്ഷ്മാണുക്കളും/അല്ലെങ്കിൽ കോശ അവശിഷ്ടങ്ങളും കഴിക്കുമ്പോൾ വിദേശ ഡിഎൻഎ ശേഖരിക്കുന്ന രക്തചംക്രമണ ഫാഗോസൈറ്റുകളിൽ വിദേശ ccfDNA പോലും സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കൂടുതൽ അനുമാനിച്ചു. ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ബിവാൾവ് ഹീമോലിംഫ് ccfDNA തന്മാത്രാ വിവരങ്ങളുടെ ഒരു സവിശേഷ ശേഖരമാണെന്നും ഒരു സെന്റിനൽ സ്പീഷീസ് എന്ന നിലയിൽ അവയുടെ പദവി ശക്തിപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
ബാക്ടീരിയയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഹീമോലിംഫ് ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ ക്രമപ്പെടുത്തലും വിശകലനവും ആതിഥേയ ബാക്ടീരിയ സസ്യജാലങ്ങളെയും ചുറ്റുമുള്ള സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ബാക്ടീരിയകളെയും കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പരമ്പരാഗത 16S rRNA തിരിച്ചറിയൽ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നെങ്കിൽ നഷ്ടപ്പെടുമായിരുന്ന കൊമെൻസൽ ബാക്ടീരിയ A. atra gill ന്റെ ക്രമങ്ങൾ ഷോട്ട് സീക്വൻസിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്, ഭാഗികമായി ഒരു റഫറൻസ് ലൈബ്രറി ബയസ് കാരണം. വാസ്തവത്തിൽ, കെർഗുലനിലെ അതേ മസൽ പാളിയിലെ M. പ്ലാറ്റെൻസിസിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച LB ഡാറ്റയുടെ ഞങ്ങളുടെ ഉപയോഗം, ഗിൽ-അനുബന്ധ ബാക്ടീരിയ സിംബിയന്റുകളുടെ ഘടന രണ്ട് മസൽ സ്പീഷീസുകൾക്കും ഒരുപോലെയാണെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം. S4, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). ജനിതകമായി വ്യത്യസ്തമായ രണ്ട് മസൽസിന്റെ ഈ സമാനത കെർഗുലന്റെ തണുത്ത, സൾഫറസ്, അഗ്നിപർവ്വത നിക്ഷേപങ്ങളിലെ ബാക്ടീരിയ സമൂഹങ്ങളുടെ ഘടനയെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം [55, 56, 57, 58]. പോർട്ട്-ഔ-ഫ്രാൻസ് തീരം പോലുള്ള ബയോടർബേറ്റഡ് തീരപ്രദേശങ്ങളിൽ നിന്ന് [59] മസ്സലുകൾ വിളവെടുക്കുമ്പോൾ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള സൾഫർ കുറയ്ക്കുന്ന സൂക്ഷ്മാണുക്കൾ നന്നായി വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്. മറ്റൊരു സാധ്യത, കൊമെൻസൽ മസൽ സസ്യജാലങ്ങളെ തിരശ്ചീന സംക്രമണം ബാധിച്ചേക്കാം എന്നതാണ് [60, 61]. സമുദ്ര പരിസ്ഥിതി, കടൽത്തീര ഉപരിതലം, മസൽസിലെ സഹജീവി ബാക്ടീരിയകളുടെ ഘടന എന്നിവ തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം നിർണ്ണയിക്കാൻ കൂടുതൽ ഗവേഷണം ആവശ്യമാണ്. ഈ പഠനങ്ങൾ നിലവിൽ നടന്നുകൊണ്ടിരിക്കുകയാണ്.
ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യുടെ നീളവും സാന്ദ്രതയും, അതിന്റെ ശുദ്ധീകരണത്തിന്റെ എളുപ്പവും, ദ്രുത ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് അനുവദിക്കുന്നതിനുള്ള ഉയർന്ന നിലവാരവും സമുദ്ര തീരദേശ ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ജൈവവൈവിധ്യം വിലയിരുത്തുന്നതിന് മസൽ ccfDNA ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ നിരവധി ഗുണങ്ങളിൽ ചിലതാണ്. ഒരു നിശ്ചിത ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ വൈറൽ കമ്മ്യൂണിറ്റികളെ (വൈറോമുകൾ) ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ഫലപ്രദമാണ് [62, 63]. ബാക്ടീരിയ, ആർക്കിയ, യൂക്കാരിയോട്ടുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, വൈറൽ ജീനോമുകളിൽ 16S സീക്വൻസുകൾ പോലുള്ള ഫൈലോജെനെറ്റിക്കലായി സംരക്ഷിത ജീനുകൾ അടങ്ങിയിട്ടില്ല. മസൽസ് പോലുള്ള സൂചക സ്പീഷീസുകളിൽ നിന്നുള്ള ദ്രാവക ബയോപ്സികൾ സാധാരണയായി തീരദേശ സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ വസിക്കുന്ന ആതിഥേയരെ ബാധിക്കുന്ന ccfDNA വൈറസ് ശകലങ്ങളുടെ താരതമ്യേന വലിയ സംഖ്യകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇതിൽ പ്രോട്ടോസോവ, ആർത്രോപോഡുകൾ, പ്രാണികൾ, സസ്യങ്ങൾ, ബാക്ടീരിയ വൈറസുകൾ (ഉദാ. ബാക്ടീരിയോഫേജുകൾ) എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്ന വൈറസുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. കെർഗുലനിലെ അതേ മസൽ പാളിയിൽ ശേഖരിച്ച നീല മസൽസിന്റെ (എം. പ്ലാറ്റെൻസിസ്) ഹീമോലിംഫ് ccfDNA വൈറോം പരിശോധിച്ചപ്പോൾ സമാനമായ ഒരു വിതരണം കണ്ടെത്തി (പട്ടിക S2, അനുബന്ധ വിവരങ്ങൾ). മനുഷ്യരുടെയോ മറ്റ് ജീവിവർഗങ്ങളുടെയോ വൈറോമിനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിൽ ccfDNA യുടെ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് തീർച്ചയായും പുതിയൊരു സമീപനമായി മാറിക്കൊണ്ടിരിക്കുന്നു [21, 37, 64]. ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA വൈറസുകളെ പഠിക്കുന്നതിന് ഈ സമീപനം പ്രത്യേകിച്ചും ഉപയോഗപ്രദമാണ്, കാരണം ബാൾട്ടിമോറിലെ ഏറ്റവും വൈവിധ്യമാർന്നതും വിശാലവുമായ വൈറസുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന എല്ലാ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA വൈറസുകളിലും ഒരൊറ്റ ജീൻ സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല [65]. ഈ വൈറസുകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും തരംതിരിക്കപ്പെടാതെ തുടരുന്നു, വൈറൽ ലോകത്തിന്റെ പൂർണ്ണമായും അജ്ഞാതമായ ഒരു ഭാഗത്ത് നിന്നുള്ള വൈറസുകൾ ഇതിൽ ഉൾപ്പെട്ടേക്കാം [66], മസ്സൽസ് A. atra, M. പ്ലാറ്റെൻസിസ് എന്നിവയുടെ വൈറോമുകളും ഹോസ്റ്റ് ശ്രേണികളും രണ്ട് സ്പീഷീസുകൾക്കിടയിലാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. അതുപോലെ (ചിത്രം S3, അധിക വിവരങ്ങൾ കാണുക). പരിസ്ഥിതിയിൽ നിലവിലുള്ള DNA ആഗിരണം ചെയ്യുന്നതിലെ സെലക്റ്റിവിറ്റിയുടെ അഭാവത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാവുന്നതിനാൽ ഈ സമാനത ആശ്ചര്യകരമല്ല. RNA വൈറോമിനെ ചിത്രീകരിക്കാൻ ശുദ്ധീകരിച്ച RNA ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഭാവി പഠനങ്ങൾ നിലവിൽ ആവശ്യമാണ്.
ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ, കോവാർസ്‌കിയുടെയും സഹപ്രവർത്തകരുടെയും [37] പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്വീകരിച്ച വളരെ കർശനമായ ഒരു പൈപ്പ്‌ലൈൻ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു, അവർ നേറ്റീവ് ccfDNA അസംബ്ലിക്ക് മുമ്പും ശേഷവുമുള്ള പൂൾഡ് റീഡുകളുടെയും കോണ്ടിഗുകളുടെയും രണ്ട് ഘട്ട ഡിലീറ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ചു, ഇത് മാപ്പ് ചെയ്യാത്ത റീഡുകളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതത്തിന് കാരണമായി. അതിനാൽ, ഈ മാപ്പ് ചെയ്യാത്ത റീഡുകളിൽ ചിലതിന് ഇപ്പോഴും സ്വന്തം ഉത്ഭവം ഉണ്ടായിരിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് തള്ളിക്കളയാനാവില്ല, പ്രാഥമികമായി ഈ മസൽ സ്പീഷീസിനുള്ള റഫറൻസ് ജീനോം ഞങ്ങളുടെ പക്കലില്ലാത്തതിനാൽ. സെൽഫ്, നോൺ-സെൽഫ് റീഡുകൾക്കിടയിലുള്ള ചിമേരകളെക്കുറിച്ചും ഇല്ലുമിന മിസെക് PE75 സൃഷ്ടിച്ച റീഡ് ലെങ്ത്സിനെക്കുറിച്ചും ഞങ്ങൾക്ക് ആശങ്കയുണ്ടായിരുന്നതിനാലാണ് ഞങ്ങൾ ഈ പൈപ്പ്‌ലൈൻ ഉപയോഗിച്ചത്. ഭൂരിഭാഗം അൺചാർട്ട് ചെയ്യാത്ത റീഡിംഗുകൾക്കും മറ്റൊരു കാരണം, പ്രത്യേകിച്ച് കെർഗുലൻ പോലുള്ള വിദൂര പ്രദേശങ്ങളിലെ സമുദ്ര സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ ഭൂരിഭാഗവും വ്യാഖ്യാനിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല എന്നതാണ്. ccfDNA ഫ്രാഗ്‌മെന്റ് നീളം മനുഷ്യ ccfDNA യ്ക്ക് സമാനമാണെന്ന് കരുതി ഞങ്ങൾ ഇല്ലുമിന മിസെക് PE75 ഉപയോഗിച്ചു. ഹീമോലിംഫ് ccfDNA യ്ക്ക് മനുഷ്യരേക്കാളും/അല്ലെങ്കിൽ സസ്തനികളേക്കാളും ദൈർഘ്യമേറിയ റീഡുകൾ ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നതിനാൽ, ദൈർഘ്യമേറിയ ccfDNA ഫ്രാഗ്‌മെന്റുകൾക്ക് കൂടുതൽ അനുയോജ്യമായ ഒരു സീക്വൻസിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. ആഴത്തിലുള്ള വിശകലനത്തിനായി കൂടുതൽ സൂചനകൾ തിരിച്ചറിയുന്നത് ഈ രീതി വളരെ എളുപ്പമാക്കും. നിലവിൽ ലഭ്യമല്ലാത്ത പൂർണ്ണമായ എ. അട്രാ ന്യൂക്ലിയർ ജീനോം സീക്വൻസ് നേടുന്നത് സ്വയവും സ്വയമല്ലാത്തതുമായ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുള്ള സിസിഎഫ്ഡിഎൻഎയുടെ വിവേചനത്തെ വളരെയധികം സഹായിക്കും. ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി എന്ന ആശയം ചിപ്പികളിൽ പ്രയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയിലാണ് ഞങ്ങളുടെ ഗവേഷണം ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നത് എന്നതിനാൽ, ഭാവിയിലെ ഗവേഷണങ്ങളിൽ ഈ ആശയം ഉപയോഗിക്കുന്നതിനാൽ, മസലുകളുടെ സൂക്ഷ്മജീവ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഈ രീതിയുടെ സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് പുതിയ ഉപകരണങ്ങളും പൈപ്പ്ലൈനുകളും വികസിപ്പിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥ.
ഒരു നോൺ-ഇൻവേസീവ് ക്ലിനിക്കൽ ബയോമാർക്കർ എന്ന നിലയിൽ, ഉയർന്ന മനുഷ്യ പ്ലാസ്മ ccfDNA അളവ് വിവിധ രോഗങ്ങൾ, ടിഷ്യു കേടുപാടുകൾ, സമ്മർദ്ദ അവസ്ഥകൾ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു [67,68,69]. ടിഷ്യു കേടുപാടുകൾക്ക് ശേഷം സ്വന്തം ഉത്ഭവമുള്ള DNA ശകലങ്ങൾ പുറത്തുവിടുന്നതുമായി ഈ വർദ്ധനവ് ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. അക്യൂട്ട് ഹീറ്റ് സ്ട്രെസ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ഞങ്ങൾ ഈ പ്രശ്നം പരിഹരിച്ചത്, അതിൽ മസ്സലുകളെ 30 °C താപനിലയിലേക്ക് ഹ്രസ്വമായി തുറന്നു. മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത തരം മസ്സലുകളിൽ മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഈ വിശകലനം നടത്തി. എന്നിരുന്നാലും, അക്യൂട്ട് ഹീറ്റ് സ്ട്രെസിന് ശേഷം ccfDNA ലെവലിൽ ഒരു മാറ്റവും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രം S5, അധിക വിവരങ്ങൾ കാണുക). മസ്സലുകൾക്ക് സെമി-ഓപ്പൺ രക്തചംക്രമണ സംവിധാനമുണ്ടെന്നും അവയുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രവർത്തനം കാരണം വലിയ അളവിൽ വിദേശ ഡിഎൻഎ ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നുവെന്നും ഈ കണ്ടെത്തൽ ഭാഗികമായെങ്കിലും വിശദീകരിച്ചേക്കാം. മറുവശത്ത്, പല അകശേരുക്കളെയും പോലെ മസ്സലുകളും സമ്മർദ്ദം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ടിഷ്യു നാശത്തെ കൂടുതൽ പ്രതിരോധിക്കും, അതുവഴി അവയുടെ ഹീമോലിമ്പിൽ ccfDNA യുടെ പ്രകാശനം പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു [70, 71].
ഇന്നുവരെ, ജല ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ജൈവവൈവിധ്യത്തിന്റെ ഡിഎൻഎ വിശകലനം പ്രധാനമായും പരിസ്ഥിതി ഡിഎൻഎ (ഇഡിഎൻഎ) മെറ്റാബാർകോഡിംഗിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ജൈവവൈവിധ്യ വിശകലനത്തിൽ ഈ രീതി സാധാരണയായി പരിമിതമാണ്. ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗിന്റെ ഉപയോഗം പിസിആറിന്റെ പരിമിതികളെയും പ്രൈമർ സെറ്റുകളുടെ പക്ഷപാതപരമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെയും മറികടക്കുന്നു. അങ്ങനെ, ഒരു അർത്ഥത്തിൽ, ഞങ്ങളുടെ രീതി അടുത്തിടെ ഉപയോഗിച്ച ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് ഇഡിഎൻഎ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗ് രീതിയോട് കൂടുതൽ അടുക്കുന്നു, ഇത് വിഘടിച്ച ഡിഎൻഎയെ നേരിട്ട് ക്രമപ്പെടുത്താനും മിക്കവാറും എല്ലാ ജീവികളെയും വിശകലനം ചെയ്യാനും കഴിയും [72, 73]. എന്നിരുന്നാലും, എൽബിയെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഇഡിഎൻഎ രീതികളിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്ന നിരവധി അടിസ്ഥാന പ്രശ്നങ്ങളുണ്ട്. തീർച്ചയായും, ഇഡിഎൻഎയും എൽബിയും തമ്മിലുള്ള പ്രധാന വ്യത്യാസം സ്വാഭാവിക ഫിൽട്ടർ ഹോസ്റ്റുകളുടെ ഉപയോഗമാണ്. ഇഡിഎൻഎ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറായി സ്പോഞ്ചുകൾ, ബിവാൾവുകൾ (ഡ്രെസീന എസ്പിപി.) പോലുള്ള സമുദ്ര ജീവിവർഗങ്ങളുടെ ഉപയോഗം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് [74, 75]. എന്നിരുന്നാലും, ഡ്രീസീനയുടെ പഠനം ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ടിഷ്യു ബയോപ്സികൾ ഉപയോഗിച്ചു. എൽബിയിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA യുടെ വിശകലനത്തിന് ടിഷ്യു ബയോപ്സി, പ്രത്യേകവും ചിലപ്പോൾ വിലയേറിയതുമായ ഉപകരണങ്ങൾ, eDNA അല്ലെങ്കിൽ ടിഷ്യു ബയോപ്സിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ലോജിസ്റ്റിക്സ് എന്നിവ ആവശ്യമില്ല. വാസ്തവത്തിൽ, എൽബിയിൽ നിന്നുള്ള ccfDNA ഒരു കോൾഡ് ചെയിൻ നിലനിർത്താതെ തന്നെ FTA പിന്തുണയോടെ സംഭരിക്കാനും വിശകലനം ചെയ്യാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു, ഇത് വിദൂര പ്രദേശങ്ങളിലെ ഗവേഷണത്തിന് ഒരു പ്രധാന വെല്ലുവിളിയാണ് [76]. ദ്രാവക ബയോപ്സികളിൽ നിന്ന് ccfDNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതും ലളിതമാണ്, കൂടാതെ ഷോട്ട്ഗൺ സീക്വൻസിംഗിനും PCR വിശകലനത്തിനും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള DNA നൽകുന്നു. eDNA വിശകലനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ചില സാങ്കേതിക പരിമിതികൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് ഒരു വലിയ നേട്ടമാണ് [77]. സാമ്പിൾ രീതിയുടെ ലാളിത്യവും കുറഞ്ഞ ചെലവും ദീർഘകാല നിരീക്ഷണ പരിപാടികൾക്കും പ്രത്യേകിച്ചും അനുയോജ്യമാണ്. ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് കഴിവിനു പുറമേ, ബിവാൾവുകളുടെ മറ്റൊരു അറിയപ്പെടുന്ന സവിശേഷത അവയുടെ മ്യൂക്കസിന്റെ കെമിക്കൽ മ്യൂക്കോപോളിസാക്കറൈഡ് ഘടനയാണ്, ഇത് വൈറസുകളുടെ ആഗിരണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു [78, 79]. ഇത് ബിവാൾവുകളെ ഒരു നിശ്ചിത ജല ആവാസവ്യവസ്ഥയിലെ ജൈവവൈവിധ്യത്തെയും കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ സ്വാധീനത്തെയും ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമായ പ്രകൃതിദത്ത ഫിൽട്ടറാക്കുന്നു. eDNA യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഹോസ്റ്റിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ DNA ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം രീതിയുടെ ഒരു പരിമിതിയായി കാണാമെങ്കിലും, ആരോഗ്യ പഠനങ്ങൾക്ക് ലഭ്യമായ വിപുലമായ വിവരങ്ങൾക്ക് eDNA യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അത്തരമൊരു നേറ്റീവ് ccfDNA ഉണ്ടായിരിക്കുന്നതുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ചെലവ് ഒരേസമയം മനസ്സിലാക്കാവുന്നതേയുള്ളൂ. ഓഫ്‌സെറ്റ് ഹോസ്റ്റ്. ഹോസ്റ്റ് ഹോസ്റ്റിന്റെ ജീനോമിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന വൈറൽ സീക്വൻസുകളുടെ സാന്നിധ്യവും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. ബിവാൾവുകളിൽ തിരശ്ചീനമായി കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന രക്താർബുദ റിട്രോവൈറസുകളുടെ സാന്നിധ്യം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ ഇത് മസ്സലുകൾക്ക് പ്രത്യേകിച്ചും പ്രധാനമാണ് [80, 81]. ഇഡിഎൻഎയേക്കാൾ എൽബിയുടെ മറ്റൊരു നേട്ടം, സൂക്ഷ്മാണുക്കളെയും (അവയുടെ ജീനോമുകളെയും) വിഴുങ്ങുന്ന ഹീമോലിമ്പിലെ രക്തകോശങ്ങൾ രക്തചംക്രമണം ചെയ്യുന്നതിന്റെ ഫാഗോസൈറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തെ ഇത് ചൂഷണം ചെയ്യുന്നു എന്നതാണ്. ബിവാൾവുകളിലെ രക്തകോശങ്ങളുടെ പ്രധാന പ്രവർത്തനമാണ് ഫാഗോസൈറ്റോസിസ് [82]. അവസാനമായി, മസ്സലുകളുടെ ഉയർന്ന ഫിൽട്ടറിംഗ് ശേഷിയും (ശരാശരി 1.5 l/h കടൽവെള്ളം) രണ്ട് ദിവസത്തെ രക്തചംക്രമണവും ഈ രീതി പ്രയോജനപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് കടൽവെള്ളത്തിന്റെ വ്യത്യസ്ത പാളികളുടെ മിശ്രിതം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഹെറ്ററോളോജസ് eDNA പിടിച്ചെടുക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. [83, 84]. അതിനാൽ, മസൽ ccfDNA വിശകലനം മസ്സലുകളുടെ പോഷക, സാമ്പത്തിക, പാരിസ്ഥിതിക ആഘാതങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ രസകരമായ ഒരു വഴിയാണ്. മനുഷ്യരിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച എൽബിയുടെ വിശകലനത്തിന് സമാനമായി, ബാഹ്യ പദാർത്ഥങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണമായി ഹോസ്റ്റ് ഡിഎൻഎയിലെ ജനിതക, എപ്പിജെനെറ്റിക് മാറ്റങ്ങൾ അളക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയും ഈ രീതി തുറക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, നാനോപോർ സീക്വൻസിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് നേറ്റീവ് ccfDNA-യിൽ ജീനോം-വൈഡ് മെത്തിലേഷൻ വിശകലനം നടത്താൻ മൂന്നാം തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യകൾ വിഭാവനം ചെയ്യാൻ കഴിയും. മസൽ ccfDNA ശകലങ്ങളുടെ നീളം ദീർഘനേരം വായിക്കുന്ന സീക്വൻസിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളുമായി തികച്ചും പൊരുത്തപ്പെടുന്നു എന്ന വസ്തുത ഈ പ്രക്രിയയെ സുഗമമാക്കണം, ഇത് രാസ പരിവർത്തനങ്ങളുടെ ആവശ്യമില്ലാതെ ഒരൊറ്റ സീക്വൻസിംഗ് റൺ മുതൽ ജീനോം-വൈഡ് ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ വിശകലനം അനുവദിക്കുന്നു. 85,86] ഇത് രസകരമായ ഒരു സാധ്യതയാണ്, കാരണം ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ പാറ്റേണുകൾ പാരിസ്ഥിതിക സമ്മർദ്ദത്തോടുള്ള പ്രതികരണത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുകയും നിരവധി തലമുറകളായി നിലനിൽക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ, കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിനോ മലിനീകരണത്തിനോ വിധേയമായതിനുശേഷം പ്രതികരണത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന അടിസ്ഥാന സംവിധാനങ്ങളെക്കുറിച്ച് വിലപ്പെട്ട ഉൾക്കാഴ്ച നൽകാൻ ഇതിന് കഴിയും [87]. എന്നിരുന്നാലും, എൽബിയുടെ ഉപയോഗത്തിന് പരിമിതികളില്ല. ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ സൂചക സ്പീഷീസുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഇതിന് ആവശ്യമാണെന്ന് പറയേണ്ടതില്ലല്ലോ. മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ, ഒരു നിശ്ചിത ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ജൈവവൈവിധ്യം വിലയിരുത്തുന്നതിന് LB ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് ഉറവിടത്തിൽ നിന്നുള്ള DNA ശകലങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം കണക്കിലെടുക്കുന്ന കർശനമായ ഒരു ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് പൈപ്പ്‌ലൈൻ ആവശ്യമാണ്. മറ്റൊരു പ്രധാന പ്രശ്നം സമുദ്ര ജീവിവർഗങ്ങൾക്കുള്ള റഫറൻസ് ജീനോമുകളുടെ ലഭ്യതയാണ്. മറൈൻ സസ്തനി ജീനോംസ് പ്രോജക്റ്റ്, അടുത്തിടെ സ്ഥാപിതമായ Fish10k പ്രോജക്റ്റ് [88] തുടങ്ങിയ സംരംഭങ്ങൾ ഭാവിയിൽ അത്തരം വിശകലനം സുഗമമാക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. സമുദ്ര ഫിൽട്ടർ-ഫീഡിംഗ് ജീവികളിൽ LB ആശയം പ്രയോഗിക്കുന്നത് സീക്വൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയിലെ ഏറ്റവും പുതിയ പുരോഗതികളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് പാരിസ്ഥിതിക സമ്മർദ്ദത്തിന് മറുപടിയായി സമുദ്ര ആവാസവ്യവസ്ഥയുടെ ആരോഗ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നതിന് മൾട്ടി-ഓം ബയോമാർക്കറുകളുടെ വികസനത്തിന് നന്നായി യോജിക്കുന്നു.
ബയോപ്രൊജക്റ്റ്സ് SRR8924808 എന്നതിന് കീഴിലുള്ള NCBI സീക്വൻസ് റീഡ് ആർക്കൈവ് https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808-ൽ ജീനോം സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റ നിക്ഷേപിച്ചിട്ടുണ്ട്.
ബ്രയർലി എ.എസ്., കിംഗ്സ്ഫോർഡ് എം.ജെ. സമുദ്രജീവികളിലും ആവാസവ്യവസ്ഥയിലും കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ സ്വാധീനം. കോൾ ബയോളജി. 2009; 19: പി 602–പി 614.
ഗിസ്സി ഇ, മാനിയ ഇ, മസാരിസ് എഡി, ഫ്രാഷെറ്റി എസ്, അൽപാനിഡോ വി, ബെവിലക്വാ എസ്, തുടങ്ങിയവർ. കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെയും മറ്റ് പ്രാദേശിക സമ്മർദ്ദങ്ങളുടെയും സംയോജിത ആഘാതങ്ങൾ സമുദ്ര പരിസ്ഥിതിയിൽ പരിഗണിക്കുക. പൊതുവായ ശാസ്ത്രീയ പരിസ്ഥിതി. 2021;755:142564.
കരേല്ല എഫ്, ആൻ്റുഫെർമോ ഇ, ഫറീന എസ്, സലാറ്റി എഫ്, മന്ദാസ് ഡി, പ്രാഡോ പി, തുടങ്ങിയവർ. ). മാർച്ച് ഒന്നാം തീയതിയിലെ ശാസ്ത്രം. 2020;7:48.
സെറോണ്ട് എൽ, നികാസ്ട്രോ സിആർ, സർഡി ജിഐ, ഗോബർവില്ലെ ഇ. ആവർത്തിച്ചുള്ള താപ സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കുറഞ്ഞ ചൂട് സഹിഷ്ണുതയാണ് നീല മുത്തുച്ചിപ്പികളുടെ വേനൽക്കാല മരണനിരക്ക് കൂടാൻ കാരണമെന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു. ശാസ്ത്രീയ റിപ്പോർട്ട് 2019; 9:17498.
ഫേ എസ്ബി, സീപീൽസ്കി എഎം, നസ്സൽ എസ്, സെർവാന്റസ്-യോഷിദ കെ, ഹ്വാൻ ജെഎൽ, ഹുബർ ഇആർ, തുടങ്ങിയവർ. മൃഗങ്ങളുടെ മരണത്തിന്റെ ആവൃത്തി, കാരണങ്ങൾ, വ്യാപ്തി എന്നിവയിലെ സമീപകാല മാറ്റങ്ങൾ. പ്രോക് നാറ്റ്ൽ അക്കാഡ് സയൻസ് യുഎസ്എ. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. ഒന്നിലധികം നോൺ-സ്പീഷീസ്-സ്പെസിഫിക് രോഗാണുക്കൾ പിന്ന നോബിലിസിൻ്റെ കൂട്ട മരണത്തിന് കാരണമായേക്കാം. ജീവിതം. 2020;10:238.
ബ്രാഡ്‌ലി എം, കൗട്ട്സ് എസ്‌ജെ, ജെങ്കിൻസ് ഇ, ഒ'ഹാര ടിഎം. ആർട്ടിക് ജന്തുജന്യ രോഗങ്ങളിൽ കാലാവസ്ഥാ വ്യതിയാനത്തിന്റെ സാധ്യതയുള്ള ആഘാതം. ഇന്റർ ജെ സർക്കംപോളാർ ഹെൽത്ത്. 2005; 64:468–77.
ബേയർ ജെ., ഗ്രീൻ എൻ‌ഡബ്ല്യു, ബ്രൂക്സ് എസ്., അലൻ ഐ‌ജെ, റൂസ് എ., ഗോമസ് ടി. തുടങ്ങിയവർ. തീരദേശ മലിനീകരണ നിരീക്ഷണത്തിൽ സിഗ്നൽ ജീവികളായി നീല മസ്സലുകൾ (മൈറ്റിലസ് എഡുലിസ് എസ്‌പി‌പി.): ഒരു അവലോകനം. മാർച്ച് എൻവയോൺ റെസ് 2017; 130:338-65.
സിറവെഗ്ന ജി, മാർസോണി എസ്, സിയീന എസ്, ബാർഡെല്ലി എ. കാൻസർ ചികിത്സയിൽ ദ്രാവക ബയോപ്സിയുടെ സംയോജനം. നാറ്റ് റെവ ക്ലീൻ ഓങ്കോൾ. 2017; 14:531–48.
വാൻ ജെസിഎം, മാസി സി, ഗാർസിയ-കോർബച്ചോ ജെ, മൗലിയർ എഫ്, ബ്രെന്റൺ ജെഡി, കാൽഡാസ് സി, തുടങ്ങിയവർ. ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി പക്വത: ട്യൂമർ ഡിഎൻഎ പ്രചരിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു. നാറ്റ് റെവ കാൻസർ. 2017;17:223–38.
മണ്ടൽ പി., മെറ്റായിസ് പി. മനുഷ്യ പ്ലാസ്മയിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ. സോക് ബയോൾ സബ്സിഡിയറികളുടെ മീറ്റിംഗ് മിനിറ്റ്സ്. 1948; 142:241-3.
ബ്രോങ്ക്ഹോർസ്റ്റ് എജെ, അൻഗെറർ ഡബ്ല്യു, ഹോൾഡൻ‌റിഡർ എസ്. കാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള തന്മാത്രാ മാർക്കറായി കോശരഹിത ഡിഎൻ‌എയ്ക്കുള്ള ഒരു പുതിയ പങ്ക്. ബയോമോളാർ വിശകലനത്തിന്റെ അളവ്. 2019;17:100087.
ഇഗ്നേഷ്യാഡിസ് എം., സ്ലെഡ്ജ് ജിഡബ്ല്യു, ജെഫ്രി എസ്എസ് ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി ക്ലിനിക്കിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നു - നടപ്പാക്കൽ പ്രശ്നങ്ങളും ഭാവിയിലെ വെല്ലുവിളികളും. നാറ്റ് റവ. ക്ലിൻ ഓങ്കോൾ. 2021; 18:297–312.
ലോ വൈ.എം., കോർബെറ്റ എൻ., ചേംബർലൈൻ പി.എഫ്., റായ് ഡബ്ല്യു., സാർജന്റ് ഐ.എൽ., റെഡ്മാൻ സി.ഡബ്ല്യു. തുടങ്ങിയവർ. മാതൃ പ്ലാസ്മയിലും സെറത്തിലും ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ ഡി.എൻ.എ. കാണപ്പെടുന്നു. ലാൻസെറ്റ്. 1997; 350:485-7.
മുഫാറെ എംഎൻ, വോങ് ആർജെ, ഷാ ജിഎം, സ്റ്റീവൻസൺ ഡികെ, ക്വേക്ക് എസ്ആർ ഗർഭകാലത്ത് സ്ത്രീകളുടെ രക്തത്തിൽ രക്തചംക്രമണം ചെയ്യുന്ന എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ആർഎൻഎ ഉപയോഗിച്ച് ഗർഭാവസ്ഥയുടെ ഗതിയെയും അതിന്റെ സങ്കീർണതകളെയും കുറിച്ചുള്ള പഠനം. ഡോപീഡിയാട്രിക്സ്. 2020;8:605219.
ഒല്ലെറിച്ച് എം, ഷെർവുഡ് കെ, കിയോൺ പി, ഷുട്ട്സ് ഇ, ബെക്ക് ജെ, സ്റ്റെഗ്ബൗർ ജെ, തുടങ്ങിയവർ. ലിക്വിഡ് ബയോപ്സി: വൃക്ക ഗ്രാഫ്റ്റിലെ അലോജെനിക് നിഖേദങ്ങൾ കണ്ടെത്താൻ ദാതാവിന്റെ കോശരഹിത ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നു. നാറ്റ് റെവ നെഫ്രോൾ. 2021; 17:591–603.
ജുവാൻ എഫ്‌സി, ലോ വൈഎം പ്രസവത്തിനു മുമ്പുള്ള രോഗനിർണയത്തിലെ ഇന്നൊവേഷൻസ്: മാതൃ പ്ലാസ്മ ജീനോം സീക്വൻസിംഗ്. അന്ന എംഡി. 2016;67:419-32.
ഗു ഡബ്ല്യു, ഡെങ് എക്സ്, ലീ എം, സുകു വൈഡി, അരെവാലോ എസ്, സ്ട്രൈക്ക് ഡി, തുടങ്ങിയവർ. രോഗബാധിതരായ ശരീരദ്രവങ്ങളുടെ അടുത്ത തലമുറ മെറ്റാജെനോമിക് സീക്വൻസിംഗിലൂടെ ദ്രുത രോഗകാരി കണ്ടെത്തൽ. നാറ്റ് മെഡിസിൻ. 2021;27:115-24.