Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Biopsi cair (LB) adalah konsep yang dengan cepat mendapatkan popularitas di bidang biomedis. Konsep ini terutama didasarkan pada deteksi fragmen DNA ekstraseluler yang bersirkulasi (ccfDNA), yang sebagian besar dilepaskan sebagai fragmen kecil setelah kematian sel di berbagai jaringan. Sebagian kecil dari fragmen ini berasal dari jaringan atau organisme asing. Dalam penelitian saat ini, kami telah menerapkan konsep ini pada remis, spesies penjaga yang dikenal karena kapasitas penyaringan air lautnya yang tinggi. Kami menggunakan kemampuan remis untuk bertindak sebagai filter alami untuk menangkap fragmen DNA lingkungan dari berbagai sumber untuk memberikan informasi tentang keanekaragaman hayati ekosistem pesisir laut. Hasil kami menunjukkan bahwa hemolimfa remis mengandung fragmen DNA yang sangat bervariasi ukurannya, dari 1 hingga 5 kb. Shotgun sequencing menunjukkan bahwa sejumlah besar fragmen DNA berasal dari mikroba asing. Di antara mereka, kami menemukan fragmen DNA dari bakteri, archaea, dan virus, termasuk virus yang diketahui menginfeksi berbagai inang yang umum ditemukan di ekosistem laut pesisir. Kesimpulannya, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB yang diterapkan pada kerang merupakan sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum dieksplorasi tentang keanekaragaman mikroba dalam ekosistem pesisir laut.
Dampak perubahan iklim (CC) terhadap keanekaragaman hayati ekosistem laut merupakan bidang penelitian yang berkembang pesat. Pemanasan global tidak hanya menyebabkan tekanan fisiologis yang penting, tetapi juga mendorong batas evolusi stabilitas termal organisme laut, yang memengaruhi habitat sejumlah spesies, mendorong mereka untuk mencari kondisi yang lebih menguntungkan [1, 2]. Selain memengaruhi keanekaragaman hayati metazoa, CC mengganggu keseimbangan interaksi inang-mikroba yang rapuh. Disbakteriosis mikroba ini menimbulkan ancaman serius bagi ekosistem laut karena membuat organisme laut lebih rentan terhadap patogen menular [3, 4]. Diyakini bahwa SS memainkan peran penting dalam kematian massal, yang merupakan masalah serius bagi pengelolaan ekosistem laut global [5, 6]. Ini merupakan masalah penting mengingat dampak ekonomi, ekologi, dan nutrisi dari banyak spesies laut. Hal ini terutama berlaku untuk bivalvia yang hidup di wilayah kutub, di mana efek CK lebih langsung dan parah [6, 7]. Faktanya, bivalvia seperti Mytilus spp. digunakan secara luas untuk memantau dampak CC pada ekosistem laut. Tidak mengherankan, sejumlah besar biomarker telah dikembangkan untuk memantau kesehatannya, sering kali menggunakan pendekatan dua tingkat yang melibatkan biomarker fungsional berdasarkan aktivitas enzimatik atau fungsi seluler seperti viabilitas sel dan aktivitas fagositosis [8]. Metode-metode ini juga mencakup pengukuran konsentrasi indikator tekanan spesifik yang terakumulasi dalam jaringan lunak setelah penyerapan air laut dalam jumlah besar. Namun, kapasitas filtrasi yang tinggi dan sistem peredaran darah semi-terbuka pada bivalvia memberikan peluang untuk mengembangkan biomarker hemolimfa baru menggunakan konsep biopsi cair (LB), pendekatan yang sederhana dan minimal invasif untuk manajemen pasien. sampel darah [9, 10]. Meskipun beberapa jenis molekul yang bersirkulasi dapat ditemukan dalam LB manusia, konsep ini terutama didasarkan pada analisis sekuensing DNA dari fragmen DNA ekstraseluler yang bersirkulasi (ccfDNA) dalam plasma. Sebenarnya, keberadaan DNA yang bersirkulasi dalam plasma manusia telah diketahui sejak pertengahan abad ke-20 [11], tetapi baru dalam beberapa tahun terakhir ini metode sequencing berthroughput tinggi telah menghasilkan diagnosis klinis berdasarkan ccfDNA. Keberadaan fragmen DNA yang bersirkulasi ini sebagian disebabkan oleh pelepasan DNA genom (nuklir dan mitokondria) secara pasif setelah kematian sel. Pada individu yang sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai patologi atau mengalami stres, sehingga mengakibatkan kerusakan jaringan. Pada individu yang sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai patologi atau mengalami stres, sehingga mengakibatkan kerusakan jaringan. здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз kamu perlu melakukan hal yang sama подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Pada orang sehat, konsentrasi cccDNA biasanya rendah (<10 ng/mL), tetapi dapat meningkat 5–10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau mengalami stres yang menyebabkan kerusakan jaringan.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, dan seterusnya.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, no могут быть увеличены в 5-10 раз kamu melakukan pekerjaan yang sama atau tentu saja, ini adalah pertanyaan yang sangat penting. Konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/ml) pada individu sehat, tetapi dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA sangat bervariasi, tetapi biasanya berkisar antara 150 hingga 200 bp. [12]. Analisis ccfDNA yang berasal dari dirinya sendiri, yaitu, ccfDNA dari sel inang yang normal atau yang telah ditransformasi, dapat digunakan untuk mendeteksi perubahan genetik dan epigenetik yang terdapat dalam genom nuklir dan/atau mitokondria, sehingga membantu dokter memilih terapi molekuler yang spesifik [13] . Namun, ccfDNA dapat diperoleh dari sumber asing seperti ccfDNA dari sel janin selama kehamilan atau dari organ yang ditransplantasikan [14,15,16,17]. ccfDNA juga merupakan sumber informasi penting untuk mendeteksi keberadaan asam nukleat dari agen infeksius (asing), yang memungkinkan deteksi non-invasif dari infeksi yang tersebar luas yang tidak teridentifikasi oleh kultur darah, sehingga menghindari biopsi invasif dari jaringan yang terinfeksi [18]. Penelitian terkini memang menunjukkan bahwa darah manusia mengandung sumber informasi yang kaya yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi patogen virus dan bakteri, dan sekitar 1% ccfDNA yang ditemukan dalam plasma manusia berasal dari luar [19]. Penelitian ini menunjukkan bahwa keanekaragaman hayati mikrobioma yang beredar dalam suatu organisme dapat dinilai menggunakan analisis ccfDNA. Akan tetapi, hingga saat ini, konsep ini hanya digunakan pada manusia dan, pada tingkat yang lebih rendah, pada vertebrata lainnya [20, 21].
Dalam makalah ini, kami menggunakan potensi LB untuk menganalisis ccfDNA Aulacomya atra, spesies selatan yang umum ditemukan di Kepulauan Kerguelen subantartika, sekelompok pulau di atas dataran tinggi besar yang terbentuk 35 juta tahun lalu. letusan gunung berapi. Dengan menggunakan sistem eksperimen in vitro, kami menemukan bahwa fragmen DNA dalam air laut dengan cepat diambil oleh kerang dan memasuki kompartemen hemolimfa. Shotgun sequencing telah menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa kerang mengandung fragmen DNA yang berasal dari dirinya sendiri dan bukan dari dirinya sendiri, termasuk bakteri simbiotik dan fragmen DNA dari bioma yang khas dari ekosistem pesisir laut vulkanik dingin. CcfDNA hemolimfa juga mengandung urutan virus yang berasal dari virus dengan rentang inang yang berbeda. Kami juga menemukan fragmen DNA dari hewan multiseluler seperti ikan bertulang, anemon laut, alga, dan serangga. Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB dapat berhasil diterapkan pada invertebrata laut untuk menghasilkan repertoar genom yang kaya dalam ekosistem laut.
Kerang dewasa (panjang 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) dan Aulacomya atra (A. atra) dikumpulkan dari pantai berbatu pasang surut Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Kepulauan Kerguelen pada bulan Desember 2018. Kerang biru dewasa lainnya (Mytilus spp.) diperoleh dari pemasok komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dan ditempatkan dalam tangki ber-aerasi dengan suhu terkontrol (4°C) yang berisi 10–20 L air garam buatan 32‰. (garam laut buatan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, AS). Untuk setiap percobaan, panjang dan berat masing-masing cangkang diukur.
Protokol akses terbuka gratis untuk program ini tersedia daring (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Secara singkat, hemolimfa LB dikumpulkan dari otot abduktor seperti yang dijelaskan [22]. Hemolimfa dijernihkan dengan sentrifugasi pada 1200×g selama 3 menit, supernatan dibekukan (-20°C) hingga digunakan. Untuk isolasi dan pemurnian cfDNA, sampel (1,5-2,0 ml) dicairkan dan diproses menggunakan kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sesuai dengan petunjuk pabrik. ccfDNA disimpan pada suhu -80°C hingga dilakukan analisis lebih lanjut. Dalam beberapa percobaan, ccfDNA diisolasi dan dimurnikan menggunakan QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA yang dimurnikan diukur menggunakan uji PicoGreen standar. Distribusi fragmen ccfDNA yang diisolasi dianalisis dengan elektroforesis kapiler menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) menggunakan High Sensitivity DNA Kit. Uji dilakukan menggunakan 1 µl sampel ccfDNA sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya.
Untuk pengurutan fragmen ccfDNA hemolimfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) menyiapkan pustaka shotgun menggunakan kit Illumina DNA Mix dari kit Illumina MiSeq PE75. Adaptor standar (BioO) digunakan. Berkas data mentah tersedia dari NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 dan SRR8924809). Kualitas pembacaan dasar dinilai menggunakan FastQC [23]. Trimmomatic [24] telah digunakan untuk adaptor kliping dan pembacaan berkualitas buruk. Pembacaan shotgun dengan ujung berpasangan digabungkan secara FLASH menjadi pembacaan tunggal yang lebih panjang dengan tumpang tindih minimum 20 bp untuk menghindari ketidakcocokan [25]. Hasil pembacaan yang digabungkan diberi anotasi dengan BLASTN menggunakan database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 dan 90% homologi), dan penyembunyian sekuens kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Hasil pembacaan yang digabungkan diberi anotasi dengan BLASTN menggunakan database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 dan 90% homologi), dan penyembunyian sekuens kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Panggilan Telepon BLASTN dan Panggilan Telepon yang Dapat Diperpanjang двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 dan 90% гомологии), dan kemampuan yang lebih besar daripada yang lain DEBU [26]. Pembacaan gabungan diberi anotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi bivalvia NCBI (nilai e < 1e-3 dan 90% homologi), dan penyembunyian urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用 DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 debu [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Panggilan Telepon BLASTN dan Panggilan Telepon yang Dapat Diperpanjang Dukungan untuk NCBI (значение e <1e-3 dan 90% гомологии), dan kemungkinan besar tidak akan melebihi сложности выполнено с DEBU использованием [26]. Pembacaan gabungan diberi anotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi bivalvia NCBI (nilai e <1e-3 dan 90% homologi), dan penyembunyian urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].Hasil pembacaan dibagi menjadi dua kelompok: terkait dengan urutan bivalvia (di sini disebut pembacaan mandiri) dan tidak terkait (pembacaan non-mandiri). Dua kelompok disusun secara terpisah menggunakan MEGAHIT untuk menghasilkan kontig [27]. Sementara itu, distribusi taksonomi pembacaan mikrobioma alien diklasifikasikan menggunakan Kraken2 [28] dan secara grafis direpresentasikan oleh diagram pai Krona di Galaxy [29, 30]. Kmer optimal ditentukan menjadi kmer-59 dari percobaan awal kami. Kontig diri kemudian diidentifikasi melalui penyelarasan dengan BLASTN (basis data NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Kontig diri kemudian diidentifikasi melalui penyelarasan dengan BLASTN (basis data NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Kontak yang Dapat Dilakukan dengan BLASTN (база данных) NCBI, значение e <1e-10 и jumlah 60%) dari jumlah yang ada. Kontig-diri kemudian diidentifikasi dengan mencocokkannya dengan BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (didukung oleh NCBI двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 dan гомология 60%). Kontig-diri kemudian diidentifikasi untuk anotasi akhir dengan mencocokkannya dengan BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). Secara paralel, kontig grup nonself dianotasi dengan BLASTN (database NCBI nt, nilai e < 1e−10 dan 60% homologi). Secara paralel, kontig grup nonself dianotasi dengan BLASTN (database NCBI nt, nilai e < 1e−10 dan 60% homologi). Pelanggan yang dapat mengakses layanan BLASTN (dibandingkan dengan NCBI, значение e <1e-10 dan гомология 60%). Secara paralel, kontig gugus asing dianotasi dengan BLASTN (basis data NT NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Kontak Terkait yang Tidak Dapat Dioperasikan dengan Bantuan BLASTN (база tidak termasuk NCBI, nilai <1e-10 dan jumlah 60%). Secara paralel, kontig grup non-diri dianotasi dengan BLASTN (database NCBI nt, nilai e <1e-10 dan 60% homologi). BLASTX juga dilakukan pada kontig nonself menggunakan database protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e−10 dan 60% homologi). BLASTX juga dilakukan pada kontig nonself menggunakan database protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e−10 dan 60% homologi). BLASTX memungkinkan Anda untuk menghubungi perusahaan lain dan RefSeq NCBI (значение e <1e-10 dan гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig non-diri menggunakan database protein NCBI nr dan RefSeq (nilai e < 1e-10 dan 60% homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX membutuhkan bantuan teknis dari pengguna lain dan RefSeq NCBI (значение e <1e-10 dan гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada kontig non-diri menggunakan database protein NCBI nr dan RefSeq (nilai e <1e-10 dan 60% homologi).Kumpulan BLASTN dan BLASTX dari non-self-contig mewakili contig final (lihat berkas Tambahan).
Primer yang digunakan untuk PCR tercantum dalam Tabel S1. DNA polimerase Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakan untuk mengamplifikasi gen target ccfDNA. Kondisi reaksi berikut digunakan: denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit, 95°C selama 1 menit, suhu annealing yang ditetapkan selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit, 35 siklus, dan terakhir 72°C dalam waktu 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis dalam gel agarosa (1,5%) yang mengandung Pewarna Gel DNA Aman SYBRTM (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pada suhu 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi dalam 500 ml air laut beroksigen (32 PSU) selama 24 jam pada suhu 4°C. DNA plasmid yang mengandung sisipan yang mengkodekan urutan cDNA galectin-7 manusia (nomor akses NCBI L07769) ditambahkan ke vial pada konsentrasi akhir 190 μg/μl. Kerang yang diinkubasi dalam kondisi yang sama tanpa penambahan DNA adalah kontrol. Tangki kontrol ketiga berisi DNA tanpa kerang. Untuk memantau kualitas DNA dalam air laut, sampel air laut (20 μl; tiga kali pengulangan) diambil dari setiap tangki pada waktu yang ditentukan. Untuk ketertelusuran DNA plasmid, kerang LB dipanen pada waktu yang ditentukan dan dianalisis dengan qPCR dan ddPCR. Karena kandungan garam air laut yang tinggi, alikuot diencerkan dalam air kualitas PCR (1:10) sebelum semua uji PCR.
PCR tetesan digital (ddPCR) dilakukan menggunakan protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Gunakan profil suhu untuk menentukan suhu optimum (Tabel S1). Tetesan dibuat menggunakan generator tetesan QX200 (BioRad). ddPCR dilakukan sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, 50 siklus 95°C selama 30 detik dan suhu pemanasan tertentu selama 1 menit dan 72°C selama 30 detik, 4°C selama 5 menit dan 90°C dalam waktu 5 menit. Jumlah tetesan dan reaksi positif (jumlah salinan/µl) diukur menggunakan pembaca tetesan QX200 (BioRad). Sampel dengan kurang dari 10.000 tetesan ditolak. Kontrol pola tidak dilakukan setiap kali ddPCR dijalankan.
qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) dan primer spesifik LGALS7. Semua PCR kuantitatif dilakukan dalam 20 µl menggunakan QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR dimulai dengan inkubasi selama 15 menit pada suhu 95°C diikuti oleh 40 siklus pada suhu 95°C selama 10 detik dan pada suhu 60°C selama 60 detik dengan satu kali pengumpulan data. Kurva pelelehan dibuat menggunakan pengukuran berturut-turut pada suhu 95°C selama 5 detik, 65°C selama 60 detik, dan 97°C pada akhir qPCR. Setiap qPCR dilakukan dalam rangkap tiga, kecuali untuk sampel kontrol.
Karena remis dikenal karena laju filtrasinya yang tinggi, pertama-tama kami menyelidiki apakah mereka dapat menyaring dan menahan fragmen DNA yang ada di air laut. Kami juga tertarik pada apakah fragmen-fragmen ini terakumulasi dalam sistem limfatik semi-terbuka mereka. Kami memecahkan masalah ini secara eksperimental dengan melacak nasib fragmen DNA terlarut yang ditambahkan ke tangki remis biru. Untuk memudahkan pelacakan fragmen DNA, kami menggunakan DNA plasmid asing (bukan diri) yang mengandung gen galectin-7 manusia. ddPCR melacak fragmen DNA plasmid di air laut dan remis. Hasil kami menunjukkan bahwa jika jumlah fragmen DNA di air laut tetap relatif konstan dari waktu ke waktu (hingga 7 hari) tanpa adanya remis, maka di hadapan remis tingkat ini hampir sepenuhnya menghilang dalam waktu 8 jam (Gbr. 1a,b). Fragmen DNA eksogen mudah dideteksi dalam waktu 15 menit dalam cairan intravalvular dan hemolimfa (Gbr. 1c). Fragmen-fragmen ini masih dapat dideteksi hingga 4 jam setelah paparan. Aktivitas penyaringan terhadap fragmen DNA ini sebanding dengan aktivitas penyaringan bakteri dan alga [31]. Hasil ini menunjukkan bahwa kerang dapat menyaring dan mengumpulkan DNA asing di kompartemen cairannya.
Konsentrasi relatif DNA plasmid dalam air laut dengan keberadaan (A) atau ketiadaan (B) remis, diukur dengan ddPCR. Dalam A, hasilnya dinyatakan dalam persentase, dengan batas kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25. Kurva logaritmik yang disesuaikan ditunjukkan dengan warna merah, dan area yang diarsir abu-abu mewakili interval kepercayaan 95%. Dalam B, garis merah mewakili nilai rata-rata dan garis biru mewakili interval kepercayaan 95% untuk konsentrasi. C Akumulasi DNA plasmid dalam hemolimfa dan cairan katup remis pada waktu yang berbeda setelah penambahan DNA plasmid. Hasil disajikan sebagai salinan absolut yang terdeteksi/mL (±SE).
Berikutnya, kami menyelidiki asal usul ccfDNA pada kerang yang dikumpulkan dari tempat perkembangbiakan kerang di Kepulauan Kerguelen, sekelompok pulau terpencil dengan pengaruh antropogenik yang terbatas. Untuk tujuan ini, cccDNA dari hemolimfa kerang diisolasi dan dimurnikan dengan metode yang umum digunakan untuk memurnikan cccDNA manusia [32, 33]. Kami menemukan bahwa konsentrasi rata-rata ccfDNA hemolimfa pada kerang berada dalam kisaran mikrogram rendah per ml hemolimfa (lihat Tabel S2, Informasi Tambahan). Kisaran konsentrasi ini jauh lebih besar daripada pada orang sehat (nanogram rendah per mililiter), tetapi dalam kasus yang jarang terjadi, pada pasien kanker, kadar ccfDNA dapat mencapai beberapa mikrogram per mililiter [34, 35]. Analisis distribusi ukuran ccfDNA hemolimfa menunjukkan bahwa fragmen-fragmen ini sangat bervariasi dalam ukuran, berkisar dari 1000 bp hingga 1000 bp. hingga 5000 bp (Gbr. 2). Hasil serupa diperoleh dengan menggunakan QIAamp Investigator Kit berbasis silika, sebuah metode yang umum digunakan dalam ilmu forensik untuk mengisolasi dan memurnikan DNA genom secara cepat dari sampel DNA konsentrasi rendah, termasuk ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA representatif dari hemolimfa kerang. Diekstraksi dengan NucleoSnap Plasma Kit (atas) dan QIAamp DNA Investigator Kit. B Plot biola yang menunjukkan distribusi konsentrasi ccfDNA hemolimfa (±SE) pada kerang. Garis hitam dan merah masing-masing mewakili median dan kuartil pertama dan ketiga.
Sekitar 1% ccfDNA pada manusia dan primata memiliki sumber asing [21, 37]. Mengingat sistem peredaran darah bivalvia yang semi-terbuka, air laut yang kaya mikroba, dan distribusi ukuran ccfDNA kerang, kami berhipotesis bahwa ccfDNA hemolimfa kerang mungkin mengandung kumpulan DNA mikroba yang kaya dan beragam. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengurutkan ccfDNA hemolimfa dari sampel Aulacomya atra yang dikumpulkan dari Kepulauan Kerguelen, menghasilkan lebih dari 10 juta pembacaan, 97,6% di antaranya lolos kontrol kualitas. Pembacaan kemudian diklasifikasikan menurut sumber sendiri dan bukan diri sendiri menggunakan basis data bivalvia BLASTN dan NCBI (Gbr. S1, Informasi Tambahan).
Pada manusia, baik DNA nuklir maupun mitokondria dapat dilepaskan ke dalam aliran darah [38]. Akan tetapi, dalam penelitian ini, tidak mungkin untuk mendeskripsikan secara rinci DNA genom nuklir kerang, mengingat genom A. atra belum diurutkan atau dideskripsikan. Akan tetapi, kami dapat mengidentifikasi sejumlah fragmen ccfDNA asal kami sendiri menggunakan pustaka bivalvia (Gbr. S2, Informasi Tambahan). Kami juga mengonfirmasi keberadaan fragmen DNA asal kami sendiri melalui amplifikasi PCR terarah pada gen-gen A. atra yang telah diurutkan (Gbr. 3). Demikian pula, mengingat genom mitokondria A. atra tersedia dalam basis data publik, seseorang dapat menemukan bukti keberadaan fragmen ccfDNA mitokondria dalam hemolimfa A. atra. Keberadaan fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi melalui amplifikasi PCR (Gbr. 3).
Berbagai gen mitokondria hadir dalam hemolimfa A. atra (titik merah – nomor stok: SRX5705969) dan M. platensis (titik biru – nomor stok: SRX5705968) yang diperkuat dengan PCR. Gambar diadaptasi dari Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolimfa dari A. atra Disimpan pada kertas FTA. Gunakan pelubang 3 mm untuk menambahkan langsung ke tabung PCR yang berisi campuran PCR.
Mengingat kandungan mikroba yang melimpah di air laut, kami awalnya berfokus pada karakterisasi urutan DNA mikroba dalam hemolimfa. Untuk melakukan ini, kami menggunakan dua strategi yang berbeda. Strategi pertama menggunakan Kraken2, sebuah program klasifikasi urutan berbasis algoritma yang dapat mengidentifikasi urutan mikroba dengan akurasi yang sebanding dengan BLAST dan alat lainnya [28]. Lebih dari 6719 pembacaan ditentukan berasal dari bakteri, sementara 124 dan 64 berasal dari archaea dan virus, masing-masing (Gbr. 4). Fragmen DNA bakteri yang paling melimpah adalah Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), dan Bacteroidetes (17%) (Gbr. 4a). Distribusi ini konsisten dengan penelitian sebelumnya tentang mikrobioma kerang biru laut [39, 40]. Gammaproteobacteria adalah kelas utama Proteobacteria (44%), termasuk banyak Vibrionales (Gbr. 4b). Metode ddPCR mengkonfirmasi keberadaan fragmen DNA Vibrio dalam ccfDNA hemolimfa A. atra (Gambar 4c) [41]. Untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang asal bakteri ccfDNA, pendekatan tambahan diambil (Gambar S2, Informasi Tambahan). Dalam kasus ini, pembacaan yang tumpang tindih disusun sebagai pembacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asal diri (bivalvia) atau bukan diri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan batas dengan homologi >90%. Dalam kasus ini, pembacaan yang tumpang tindih disusun sebagai pembacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asal diri (bivalvia) atau bukan diri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan batas dengan homologi >90%. Dalam hal ini, layanan yang diperlukan untuk membantu Anda dan teman-teman Anda tombol-tombol yang dapat disesuaikan (двустворчатые моллюски) atau gunakan untuk BLASTN dan значения e 1e-3 и tingkat pengembalian > 90%. Dalam kasus ini, pembacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai pembacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asli (bivalvia) atau non-asli menggunakan BLASTN dan nilai e 1e-3 dan batas dengan homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Dalam hal ini, keterampilan yang diperlukan untuk menangani masalah dan panggilan telepon как собственные (двустворчатые моллюски) atau tidak perlu melalui panggilan e BLASTN dan 1e-3 dan порога nilai > 90%. Dalam kasus ini, pembacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai pembacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai milik sendiri (bivalvia) atau bukan asli menggunakan nilai e BLASTN dan 1e-3 serta ambang homologi >90%.Karena genom A. atra belum diurutkan, kami menggunakan strategi perakitan de novo dari perakit MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Sebanyak 147.188 kontig telah diidentifikasi sebagai dependen (bivalvia) asal. Kontig-kontig ini kemudian diledakkan dengan nilai-e 1e-10 menggunakan BLASTN dan BLASTX. Strategi ini memungkinkan kami untuk mengidentifikasi 482 fragmen non-bivalvia yang ada dalam ccfDNA A. atra. Lebih dari setengah (57%) dari fragmen DNA ini diperoleh dari bakteri, terutama dari simbion insang, termasuk simbion sulfotrofik, dan dari simbion insang Solemya velum (Gbr. 5).
Kelimpahan relatif pada tingkat tipe. B Keanekaragaman mikroba dari dua filum utama (Firmicutes dan Proteobacteria). Amplifikasi representatif ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmen gen 16S rRNA (biru) dalam tiga atra hemolimfa.
Sebanyak 482 kontig yang dikumpulkan dianalisis. Profil umum distribusi taksonomi anotasi kontig metagenomik (prokariota dan eukariota). B Distribusi terperinci fragmen DNA bakteri yang diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX.
Analisis Kraken2 juga menunjukkan bahwa ccfDNA kerang mengandung fragmen DNA arkea, termasuk fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), dan Thaurmarcheota (11%) (Gbr. 6a). Keberadaan fragmen DNA yang berasal dari Euryarchaeota dan Crenarchaeota, yang sebelumnya ditemukan dalam komunitas mikroba kerang California, seharusnya tidak mengejutkan [42]. Meskipun Euryarchaeota sering dikaitkan dengan kondisi ekstrem, kini diketahui bahwa Euryarchaeota dan Crenarcheota merupakan prokariota yang paling umum di lingkungan kriogenik laut [43, 44]. Keberadaan mikroorganisme metanogenik dalam kerang tidak mengejutkan, mengingat laporan terkini tentang kebocoran metana yang luas dari kebocoran dasar di Dataran Tinggi Kerguelen [45] dan kemungkinan produksi metana mikroba yang diamati di lepas pantai Kepulauan Kerguelen [46].
Perhatian kami kemudian beralih ke pembacaan dari virus DNA. Sejauh pengetahuan kami, ini adalah studi off-target pertama dari kandungan virus kerang. Seperti yang diharapkan, kami menemukan fragmen DNA bakteriofag (Caudovirales) (Gbr. 6b). Namun, DNA virus yang paling umum berasal dari filum nukleositovirus, yang juga dikenal sebagai virus DNA besar sitoplasma nuklir (NCLDV), yang memiliki genom terbesar dari semua virus. Dalam filum ini, sebagian besar sekuens DNA termasuk dalam famili Mimimidoviridae (58%) dan Poxviridae (21%), yang inang alaminya termasuk vertebrata dan artropoda, sementara sebagian kecil dari sekuens DNA ini termasuk alga virologi yang diketahui. Menginfeksi alga eukariotik laut. Sekuens tersebut juga diperoleh dari virus Pandora, virus raksasa dengan ukuran genom terbesar dari semua genus virus yang diketahui. Menariknya, kisaran inang yang diketahui terinfeksi virus, sebagaimana ditentukan oleh sekuensing ccfDNA hemolimfa, relatif besar (Gambar S3, Informasi Tambahan). Ini mencakup virus yang menginfeksi serangga seperti Baculoviridae dan Iridoviridae, serta virus yang menginfeksi amuba, alga, dan vertebrata. Kami juga menemukan sekuens yang cocok dengan genom Pithovirus sibericum. Pitovirus (juga dikenal sebagai "virus zombi") pertama kali diisolasi dari lapisan tanah beku abadi berusia 30.000 tahun di Siberia [47]. Dengan demikian, hasil kami konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa tidak semua spesies modern dari virus ini punah [48] dan bahwa virus ini mungkin ada di ekosistem laut subarktik terpencil.
Akhirnya, kami menguji untuk melihat apakah kami dapat menemukan fragmen DNA dari hewan multiseluler lainnya. Sebanyak 482 kontig asing diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX dengan pustaka nt, nr, dan RefSeq (genomik dan protein). Hasil kami menunjukkan bahwa di antara fragmen asing ccfDNA hewan multiseluler, DNA tulang bertulang mendominasi (Gbr. 5). Fragmen DNA dari serangga dan spesies lain juga telah ditemukan. Sebagian besar fragmen DNA belum teridentifikasi, mungkin karena kurangnya representasi sejumlah besar spesies laut dalam basis data genomik dibandingkan dengan spesies terestrial [49].
Dalam makalah ini, kami menerapkan konsep LB pada kerang, dengan menyatakan bahwa sekuensing suntikan ccfDNA hemolimfa dapat memberikan wawasan tentang komposisi ekosistem pesisir laut. Secara khusus, kami menemukan bahwa 1) hemolimfa kerang mengandung konsentrasi yang relatif tinggi (kadar mikrogram) fragmen DNA yang beredar relatif besar (~1-5 kb); 2) fragmen DNA ini bersifat independen dan non-independen 3) Di antara sumber asing fragmen DNA ini, kami menemukan DNA bakteri, arkea, dan virus, serta DNA hewan multiseluler lainnya; 4) Akumulasi fragmen ccfDNA asing ini dalam hemolimfa terjadi dengan cepat dan berkontribusi pada aktivitas penyaringan internal kerang. Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB, yang sejauh ini telah diterapkan terutama di bidang biomedis, mengkodekan sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum dieksplorasi yang dapat digunakan untuk lebih memahami interaksi antara spesies penjaga dan lingkungannya.
Selain primata, isolasi ccfDNA telah dilaporkan pada mamalia, termasuk tikus, anjing, kucing, dan kuda [50, 51, 52]. Namun, sepengetahuan kami, penelitian kami adalah yang pertama melaporkan deteksi dan pengurutan ccfDNA pada spesies laut dengan sistem sirkulasi terbuka. Fitur anatomi dan kemampuan penyaringan kerang ini mungkin, setidaknya sebagian, menjelaskan karakteristik ukuran yang berbeda dari fragmen DNA yang bersirkulasi dibandingkan dengan spesies lain. Pada manusia, sebagian besar fragmen DNA yang bersirkulasi dalam darah adalah fragmen kecil yang ukurannya berkisar antara 150 hingga 200 bp. dengan puncak maksimum 167 bp [34, 53]. Sebagian kecil tetapi signifikan dari fragmen DNA berukuran antara 300 dan 500 bp, dan sekitar 5% lebih panjang dari 900 bp. [54]. Alasan untuk distribusi ukuran ini adalah bahwa sumber utama ccfDNA dalam plasma terjadi sebagai akibat dari kematian sel, baik karena kematian sel atau karena nekrosis sel hematopoietik yang bersirkulasi pada individu yang sehat atau karena apoptosis sel tumor pada pasien kanker (dikenal sebagai DNA tumor yang bersirkulasi). , ctDNA). Distribusi ukuran ccfDNA hemolimfa yang kami temukan di kerang berkisar antara 1000 hingga 5000 bp, menunjukkan bahwa ccfDNA kerang memiliki asal yang berbeda. Ini adalah hipotesis logis, karena kerang memiliki sistem vaskular semi-terbuka dan hidup di lingkungan perairan laut yang mengandung konsentrasi tinggi DNA genom mikroba. Faktanya, percobaan laboratorium kami menggunakan DNA eksogen telah menunjukkan bahwa kerang mengumpulkan fragmen DNA di air laut, setidaknya setelah beberapa jam mereka terdegradasi setelah penyerapan seluler dan/atau dilepaskan dan/atau disimpan dalam berbagai organisasi. Mengingat kelangkaan sel (baik prokariotik maupun eukariotik), penggunaan kompartemen intravalvular akan mengurangi jumlah ccfDNA dari sumber sendiri maupun dari sumber asing. Mempertimbangkan pentingnya kekebalan bawaan bivalvia dan sejumlah besar fagosit yang bersirkulasi, kami selanjutnya berhipotesis bahwa bahkan ccfDNA asing diperkaya dalam fagosit yang bersirkulasi yang mengumpulkan DNA asing setelah menelan mikroorganisme dan/atau serpihan seluler. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa bivalvia merupakan gudang unik informasi molekuler dan memperkuat status mereka sebagai spesies penjaga.
Data kami menunjukkan bahwa pengurutan dan analisis fragmen ccfDNA hemolimfa yang berasal dari bakteri dapat memberikan informasi penting tentang flora bakteri inang dan bakteri yang ada di ekosistem laut sekitarnya. Teknik pengurutan bidikan telah mengungkap urutan bakteri komensal A. atra gill yang akan terlewatkan jika metode identifikasi 16S rRNA konvensional digunakan, sebagian karena bias pustaka referensi. Faktanya, penggunaan data LB yang kami kumpulkan dari M. platensis di lapisan remis yang sama di Kerguelen menunjukkan bahwa komposisi simbion bakteri yang terkait dengan insang sama untuk kedua spesies remis (Gbr. S4, Informasi Tambahan). Kesamaan dua remis yang berbeda secara genetik ini mungkin mencerminkan komposisi komunitas bakteri di endapan dingin, belerang, dan vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tingkat mikroorganisme pereduksi sulfur yang lebih tinggi telah dijelaskan dengan baik ketika memanen kerang dari daerah pesisir yang mengalami bioturbasi [59], seperti pesisir Port-au-France. Kemungkinan lain adalah bahwa flora kerang komensal mungkin terpengaruh oleh penularan horizontal [60, 61]. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan korelasi antara lingkungan laut, permukaan dasar laut, dan komposisi bakteri simbiotik pada kerang. Penelitian ini saat ini sedang berlangsung.
Panjang dan konsentrasi ccfDNA hemolimfa, kemudahan pemurniannya, dan kualitasnya yang tinggi untuk memungkinkan pengurutan cepat adalah beberapa dari sekian banyak keuntungan menggunakan ccfDNA kerang untuk menilai keanekaragaman hayati di ekosistem pesisir laut. Pendekatan ini khususnya efektif untuk mengkarakterisasi komunitas virus (virome) di ekosistem tertentu [62, 63]. Tidak seperti bakteri, archaea, dan eukariota, genom virus tidak mengandung gen yang dilestarikan secara filogenetik seperti urutan 16S. Hasil kami menunjukkan bahwa biopsi cair dari spesies indikator seperti kerang dapat digunakan untuk mengidentifikasi sejumlah besar fragmen virus ccfDNA yang diketahui menginfeksi inang yang biasanya menghuni ekosistem laut pesisir. Ini termasuk virus yang diketahui menginfeksi protozoa, artropoda, serangga, tanaman, dan virus bakteri (misalnya, bakteriofag). Distribusi serupa ditemukan ketika kami memeriksa virome ccfDNA hemolimfa dari kerang biru (M. platensis) yang dikumpulkan dalam lapisan kerang yang sama di Kerguelen (Tabel S2, Informasi Tambahan). Shotgun sequencing ccfDNA memang merupakan pendekatan baru yang mendapatkan momentum dalam studi virome manusia atau spesies lain [21, 37, 64]. Pendekatan ini khususnya berguna untuk mempelajari virus DNA untai ganda, karena tidak ada gen tunggal yang dilestarikan di antara semua virus DNA untai ganda, yang mewakili kelas virus yang paling beragam dan luas di Baltimore [65]. Meskipun sebagian besar virus ini tetap tidak terklasifikasi dan mungkin termasuk virus dari bagian dunia virus yang sama sekali tidak dikenal [66], kami menemukan bahwa virome dan rentang inang kerang A. atra dan M. platensis berada di antara kedua spesies tersebut. serupa (lihat gambar S3, informasi tambahan). Kesamaan ini tidak mengejutkan, karena mungkin mencerminkan kurangnya selektivitas dalam penyerapan DNA yang ada di lingkungan. Penelitian masa depan menggunakan RNA yang dimurnikan saat ini diperlukan untuk mengkarakterisasi virome RNA.
Dalam penelitian kami, kami menggunakan alur kerja yang sangat ketat yang diadaptasi dari karya Kowarski dan rekan-rekannya [37], yang menggunakan penghapusan dua langkah dari kumpulan bacaan dan kontig sebelum dan setelah perakitan ccfDNA asli, yang menghasilkan proporsi bacaan yang tidak dipetakan yang tinggi. Oleh karena itu, kami tidak dapat mengesampingkan bahwa beberapa bacaan yang tidak dipetakan ini mungkin masih memiliki asal-usulnya sendiri, terutama karena kami tidak memiliki genom referensi untuk spesies kerang ini. Kami juga menggunakan alur kerja ini karena kami khawatir tentang chimera antara bacaan diri dan bukan diri dan panjang bacaan yang dihasilkan oleh Illumina MiSeq PE75. Alasan lain untuk sebagian besar bacaan yang belum dipetakan adalah bahwa banyak mikroba laut, terutama di daerah terpencil seperti Kerguelen, belum dianotasi. Kami menggunakan Illumina MiSeq PE75, dengan asumsi panjang fragmen ccfDNA mirip dengan ccfDNA manusia. Untuk penelitian di masa mendatang, mengingat hasil kami menunjukkan bahwa ccfDNA hemolimfa memiliki pembacaan yang lebih panjang daripada manusia dan/atau mamalia, kami sarankan untuk menggunakan platform sekuensing yang lebih cocok untuk fragmen ccfDNA yang lebih panjang. Praktik ini akan mempermudah identifikasi lebih banyak indikasi untuk analisis yang lebih mendalam. Memperoleh sekuens genom nuklir A. atra lengkap yang saat ini tidak tersedia juga akan sangat memudahkan diskriminasi ccfDNA dari sumber sendiri dan bukan sumber sendiri. Mengingat penelitian kami telah difokuskan pada kemungkinan penerapan konsep biopsi cair pada kerang, kami berharap bahwa seiring konsep ini digunakan dalam penelitian di masa mendatang, alat dan jalur baru akan dikembangkan untuk meningkatkan potensi metode ini untuk mempelajari keragaman mikroba kerang. ekosistem laut.
Sebagai biomarker klinis non-invasif, peningkatan kadar ccfDNA plasma manusia dikaitkan dengan berbagai penyakit, kerusakan jaringan, dan kondisi stres [67,68,69]. Peningkatan ini dikaitkan dengan pelepasan fragmen DNA dari asalnya sendiri setelah kerusakan jaringan. Kami mengatasi masalah ini dengan menggunakan stres panas akut, di mana remis terpapar sebentar pada suhu 30 °C. Kami melakukan analisis ini pada tiga jenis remis yang berbeda dalam tiga percobaan independen. Namun, kami tidak menemukan perubahan apa pun dalam kadar ccfDNA setelah stres panas akut (lihat Gambar S5, informasi tambahan). Penemuan ini dapat menjelaskan, setidaknya sebagian, fakta bahwa remis memiliki sistem peredaran darah semi-terbuka dan mengumpulkan sejumlah besar DNA asing karena aktivitas penyaringannya yang tinggi. Di sisi lain, remis, seperti banyak invertebrata, mungkin lebih tahan terhadap kerusakan jaringan akibat stres, sehingga membatasi pelepasan ccfDNA dalam hemolimfa mereka [70, 71].
Sampai saat ini, analisis DNA keanekaragaman hayati dalam ekosistem akuatik terutama difokuskan pada metabarkode DNA lingkungan (eDNA). Namun, metode ini biasanya terbatas dalam analisis keanekaragaman hayati ketika primer digunakan. Penggunaan shotgun sequencing menghindari keterbatasan PCR dan pemilihan set primer yang bias. Jadi, dalam arti tertentu, metode kami lebih dekat dengan metode shotgun sequencing eDNA berthroughput tinggi yang baru-baru ini digunakan, yang mampu secara langsung mengurutkan DNA yang terfragmentasi dan menganalisis hampir semua organisme [72, 73]. Namun, ada sejumlah masalah mendasar yang membedakan LB dari metode eDNA standar. Tentu saja, perbedaan utama antara eDNA dan LB adalah penggunaan inang filter alami. Penggunaan spesies laut seperti spons dan bivalvia (Dresseina spp.) sebagai filter alami untuk mempelajari eDNA telah dilaporkan [74, 75]. Namun, penelitian Dreissena menggunakan biopsi jaringan tempat DNA diekstraksi. Analisis ccfDNA dari LB tidak memerlukan biopsi jaringan, peralatan khusus dan terkadang mahal serta logistik yang terkait dengan eDNA atau biopsi jaringan. Faktanya, kami baru-baru ini melaporkan bahwa ccfDNA dari LB dapat disimpan dan dianalisis dengan dukungan FTA tanpa mempertahankan rantai dingin, yang merupakan tantangan utama untuk penelitian di daerah terpencil [76]. Ekstraksi ccfDNA dari biopsi cair juga sederhana dan menyediakan DNA berkualitas tinggi untuk shotgun sequencing dan analisis PCR. Ini merupakan keuntungan besar mengingat beberapa keterbatasan teknis yang terkait dengan analisis eDNA [77]. Kesederhanaan dan biaya rendah dari metode pengambilan sampel juga sangat cocok untuk program pemantauan jangka panjang. Selain kemampuan penyaringannya yang tinggi, fitur bivalvia lain yang terkenal adalah komposisi mukopolisakarida kimiawi dari lendirnya, yang meningkatkan penyerapan virus [78, 79]. Hal ini menjadikan bivalvia sebagai penyaring alami yang ideal untuk mengkarakterisasi keanekaragaman hayati dan dampak perubahan iklim dalam ekosistem perairan tertentu. Meskipun keberadaan fragmen DNA yang berasal dari inang dapat dilihat sebagai keterbatasan metode dibandingkan dengan eDNA, biaya yang terkait dengan memiliki ccfDNA asli tersebut dibandingkan dengan eDNA secara bersamaan dapat dipahami karena banyaknya informasi yang tersedia untuk studi kesehatan. mengimbangi inang. Ini termasuk keberadaan sekuens virus yang terintegrasi ke dalam genom inang inang. Ini terutama penting untuk kerang, mengingat keberadaan retrovirus leukemia yang ditularkan secara horizontal pada bivalvia [80, 81]. Keuntungan lain dari LB dibandingkan eDNA adalah bahwa ia memanfaatkan aktivitas fagositosis sel darah yang bersirkulasi dalam hemolimfa, yang menelan mikroorganisme (dan genomnya). Fagositosis adalah fungsi utama sel darah pada bivalvia [82]. Akhirnya, metode ini memanfaatkan kapasitas penyaringan kerang yang tinggi (rata-rata 1,5 l/jam air laut) dan sirkulasi dua hari, yang meningkatkan pencampuran berbagai lapisan air laut, yang memungkinkan penangkapan eDNA heterolog. [83, 84]. Dengan demikian, analisis ccfDNA kerang merupakan cara yang menarik mengingat dampak gizi, ekonomi, dan lingkungan dari kerang. Mirip dengan analisis LB yang dikumpulkan dari manusia, metode ini juga membuka kemungkinan untuk mengukur perubahan genetik dan epigenetik dalam DNA inang sebagai respons terhadap zat eksogen. Misalnya, teknologi sekuensing generasi ketiga dapat dipertimbangkan untuk melakukan analisis metilasi genom secara luas dalam ccfDNA asli menggunakan sekuensing nanopore. Proses ini harus difasilitasi oleh fakta bahwa panjang fragmen ccfDNA kerang idealnya kompatibel dengan platform sekuensing bacaan panjang yang memungkinkan analisis metilasi DNA genom secara luas dari satu kali sekuensing tanpa perlu transformasi kimia.85,86] Ini adalah kemungkinan yang menarik, karena telah ditunjukkan bahwa pola metilasi DNA mencerminkan respons terhadap stres lingkungan dan bertahan selama beberapa generasi. Oleh karena itu, hal ini dapat memberikan wawasan berharga tentang mekanisme yang mendasari yang mengatur respons setelah paparan perubahan iklim atau polutan [87]. Namun, penggunaan LB bukannya tanpa batasan. Tak perlu dikatakan, ini memerlukan keberadaan spesies indikator dalam ekosistem. Seperti disebutkan di atas, penggunaan LB untuk menilai keanekaragaman hayati ekosistem tertentu juga memerlukan jalur bioinformatika yang ketat yang memperhitungkan keberadaan fragmen DNA dari sumbernya. Masalah utama lainnya adalah ketersediaan genom referensi untuk spesies laut. Diharapkan bahwa inisiatif seperti Marine Mammal Genomes Project dan proyek Fish10k yang baru-baru ini didirikan [88] akan memfasilitasi analisis tersebut di masa mendatang. Penerapan konsep LB pada organisme penyaring makanan laut juga kompatibel dengan kemajuan terbaru dalam teknologi sekuensing, membuatnya sangat cocok untuk pengembangan biomarker multi-ohm untuk memberikan informasi penting tentang kesehatan habitat laut sebagai respons terhadap stres lingkungan.
Data pengurutan genom telah disimpan di Arsip Pembacaan Urutan NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bawah Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak perubahan iklim terhadap kehidupan dan ekosistem laut. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, dkk. Pertimbangkan dampak gabungan dari perubahan iklim dan pemicu stres lokal lainnya pada lingkungan laut. lingkungan ilmiah umum. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, dkk. ). Sains tanggal 1 Maret. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleransi panas yang berkurang dalam kondisi stres panas yang berulang menjelaskan tingginya angka kematian kerang biru di musim panas. Laporan ilmiah 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, dkk. Perubahan terkini dalam frekuensi, penyebab, dan tingkat kematian hewan. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, dkk. Berbagai patogen non-spesies mungkin telah menyebabkan kematian massal Pinna nobilis. Kehidupan. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Dampak potensial perubahan iklim terhadap penyakit zoonosis Arktik. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. dkk. Kerang biru (Mytilus edulis spp.) sebagai organisme sinyal dalam pemantauan polusi pesisir: tinjauan. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair dalam pengobatan kanker. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, dkk. Pematangan biopsi cair: Memungkinkan DNA tumor bersirkulasi. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukleat dalam plasma manusia. Risalah rapat anak perusahaan Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran baru DNA bebas sel sebagai penanda molekuler untuk pengobatan kanker. Kuantifikasi analisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cair memasuki klinik – masalah penerapan dan tantangan masa depan. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dan lainnya. DNA janin terdapat dalam plasma dan serum ibu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studi tentang perjalanan kehamilan dan komplikasinya menggunakan RNA ekstraseluler yang beredar dalam darah wanita selama kehamilan. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, dkk. Biopsi cair: DNA bebas sel donor digunakan untuk mendeteksi lesi alogenik pada cangkok ginjal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dalam diagnostik prenatal: pengurutan genom plasma ibu. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, dkk. Deteksi patogen cepat dengan pengurutan metagenomik generasi berikutnya dari cairan tubuh yang terinfeksi. Nat Medicine. 2021;27:115-24.