Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Biopsi cair (LB) adalah konsep yang semakin populer di bidang biomedis. Konsep ini terutama didasarkan pada deteksi fragmen DNA ekstraseluler yang beredar (ccfDNA), yang sebagian besar dilepaskan sebagai fragmen kecil setelah kematian sel di berbagai jaringan. Sebagian kecil fragmen ini berasal dari jaringan atau organisme asing. Dalam penelitian ini, kami menerapkan konsep ini pada kerang, spesies indikator yang dikenal karena kapasitas penyaringan air lautnya yang tinggi. Kami menggunakan kemampuan kerang untuk bertindak sebagai filter alami untuk menangkap fragmen DNA lingkungan dari berbagai sumber guna memberikan informasi tentang keanekaragaman hayati ekosistem pesisir laut. Hasil kami menunjukkan bahwa hemolimfa kerang mengandung fragmen DNA yang sangat bervariasi ukurannya, dari 1 hingga 5 kb. Sekuensing shotgun menunjukkan bahwa sejumlah besar fragmen DNA berasal dari mikroba asing. Di antaranya, kami menemukan fragmen DNA dari bakteri, archaea, dan virus, termasuk virus yang diketahui menginfeksi berbagai inang yang umum ditemukan di ekosistem pesisir laut. Kesimpulannya, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB yang diterapkan pada kerang merupakan sumber pengetahuan yang kaya namun belum dieksplorasi mengenai keanekaragaman mikroba di ekosistem pesisir laut.
Dampak perubahan iklim (CC) terhadap keanekaragaman hayati ekosistem laut merupakan bidang penelitian yang berkembang pesat. Pemanasan global tidak hanya menyebabkan tekanan fisiologis yang penting, tetapi juga mendorong batas evolusi stabilitas termal organisme laut, memengaruhi habitat sejumlah spesies, dan mendorong mereka untuk mencari kondisi yang lebih menguntungkan [1, 2]. Selain memengaruhi keanekaragaman hayati metazoa, CC mengganggu keseimbangan halus interaksi inang-mikroba. Disbakteriosis mikroba ini menimbulkan ancaman serius bagi ekosistem laut karena membuat organisme laut lebih rentan terhadap patogen infeksius [3, 4]. Dipercaya bahwa SS memainkan peran penting dalam kematian massal, yang merupakan masalah serius bagi pengelolaan ekosistem laut global [5, 6]. Ini adalah isu penting mengingat dampak ekonomi, ekologi, dan nutrisi dari banyak spesies laut. Hal ini terutama berlaku untuk bivalvia yang hidup di wilayah kutub, di mana efek CK lebih langsung dan parah [6, 7]. Faktanya, bivalvia seperti Mytilus spp. Banyak digunakan untuk memantau dampak perubahan iklim terhadap ekosistem laut. Tidak mengherankan, sejumlah besar biomarker telah dikembangkan untuk memantau kesehatan mereka, seringkali menggunakan pendekatan dua tingkat yang melibatkan biomarker fungsional berdasarkan aktivitas enzimatik atau fungsi seluler seperti viabilitas sel dan aktivitas fagositik [8]. Metode ini juga mencakup pengukuran konsentrasi indikator tekanan spesifik yang terakumulasi dalam jaringan lunak setelah penyerapan sejumlah besar air laut. Namun, kapasitas filtrasi yang tinggi dan sistem sirkulasi semi-terbuka pada bivalvia memberikan peluang untuk mengembangkan biomarker hemolimfa baru menggunakan konsep biopsi cair (LB), pendekatan sederhana dan minimal invasif untuk manajemen pasien. sampel darah [9, 10]. Meskipun beberapa jenis molekul yang beredar dapat ditemukan dalam LB manusia, konsep ini terutama didasarkan pada analisis sekuensing DNA fragmen DNA ekstraseluler yang beredar (ccfDNA) dalam plasma. Faktanya, keberadaan DNA yang beredar dalam plasma manusia telah diketahui sejak pertengahan abad ke-20 [11], namun baru beberapa tahun terakhir ini munculnya metode sekuensing berkecepatan tinggi yang mengarah pada diagnosis klinis berdasarkan ccfDNA. Keberadaan fragmen DNA yang beredar ini sebagian disebabkan oleh pelepasan pasif DNA genomik (nuklear dan mitokondrial) setelah kematian sel. Pada individu sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai penyakit atau mengalami stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan. Pada individu sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai penyakit atau mengalami stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan. здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз kamu perlu melakukan hal yang sama подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Pada orang sehat, konsentrasi cccDNA biasanya rendah (<10 ng/mL), tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau di bawah tekanan yang menyebabkan kerusakan jaringan.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, dan seterusnya.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, no могут быть увеличены в 5-10 раз kamu melakukan pekerjaan yang sama atau tentu saja, ini adalah pertanyaan yang sangat penting. Konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/ml) pada individu sehat, tetapi dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA sangat bervariasi, tetapi biasanya berkisar antara 150 hingga 200 bp. [12]. Analisis ccfDNA yang berasal dari diri sendiri, yaitu ccfDNA dari sel inang normal atau yang telah mengalami transformasi, dapat digunakan untuk mendeteksi perubahan genetik dan epigenetik yang ada dalam genom nuklir dan/atau mitokondria, sehingga membantu dokter memilih terapi yang ditargetkan secara molekuler [13]. Namun, ccfDNA dapat diperoleh dari sumber asing seperti ccfDNA dari sel janin selama kehamilan atau dari organ yang ditransplantasikan [14,15,16,17]. ccfDNA juga merupakan sumber informasi penting untuk mendeteksi keberadaan asam nukleat dari agen infeksi (asing), yang memungkinkan deteksi non-invasif infeksi yang meluas yang tidak teridentifikasi oleh kultur darah, sehingga menghindari biopsi invasif pada jaringan yang terinfeksi [18]. Penelitian terbaru memang menunjukkan bahwa darah manusia mengandung sumber informasi yang kaya yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi patogen virus dan bakteri, dan bahwa sekitar 1% dari ccfDNA yang ditemukan dalam plasma manusia berasal dari luar [19]. Penelitian ini menunjukkan bahwa keanekaragaman hayati mikrobioma sirkulasi suatu organisme dapat dinilai menggunakan analisis ccfDNA. Namun, hingga saat ini, konsep ini digunakan secara eksklusif pada manusia dan, dalam skala yang lebih kecil, pada vertebrata lainnya [20, 21].
Dalam makalah ini, kami menggunakan potensi LB untuk menganalisis ccfDNA dari Aulacomya atra, spesies selatan yang umum ditemukan di Kepulauan Kerguelen subantartika, sekelompok pulau di atas dataran tinggi besar yang terbentuk 35 juta tahun yang lalu akibat letusan gunung berapi. Menggunakan sistem eksperimental in vitro, kami menemukan bahwa fragmen DNA dalam air laut dengan cepat diserap oleh kerang dan masuk ke kompartemen hemolimfa. Pengurutan shotgun menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa kerang mengandung fragmen DNA dari asalnya sendiri dan bukan dari asalnya sendiri, termasuk bakteri simbion dan fragmen DNA dari bioma yang khas dari ekosistem pesisir laut vulkanik dingin. ccfDNA hemolimfa juga mengandung sekuens virus yang berasal dari virus dengan kisaran inang yang berbeda. Kami juga menemukan fragmen DNA dari hewan multiseluler seperti ikan bertulang, anemon laut, alga, dan serangga. Kesimpulannya, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB dapat berhasil diterapkan pada invertebrata laut untuk menghasilkan repertoar genomik yang kaya dalam ekosistem laut.
Kerang dewasa (panjang 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) dan Aulacomya atra (A. atra) dikumpulkan dari pantai berbatu pasang surut Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E), Kepulauan Kerguelen pada Desember 2018. Kerang biru dewasa lainnya (Mytilus spp.) diperoleh dari pemasok komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dan ditempatkan dalam tangki beraerasi yang dikontrol suhunya (4°C) berisi 10–20 L air garam buatan 32‰ (garam laut buatan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, AS). Untuk setiap percobaan, panjang dan berat masing-masing cangkang diukur.
Protokol akses terbuka gratis untuk program ini tersedia secara online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Singkatnya, hemolimfa LB dikumpulkan dari otot abduktor seperti yang dijelaskan [22]. Hemolimfa dijernihkan dengan sentrifugasi pada 1200×g selama 3 menit, supernatan dibekukan (-20°C) hingga digunakan. Untuk isolasi dan pemurnian cfDNA, sampel (1,5-2,0 ml) dicairkan dan diproses menggunakan kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sesuai dengan instruksi pabrik. ccfDNA disimpan pada suhu -80°C hingga analisis lebih lanjut. Dalam beberapa percobaan, ccfDNA diisolasi dan dimurnikan menggunakan QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA yang telah dimurnikan diukur kuantitasnya menggunakan uji PicoGreen standar. Distribusi fragmen ccfDNA yang diisolasi dianalisis dengan elektroforesis kapiler menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) dengan menggunakan Kit DNA Sensitivitas Tinggi. Pengujian dilakukan menggunakan 1 µl sampel ccfDNA sesuai dengan petunjuk pabrik.
Untuk pengurutan fragmen ccfDNA hemolimfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) menyiapkan pustaka shotgun menggunakan kit Illumina DNA Mix dari kit Illumina MiSeq PE75. Adaptor standar (BioO) digunakan. File data mentah tersedia dari Arsip Pembacaan Urutan NCBI (SRR8924808 dan SRR8924809). Kualitas pembacaan dasar dinilai menggunakan FastQC [23]. Trimmomatic [24] telah digunakan untuk memotong adaptor dan pembacaan berkualitas buruk. Pembacaan shotgun dengan ujung berpasangan digabungkan FLASH menjadi pembacaan tunggal yang lebih panjang dengan tumpang tindih minimum 20 bp untuk menghindari ketidakcocokan [25]. Bacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan basis data Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 dan homologi 90%), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Bacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan basis data Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 dan homologi 90%), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Panggilan Telepon BLASTN dan Panggilan Telepon yang Dapat Diperpanjang двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), dan mesin yang tidak mudah rusak karena debu yang berlebihan [26]. Pembacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan basis data taksonomi bivalvia NCBI (nilai e < 1e-3 dan homologi 90%), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用 DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 debu [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Panggilan Telepon BLASTN dan Panggilan Telepon yang Dapat Diperpanjang NCBI (значение e <1e-3 dan 90% гомологии), dan kemampuan yang lebih baik daripada yang lain DEBU использованием [26]. Pembacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan basis data taksonomi bivalvia NCBI (nilai e <1e-3 dan homologi 90%), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].Bacaan dibagi menjadi dua kelompok: terkait dengan sekuens bivalvia (di sini disebut self-reads) dan tidak terkait (non-self-reads). Kedua kelompok dirakit secara terpisah menggunakan MEGAHIT untuk menghasilkan kontig [27]. Sementara itu, distribusi taksonomi bacaan mikrobioma asing diklasifikasikan menggunakan Kraken2 [28] dan direpresentasikan secara grafis oleh diagram lingkaran Krona di Galaxy [29, 30]. Kmer optimal ditentukan sebagai kmer-59 dari percobaan pendahuluan kami. Kontig-kontig tersebut kemudian diidentifikasi dengan penyelarasan menggunakan BLASTN (basis data bivalve NCBI, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir. Kontig-kontig tersebut kemudian diidentifikasi dengan penyelarasan menggunakan BLASTN (basis data bivalve NCBI, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir. Kontak yang Dapat Dilakukan dengan BLASTN (база данных) NCBI, значение e <1e-10 и jumlah 60%) dari jumlah yang ada. Kontig-kontig tersebut kemudian diidentifikasi dengan mencocokkannya dengan BLASTN (basis data bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (didukung oleh NCBI двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 dan гомология 60%). Kontig-kontig tersebut kemudian diidentifikasi untuk anotasi akhir dengan mencocokkannya dengan BLASTN (basis data bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). Secara paralel, kontig kelompok nonself dianotasi dengan BLASTN (basis data nt NCBI, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). Secara paralel, kontig kelompok nonself dianotasi dengan BLASTN (basis data nt NCBI, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). Pelanggan yang dapat mengakses layanan BLASTN (dibandingkan dengan NCBI, значение e <1e-10 dan гомология 60%). Secara paralel, kontig kelompok asing dianotasi dengan BLASTN (basis data NT NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Kontak Terkait yang Tidak Dapat Dioperasikan dengan Bantuan BLASTN (база tidak termasuk NCBI, nilai <1e-10 dan jumlah 60%). Secara paralel, kontig kelompok non-diri dianotasi dengan BLASTN (basis data nt NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig nonself menggunakan basis data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig nonself menggunakan basis data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). BLASTX memungkinkan Anda untuk menghubungi perusahaan lain dan RefSeq NCBI (значение e <1e-10 dan гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig non-diri menggunakan basis data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e-10 dan homologi 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX membutuhkan bantuan teknis dari pengguna lain dan RefSeq NCBI (значение e <1e-10 dan гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig non-diri menggunakan basis data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan homologi 60%).Kumpulan kontig non-diri dari BLASTN dan BLASTX mewakili kontig akhir (lihat berkas tambahan).
Primer yang digunakan untuk PCR tercantum dalam Tabel S1. Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakan untuk mengamplifikasi gen target ccfDNA. Kondisi reaksi berikut digunakan: denaturasi pada 95°C selama 3 menit, 95°C selama 1 menit, suhu annealing yang ditetapkan selama 1 menit, elongasi pada 72°C selama 1 menit, 35 siklus, dan akhirnya 72°C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis dalam gel agarosa (1,5%) yang mengandung SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pada 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi dalam 500 ml air laut beroksigen (32 PSU) selama 24 jam pada suhu 4°C. DNA plasmid yang mengandung sisipan yang mengkodekan sekuens cDNA galectin-7 manusia (nomor akses NCBI L07769) ditambahkan ke dalam vial dengan konsentrasi akhir 190 μg/μl. Kerang yang diinkubasi dalam kondisi yang sama tanpa penambahan DNA digunakan sebagai kontrol. Tangki kontrol ketiga berisi DNA tanpa kerang. Untuk memantau kualitas DNA dalam air laut, sampel air laut (20 μl; tiga kali pengulangan) diambil dari setiap tangki pada waktu yang ditentukan. Untuk penelusuran DNA plasmid, kerang LB dipanen pada waktu yang ditentukan dan dianalisis dengan qPCR dan ddPCR. Karena kandungan garam air laut yang tinggi, alikuot diencerkan dalam air berkualitas PCR (1:10) sebelum semua pengujian PCR.
PCR tetesan digital (ddPCR) dilakukan menggunakan protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Gunakan profil suhu untuk menentukan suhu optimum (Tabel S1). Tetesan dihasilkan menggunakan generator tetesan QX200 (BioRad). ddPCR dilakukan sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, 50 siklus 95°C selama 30 detik dan suhu annealing tertentu selama 1 menit dan 72°C selama 30 detik, 4°C selama 5 menit dan 90°C dalam 5 menit. Jumlah tetesan dan reaksi positif (jumlah salinan/µl) diukur menggunakan pembaca tetesan QX200 (BioRad). Sampel dengan kurang dari 10.000 tetesan ditolak. Kontrol pola tidak dilakukan setiap kali ddPCR dijalankan.
qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) dan primer spesifik LGALS7. Semua PCR kuantitatif dilakukan dalam 20 µl menggunakan Kit PCR QuantiFast SYBR Green (QIAGEN). qPCR dimulai dengan inkubasi 15 menit pada 95°C diikuti oleh 40 siklus pada 95°C selama 10 detik dan pada 60°C selama 60 detik dengan satu kali pengumpulan data. Kurva peleburan dihasilkan menggunakan pengukuran berturut-turut pada 95°C selama 5 detik, 65°C selama 60 detik, dan 97°C di akhir qPCR. Setiap qPCR dilakukan dalam rangkap tiga, kecuali untuk sampel kontrol.
Karena kerang dikenal memiliki tingkat penyaringan yang tinggi, kami pertama-tama menyelidiki apakah mereka dapat menyaring dan menahan fragmen DNA yang ada di air laut. Kami juga tertarik untuk mengetahui apakah fragmen-fragmen ini terakumulasi dalam sistem limfatik semi-terbuka mereka. Kami menyelesaikan masalah ini secara eksperimental dengan melacak nasib fragmen DNA terlarut yang ditambahkan ke tangki kerang biru. Untuk mempermudah pelacakan fragmen DNA, kami menggunakan DNA plasmid asing (bukan DNA sendiri) yang mengandung gen galectin-7 manusia. ddPCR melacak fragmen DNA plasmid di air laut dan kerang. Hasil kami menunjukkan bahwa jika jumlah fragmen DNA di air laut tetap relatif konstan dari waktu ke waktu (hingga 7 hari) tanpa adanya kerang, maka dengan adanya kerang, tingkat ini hampir sepenuhnya menghilang dalam waktu 8 jam (Gambar 1a,b). Fragmen DNA eksogen mudah dideteksi dalam waktu 15 menit dalam cairan intravalvular dan hemolimfa (Gambar 1c). Fragmen-fragmen ini masih dapat dideteksi hingga 4 jam setelah terpapar. Aktivitas penyaringan terhadap fragmen DNA ini sebanding dengan aktivitas penyaringan bakteri dan alga [31]. Hasil ini menunjukkan bahwa kerang dapat menyaring dan mengakumulasi DNA asing di kompartemen cairannya.
Konsentrasi relatif DNA plasmid dalam air laut dengan adanya (A) atau tanpa adanya (B) kerang, diukur dengan ddPCR. Pada A, hasilnya dinyatakan sebagai persentase, dengan batas kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25. Kurva logaritmik yang sesuai ditunjukkan dengan warna merah, dan area yang diarsir abu-abu mewakili interval kepercayaan 95%. Pada B, garis merah mewakili rata-rata dan garis biru mewakili interval kepercayaan 95% untuk konsentrasi. C Akumulasi DNA plasmid dalam hemolimfa dan cairan katup kerang pada waktu yang berbeda setelah penambahan DNA plasmid. Hasil disajikan sebagai salinan absolut yang terdeteksi/mL (±SE).
Selanjutnya, kami menyelidiki asal usul ccfDNA pada kerang yang dikumpulkan dari hamparan kerang di Kepulauan Kerguelen, sekelompok pulau terpencil dengan pengaruh antropogenik yang terbatas. Untuk tujuan ini, cccDNA dari hemolimfa kerang diisolasi dan dimurnikan dengan metode yang umum digunakan untuk memurnikan cccDNA manusia [32, 33]. Kami menemukan bahwa konsentrasi rata-rata ccfDNA hemolimfa pada kerang berada dalam kisaran mikrogram per ml hemolimfa (lihat Tabel S2, Informasi Tambahan). Kisaran konsentrasi ini jauh lebih besar daripada pada orang sehat (nanogram per mililiter), tetapi dalam kasus yang jarang terjadi, pada pasien kanker, kadar ccfDNA dapat mencapai beberapa mikrogram per mililiter [34, 35]. Analisis distribusi ukuran ccfDNA hemolimfa menunjukkan bahwa fragmen-fragmen ini sangat bervariasi ukurannya, mulai dari 1000 bp hingga 5000 bp (Gambar 2). Hasil serupa diperoleh dengan menggunakan QIAamp Investigator Kit berbasis silika, sebuah metode yang umum digunakan dalam ilmu forensik untuk mengisolasi dan memurnikan DNA genomik secara cepat dari sampel DNA konsentrasi rendah, termasuk ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA representatif dari hemolimfa kerang. Diekstraksi dengan Kit NucleoSnap Plasma (atas) dan Kit QIAamp DNA Investigator. B Plot biola yang menunjukkan distribusi konsentrasi ccfDNA hemolimfa (±SE) pada kerang. Garis hitam dan merah masing-masing mewakili median dan kuartil pertama dan ketiga.
Kira-kira 1% ccfDNA pada manusia dan primata memiliki sumber asing [21, 37]. Mengingat sistem peredaran darah semi-terbuka pada bivalvia, air laut yang kaya mikroba, dan distribusi ukuran ccfDNA kerang, kami berhipotesis bahwa ccfDNA hemolimfa kerang mungkin mengandung kumpulan DNA mikroba yang kaya dan beragam. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengurutkan ccfDNA hemolimfa dari sampel Aulacomya atra yang dikumpulkan dari Kepulauan Kerguelen, menghasilkan lebih dari 10 juta pembacaan, 97,6% di antaranya lolos kontrol kualitas. Pembacaan kemudian diklasifikasikan menurut sumber diri dan bukan diri menggunakan basis data bivalvia BLASTN dan NCBI (Gambar S1, Informasi Tambahan).
Pada manusia, DNA nuklear dan mitokondrial dapat dilepaskan ke dalam aliran darah [38]. Namun, dalam penelitian ini, tidak mungkin untuk menjelaskan secara detail DNA genomik nuklear kerang, mengingat genom A. atra belum diurutkan atau dijelaskan. Namun, kami dapat mengidentifikasi sejumlah fragmen ccfDNA yang berasal dari kami sendiri menggunakan pustaka bivalvia (Gambar S2, Informasi Tambahan). Kami juga mengkonfirmasi keberadaan fragmen DNA yang berasal dari kami sendiri dengan amplifikasi PCR terarah dari gen A. atra yang telah diurutkan (Gambar 3). Demikian pula, mengingat genom mitokondrial A. atra tersedia di basis data publik, seseorang dapat menemukan bukti keberadaan fragmen ccfDNA mitokondrial dalam hemolimfa A. atra. Keberadaan fragmen DNA mitokondrial dikonfirmasi dengan amplifikasi PCR (Gambar 3).
Berbagai gen mitokondria terdapat dalam hemolimfa A. atra (titik merah – nomor stok: SRX5705969) dan M. platensis (titik biru – nomor stok: SRX5705968) yang diamplifikasi dengan PCR. Gambar diadaptasi dari Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolimfa dari A. atra Disimpan pada kertas FTA. Gunakan pelubang 3 mm untuk menambahkan langsung ke tabung PCR yang berisi campuran PCR.
Mengingat banyaknya kandungan mikroba dalam air laut, kami awalnya berfokus pada karakterisasi sekuens DNA mikroba dalam hemolimfa. Untuk melakukan ini, kami menggunakan dua strategi berbeda. Strategi pertama menggunakan Kraken2, program klasifikasi sekuens berbasis algoritma yang dapat mengidentifikasi sekuens mikroba dengan akurasi yang sebanding dengan BLAST dan alat lainnya [28]. Lebih dari 6719 bacaan ditentukan berasal dari bakteri, sedangkan 124 dan 64 masing-masing berasal dari archaea dan virus (Gambar 4). Fragmen DNA bakteri yang paling melimpah adalah Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), dan Bacteroidetes (17%) (Gambar 4a). Distribusi ini konsisten dengan penelitian sebelumnya tentang mikrobioma kerang biru laut [39, 40]. Gammaproteobacteria adalah kelas utama Proteobacteria (44%), termasuk banyak Vibrionales (Gambar 4b). Metode ddPCR mengkonfirmasi keberadaan fragmen DNA Vibrio dalam ccfDNA hemolimfa A. atra (Gambar 4c) [41]. Untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang asal bakteri ccfDNA, pendekatan tambahan dilakukan (Gambar S2, Informasi Tambahan). Dalam kasus ini, bacaan yang tumpang tindih dirangkai sebagai bacaan berpasangan (paired-end reads) dan diklasifikasikan sebagai berasal dari diri sendiri (kerang) atau bukan diri sendiri menggunakan BLASTN dan nilai e sebesar 1e−3 serta ambang batas dengan homologi >90%. Dalam kasus ini, bacaan yang tumpang tindih dirangkai sebagai bacaan berpasangan (paired-end reads) dan diklasifikasikan sebagai berasal dari diri sendiri (kerang) atau bukan diri sendiri menggunakan BLASTN dan nilai e sebesar 1e−3 serta ambang batas dengan homologi >90%. Dalam hal ini, layanan yang diperlukan untuk membantu Anda dan teman-teman Anda tombol-tombol yang dapat disesuaikan (двустворчатые моллюски) atau gunakan untuk BLASTN dan значения e 1e-3 и tingkat pengembalian > 90%. Dalam kasus ini, bacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asli (kerang) atau bukan asli menggunakan BLASTN dan nilai e sebesar 1e-3 dan batas dengan homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Dalam hal ini, keterampilan yang diperlukan untuk menangani masalah dan panggilan telepon как собственные (двустворчатые моллюски) atau tidak perlu melalui panggilan e BLASTN dan 1e-3 dan порога nilai > 90%. Dalam kasus ini, bacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai milik sendiri (kerang) atau bukan milik sendiri menggunakan e BLASTN dan nilai 1e-3 serta ambang batas homologi >90%.Karena genom A. atra belum diurutkan, kami menggunakan strategi perakitan de novo dari perakit MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Sebanyak 147.188 kontig telah diidentifikasi sebagai dependen (bivalvia) asal. Kontig-kontig ini kemudian dieksplorasi dengan nilai e sebesar 1e-10 menggunakan BLASTN dan BLASTX. Strategi ini memungkinkan kami untuk mengidentifikasi 482 fragmen non-bivalvia yang ada dalam ccfDNA A. atra. Lebih dari setengah (57%) fragmen DNA ini diperoleh dari bakteri, terutama dari simbion insang, termasuk simbion sulfotrofik, dan dari simbion insang Solemya velum (Gambar 5).
Kelimpahan relatif pada tingkat tipe. B. Keragaman mikroba dari dua filum utama (Firmicutes dan Proteobacteria). Amplifikasi representatif dari ddPCR. C. Vibrio spp. A. Fragmen gen 16S rRNA (biru) dalam tiga hemolimfa atra.
Sebanyak 482 kontig yang dikumpulkan dianalisis. Profil umum distribusi taksonomi anotasi kontig metagenomik (prokariota dan eukariota). B Distribusi rinci fragmen DNA bakteri yang diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX.
Analisis Kraken2 juga menunjukkan bahwa ccfDNA kerang mengandung fragmen DNA archaea, termasuk fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), dan Thaurmarcheota (11%) (Gambar 6a). Kehadiran fragmen DNA yang berasal dari Euryarchaeota dan Crenarchaeota, yang sebelumnya ditemukan dalam komunitas mikroba kerang California, seharusnya tidak mengejutkan [42]. Meskipun Euryarchaeota sering dikaitkan dengan kondisi ekstrem, kini diakui bahwa Euryarchaeota dan Crenarcheota termasuk di antara prokariota yang paling umum di lingkungan kriogenik laut [43, 44]. Kehadiran mikroorganisme metanogenik pada kerang tidak mengherankan, mengingat laporan terbaru tentang kebocoran metana yang luas dari dasar laut di Dataran Tinggi Kerguelen [45] dan kemungkinan produksi metana mikroba yang diamati di lepas pantai Kepulauan Kerguelen [46].
Perhatian kami kemudian beralih ke pembacaan dari virus DNA. Sejauh pengetahuan kami, ini adalah studi off-target pertama tentang kandungan virus pada kerang. Seperti yang diharapkan, kami menemukan fragmen DNA dari bakteriofag (Caudovirales) (Gambar 6b). Namun, DNA virus yang paling umum berasal dari filum nukleositovirus, juga dikenal sebagai virus DNA besar nukleositoplasma (NCLDV), yang memiliki genom terbesar dari semua virus. Dalam filum ini, sebagian besar sekuens DNA termasuk dalam famili Mimimidoviridae (58%) dan Poxviridae (21%), yang inang alaminya meliputi vertebrata dan arthropoda, sementara sebagian kecil dari sekuens DNA ini termasuk dalam alga eukariotik laut yang diketahui terinfeksi virus. Sekuens tersebut juga diperoleh dari virus Pandora, virus raksasa dengan ukuran genom terbesar dari semua genus virus yang diketahui. Menariknya, kisaran inang yang diketahui terinfeksi virus, sebagaimana ditentukan oleh sekuensing ccfDNA hemolimfa, relatif besar (Gambar S3, Informasi Tambahan). Ini termasuk virus yang menginfeksi serangga seperti Baculoviridae dan Iridoviridae, serta virus yang menginfeksi amoeba, alga, dan vertebrata. Kami juga menemukan sekuens yang cocok dengan genom Pithovirus sibericum. Pitovirus (juga dikenal sebagai "virus zombie") pertama kali diisolasi dari lapisan es abadi berusia 30.000 tahun di Siberia [47]. Dengan demikian, hasil kami konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa tidak semua spesies modern virus ini punah [48] dan bahwa virus ini mungkin ada di ekosistem laut subarktik terpencil.
Terakhir, kami menguji apakah kami dapat menemukan fragmen DNA dari hewan multiseluler lainnya. Sebanyak 482 kontig asing diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX dengan pustaka nt, nr, dan RefSeq (genomik dan protein). Hasil kami menunjukkan bahwa di antara fragmen asing ccfDNA hewan multiseluler, DNA tulang mendominasi (Gambar 5). Fragmen DNA dari serangga dan spesies lain juga telah ditemukan. Sebagian besar fragmen DNA belum teridentifikasi, mungkin karena kurangnya representasi sejumlah besar spesies laut dalam basis data genomik dibandingkan dengan spesies darat [49].
Dalam makalah ini, kami menerapkan konsep LB pada kerang, dengan berargumen bahwa sekuensing shot ccfDNA hemolimfa dapat memberikan wawasan tentang komposisi ekosistem pesisir laut. Secara khusus, kami menemukan bahwa 1) hemolimfa kerang mengandung konsentrasi yang relatif tinggi (tingkat mikrogram) fragmen DNA sirkulasi yang relatif besar (~1-5 kb); 2) fragmen DNA ini bersifat independen dan non-independen; 3) di antara sumber asing fragmen DNA ini, kami menemukan DNA bakteri, archaea, dan virus, serta DNA hewan multiseluler lainnya; 4) akumulasi fragmen ccfDNA asing ini dalam hemolimfa terjadi dengan cepat dan berkontribusi pada aktivitas penyaringan internal kerang. Kesimpulannya, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB, yang selama ini sebagian besar diterapkan di bidang biomedis, mengandung sumber pengetahuan yang kaya namun belum dieksplorasi yang dapat digunakan untuk lebih memahami interaksi antara spesies penanda dan lingkungannya.
Selain primata, isolasi ccfDNA telah dilaporkan pada mamalia, termasuk tikus, anjing, kucing, dan kuda [50, 51, 52]. Namun, sepengetahuan kami, penelitian kami adalah yang pertama melaporkan deteksi dan pengurutan ccfDNA pada spesies laut dengan sistem sirkulasi terbuka. Fitur anatomi dan kemampuan penyaringan kerang ini mungkin, setidaknya sebagian, menjelaskan karakteristik ukuran fragmen DNA yang bersirkulasi yang berbeda dibandingkan dengan spesies lain. Pada manusia, sebagian besar fragmen DNA yang bersirkulasi dalam darah adalah fragmen kecil dengan ukuran berkisar antara 150 hingga 200 bp, dengan puncak maksimum 167 bp [34, 53]. Sebagian kecil namun signifikan dari fragmen DNA berukuran antara 300 dan 500 bp, dan sekitar 5% lebih panjang dari 900 bp [54]. Alasan distribusi ukuran ini adalah karena sumber utama ccfDNA dalam plasma terjadi sebagai akibat dari kematian sel, baik karena kematian sel atau karena nekrosis sel hematopoietik yang bersirkulasi pada individu sehat atau karena apoptosis sel tumor pada pasien kanker (dikenal sebagai DNA tumor yang bersirkulasi, ctDNA). Distribusi ukuran ccfDNA hemolimfa yang kami temukan pada kerang berkisar antara 1000 hingga 5000 bp, menunjukkan bahwa ccfDNA kerang memiliki asal yang berbeda. Ini adalah hipotesis yang logis, karena kerang memiliki sistem vaskular semi-terbuka dan hidup di lingkungan perairan laut yang mengandung konsentrasi tinggi DNA genom mikroba. Bahkan, percobaan laboratorium kami menggunakan DNA eksogen telah menunjukkan bahwa kerang mengakumulasi fragmen DNA di air laut, setidaknya setelah beberapa jam fragmen tersebut terdegradasi setelah penyerapan seluler dan/atau dilepaskan dan/atau disimpan dalam berbagai organisasi. Mengingat kelangkaan sel (baik prokariotik maupun eukariotik), penggunaan kompartemen intravalvular akan mengurangi jumlah ccfDNA dari sumber internal maupun dari sumber asing. Mempertimbangkan pentingnya imunitas bawaan bivalvia dan banyaknya fagosit yang bersirkulasi, kami selanjutnya berhipotesis bahwa bahkan ccfDNA asing diperkaya dalam fagosit yang bersirkulasi yang mengakumulasi DNA asing setelah menelan mikroorganisme dan/atau puing-puing seluler. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa bivalvia merupakan gudang informasi molekuler yang unik dan memperkuat statusnya sebagai spesies penanda.
Data kami menunjukkan bahwa pengurutan dan analisis fragmen ccfDNA hemolimfa yang berasal dari bakteri dapat memberikan informasi penting tentang flora bakteri inang dan bakteri yang ada di ekosistem laut sekitarnya. Teknik pengurutan shot telah mengungkapkan sekuens bakteri komensal insang A. atra yang akan terlewatkan jika metode identifikasi 16S rRNA konvensional digunakan, sebagian karena bias pustaka referensi. Bahkan, penggunaan data LB yang dikumpulkan dari M. platensis di lapisan kerang yang sama di Kerguelen menunjukkan bahwa komposisi simbion bakteri yang terkait dengan insang sama untuk kedua spesies kerang (Gambar S4, Informasi Tambahan). Kesamaan dua kerang yang berbeda secara genetik ini mungkin mencerminkan komposisi komunitas bakteri di endapan dingin, belerang, dan vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tingkat mikroorganisme pereduksi sulfur yang lebih tinggi telah dijelaskan dengan baik ketika memanen kerang dari daerah pesisir yang mengalami bioturbasi [59], seperti pantai Port-au-France. Kemungkinan lain adalah bahwa flora komensal kerang dapat dipengaruhi oleh transmisi horizontal [60, 61]. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan korelasi antara lingkungan laut, permukaan dasar laut, dan komposisi bakteri simbion pada kerang. Studi-studi ini sedang berlangsung.
Panjang dan konsentrasi ccfDNA hemolimfa, kemudahan pemurniannya, dan kualitas tinggi yang memungkinkan sekuensing shotgun cepat adalah beberapa dari banyak keuntungan menggunakan ccfDNA kerang untuk menilai keanekaragaman hayati di ekosistem pesisir laut. Pendekatan ini sangat efektif untuk mengkarakterisasi komunitas virus (virom) dalam ekosistem tertentu [62, 63]. Tidak seperti bakteri, archaea, dan eukariota, genom virus tidak mengandung gen yang terlestarikan secara filogenetik seperti sekuens 16S. Hasil kami menunjukkan bahwa biopsi cair dari spesies indikator seperti kerang dapat digunakan untuk mengidentifikasi sejumlah besar fragmen virus ccfDNA yang diketahui menginfeksi inang yang biasanya menghuni ekosistem pesisir laut. Ini termasuk virus yang diketahui menginfeksi protozoa, arthropoda, serangga, tumbuhan, dan virus bakteri (misalnya, bakteriofag). Distribusi serupa ditemukan ketika kami memeriksa virome ccfDNA hemolimfa kerang biru (M. platensis) yang dikumpulkan di lapisan kerang yang sama di Kerguelen (Tabel S2, Informasi Tambahan). Pengurutan shotgun ccfDNA memang merupakan pendekatan baru yang semakin populer dalam studi virome manusia atau spesies lain [21, 37, 64]. Pendekatan ini sangat berguna untuk mempelajari virus DNA untai ganda, karena tidak ada gen tunggal yang terkonservasi di antara semua virus DNA untai ganda, yang mewakili kelas virus yang paling beragam dan luas di Baltimore [65]. Meskipun sebagian besar virus ini tetap tidak terklasifikasi dan mungkin termasuk virus dari bagian dunia virus yang sama sekali tidak diketahui [66], kami menemukan bahwa virome dan kisaran inang kerang A. atra dan M. platensis berada di antara kedua spesies tersebut secara serupa (lihat gambar S3, informasi tambahan). Kesamaan ini tidak mengejutkan, karena mungkin mencerminkan kurangnya selektivitas dalam pengambilan DNA yang ada di lingkungan. Saat ini, studi lebih lanjut menggunakan RNA yang dimurnikan diperlukan untuk mengkarakterisasi virome RNA.
Dalam penelitian kami, kami menggunakan alur kerja yang sangat ketat yang diadaptasi dari karya Kowarski dan kolega [37], yang menggunakan penghapusan dua langkah dari bacaan dan kontig yang dikumpulkan sebelum dan sesudah perakitan ccfDNA asli, menghasilkan proporsi bacaan yang tidak terpetakan yang tinggi. Oleh karena itu, kami tidak dapat mengesampingkan kemungkinan bahwa beberapa bacaan yang tidak terpetakan ini mungkin masih memiliki asal-usulnya sendiri, terutama karena kami tidak memiliki genom referensi untuk spesies kerang ini. Kami juga menggunakan alur kerja ini karena kami khawatir tentang chimera antara bacaan diri dan bukan diri serta panjang bacaan yang dihasilkan oleh Illumina MiSeq PE75. Alasan lain untuk sebagian besar bacaan yang tidak terpetakan adalah bahwa sebagian besar mikroba laut, terutama di daerah terpencil seperti Kerguelen, belum dianotasi. Kami menggunakan Illumina MiSeq PE75, dengan asumsi panjang fragmen ccfDNA mirip dengan ccfDNA manusia. Untuk studi selanjutnya, mengingat hasil kami menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa memiliki pembacaan yang lebih panjang daripada manusia dan/atau mamalia, kami merekomendasikan penggunaan platform sekuensing yang lebih sesuai untuk fragmen ccfDNA yang lebih panjang. Praktik ini akan mempermudah identifikasi lebih banyak indikasi untuk analisis yang lebih mendalam. Memperoleh sekuens genom nuklir A. atra lengkap yang saat ini belum tersedia juga akan sangat mempermudah pembedaan ccfDNA dari sumber diri dan non-diri. Mengingat penelitian kami berfokus pada kemungkinan penerapan konsep biopsi cair pada kerang, kami berharap bahwa seiring dengan penggunaan konsep ini dalam penelitian selanjutnya, alat dan alur kerja baru akan dikembangkan untuk meningkatkan potensi metode ini dalam mempelajari keanekaragaman mikroba ekosistem laut kerang.
Sebagai biomarker klinis non-invasif, peningkatan kadar ccfDNA plasma manusia dikaitkan dengan berbagai penyakit, kerusakan jaringan, dan kondisi stres [67,68,69]. Peningkatan ini dikaitkan dengan pelepasan fragmen DNA asal mereka sendiri setelah kerusakan jaringan. Kami membahas masalah ini menggunakan stres panas akut, di mana kerang terpapar suhu 30 °C secara singkat. Kami melakukan analisis ini pada tiga jenis kerang yang berbeda dalam tiga percobaan independen. Namun, kami tidak menemukan perubahan kadar ccfDNA setelah stres panas akut (lihat Gambar S5, informasi tambahan). Penemuan ini mungkin menjelaskan, setidaknya sebagian, fakta bahwa kerang memiliki sistem peredaran darah semi-terbuka dan mengakumulasi sejumlah besar DNA asing karena aktivitas penyaringannya yang tinggi. Di sisi lain, kerang, seperti banyak invertebrata, mungkin lebih tahan terhadap kerusakan jaringan akibat stres, sehingga membatasi pelepasan ccfDNA dalam hemolimfa mereka [70, 71].
Sampai saat ini, analisis DNA keanekaragaman hayati di ekosistem perairan sebagian besar berfokus pada metabarcoding DNA lingkungan (eDNA). Namun, metode ini biasanya terbatas dalam analisis keanekaragaman hayati ketika primer digunakan. Penggunaan sekuensing shotgun mengatasi keterbatasan PCR dan pemilihan set primer yang bias. Dengan demikian, dalam arti tertentu, metode kami lebih dekat dengan metode sekuensing eDNA Shotgun berkecepatan tinggi yang baru-baru ini digunakan, yang mampu secara langsung mengurutkan DNA yang terfragmentasi dan menganalisis hampir semua organisme [72, 73]. Namun, ada sejumlah masalah mendasar yang membedakan LB dari metode eDNA standar. Tentu saja, perbedaan utama antara eDNA dan LB adalah penggunaan inang penyaring alami. Penggunaan spesies laut seperti spons dan bivalvia (Dresseina spp.) sebagai penyaring alami untuk mempelajari eDNA telah dilaporkan [74, 75]. Namun, penelitian Dreissena menggunakan biopsi jaringan dari mana DNA diekstrak. Analisis ccfDNA dari LB tidak memerlukan biopsi jaringan, peralatan khusus dan terkadang mahal, serta logistik yang terkait dengan eDNA atau biopsi jaringan. Bahkan, kami baru-baru ini melaporkan bahwa ccfDNA dari LB dapat disimpan dan dianalisis dengan dukungan FTA tanpa perlu menjaga rantai dingin, yang merupakan tantangan utama untuk penelitian di daerah terpencil [76]. Ekstraksi ccfDNA dari biopsi cair juga sederhana dan menghasilkan DNA berkualitas tinggi untuk sekuensing shotgun dan analisis PCR. Ini merupakan keuntungan besar mengingat beberapa keterbatasan teknis yang terkait dengan analisis eDNA [77]. Kesederhanaan dan biaya rendah dari metode pengambilan sampel juga sangat cocok untuk program pemantauan jangka panjang. Selain kemampuan penyaringannya yang tinggi, fitur lain yang terkenal dari bivalvia adalah komposisi mukopolisakarida kimia dari lendirnya, yang mendorong penyerapan virus [78, 79]. Hal ini menjadikan bivalvia sebagai filter alami yang ideal untuk mengkarakterisasi keanekaragaman hayati dan dampak perubahan iklim di ekosistem perairan tertentu. Meskipun keberadaan fragmen DNA yang berasal dari inang dapat dilihat sebagai keterbatasan metode ini dibandingkan dengan eDNA, biaya yang terkait dengan memiliki ccfDNA asli dibandingkan dengan eDNA dapat dipahami mengingat banyaknya informasi yang tersedia untuk studi kesehatan. Ini termasuk keberadaan sekuens virus yang terintegrasi ke dalam genom inang. Hal ini sangat penting untuk kerang, mengingat keberadaan retrovirus leukemia yang ditularkan secara horizontal pada bivalvia [80, 81]. Keuntungan lain dari LB dibandingkan dengan eDNA adalah bahwa ia memanfaatkan aktivitas fagositik sel darah yang bersirkulasi dalam hemolimfa, yang menelan mikroorganisme (dan genomnya). Fagositosis adalah fungsi utama sel darah pada bivalvia [82]. Terakhir, metode ini memanfaatkan kapasitas penyaringan kerang yang tinggi (rata-rata 1,5 l/jam air laut) dan sirkulasi dua hari, yang meningkatkan pencampuran lapisan air laut yang berbeda, memungkinkan penangkapan eDNA heterolog. [83, 84]. Oleh karena itu, analisis ccfDNA kerang merupakan pendekatan yang menarik mengingat dampak nutrisi, ekonomi, dan lingkungan dari kerang. Mirip dengan analisis LB yang dikumpulkan dari manusia, metode ini juga membuka kemungkinan untuk mengukur perubahan genetik dan epigenetik pada DNA inang sebagai respons terhadap zat eksogen. Misalnya, teknologi sekuensing generasi ketiga dapat dipertimbangkan untuk melakukan analisis metilasi genomik pada ccfDNA asli menggunakan sekuensing nanopore. Proses ini seharusnya difasilitasi oleh fakta bahwa panjang fragmen ccfDNA kerang sangat kompatibel dengan platform sekuensing bacaan panjang yang memungkinkan analisis metilasi DNA genomik dari satu kali proses sekuensing tanpa perlu transformasi kimia.85,86] Ini adalah kemungkinan yang menarik, karena telah ditunjukkan bahwa pola metilasi DNA mencerminkan respons terhadap stres lingkungan dan bertahan selama beberapa generasi. Oleh karena itu, hal ini dapat memberikan wawasan berharga tentang mekanisme yang mendasari respons setelah terpapar perubahan iklim atau polutan [87]. Namun, penggunaan LB tidak tanpa keterbatasan. Tentu saja, ini membutuhkan keberadaan spesies indikator dalam ekosistem. Seperti yang disebutkan di atas, penggunaan LB untuk menilai keanekaragaman hayati suatu ekosistem juga membutuhkan alur kerja bioinformatika yang ketat yang memperhitungkan keberadaan fragmen DNA dari sumbernya. Masalah utama lainnya adalah ketersediaan genom referensi untuk spesies laut. Diharapkan inisiatif seperti Proyek Genom Mamalia Laut dan proyek Fish10k yang baru didirikan [88] akan memfasilitasi analisis tersebut di masa mendatang. Penerapan konsep LB pada organisme penyaring makanan laut juga kompatibel dengan kemajuan terbaru dalam teknologi pengurutan, sehingga sangat cocok untuk pengembangan biomarker multi-ohm untuk memberikan informasi penting tentang kesehatan habitat laut sebagai respons terhadap tekanan lingkungan.
Data pengurutan genom telah disimpan di NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bawah Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak perubahan iklim terhadap kehidupan dan ekosistem laut. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, dkk. Pertimbangkan dampak gabungan perubahan iklim dan tekanan lokal lainnya terhadap lingkungan laut. Lingkungan ilmiah umum. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, dkk. ). Sains tanggal 1 Maret. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Penurunan toleransi panas di bawah kondisi stres panas berulang menjelaskan tingginya angka kematian kerang biru di musim panas. Laporan ilmiah 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, dkk. Perubahan terkini dalam frekuensi, penyebab, dan tingkat kematian hewan. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, dkk. Berbagai patogen non-spesies mungkin telah menyebabkan kematian massal Pinna nobilis. Kehidupan. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Dampak potensial perubahan iklim terhadap penyakit zoonosis Arktik. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. dkk. Kerang biru (Mytilus edulis spp.) sebagai organisme penanda dalam pemantauan pencemaran pesisir: sebuah tinjauan. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair dalam pengobatan kanker. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, dkk. Pematangan biopsi cair: Memungkinkan DNA tumor untuk bersirkulasi. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukleat dalam plasma manusia. Risalah rapat anak perusahaan Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran baru DNA bebas sel sebagai penanda molekuler untuk pengobatan kanker. Kuantifikasi analisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS. Biopsi cair memasuki klinik – masalah implementasi dan tantangan masa depan. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dan lainnya. DNA janin terdapat dalam plasma dan serum ibu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studi tentang jalannya kehamilan dan komplikasinya menggunakan RNA ekstraseluler yang beredar dalam darah wanita selama kehamilan. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, dkk. Biopsi cair: DNA bebas sel donor digunakan untuk mendeteksi lesi alogenik pada cangkok ginjal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dalam diagnostik prenatal: pengurutan genom plasma ibu. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, dkk. Deteksi patogen cepat dengan sekuensing metagenomik generasi berikutnya dari cairan tubuh yang terinfeksi. Nat Medicine. 2021;27:115-24.