Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော browser ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ render လုပ်ပါမည်။
အရည်တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်း (LB) သည် ဇီဝဆေးပညာနယ်ပယ်တွင် အလျင်အမြန် ရေပန်းစားလာနေသော အယူအဆတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤအယူအဆသည် အဓိကအားဖြင့် တစ်ရှူးအမျိုးမျိုးတွင် ဆဲလ်သေဆုံးပြီးနောက် အပိုင်းအစငယ်များအဖြစ် ထုတ်လွှတ်သော လည်ပတ်နေသော ဆဲလ်ပြင်ပ DNA (ccfDNA) အပိုင်းအစများကို ထောက်လှမ်းခြင်းအပေါ် အခြေခံထားသည်။ ဤအပိုင်းအစများ၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်သည် ပြင်ပ (ပြင်ပ) တစ်ရှူးများ သို့မဟုတ် သက်ရှိများမှ ဆင်းသက်လာသည်။ လက်ရှိလုပ်ငန်းတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤအယူအဆကို ၎င်းတို့၏ ပင်လယ်ရေစစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းမြင့်မားမှုအတွက် လူသိများသော ကင်းစောင့်မျိုးစိတ်တစ်ခုဖြစ်သည့် mussels တွင် အသုံးချခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲမှုအကြောင်း အချက်အလက်များပေးရန်အတွက် အရင်းအမြစ်အမျိုးမျိုးမှ ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ DNA အပိုင်းအစများကို ဖမ်းယူရန် သဘာဝစစ်ထုတ်ကိရိယာများအဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းကို mussels ၏စွမ်းရည်ကို အသုံးပြုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ mussel hemolymph တွင် 1 kb မှ 5 kb အထိ အရွယ်အစားများစွာကွဲပြားသော DNA အပိုင်းအစများပါဝင်ကြောင်း ပြသသည်။ Shotgun sequencing အရ DNA အပိုင်းအစများစွာသည် ပြင်ပအဏုဇီဝများမှ ဆင်းသက်လာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ၎င်းတို့ထဲတွင် ဘက်တီးရီးယား၊ archaea နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်များမှ DNA အပိုင်းအစများကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ကမ်းရိုးတန်းပင်လယ်ဂေဟစနစ်များတွင် အဖြစ်များသော အိမ်ရှင်အမျိုးမျိုးကို ကူးစက်သည်ဟု သိရှိထားသော ဗိုင်းရပ်စ်များ ပါဝင်သည်။ အဆုံးသတ်အနေနဲ့ ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ လေ့လာမှုအရ မုတ်ကောင်တွေမှာ အသုံးပြုတဲ့ LB သဘောတရားဟာ ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်း ဂေဟစနစ်တွေမှာ ရှိတဲ့ အဏုဇီဝမျိုးကွဲတွေအကြောင်း ကြွယ်ဝပေမယ့် မရှာဖွေရသေးတဲ့ အသိပညာရင်းမြစ်တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ပြသနေပါတယ်။
အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများအပေါ် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု (CC) ၏ သက်ရောက်မှုသည် အလျင်အမြန် ကြီးထွားလာသော သုတေသနနယ်ပယ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ကမ္ဘာကြီးပူနွေးလာမှုသည် အရေးကြီးသော ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဖိစီးမှုများကိုသာ ဖြစ်စေသည်မဟုတ်ဘဲ၊ အဏ္ဏဝါသက်ရှိများ၏ အပူတည်ငြိမ်မှု၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များကို တွန်းအားပေးပြီး မျိုးစိတ်အများအပြား၏ နေထိုင်ရာကို ထိခိုက်စေကာ ၎င်းတို့အား ပိုမိုအဆင်ပြေသော အခြေအနေများကို ရှာဖွေရန် တွန်းအားပေးသည် [1၊ 2]။ metazoans များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို ထိခိုက်စေခြင်းအပြင်၊ CC သည် အိမ်ရှင်-အဏုဇီဝ အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု၏ နူးညံ့သိမ်မွေ့သော ဟန်ချက်ညီမှုကို နှောင့်ယှက်သည်။ ဤအဏုဇီဝ dysbacteriosis သည် အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များအတွက် ပြင်းထန်သော ခြိမ်းခြောက်မှုတစ်ခု ဖြစ်စေသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းသည် အဏ္ဏဝါသက်ရှိများအား ကူးစက်တတ်သော ရောဂါပိုးများကို ပိုမိုလွယ်ကူစွာ ခံရစေနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည် [3၊ 4]။ SS သည် အစုလိုက်အပြုံလိုက်သေဆုံးမှုများတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်ဟု ယုံကြည်ရပြီး ၎င်းသည် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များကို စီမံခန့်ခွဲရန်အတွက် ပြင်းထန်သော ပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည် [5၊ 6]။ အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်များစွာ၏ စီးပွားရေး၊ ဂေဟဗေဒနှင့် အာဟာရဆိုင်ရာ သက်ရောက်မှုများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင် ၎င်းသည် အရေးကြီးသော ပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည်။ ၎င်းသည် CK ၏ သက်ရောက်မှုများသည် ပိုမိုချက်ချင်းနှင့် ပြင်းထန်သော ဝင်ရိုးစွန်းဒေသများတွင် နေထိုင်သော bivalves များအတွက် အထူးသဖြင့် မှန်ကန်ပါသည် [6၊ 7]။ အမှန်မှာ၊ Mytilus spp ကဲ့သို့သော bivalves များကို အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များအပေါ် CC ၏ သက်ရောက်မှုများကို စောင့်ကြည့်ရန် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုကြသည်။ အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ၊ ၎င်းတို့၏ကျန်းမာရေးကိုစောင့်ကြည့်ရန်အတွက် ဇီဝအမှတ်အသားများစွာကို တီထွင်ထားပြီး၊ အင်ဇိုင်းလှုပ်ရှားမှု သို့မဟုတ် ဆဲလ်ရှင်သန်နိုင်မှုနှင့် phagocytic လှုပ်ရှားမှုကဲ့သို့သော ဆဲလ်လုပ်ဆောင်ချက်များအပေါ် အခြေခံ၍ လုပ်ဆောင်နိုင်သော ဇီဝအမှတ်အသားများပါဝင်သည့် နှစ်ထပ်ချဉ်းကပ်မှုကို မကြာခဏအသုံးပြုလေ့ရှိသည် [8]။ ဤနည်းလမ်းများသည် ပင်လယ်ရေများစွာစုပ်ယူပြီးနောက် ပျော့ပျောင်းသောတစ်ရှူးများတွင်စုပုံလာသော သီးခြားဖိအားညွှန်းကိန်းများ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုင်းတာခြင်းလည်း ပါဝင်သည်။ သို့သော်၊ bivalves များ၏ မြင့်မားသောစစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းနှင့် semi-open circulatory system သည် လူနာစီမံခန့်ခွဲမှုအတွက် ရိုးရှင်းပြီး အနည်းဆုံးကျူးကျော်ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည့် အရည်တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်း (LB) ၏ အယူအဆကို အသုံးပြု၍ hemolymph biomarkers အသစ်များ တီထွင်ရန် အခွင့်အရေးပေးသည်။ သွေးနမူနာများ [9, 10]။ လူ့ LB တွင် လည်ပတ်နေသော မော်လီကျူးအမျိုးအစားများစွာကို တွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း၊ ဤအယူအဆသည် အဓိကအားဖြင့် ပလာစမာတွင် လည်ပတ်နေသော extracellular DNA (ccfDNA) အပိုင်းအစများ၏ DNA sequencing ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအပေါ် အခြေခံသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ လူ့ပလာစမာတွင် လည်ပတ်နေသော DNA ရှိနေခြင်းကို ၂၀ ရာစုအလယ်ပိုင်းမှစ၍ သိရှိခဲ့ကြသည် [11]၊ သို့သော် မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်းမှသာ high-throughput sequencing နည်းလမ်းများ ပေါ်ပေါက်လာခြင်းကြောင့် ccfDNA ကို အခြေခံ၍ ဆေးခန်းရောဂါရှာဖွေခြင်းသို့ ဦးတည်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်သေဆုံးပြီးနောက် ဂျီနိုမစ် DNA (နျူကလီးယားနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယ) ၏ တိတ်တဆိတ်ထုတ်လွှတ်မှုကြောင့် ဤလည်ပတ်နေသော DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းမှာ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် ဖြစ်သည်။ ကျန်းမာသောလူများတွင် ccfDNA ၏ ပါဝင်မှုသည် ပုံမှန်အားဖြင့် နိမ့်ကျနေပါသည် (<10 ng/mL) သို့သော် ရောဂါဗေဒအမျိုးမျိုးခံစားနေရသူများ သို့မဟုတ် စိတ်ဖိစီးမှုများခံစားနေရသူများတွင် ၅-၁၀ ဆ မြင့်တက်လာနိုင်ပြီး တစ်ရှူးများ ပျက်စီးစေပါသည်။ ကျန်းမာသောလူများတွင် ccfDNA ၏ ပါဝင်မှုသည် ပုံမှန်အားဖြင့် နိမ့်ကျနေပါသည် (<10 ng/mL) သို့သော် ရောဂါဗေဒအမျိုးမျိုးခံစားနေရသူများ သို့မဟုတ် စိတ်ဖိစီးမှုများခံစားနေရသူများတွင် ၅-၁၀ ဆ မြင့်တက်လာနိုင်ပြီး တစ်ရှူးများ ပျက်စီးစေပါသည်။ У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 ральруы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ကျန်းမာသောလူများတွင် cccDNA ပါဝင်မှုသည် ပုံမှန်အားဖြင့် နိမ့်ကျလေ့ရှိသည် (<10 ng/mL)၊ သို့သော် ရောဂါဗေဒအမျိုးမျိုးရှိသော သို့မဟုတ် တစ်ရှူးပျက်စီးမှုကို ဖြစ်စေသော ဖိစီးမှုခံစားနေရသော လူနာများတွင် ၅-၁၀ ဆ မြင့်တက်လာနိုင်သည်။在健康个体中，ccfDNA的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患倅5倍，从而导致组织损伤။在健康个体中，ccfdna的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承受厸力患5-10倍，从而组织。。 损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раиз упт различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ကျန်းမာသောလူများတွင် ccfDNA ပါဝင်မှုမှာ များသောအားဖြင့် နိမ့်ကျလေ့ရှိသည် (<10 ng/ml)၊ သို့သော် ရောဂါဗေဒ သို့မဟုတ် ဖိစီးမှုအမျိုးမျိုးရှိသော လူနာများတွင် ၅-၁၀ ဆ မြင့်တက်လာနိုင်ပြီး တစ်ရှူးများ ပျက်စီးစေနိုင်သည်။ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ အရွယ်အစားသည် ကျယ်ပြန့်စွာ ကွဲပြားသော်လည်း ပုံမှန်အားဖြင့် 150 မှ 200 bp အထိ ရှိသည်။ [12]။ ပုံမှန် သို့မဟုတ် အသွင်ပြောင်းထားသော အိမ်ရှင်ဆဲလ်များမှ ccfDNA ကိုယ်တိုင်ဆင်းသက်လာသော ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် နျူကလီးယားနှင့်/သို့မဟုတ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မျိုးရိုးဗီဇတွင် တွေ့ရှိရသော မျိုးရိုးဗီဇနှင့် အပိုမျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ ပြောင်းလဲမှုများကို ထောက်လှမ်းနိုင်ပြီး ဆရာဝန်များအနေဖြင့် မော်လီကျူးပစ်မှတ်ထားသော ကုထုံးများကို ရွေးချယ်ရာတွင် အထောက်အကူဖြစ်စေသည် [13]။ သို့သော် ccfDNA ကို ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ် သန္ဓေသားဆဲလ်များမှ သို့မဟုတ် အစားထိုးအင်္ဂါများမှ ccfDNA ကဲ့သို့သော ပြင်ပရင်းမြစ်များမှ ရယူနိုင်သည် [14,15,16,17]။ ccfDNA သည် ကူးစက်တတ်သော အရာ (ပြင်ပ) ၏ နျူကလစ်အက်ဆစ်များ ရှိနေခြင်းကို ထောက်လှမ်းရန်အတွက် အရေးကြီးသော အချက်အလက်ရင်းမြစ်တစ်ခုလည်းဖြစ်ပြီး ၎င်းသည် သွေးယဉ်ကျေးမှုဖြင့် မဖော်ထုတ်နိုင်သော ကျယ်ပြန့်သော ရောဂါပိုးများကို ကျူးကျော်ဝင်ရောက်ခြင်းမရှိဘဲ ထောက်လှမ်းနိုင်စေပြီး ကူးစက်ခံရသော တစ်ရှူးများ၏ ကျူးကျော်ဝင်ရောက်သော တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်းကို ရှောင်ရှားနိုင်စေသည် [18]။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ လူ့သွေးတွင် ဗိုင်းရပ်စ်နှင့် ဘက်တီးရီးယား ရောဂါပိုးများကို ဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် အချက်အလက်ရင်းမြစ် ကြွယ်ဝစွာ ပါဝင်ကြောင်းနှင့် လူ့ပလာစမာတွင် တွေ့ရှိရသော ccfDNA ၏ 1% ခန့်သည် ပြင်ပရင်းမြစ်မှ ဖြစ်သည်ကို ပြသထားသည် [19]။ ဤလေ့လာမှုများက သက်ရှိတစ်ခု၏ လည်ပတ်နေသော အဏုဇီဝပိုးမွှားများ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲမှုကို ccfDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်နိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ သို့သော် မကြာသေးမီကအထိ ဤသဘောတရားကို လူသားများတွင်သာ အသုံးပြုခဲ့ပြီး အခြားကျောရိုးရှိသတ္တဝါများတွင် အနည်းငယ်သာ အသုံးပြုခဲ့သည် [20၊ 21]။
လက်ရှိစာတမ်းတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LB အလားအလာကို အသုံးပြု၍ လွန်ခဲ့သောနှစ်ပေါင်း ၃၅ သန်းက ဖွဲ့စည်းခဲ့သော ကုန်းပြင်မြင့်ကြီးတစ်ခုပေါ်ရှိ ကျွန်းစုတစ်ခုဖြစ်သည့် subantarctic Kerguelen Islands တွင် တွေ့ရလေ့ရှိသော တောင်ပိုင်းမျိုးစိတ် Aulacomya atra ၏ ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါသည်။ မီးတောင်ပေါက်ကွဲမှု။ in vitro စမ်းသပ်စနစ်ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ပင်လယ်ရေရှိ DNA အပိုင်းအစများကို mussels များက လျင်မြန်စွာ စုပ်ယူပြီး hemolymph compartment ထဲသို့ ဝင်ရောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ Shotgun sequencing အရ mussel hemolymph ccfDNA တွင် ၎င်း၏ကိုယ်ပိုင်နှင့် ကိုယ်ပိုင်မဟုတ်သော DNA အပိုင်းအစများ ပါဝင်ကြောင်း၊ ၎င်းတွင် symbiotic ဘက်တီးရီးယားများနှင့် အအေးမီးတောင်ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များ၏ ပုံမှန် biomes မှ DNA အပိုင်းအစများ ပါဝင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ Hemolymph ccfDNA တွင် host range အမျိုးမျိုးရှိသော ဗိုင်းရပ်စ်များမှ ဆင်းသက်လာသော ဗိုင်းရပ်စ် sequences များလည်း ပါဝင်သည်။ အရိုးငါးများ၊ ပင်လယ်နှင်းဆီပန်းများ၊ ရေညှိများနှင့် အင်းဆက်ပိုးမွှားများကဲ့သို့သော multicellular တိရစ္ဆာန်များမှ DNA အပိုင်းအစများကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် LB သဘောတရားကို ပင်လယ်ကျောရိုးမဲ့သတ္တဝါများတွင် အောင်မြင်စွာအသုံးချနိုင်ပြီး ပင်လယ်ဂေဟစနစ်များတွင် ကြွယ်ဝသော genomic repertoire ကို ဖန်တီးနိုင်ကြောင်း ပြသသည်။
အရွယ်ရောက်ပြီးသူများ (အရှည် ၅၅-၇၀ မီလီမီတာ) Mytilus platensis (M. platensis) နှင့် Aulacomya atra (A. atra) တို့ကို ၂၀၁၈ ခုနှစ် ဒီဇင်ဘာလတွင် Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.) ရှိ ဒီရေတက်ကျောက်ဆောင်ကမ်းရိုးတန်းများမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ အခြား အရွယ်ရောက်ပြီးသော အပြာရောင်မုတ်ကောင်များ (Mytilus spp.) ကို စီးပွားဖြစ်ပေးသွင်းသူ (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) မှ ရရှိခဲ့ပြီး 32‰ အတုဆားရည် ၁၀-၂၀ လီတာပါဝင်သော အပူချိန်ထိန်းချုပ်ထားသော (၄°C) လေဝင်လေထွက်ကောင်းသော တိုင်ကီထဲတွင် ထည့်ထားသည်။ (အတုပင်လယ်ဆား Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA)။ စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီအတွက် တစ်ဦးချင်းခရုခွံများ၏ အရှည်နှင့် အလေးချိန်ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။
ဤပရိုဂရမ်အတွက် အခမဲ့ open access protocol ကို အွန်လိုင်းတွင် ရရှိနိုင်ပါသည် (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် LB hemolymph ကို [22] တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း abductor ကြွက်သားများမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ hemolymph ကို 1200×g တွင် 3 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ကြည်လင်စေခဲ့ပြီး supernatant ကို အသုံးမပြုမချင်း (-20°C) အေးခဲစေခဲ့သည်။ cfDNA ကို သီးခြားခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ရန်အတွက်၊ နမူနာများ (1.5-2.0 ml) ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ကို အသုံးပြု၍ အရည်ပျော်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ နောက်ထပ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု မပြုလုပ်မချင်း ccfDNA ကို -80°C တွင် သိမ်းဆည်းခဲ့သည်။ အချို့သော စမ်းသပ်မှုများတွင် ccfDNA ကို QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) ကို အသုံးပြု၍ သီးခြားခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ခဲ့သည်။ သန့်စင်ထားသော DNA ကို စံ PicoGreen assay ကို အသုံးပြု၍ ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ccfDNA ၏ အပိုင်းအစဖြန့်ဖြူးမှုကို High Sensitivity DNA Kit ကိုအသုံးပြု၍ Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ကို အသုံးပြု၍ capillary electrophoresis ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း ccfDNA နမူနာ 1 µl ကို အသုံးပြု၍ assay ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
hemolymph ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ sequencing အတွက်၊ Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) သည် Illumina MiSeq PE75 kit ၏ Illumina DNA Mix kit ကို အသုံးပြု၍ shotgun libraries များကို ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ စံ adapter (BioO) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ Raw data ဖိုင်များကို NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 နှင့် SRR8924809) မှ ရရှိနိုင်ပါသည်။ အခြေခံဖတ်ရှုမှုအရည်အသွေးကို FastQC [23] ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ Trimmomatic [24] ကို clipping adapters များနှင့် အရည်အသွေးညံ့ဖျင်းသော ဖတ်ရှုမှုများအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ တွဲဖက်အစွန်းများပါရှိသော Shotgun ဖတ်ရှုမှုများကို FLASH ဖြင့် မကိုက်ညီမှုများကို ရှောင်ရှားရန် အနည်းဆုံး 20 bp ထပ်နေသော ပိုရှည်သော single ဖတ်ရှုမှုများအဖြစ် ပေါင်းစည်းခဲ့သည် [25]။ ပေါင်းစည်းထားသော ဖတ်ရှုမှုများကို bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့ပြီး ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော sequence များကို masking ကို DUST [26] ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ပေါင်းစည်းထားသော ဖတ်ရှုမှုများကို bivalve NCBI Taxonomy database (e value < 1e−3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့ပြီး ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော sequence များကို masking ကို DUST [26] ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуслтвор (значение e < 1e-3 နှင့် 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпольностей низкой сложности было выпольнеспам [၂၆]။ NCBI bivalve taxonomy database (e value < 1e-3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် စုပေါင်းဖတ်ရှုမှုများကို မှတ်ချက်ပြုခဲ့ပြီး၊ ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော sequence masking ကို DUST [26] ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။使用双壳类NCBI 分类数据库 (e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数用 并使进行低复杂度序列的掩蔽။使用双壳类 ncbi 分类（（<1e-3和 90%同源）用用用注释合并读数，幨俽6用 ဖုန်မှုန့်复杂度序列的。。。掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽潩蔽掩掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннылвсус NCBI (значение e <1e-3 နှင့် 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпосьностей низкой сложности было выпосьненно [၂၆]။ NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် စုပေါင်းဖတ်ရှုမှုများကို မှတ်ချက်ပြုခဲ့ပြီး DUST [26] ကို အသုံးပြု၍ ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော sequence masking ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဖတ်ရှုမှုများကို အုပ်စုနှစ်စုခွဲခြားထားသည်- bivalve sequences နှင့်ဆက်စပ်သော (ဤနေရာတွင် self-reads ဟုခေါ်သည်) နှင့် မသက်ဆိုင်သော (non-self-reads)။ contigs များထုတ်လုပ်ရန် MEGAHIT ကို အသုံးပြု၍ အုပ်စုနှစ်စုကို သီးခြားစီစုစည်းထားသည် [27]။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ဂြိုလ်သား microbiome ဖတ်ရှုမှုများ၏ taxonomic distribution ကို Kraken2 [28] ကို အသုံးပြု၍ အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့ပြီး Galaxy ပေါ်ရှိ Krona pie chart ဖြင့် ဂရပ်ဖစ်ဖြင့်ကိုယ်စားပြုခဲ့သည် [29၊ 30]။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ကနဦးစမ်းသပ်မှုများမှ အကောင်းဆုံး kmers များကို kmers-59 အဖြစ် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် နောက်ဆုံးမှတ်ချက်အတွက် BLASTN (bivalve NCBI database၊ e value < 1e−10 နှင့် 60% homology) နှင့် alignment လုပ်ခြင်းဖြင့် self contig များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် နောက်ဆုံးမှတ်ချက်အတွက် BLASTN (bivalve NCBI database၊ e value < 1e−10 နှင့် 60% homology) နှင့် alignment လုပ်ခြင်းဖြင့် self contig များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данныюх двустворча двустворча значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. ထို့နောက် နောက်ဆုံးမှတ်ချက်အတွက် BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 and 60% homology) နှင့် တိုက်ဆိုင်စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် self-contig များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库၊ အီး 值< 1e-10 和60%同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释။然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库၊ အီး 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления NBI с для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)။ ထို့နောက် BLASTN (NCBI bivalve database၊ e value <1e-10 နှင့် 60% homology) နှင့် တိုက်ဆိုင်စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် နောက်ဆုံးမှတ်ချက်ပေးရန် self-contig များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ nonself group contig များကို BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 and 60% homology) ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့သည်။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ nonself group contig များကို BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 and 60% homology) ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့သည်။ Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, зна <чиоя-1гоме 60%)။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ပြင်ပအုပ်စုဆက်စပ်မှုများကို BLASTN (NT NCBI database၊ e value <1e-10 နှင့် 60% homology) ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့သည်။平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值<1e-10和60%同源性）注释非自身组重叠群။平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值<1e-10和60%同源性）注释非自身组重叠群။ Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (базачни даненны) <1e-10 နှင့် гомология 60%)။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ non-self group contig များကို BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 and 60% homology) ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့သည်။ BLASTX ကို nr နှင့် RefSeq ပရိုတင်း NCBI ဒေတာဘေ့စ်များ (e တန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% homology) ကို အသုံးပြု၍ nonself contigs များတွင်လည်း ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ BLASTX ကို nr နှင့် RefSeq ပရိုတင်း NCBI ဒေတာဘေ့စ်များ (e တန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% homology) ကို အသုံးပြု၍ nonself contigs များတွင်လည်း ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (зна<1e-1e) гомология 60%)။ BLASTX ကို nr နှင့် RefSeq NCBI ပရိုတင်းဒေတာဘေ့စ်များ (e တန်ဖိုး < 1e-10 နှင့် 60% homology) ကို အသုံးပြု၍ non-self contig များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 倧源)还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 倧源) BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значиогом 60%)။ BLASTX ကို nr နှင့် RefSeq NCBI ပရိုတင်းဒေတာဘေ့စ်များ (e တန်ဖိုး <1e-10 နှင့် 60% homology) ကို အသုံးပြု၍ non-self contig များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။non-self-contigs များ၏ BLASTN နှင့် BLASTX pool များသည် နောက်ဆုံး contigs များကို ကိုယ်စားပြုသည် (Supplementary file ကိုကြည့်ပါ)။
PCR အတွက်အသုံးပြုသော primer များကို ဇယား S1 တွင်ဖော်ပြထားသည်။ Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ကို ccfDNA ပစ်မှတ်ဂျင်းများကို များပြားစေရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။ အောက်ပါတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို အသုံးပြုခဲ့သည်- ၉၅°C တွင် ၃ မိနစ် denaturation၊ ၉၅°C တွင် ၁ မိနစ်၊ ၁ မိနစ် annealing အပူချိန်သတ်မှတ်ခြင်း၊ ၇၂°C တွင် ၁ မိနစ် elongation၊ ၃၅ cycles နှင့် နောက်ဆုံးတွင် ၁၀ မိနစ်အတွင်း ၇၂°C။ PCR ထုတ်ကုန်များကို ၉၅ V တွင် SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ပါဝင်သော agarose gels (1.5%) တွင် electrophoresis ဖြင့် ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။
မုတ်ကောင်များ (Mytilus spp.) ကို အောက်ဆီဂျင်ပါဝင်သော ပင်လယ်ရေ 500 ml (32 PSU) တွင် 4°C တွင် 24 နာရီကြာ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ human galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) ကို encode လုပ်ထားသော insert ပါ၀င်သည့် Plasmid DNA ကို 190 μg/μl ၏ နောက်ဆုံးပါဝင်မှုဖြင့် vial ထဲသို့ ထည့်ခဲ့သည်။ DNA ထပ်ထည့်ခြင်းမရှိဘဲ တူညီသောအခြေအနေများတွင် ပေါင်းထည့်ထားသော မုတ်ကောင်များသည် ထိန်းချုပ်ထားသည်။ တတိယထိန်းချုပ်ကန်တွင် မုတ်ကောင်မပါသော DNA ပါဝင်သည်။ ပင်လယ်ရေရှိ DNA ၏ အရည်အသွေးကို စောင့်ကြည့်ရန်အတွက် သတ်မှတ်ထားသောအချိန်တွင် တိုင်ကီတစ်ခုစီမှ ပင်လယ်ရေနမူနာများ (20 μl; သုံးကြိမ်ထပ်လုပ်ခြင်း) ကို ရယူခဲ့သည်။ plasmid DNA ခြေရာခံနိုင်မှုအတွက် LB မုတ်ကောင်များကို သတ်မှတ်ထားသောအချိန်များတွင် စုဆောင်းပြီး qPCR နှင့် ddPCR ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ပင်လယ်ရေတွင် ဆားပါဝင်မှု မြင့်မားသောကြောင့် PCR assays အားလုံးမပြုလုပ်မီ aliquots များကို PCR အရည်အသွေးရှိသောရေ (1:10) တွင် ရောစပ်ခဲ့သည်။
ဒစ်ဂျစ်တယ် droplet PCR (ddPCR) ကို BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အကောင်းဆုံးအပူချိန်ကို ဆုံးဖြတ်ရန် အပူချိန်ပရိုဖိုင်ကို အသုံးပြုပါ (ဇယား S1)။ QX200 drop generator (BioRad) ကို အသုံးပြု၍ အစက်များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ ddPCR ကို အောက်ပါအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်- ၉၅°C တွင် ၅ မိနစ်၊ ၉၅°C တွင် ၃၀ စက္ကန့် ၅၀ စက်ဝန်းနှင့် ၁ မိနစ်အတွက် ပေးထားသော အပူပေးအပူချိန်နှင့် ၇၂°C တွင် ၃၀ စက္ကန့်၊ ၄°C တွင် ၅ မိနစ်နှင့် ၉၀°C တွင် ၅ မိနစ်အတွင်း။ အစက်အရေအတွက်နှင့် အပြုသဘောဆောင်သော တုံ့ပြန်မှုများ (မိတ္တူအရေအတွက်/µl) ကို QX200 drop reader (BioRad) ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ အစက် ၁၀,၀၀၀ အောက်ရှိသော နမူနာများကို ငြင်းပယ်ခဲ့သည်။ ddPCR ကို လုပ်ဆောင်တိုင်း ပုံစံထိန်းချုပ်မှုကို မလုပ်ဆောင်ခဲ့ပါ။
qPCR ကို Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) နှင့် LGALS7 သီးသန့် primer များကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ quantitative PCR အားလုံးကို QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ကို အသုံးပြု၍ 20 µl တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ qPCR ကို 95°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ incubation ဖြင့် စတင်ခဲ့ပြီး 95°C တွင် 10 စက္ကန့်နှင့် 60°C တွင် 60 စက္ကန့်ကြာ 40 cycles ဖြင့် data collection တစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ qPCR ၏အဆုံးတွင် 95°C တွင် 5 စက္ကန့်၊ 65°C တွင် 60 စက္ကန့်နှင့် 97°C တွင် အဆက်မပြတ်တိုင်းတာမှုများကို အသုံးပြု၍ Melting curves များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ control sample များမှအပ qPCR တစ်ခုစီကို triplicate ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
မုတ်ကောင်များသည် ၎င်းတို့၏ စစ်ထုတ်မှုနှုန်းမြင့်မားသည်ဟု လူသိများသောကြောင့်၊ ပင်လယ်ရေတွင်ရှိသော DNA အပိုင်းအစများကို စစ်ထုတ်ပြီး ထိန်းသိမ်းနိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ ဦးစွာ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ ဤအပိုင်းအစများသည် ၎င်းတို့၏ တစ်ဝက်ပွင့် ပြန်ရည်စနစ်တွင် စုပုံနေခြင်း ရှိ၊ မရှိကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ စိတ်ဝင်စားခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် အပြာရောင် မုတ်ကောင်ကန်များထဲသို့ ထည့်ထားသော ပျော်ဝင်နိုင်သော DNA အပိုင်းအစများ၏ ကံကြမ္မာကို ခြေရာခံခြင်းဖြင့် ဤပြဿနာကို စမ်းသပ်မှုအရ ဖြေရှင်းခဲ့ပါသည်။ DNA အပိုင်းအစများကို ခြေရာခံရာတွင် လွယ်ကူချောမွေ့စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူ့ galectin-7 မျိုးဗီဇပါရှိသော ပြင်ပ (ကိုယ်ပိုင်မဟုတ်) plasmid DNA ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ ddPCR သည် ပင်လယ်ရေနှင့် မုတ်ကောင်များတွင် plasmid DNA အပိုင်းအစများကို ခြေရာခံပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ရလဒ်များအရ မုတ်ကောင်များ မရှိချိန်တွင် ပင်လယ်ရေရှိ DNA အပိုင်းအစများ၏ ပမာဏသည် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ (၇ ရက်အထိ) တည်ငြိမ်နေပါက မုတ်ကောင်များ ရှိနေချိန်တွင် ဤအဆင့်သည် ၈ နာရီအတွင်း လုံးဝနီးပါး ပျောက်ကွယ်သွားကြောင်း ပြသသည် (ပုံ ၁က၊ ခ)။ ပြင်ပ DNA အပိုင်းအစများကို intravalvular fluid နှင့် hemolymph တွင် ၁၅ မိနစ်အတွင်း အလွယ်တကူ တွေ့ရှိနိုင်သည် (ပုံ ၁ဂ)။ ဤအပိုင်းအစများကို ထိတွေ့ပြီးနောက် ၄ နာရီအထိ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သေးသည်။ DNA အပိုင်းအစများနှင့် ပတ်သက်၍ ဤစစ်ထုတ်ခြင်း လုပ်ဆောင်ချက်သည် ဘက်တီးရီးယားနှင့် ရေညှိများ၏ စစ်ထုတ်ခြင်း လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သည် [31]။ ဤရလဒ်များက မုတ်ကောင်များသည် ၎င်းတို့၏ အရည်ခန်းများတွင် ပြင်ပ DNA ကို စစ်ထုတ်ပြီး စုဆောင်းနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
ddPCR ဖြင့်တိုင်းတာသော မုတ်ကောင်များရှိနေခြင်း (A) သို့မဟုတ်မရှိခြင်း (B) တွင် ပင်လယ်ရေရှိ plasmid DNA ၏ ဆွေမျိုးပါဝင်မှုများ။ A တွင် ရလဒ်များကို ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ်ဖော်ပြထားပြီး လေးထောင့်ကွက်များ၏ နယ်နိမိတ်များသည် 75th နှင့် 25th percentiles များကိုကိုယ်စားပြုသည်။ fitted logarithmic curve ကို အနီရောင်ဖြင့်ပြသထားပြီး မီးခိုးရောင်ဖြင့်အရိပ်ကျနေသောဧရိယာသည် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလကိုကိုယ်စားပြုသည်။ B တွင် အနီရောင်မျဉ်းသည် ပျမ်းမျှကိုကိုယ်စားပြုပြီး အပြာရောင်မျဉ်းသည် ပါဝင်မှုအတွက် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလကိုကိုယ်စားပြုသည်။ C plasmid DNA ထည့်သွင်းပြီးနောက် မုတ်ကောင်များ၏ hemolymph နှင့် valve fluid တွင် plasmid DNA စုပုံခြင်း။ ရလဒ်များကို တွေ့ရှိထားသော absolute copy/mL (±SE) အဖြစ်တင်ပြထားသည်။
ထို့နောက် လူသားတို့၏ လွှမ်းမိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသော ဝေးလံခေါင်သီသော ကျွန်းစုတစ်ခုဖြစ်သည့် Kerguelen ကျွန်းများရှိ မုတ်ကောင်အုပ်စုများမှ စုဆောင်းရရှိသော မုတ်ကောင်များတွင် ccfDNA ၏ မူလအစကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ ဤရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ မုတ်ကောင်သွေးဆဲလ်များမှ cccDNA ကို လူ့ cccDNA ကို သန့်စင်ရန် အသုံးများသော နည်းလမ်းများဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ခဲ့သည် [32၊ 33]။ မုတ်ကောင်များတွင် ပျမ်းမျှ hemolymph ccfDNA ပါဝင်မှုများသည် hemolymph တစ်မီလီလီတာလျှင် မိုက်ခရိုဂရမ်နည်းသော အပိုင်းအခြားတွင် ရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ဇယား S2၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်များကို ကြည့်ပါ)။ ဤပါဝင်မှုအပိုင်းအခြားသည် ကျန်းမာသောလူများထက် များစွာပိုများသည် (တစ်မီလီလီတာလျှင် နာနိုဂရမ်နည်းသည်)၊ သို့သော် ရှားရှားပါးပါးကိစ္စများတွင် ကင်ဆာလူနာများတွင် ccfDNA အဆင့်သည် တစ်မီလီလီတာလျှင် မိုက်ခရိုဂရမ်များစွာအထိ ရောက်ရှိနိုင်သည် [34၊ 35]။ hemolymph ccfDNA ၏ အရွယ်အစားဖြန့်ဖြူးမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ဤအပိုင်းအစများသည် အရွယ်အစားအားဖြင့် 1000 bp မှ 1000 bp အထိ၊ 5000 bp အထိ ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၂)။ အလားတူရလဒ်များကို silica-based QIAamp Investigator Kit ကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့ပြီး ၎င်းသည် forensic science တွင် ccfDNA [36] အပါအဝင် செறிவுக்கள்கள்နည်းသော DNA နမူနာများမှ genomic DNA ကို လျင်မြန်စွာ ခွဲထုတ်သန့်စင်ရန် အသုံးများသော နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
မုတ်ကောင်သွေးဥများ၏ ကိုယ်စားပြု ccfDNA အီလက်ထရိုဖိုဂရမ်။ NucleoSnap Plasma Kit (အပေါ်) နှင့် QIAamp DNA Investigator Kit ဖြင့် ထုတ်ယူထားသည်။ B မုတ်ကောင်များတွင် သွေးဥများ ccfDNA ပါဝင်မှု (±SE) ၏ ဖြန့်ဖြူးမှုကို ပြသသည့် တယောပုံ။ အနက်ရောင်နှင့် အနီရောင်မျဉ်းများသည် အသီးသီး အလယ်အလတ်နှင့် ပထမနှင့် တတိယ ကွာတိုင်းလ်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။
လူသားများနှင့် မျောက်ဝံများတွင် ccfDNA ၏ ၁% ခန့်သည် ပြင်ပရင်းမြစ်မှ လာပါသည် [၂၁၊ ၃၇]။ bivalves များ၏ semi-open circulatory system၊ microbial ကြွယ်ဝသော ပင်လယ်ရေနှင့် mussel ccfDNA ၏ အရွယ်အစား ဖြန့်ဖြူးမှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင်၊ mussel hemolymph ccfDNA တွင် microbial DNA ၏ ကြွယ်ဝပြီး ကွဲပြားသော အစုအဝေးတစ်ခု ပါဝင်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆခဲ့သည်။ ဤယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ Kerguelen Islands မှ စုဆောင်းရရှိသော Aulacomya atra နမူနာများမှ hemolymph ccfDNA ကို ကျွန်ုပ်တို့ စီစဉ်ခဲ့ပြီး ဖတ်ရှုမှု ၁၀ ​​သန်းကျော် ရရှိခဲ့ကာ ၎င်းတို့အနက် ၉၇.၆% သည် အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုကို အောင်မြင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဖတ်ရှုမှုများကို BLASTN နှင့် NCBI bivalve databases များကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်ပိုင်နှင့် ကိုယ်ပိုင်မဟုတ်သော ရင်းမြစ်များအလိုက် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည် (ပုံ S1၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်များ)။
လူသားများတွင် နျူကလီးယားနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် DNA နှစ်မျိုးလုံးကို သွေးကြောထဲသို့ ထုတ်လွှတ်နိုင်သည် [38]။ သို့သော်၊ လက်ရှိလေ့လာမှုတွင် A. atra မျိုးရိုးဗီဇကို အစီအစဉ်မဆွဲရသေးခြင်း သို့မဟုတ် ဖော်ပြထားခြင်း မရှိသောကြောင့် မုတ်ကောင်များ၏ နျူကလီးယား မျိုးရိုးဗီဇ DNA ကို အသေးစိတ်ဖော်ပြရန် မဖြစ်နိုင်ပါ။ သို့သော်၊ bivalve library (ပုံ S2၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်များ) ကို အသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့၏ မူလဇာစ်မြစ် ccfDNA အပိုင်းအစ အများအပြားကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့သည်။ အစီအစဉ်ချထားသော A. atra မျိုးရိုးဗီဇများ၏ directed PCR amplification ဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ မူလဇာစ်မြစ် DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကိုလည်း အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 3)။ အလားတူပင်၊ A. atra ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် မျိုးရိုးဗီဇကို အများပြည်သူ databases များတွင် ရရှိနိုင်သောကြောင့်၊ A. atra ၏ hemolymph တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ccfDNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းအတွက် အထောက်အထားကို ရှာတွေ့နိုင်သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကို PCR amplification ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 3)။
PCR ဖြင့် ချဲ့ထွင်ထားသော A. atra (အနီရောင်အစက်များ – စတော့နံပါတ်: SRX5705969) နှင့် M. platensis (အပြာရောင်အစက်များ – စတော့နံပါတ်: SRX5705968) ၏ hemolymph တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မျိုးဗီဇအမျိုးမျိုး ရှိနေခဲ့သည်။ Breton et al., 2011 မှ ကူးယူဖော်ပြထားသော ပုံကို B A. atra မှ hemolymph supernatant ချဲ့ထွင်ခြင်း FTA စက္ကူပေါ်တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ PCR ရောစပ်ထားသော PCR ပြွန်ထဲသို့ တိုက်ရိုက်ထည့်ရန် ၃ မီလီမီတာ အပေါက်ကို အသုံးပြုပါ။
ပင်လယ်ရေတွင် အဏုဇီဝပိုးများ ပေါများပါဝင်မှုကို ထောက်ရှုခြင်းအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် သွေးနီဥများရှိ အဏုဇီဝ DNA အစီအစဥ်များ၏ လက္ခဏာရပ်များကို ကနဦးတွင် အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။ ထိုသို့ပြုလုပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဗျူဟာနှစ်ခုကို အသုံးပြုပါသည်။ ပထမဗျူဟာတွင် BLAST နှင့် အခြားကိရိယာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော တိကျမှုဖြင့် အဏုဇီဝအစီအစဥ်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည့် အယ်လဂိုရီသမ်အခြေခံ အစီအစဥ်ခွဲခြားမှုပရိုဂရမ် Kraken2 ကို အသုံးပြုခဲ့သည် [28]။ ဘက်တီးရီးယားမှ မူလအစဖြစ်သည်ဟု ဖတ်ရှုမှု ၆၇၁၉ ခုကျော်ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး ၁၂၄ ခုနှင့် ၆၄ ခုမှာ archaea နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်များမှ အသီးသီးဖြစ်သည် (ပုံ ၄)။ အပေါများဆုံး ဘက်တီးရီးယား DNA အပိုင်းအစများမှာ Firmicutes (၄၆%)၊ Proteobacteria (၂၇%) နှင့် Bacteroidetes (၁၇%) ဖြစ်သည် (ပုံ ၄က)။ ဤဖြန့်ဖြူးမှုသည် marine blue mussel microbiome ၏ ယခင်လေ့လာမှုများနှင့် ကိုက်ညီပါသည် [39၊ 40]။ Gammaproteobacteria သည် Proteobacteria ၏ အဓိကအတန်းအစား (၄၄%) ဖြစ်ပြီး Vibrionales အများအပြားပါဝင်သည် (ပုံ ၄ခ)။ ddPCR နည်းလမ်းက A. atra hemolymph ၏ ccfDNA တွင် Vibrio DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကို အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 4c) [41]။ ccfDNA ၏ ဘက်တီးရီးယားဇာစ်မြစ်အကြောင်း ပိုမိုသိရှိနိုင်ရန်အတွက်၊ အပိုဆောင်းချဉ်းကပ်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ S2၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်များ)။ ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသော ဖတ်ရှုမှုများကို paired-end ဖတ်ရှုမှုများအဖြစ် စုစည်းပြီး BLASTN နှင့် 1e−3 e တန်ဖိုးနှင့် >90% homology ရှိသော cutoff ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော မူလအစအဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည်။ ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသော ဖတ်ရှုမှုများကို paired-end ဖတ်ရှုမှုများအဖြစ် စုစည်းပြီး BLASTN နှင့် 1e−3 e တန်ဖိုးနှင့် >90% homology ရှိသော cutoff ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော မူလအစအဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည်။ В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицирова (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечи0ния % ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်ရှုမှုများကို paired-ended ဖတ်ရှုမှုများအဖြစ် စုဆောင်းခဲ့ပြီး BLASTN နှင့် 1e-3 ၏ e တန်ဖိုးနှင့် >90% homology ဖြင့် cutoff ကို အသုံးပြု၍ native (bivalve) သို့မဟုတ် non-original အဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည်။在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源။在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用使用使用 blastn的咼 1 90%同源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицироввсбты (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3го и 9 пгирого ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်ရှုမှုများကို paired-ended reads အဖြစ်စုဆောင်းပြီး e BLASTN နှင့် 1e-3 တန်ဖိုးများနှင့် homology threshold >90% ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်ပိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် မူရင်းမဟုတ်သောအဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည်။A. atra မျိုးရိုးဗီဇကို အစီအစဉ်မဆွဲရသေးသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler ၏ de novo assembly strategy ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ မူလအစ၏ မှီခို (bivalves) အဖြစ် contigs စုစုပေါင်း ၁၄၇,၁၈၈ ခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဤ contigs များကို BLASTN နှင့် BLASTX ကို အသုံးပြု၍ 1e-10 ၏ e-values ​​​​များဖြင့် ပေါက်ကွဲစေခဲ့သည်။ ဤနည်းဗျူဟာသည် A. atra ccfDNA တွင်ရှိသော non-bivalve အပိုင်းအစ ၄၈၂ ခုကို ဖော်ထုတ်နိုင်စေခဲ့သည်။ ဤ DNA အပိုင်းအစများ၏ ထက်ဝက်ကျော် (၅၇%) ကို ဘက်တီးရီးယားများမှ ရရှိခဲ့ပြီး အဓိကအားဖြင့် sulfotrophic symbionts များအပါအဝင် gill symbionts များနှင့် gill symbionts Solemya velum (ပုံ ၅) မှ ရရှိခဲ့သည်။
အမျိုးအစားအဆင့်တွင် နှိုင်းရပေါများမှု။ B အဓိက မျိုးစိတ်နှစ်ခု (Firmicutes နှင့် Proteobacteria) ၏ အဏုဇီဝမျိုးကွဲ။ ddPCR ၏ ကိုယ်စားပြု တိုးပွားလာမှု C Vibrio spp။ A. atra hemolymphs သုံးခုတွင် 16S rRNA မျိုးဗီဇ၏ အပိုင်းအစများ (အပြာရောင်)။
စုဆောင်းထားသော contig စုစုပေါင်း ၄၈၂ ခုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ metagenomic contig annotations (prokaryotes နှင့် eukaryotes) များ၏ taxonomic ဖြန့်ဖြူးမှု၏ အထွေထွေပရိုဖိုင်။ B BLASTN နှင့် BLASTX မှ ဖော်ထုတ်ထားသော ဘက်တီးရီးယား DNA အပိုင်းအစများ၏ အသေးစိတ်ဖြန့်ဖြူးမှု။
Kraken2 ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ မုတ်ကောင် ccfDNA တွင် Euryarchaeota (65%)၊ Crenarchaeota (24%) နှင့် Thaurmarcheota (11%) တို့၏ DNA အပိုင်းအစများ အပါအဝင် archaeal DNA အပိုင်းအစများ ပါဝင်ကြောင်းလည်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 6a)။ ကယ်လီဖိုးနီးယား မုတ်ကောင်များ၏ အဏုဇီဝအသိုင်းအဝိုင်းတွင် ယခင်ကတွေ့ရှိခဲ့သော Euryarchaeota နှင့် Crenarchaeota မှရရှိသော DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းသည် အံ့သြစရာတော့ မဖြစ်သင့်ပါ [42]။ Euryarchaeota သည် အစွန်းရောက်အခြေအနေများနှင့် မကြာခဏ ဆက်စပ်နေသော်လည်း၊ ယခုအခါ Euryarchaeota နှင့် Crenarcheota နှစ်မျိုးလုံးသည် အဏ္ဏဝါ cryogenic ပတ်ဝန်းကျင်တွင် အဖြစ်အများဆုံး prokaryotes များထဲတွင် ပါဝင်ကြောင်း သိရှိလာကြပါပြီ [43၊ 44]။ Kerguelen Plateau ရှိ အောက်ခြေယိုစိမ့်မှုများမှ မီသိန်းယိုစိမ့်မှုများ ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်နှင့် Kerguelen Islands ၏ ကမ်းရိုးတန်းတွင် အဏုဇီဝမီသိန်းထုတ်လုပ်မှု ဖြစ်နိုင်ကြောင်း မကြာသေးမီက အစီရင်ခံစာများအရ မုတ်ကောင်များတွင် မီသိန်းထုတ်လုပ်သည့် အဏုဇီဝများ ရှိနေခြင်းသည် အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ [45]။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့၏ အာရုံသည် DNA ဗိုင်းရပ်စ်များမှ ဖတ်ရှုမှုများဆီသို့ ပြောင်းလဲသွားပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ အကောင်းဆုံး အသိပညာအရ၊ ၎င်းသည် မုတ်ကောင်များ၏ ဗိုင်းရပ်စ်ပါဝင်မှု၏ ပထမဆုံး ပစ်မှတ်မဟုတ်သော လေ့လာမှုဖြစ်သည်။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ဘက်တီးရီးယားပိုးများ (Caudovirales) ၏ DNA အပိုင်းအစများကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၆ခ)။ သို့သော်၊ အဖြစ်အများဆုံး ဗိုင်းရပ်စ် DNA သည် မည်သည့်ဗိုင်းရပ်စ်၏ ဂျီနိုမ်အကြီးဆုံးရှိသည့် nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV) ဟုလည်း လူသိများသော nucleocytoviruses ၏ phylum မှ လာပါသည်။ ဤ phylum အတွင်းတွင်၊ DNA အစီအစဥ်အများစုသည် Mimimidoviridae (၅၈%) နှင့် Poxviridae (၂၁%) မျိုးရင်းများနှင့် သက်ဆိုင်ပြီး ၎င်းတို့၏ သဘာဝအိမ်ရှင်များတွင် ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများနှင့် arthropods များ ပါဝင်ပြီး ဤ DNA အစီအစဥ်များ၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်သည် လူသိများသော ဗိုင်းရပ်စ်ဆိုင်ရာ ရေညှိများနှင့် သက်ဆိုင်သည်။ ရေနေ eukaryotic ရေညှိများကို ကူးစက်သည်။ အစီအစဥ်များကို မည်သည့်ဗိုင်းရပ်စ် မျိုးစုတွင်မဆို ဂျီနိုမ်အရွယ်အစား အကြီးဆုံးရှိသော ဧရာမဗိုင်းရပ်စ်ဖြစ်သည့် Pandora ဗိုင်းရပ်စ်မှလည်း ရရှိသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက hemolymph ccfDNA sequencing အရ ဆုံးဖြတ်ထားတဲ့အတိုင်း ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်ခံရတယ်လို့ သိရှိထားတဲ့ host တွေရဲ့ အကွာအဝေးဟာ အတော်လေး များပြားပါတယ် (ပုံ S3၊ နောက်ဆက်တွဲ သတင်းအချက်အလက်)။ ၎င်းမှာ Baculoviridae နဲ့ Iridoviridae လိုမျိုး အင်းဆက်ပိုးမွှားတွေကို ကူးစက်တဲ့ ဗိုင်းရပ်စ်တွေအပြင် အမီးဘား၊ ရေညှိနဲ့ ကျောရိုးရှိသတ္တဝါတွေကို ကူးစက်တဲ့ ဗိုင်းရပ်စ်တွေလည်း ပါဝင်ပါတယ်။ Pithovirus sibericum မျိုးရိုးဗီဇနဲ့ ကိုက်ညီတဲ့ sequence တွေကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ Pitoviruses (“zombie viruses” လို့ လူသိများတယ်) ကို ဆိုက်ဘေးရီးယားက နှစ်ပေါင်း ၃၀,၀၀၀ သက်တမ်းရှိတဲ့ permafrost ကနေ ပထမဆုံး ခွဲထုတ်ခဲ့ပါတယ် [47]။ ဒါကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ ရလဒ်တွေဟာ ဒီဗိုင်းရပ်စ်တွေရဲ့ ခေတ်သစ်မျိုးစိတ်အားလုံး မျိုးသုဉ်းသွားပြီ မဟုတ်ဘူးဆိုတာကို ပြသတဲ့ [48] နဲ့ ဒီဗိုင်းရပ်စ်တွေဟာ ဝေးလံခေါင်သီတဲ့ subarctic marine ecosystem တွေမှာ ရှိနေနိုင်ကြောင်း ပြသတဲ့ ယခင်အစီရင်ခံစာတွေနဲ့ ကိုက်ညီပါတယ်။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့၊ အခြားဆဲလ်များစွာပါဝင်သော တိရစ္ဆာန်များမှ DNA အပိုင်းအစများကို ရှာတွေ့နိုင်မလားဆိုတာ စမ်းသပ်ခဲ့ပါတယ်။ BLASTN နှင့် BLASTX မှတစ်ဆင့် nt၊ nr နှင့် RefSeq စာကြည့်တိုက်များ (ဂျီနိုမစ်နှင့် ပရိုတင်း) ဖြင့် ပြင်ပမျိုးကွဲပေါင်း ၄၈၂ ခုကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပါတယ်။ ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ ရလဒ်တွေအရ ဆဲလ်များစွာပါဝင်တဲ့ တိရစ္ဆာန်တွေရဲ့ ccfDNA ရဲ့ ပြင်ပအပိုင်းအစတွေထဲမှာ အရိုးအရိုးတွေရဲ့ DNA လွှမ်းမိုးနေတာကို ပြသနေပါတယ် (ပုံ ၅)။ အင်းဆက်ပိုးမွှားတွေနဲ့ အခြားမျိုးစိတ်တွေကနေ ရရှိတဲ့ DNA အပိုင်းအစတွေကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ DNA အပိုင်းအစတွေရဲ့ အတော်လေး ကြီးမားတဲ့ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုကိုတော့ မဖော်ထုတ်နိုင်သေးပါဘူး၊ ကုန်းနေမျိုးစိတ်တွေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် ဂျီနိုမစ်ဒေတာဘေ့စ်တွေမှာ ရေနေမျိုးစိတ် အများအပြားကို ကိုယ်စားပြုမှု နည်းပါးတာကြောင့် ဖြစ်နိုင်ပါတယ် [49]။
လက်ရှိစာတမ်းတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LB သဘောတရားကို မုတ်ကောင်များတွင် အသုံးချပြီး hemolymph ccfDNA ရိုက်ချက် အစီအစဉ်ချခြင်းသည် ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များ၏ ဖွဲ့စည်းမှုကို ထိုးထွင်းသိမြင်စေနိုင်သည်ဟု ငြင်းခုံပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ ၁) မုတ်ကောင် hemolymph တွင် လည်ပတ်နေသော DNA အပိုင်းအစများ (~1-5 kb) ၏ မြင့်မားသော ပါဝင်မှု (မိုက်ခရိုဂရမ်အဆင့်) ပါဝင်ကြောင်း၊ ၂) ဤ DNA အပိုင်းအစများသည် လွတ်လပ်သည်နှင့် မလွတ်လပ်သည် နှစ်မျိုးလုံးဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ၃) ဤ DNA အပိုင်းအစများ၏ ပြင်ပရင်းမြစ်များထဲတွင် ဘက်တီးရီးယား၊ ရှေးဟောင်းနှင့် ဗိုင်းရပ်စ် DNA အပြင် အခြားဆဲလ်များစွာပါသော တိရစ္ဆာန်များ၏ DNA ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ၄) ဤပြင်ပ ccfDNA အပိုင်းအစများ hemolymph တွင် စုပုံခြင်းသည် လျင်မြန်စွာ ဖြစ်ပေါ်ပြီး မုတ်ကောင်များ၏ အတွင်းပိုင်း စစ်ထုတ်ခြင်း လုပ်ဆောင်ချက်ကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာမှုအရ ယခုအချိန်အထိ ဇီဝဆေးပညာနယ်ပယ်တွင် အဓိကအသုံးပြုခဲ့သော LB သဘောတရားသည် sentinel မျိုးစိတ်များနှင့် ၎င်းတို့၏ ပတ်ဝန်းကျင်အကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုအား ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ နားလည်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် ကြွယ်ဝသော်လည်း မရှာဖွေရသေးသော အသိပညာအရင်းအမြစ်တစ်ခုကို ဖော်ပြကြောင်း ပြသထားသည်။
မျောက်ဝံများအပြင်၊ ကြွက်၊ ခွေး၊ ကြောင်နှင့် မြင်းများအပါအဝင် နို့တိုက်သတ္တဝါများတွင် ccfDNA ခွဲထုတ်ခြင်းကို အစီရင်ခံစာများ ထွက်ပေါ်ခဲ့သည် [50၊ 51၊ 52]။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ဗဟုသုတအရ၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာမှုသည် ပွင့်လင်းသော သွေးလည်ပတ်မှုစနစ်ဖြင့် ရေနေမျိုးစိတ်များတွင် ccfDNA ကို ထောက်လှမ်းခြင်းနှင့် အစီအစဉ်ချခြင်းကို အစီရင်ခံရန် ပထမဆုံးဖြစ်သည်။ မုတ်ကောင်များ၏ ဤခန္ဓာဗေဒဆိုင်ရာ အင်္ဂါရပ်နှင့် စစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းသည် အနည်းဆုံး တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် အခြားမျိုးစိတ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လည်ပတ်နေသော DNA အပိုင်းအစများ၏ ကွဲပြားသော အရွယ်အစား ဝိသေသလက္ခဏာများကို ရှင်းပြနိုင်သည်။ လူသားများတွင်၊ သွေးထဲတွင် လည်ပတ်နေသော DNA အပိုင်းအစအများစုသည် အရွယ်အစား 150 မှ 200 bp အထိ ရှိပြီး အများဆုံး 167 bp ၏ အမြင့်ဆုံးဖြစ်သည် [34၊ 53]။ DNA အပိုင်းအစများ၏ သေးငယ်သော်လည်း သိသာထင်ရှားသော အစိတ်အပိုင်းသည် အရွယ်အစား 300 မှ 500 bp ကြားတွင် ရှိပြီး 5% ခန့်သည် 900 bp ထက် ရှည်သည်။ [54]။ ဤအရွယ်အစားဖြန့်ဖြူးမှုအတွက် အကြောင်းရင်းမှာ ပလာစမာရှိ ccfDNA ၏ အဓိကရင်းမြစ်သည် ဆဲလ်သေဆုံးမှုကြောင့် သို့မဟုတ် ကျန်းမာသောလူများတွင် လည်ပတ်နေသော hematopoietic ဆဲလ်များ necrosis ကြောင့် သို့မဟုတ် ကင်ဆာလူနာများတွင် အကျိတ်ဆဲလ်များ apoptosis (လည်ပတ်နေသော tumor DNA ဟုလူသိများသည်) ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းဖြစ်သည်။ မုတ်ကောင်များတွင် ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သော hemolymph ccfDNA ၏ အရွယ်အစားဖြန့်ဖြူးမှုသည် 1000 မှ 5000 bp အထိရှိပြီး မုတ်ကောင် ccfDNA သည် မတူညီသောဇာစ်မြစ်ရှိကြောင်း အကြံပြုသည်။ မုတ်ကောင်များတွင် semi-open vascular system ရှိပြီး microbial genomic DNA မြင့်မားစွာပါဝင်သည့် ပင်လယ်ရေနေပတ်ဝန်းကျင်များတွင် နေထိုင်ကြသောကြောင့် ၎င်းသည် ယုတ္တိတန်သောယူဆချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ အမှန်မှာ၊ exogenous DNA ကို အသုံးပြုသည့် ကျွန်ုပ်တို့၏ဓာတ်ခွဲခန်းစမ်းသပ်မှုများအရ မုတ်ကောင်များသည် ပင်လယ်ရေတွင် DNA အပိုင်းအစများစုပုံလာပြီး အနည်းဆုံး နာရီအနည်းငယ်အကြာတွင် ဆဲလ်စုပ်ယူပြီးနောက်နှင့်/သို့မဟုတ် ထုတ်လွှတ်ပြီးနောက်နှင့်/သို့မဟုတ် အဖွဲ့အစည်းအမျိုးမျိုးတွင် သိမ်းဆည်းပြီးနောက် ပြိုကွဲသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဆဲလ်များ (prokaryotic နှင့် eukaryotic နှစ်မျိုးလုံး) ရှားပါးမှုကြောင့်၊ intravalvular compartments များကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် ကိုယ်တိုင်ရင်းမြစ်များမှသာမက ပြင်ပရင်းမြစ်များမှပါ ccfDNA ပမာဏကို လျှော့ချပေးမည်ဖြစ်သည်။ bivalve innate immune ၏ အရေးပါမှုနှင့် လည်ပတ်နေသော phagocytes အရေအတွက် များပြားမှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခြင်းဖြင့်၊ ပြင်ပ ccfDNA သည်ပင် အဏုဇီဝများနှင့်/သို့မဟုတ် ဆဲလ်အပျက်အစီးများကို မျိုချမိသောအခါ ပြင်ပ DNA များကို စုဆောင်းသည့် လည်ပတ်နေသော phagocytes များတွင် ကြွယ်ဝသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ထပ်မံယူဆခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ကျွန်ုပ်တို့၏ ရလဒ်များက bivalve hemolymph ccfDNA သည် မော်လီကျူးအချက်အလက်များ၏ ထူးခြားသော သိုလှောင်ရုံတစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့၏ sentinel မျိုးစိတ်အဖြစ် အခြေအနေကို အားကောင်းစေကြောင်း ပြသသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာအရ ဘက်တီးရီးယားမှဆင်းသက်လာသော hemolymph ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ sequencing နှင့် analysis သည် host bacterial flora နှင့် ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ marine ecosystem တွင်ရှိသော ဘက်တီးရီးယားများအကြောင်း အဓိကအချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။ shot sequencing နည်းပညာများသည် reference library bias ကြောင့် ရိုးရာ 16S rRNA identification နည်းလမ်းများကို အသုံးပြုပါက လွတ်သွားနိုင်သည့် commensal bacteria A. atra gill ၏ sequences များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ အမှန်စင်စစ်၊ Kerguelen ရှိ တူညီသော mussel layer တွင် M. platensis မှစုဆောင်းရရှိသော LB data ကို အသုံးပြုခြင်းက gill နှင့်ဆက်စပ်သော ဘက်တီးရီးယား symbionts များ၏ ဖွဲ့စည်းမှုသည် mussel မျိုးစိတ်နှစ်မျိုးလုံးအတွက် အတူတူပင်ဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ S4၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်များ)။ မျိုးရိုးဗီဇကွဲပြားသော mussels နှစ်ခု၏ ဤဆင်တူမှုသည် Kerguelen ၏ အအေး၊ ဆာလ်ဖာပါဝင်သောနှင့် မီးတောင်သိုက်များရှိ ဘက်တီးရီးယားအသိုင်းအဝိုင်းများ၏ ဖွဲ့စည်းမှုကို ထင်ဟပ်စေနိုင်သည် [55၊ 56၊ 57၊ 58]။ Port-au-France ကမ်းရိုးတန်းကဲ့သို့သော bioturbated ကမ်းရိုးတန်းဒေသများမှ mussels များကို စုဆောင်းသောအခါ ဆာလ်ဖာလျှော့ချပေးသော အဏုဇီဝများ မြင့်မားစွာပါဝင်ကြောင်း ကောင်းစွာဖော်ပြထားသည် [59]။ နောက်ထပ်ဖြစ်နိုင်ခြေတစ်ခုမှာ commensal mussel flora သည် အလျားလိုက်ကူးစက်မှုကြောင့် ထိခိုက်ခံရနိုင်သည် [60၊ 61]။ ပင်လယ်ပတ်ဝန်းကျင်၊ ပင်လယ်ကြမ်းပြင်မျက်နှာပြင်နှင့် mussels ရှိ သဟဇီဝဘက်တီးရီးယားများ၏ ဖွဲ့စည်းမှုအကြား ဆက်စပ်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် နောက်ထပ်သုတေသနပြုလုပ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤလေ့လာမှုများကို လက်ရှိလုပ်ဆောင်နေပါသည်။
hemolymph ccfDNA ၏ အရှည်နှင့် အာရုံစူးစိုက်မှု၊ ၎င်း၏ သန့်စင်ရလွယ်ကူမှုနှင့် လျင်မြန်စွာ shotgun sequencing လုပ်နိုင်စေရန် အရည်အသွေးမြင့်မားမှုတို့သည် ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်း ဂေဟစနစ်များတွင် ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို အကဲဖြတ်ရန် mussel ccfDNA ကိုအသုံးပြုခြင်း၏ အားသာချက်များစွာထဲမှ အချို့ဖြစ်သည်။ ဤနည်းလမ်းသည် ပေးထားသော ဂေဟစနစ်တစ်ခုရှိ ဗိုင်းရပ်စ်အသိုင်းအဝိုင်းများ (viromes) ကို လက္ခဏာရပ်ဖော်ပြရန်အတွက် အထူးထိရောက်ပါသည် [62၊ 63]။ ဘက်တီးရီးယား၊ archaea နှင့် eukaryotes နှင့်မတူဘဲ၊ ဗိုင်းရပ်စ် genomes များတွင် 16S sequences ကဲ့သို့သော phylogenetically conserved genes များ မပါဝင်ပါ။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက mussels ကဲ့သို့သော indicator species များမှ အရည် biopsies များကို ကမ်းရိုးတန်း ပင်လယ်ဂေဟစနစ်များတွင် ပုံမှန်နေထိုင်သော host များကို ကူးစက်သည်ဟု သိရှိထားသော ccfDNA ဗိုင်းရပ်စ်အပိုင်းအစများစွာကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ၎င်းတွင် protozoa၊ arthropods၊ အင်းဆက်ပိုးမွှားများ၊ အပင်များနှင့် ဘက်တီးရီးယားဗိုင်းရပ်စ်များ (ဥပမာ၊ bacteriophage) ကို ကူးစက်သည်ဟု သိရှိထားသော ဗိုင်းရပ်စ်များ ပါဝင်သည်။ Kerguelen တွင် တူညီသော mussel အလွှာတွင် စုဆောင်းထားသော blue mussels (M. platensis) ၏ hemolymph ccfDNA virome ကို စစ်ဆေးသောအခါ အလားတူဖြန့်ဖြူးမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ဇယား S2၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်)။ ccfDNA ၏ Shotgun sequencing သည် လူသားများ သို့မဟုတ် အခြားမျိုးစိတ်များ၏ virome ကို လေ့လာရာတွင် အရှိန်အဟုန်ရလာသော ချဉ်းကပ်မှုအသစ်တစ်ခုဖြစ်သည် [21၊ 37၊ 64]။ ဤချဉ်းကပ်မှုသည် double-stranded DNA ဗိုင်းရပ်စ်များအားလုံးတွင် တစ်ခုတည်းသော gene မှ Baltimore ရှိ ကွဲပြားမှုအရှိဆုံးနှင့် အကျယ်ပြန့်ဆုံး ဗိုင်းရပ်စ်အမျိုးအစားကို ကိုယ်စားပြုသောကြောင့် double-stranded DNA ဗိုင်းရပ်စ်များကို လေ့လာရန်အတွက် အထူးအသုံးဝင်ပါသည် [65]။ ဤဗိုင်းရပ်စ်အများစုသည် အမျိုးအစားခွဲခြားထားခြင်းမရှိသေးဘဲ ဗိုင်းရပ်စ်ကမ္ဘာ၏ လုံးဝမသိသော အစိတ်အပိုင်းမှ ဗိုင်းရပ်စ်များ ပါဝင်နိုင်သော်လည်း [66]၊ mussels A. atra နှင့် M. platensis ၏ viromes များနှင့် host ranges များသည် မျိုးစိတ်နှစ်ခုကြားတွင် ကျရောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ အလားတူပင် (ပုံ S3၊ နောက်ထပ်အချက်အလက်များကိုကြည့်ပါ)။ ဤဆင်တူယိုးမှားမှုသည် အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းသည် ပတ်ဝန်းကျင်တွင်ရှိသော DNA ကို စုပ်ယူရာတွင် ရွေးချယ်မှုမရှိခြင်းကို ထင်ဟပ်စေနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ သန့်စင်ထားသော RNA ကိုအသုံးပြု၍ အနာဂတ်လေ့လာမှုများသည် RNA virome ကို လက္ခဏာရပ်ဖော်ပြရန် လက်ရှိလိုအပ်ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင်၊ Kowarski နှင့်လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များ [37] ၏လုပ်ဆောင်ချက်မှ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသော အလွန်တင်းကျပ်သော pipeline တစ်ခုကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတို့သည် native ccfDNA စုစည်းမှုမတိုင်မီနှင့် စုစည်းပြီးနောက် ဖတ်ရှုမှုများနှင့် contigs များကို အဆင့်နှစ်ဆင့်ဖျက်ခြင်းကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး unmap လုပ်ထားသော ဖတ်ရှုမှုများ၏ အချိုးအစားမြင့်မားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤ unmap လုပ်ထားသော ဖတ်ရှုမှုအချို့သည် ၎င်းတို့၏ကိုယ်ပိုင်ဇာစ်မြစ်ရှိနေသေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ငြင်းဆို၍မရပါ၊ အဓိကအားဖြင့် ဤ mussel မျိုးစိတ်အတွက် reference genome မရှိသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ self နှင့် non-self ဖတ်ရှုမှုများနှင့် Illumina MiSeq PE75 မှထုတ်ပေးသော ဖတ်ရှုမှုအရှည်များအကြား chimeras များကို ကျွန်ုပ်တို့စိုးရိမ်သောကြောင့် ဤ pipeline ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဇယားမဆွဲထားသော ဖတ်ရှုမှုအများစုအတွက် နောက်ထပ်အကြောင်းရင်းတစ်ခုမှာ Kerguelen ကဲ့သို့သော ဝေးလံခေါင်သီသောဒေသများရှိ ရေနေအဏုဇီဝပိုးမွှားအများစုကို မှတ်ချက်မပေးထားခြင်းဖြစ်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် Illumina MiSeq PE75 ကိုအသုံးပြုခဲ့ပြီး ccfDNA အပိုင်းအစအရှည်များသည် လူသား ccfDNA နှင့်ဆင်တူသည်ဟုယူဆခဲ့သည်။ အနာဂတ်လေ့လာမှုများအတွက်၊ hemolymph ccfDNA သည် လူသားများနှင့်/သို့မဟုတ် နို့တိုက်သတ္တဝါများထက် ပိုမိုရှည်လျားသော ဖတ်ချက်များရှိကြောင်း ပြသသည့် ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ၊ ccfDNA အပိုင်းအစများအတွက် ပိုမိုရှည်လျားသော sequencing platform ကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ဤလုပ်ဆောင်မှုသည် ပိုမိုနက်ရှိုင်းသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ညွှန်ပြချက်များကို ပိုမိုဖော်ထုတ်ရန် ပိုမိုလွယ်ကူစေမည်ဖြစ်သည်။ လက်ရှိရရှိနိုင်ခြင်းမရှိသော ပြီးပြည့်စုံသော A. atra nuclear genome sequence ကို ရယူခြင်းသည် ccfDNA ကို ကိုယ်ပိုင်နှင့် ကိုယ်ပိုင်မဟုတ်သော အရင်းအမြစ်များမှ ခွဲခြားသတ်မှတ်ရာတွင်လည်း များစွာအထောက်အကူပြုမည်ဖြစ်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ သုတေသနသည် အရည် biopsy သဘောတရားကို mussels များတွင် အသုံးချနိုင်ခြေကို အာရုံစိုက်ထားသောကြောင့်၊ ဤသဘောတရားကို အနာဂတ်သုတေသနတွင် အသုံးပြုသည်နှင့်အမျှ၊ mussels ၏ အဏုဇီဝမျိုးကွဲများကို လေ့လာရန် ဤနည်းလမ်း၏ အလားအလာကို မြှင့်တင်ရန် ကိရိယာအသစ်များနှင့် ပိုက်လိုင်းအသစ်များ တီထွင်လာမည်ဟု မျှော်လင့်ပါသည်။
ကျူးကျော်ဝင်ရောက်ခြင်းမရှိသော ဆေးခန်းဇီဝအမှတ်အသားတစ်ခုအနေဖြင့်၊ လူ့ပလာစမာအဆင့် ccfDNA မြင့်မားခြင်းသည် ရောဂါအမျိုးမျိုး၊ တစ်ရှူးပျက်စီးမှုနှင့် ဖိစီးမှုအခြေအနေများနှင့် ဆက်စပ်နေသည် [67,68,69]။ ဤတိုးလာမှုသည် တစ်ရှူးပျက်စီးပြီးနောက် ၎င်း၏ကိုယ်ပိုင်မူလအစ DNA အပိုင်းအစများထွက်ရှိမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤပြဿနာကို အပူဒဏ်ကို အသုံးပြု၍ ဖြေရှင်းခဲ့ပြီး၊ မုတ်ကောင်များကို 30°C အပူချိန်တွင် ခဏတာထိတွေ့စေခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို မတူညီသောစမ်းသပ်ချက်သုံးကြိမ်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ သို့သော် အပူဒဏ်ကို ပြင်းထန်စွာခံစားရပြီးနောက် ccfDNA အဆင့်တွင် မည်သည့်ပြောင်းလဲမှုကိုမျှ မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ S5၊ နောက်ထပ်အချက်အလက်များကိုကြည့်ပါ)။ ဤတွေ့ရှိချက်သည် မုတ်ကောင်များတွင် semi-open circulatory system ရှိပြီး ၎င်းတို့၏ filtering activity မြင့်မားခြင်းကြောင့် ပြင်ပ DNA အမြောက်အမြားစုပုံနေခြင်းကို အနည်းဆုံးတစ်စိတ်တစ်ပိုင်းရှင်းပြနိုင်ပါသည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ ကျောရိုးမဲ့သတ္တဝါအများစုကဲ့သို့ မုတ်ကောင်များသည် ဖိစီးမှုကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော တစ်ရှူးပျက်စီးမှုကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိနိုင်ပြီး ၎င်းတို့၏ hemolymph တွင် ccfDNA ထုတ်လွှတ်မှုကို ကန့်သတ်ထားသည် [70, 71]။
ယနေ့အထိ၊ ရေနေဂေဟစနစ်များရှိ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများ၏ DNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ပတ်ဝန်းကျင် DNA (eDNA) metabarcoding ကို အဓိကထားခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ဤနည်းလမ်းသည် primer များကိုအသုံးပြုသောအခါတွင် ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အကန့်အသတ်ရှိသည်။ shotgun sequencing ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် PCR ၏ကန့်သတ်ချက်များနှင့် primer set များ၏ဘက်လိုက်ရွေးချယ်မှုကို ရှောင်ကွင်းပေးသည်။ ထို့ကြောင့်၊ တစ်နည်းအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းသည် မကြာသေးမီကအသုံးပြုခဲ့သော high-throughput eDNA Shotgun sequencing နည်းလမ်းနှင့် ပိုမိုနီးစပ်ပြီး ၎င်းသည် အပိုင်းပိုင်းကွဲနေသော DNA ကို တိုက်ရိုက် sequence လုပ်နိုင်ပြီး သက်ရှိအားလုံးနီးပါးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်သည် [72၊ 73]။ သို့သော်၊ LB ကို စံ eDNA နည်းလမ်းများမှ ခွဲခြားသတ်မှတ်သည့် အခြေခံပြဿနာအချို့ရှိပါသည်။ ဟုတ်ပါတယ်၊ eDNA နှင့် LB အကြား အဓိကကွာခြားချက်မှာ သဘာဝ filter host များကိုအသုံးပြုခြင်းဖြစ်သည်။ eDNA ကိုလေ့လာရန်အတွက် သဘာဝ filter အဖြစ် sponges နှင့် bivalves (Dresseina spp.) ကဲ့သို့သော ရေနေမျိုးစိတ်များကို အသုံးပြုမှုကို အစီရင်ခံထားပြီးဖြစ်သည် [74၊ 75]။ သို့သော်၊ Dreissena ၏လေ့လာမှုတွင် DNA ကိုထုတ်ယူခဲ့သော တစ်ရှူး biopsies များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ LB မှ ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် တစ်ရှူးတစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်း၊ eDNA သို့မဟုတ် တစ်ရှူးတစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်းနှင့် ဆက်စပ်သော အထူးပြုပြီး တစ်ခါတစ်ရံတွင် စျေးကြီးသော ပစ္စည်းကိရိယာများနှင့် ထောက်ပံ့ပို့ဆောင်ရေး မလိုအပ်ပါ။ အမှန်မှာ၊ LB မှ ccfDNA ကို အအေးကွင်းဆက်ကို ထိန်းသိမ်းစရာမလိုဘဲ FTA အထောက်အပံ့ဖြင့် သိမ်းဆည်းပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်ကြောင်း မကြာသေးမီက ကျွန်ုပ်တို့ တင်ပြခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် ဝေးလံခေါင်သီသောဒေသများတွင် သုတေသနအတွက် အဓိကစိန်ခေါ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည် [76]။ အရည်တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်းမှ ccfDNA ထုတ်ယူခြင်းသည်လည်း ရိုးရှင်းပြီး shotgun sequencing နှင့် PCR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အရည်အသွေးမြင့် DNA ကို ပေးစွမ်းသည်။ eDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသော နည်းပညာဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်အချို့ကြောင့် ၎င်းသည် အားသာချက်ကြီးတစ်ခုဖြစ်သည် [77]။ နမူနာယူခြင်းနည်းလမ်း၏ ရိုးရှင်းမှုနှင့် ကုန်ကျစရိတ်နည်းပါးခြင်းသည် ရေရှည်စောင့်ကြည့်ရေးအစီအစဉ်များအတွက်လည်း အထူးသင့်လျော်ပါသည်။ ၎င်းတို့၏ စစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းမြင့်မားခြင်းအပြင်၊ bivalves များ၏ နောက်ထပ်လူသိများသော အင်္ဂါရပ်တစ်ခုမှာ ၎င်းတို့၏ ချွဲ၏ ဓာတု mucopolysaccharide ဖွဲ့စည်းမှုဖြစ်ပြီး ဗိုင်းရပ်စ်များ စုပ်ယူမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည် [78၊ 79]။ ၎င်းသည် bivalves များကို ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများနှင့် ရေနေဂေဟစနစ်တစ်ခုတွင် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ သက်ရောက်မှုကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် အကောင်းဆုံး သဘာဝစစ်ထုတ်ကိရိယာတစ်ခု ဖြစ်စေသည်။ eDNA နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက host မှဆင်းသက်လာသော DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကို နည်းလမ်း၏ ကန့်သတ်ချက်တစ်ခုအဖြစ် ရှုမြင်နိုင်သော်လည်း၊ eDNA နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ထိုကဲ့သို့သော native ccfDNA ရှိခြင်းနှင့် ဆက်စပ်သော ကုန်ကျစရိတ်ကို ကျန်းမာရေးလေ့လာမှုများအတွက် ရရှိနိုင်သော အချက်အလက်များစွာအတွက် တစ်ပြိုင်နက်တည်း နားလည်နိုင်ပါသည်။ offset host။ ၎င်းတွင် host host ၏ genome ထဲသို့ ပေါင်းစပ်ထားသော ဗိုင်းရပ်စ် sequence များ ရှိနေခြင်း ပါဝင်သည်။ bivalves များတွင် အလျားလိုက် ပျံ့နှံ့သွားသော leukemic retroviruses များ ရှိနေခြင်းကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါက ၎င်းသည် mussels အတွက် အထူးအရေးကြီးပါသည် [80၊ 81]။ eDNA ထက် LB ၏ နောက်ထပ်အားသာချက်တစ်ခုမှာ ၎င်းသည် hemolymph တွင် လည်ပတ်နေသော သွေးဆဲလ်များ၏ phagocytic activity ကို အသုံးချပြီး microorganisms (နှင့် ၎င်းတို့၏ genomes များကို စုပ်ယူသည်)။ Phagocytosis သည် bivalves ရှိ သွေးဆဲလ်များ၏ အဓိကလုပ်ဆောင်ချက်ဖြစ်သည် [82]။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ဤနည်းလမ်းသည် mussels ၏ မြင့်မားသော filtering စွမ်းရည် (ပျမ်းမျှ ပင်လယ်ရေ 1.5 l/h) နှင့် နှစ်ရက်လည်ပတ်မှုကို အခွင့်ကောင်းယူထားပြီး ပင်လယ်ရေ အလွှာအမျိုးမျိုး ရောနှောမှုကို တိုးမြင့်စေပြီး heterologous eDNA ကို ဖမ်းယူနိုင်စေပါသည်။ [83၊ 84]။ ထို့ကြောင့် မုတ်ကောင် ccfDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် မုတ်ကောင်များ၏ အာဟာရ၊ စီးပွားရေးနှင့် ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ သက်ရောက်မှုများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင် စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော လမ်းကြောင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ လူသားများထံမှ စုဆောင်းရရှိသော LB ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ဆင်တူသည်မှာ ဤနည်းလမ်းသည် ပြင်ပပစ္စည်းများကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် အိမ်ရှင် DNA တွင် မျိုးရိုးဗီဇနှင့် epigenetic ပြောင်းလဲမှုများကို တိုင်းတာနိုင်ခြေကိုလည်း ဖွင့်ပေးပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ nanopore sequencing ကို အသုံးပြု၍ native ccfDNA တွင် genome-wide methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ရန် တတိယမျိုးဆက် sequencing နည်းပညာများကို မြင်ယောင်နိုင်ပါသည်။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို mussel ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ အရှည်သည် ဓာတုပြောင်းလဲမှုများ မလိုအပ်ဘဲ single sequencing run မှ genome-wide DNA methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ခွင့်ပြုသည့် long-read sequencing platform များနှင့် အကောင်းဆုံး သဟဇာတဖြစ်မှုဖြင့် လွယ်ကူချောမွေ့စေသင့်သည်။85,86] ၎င်းသည် စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော ဖြစ်နိုင်ခြေတစ်ခုဖြစ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် DNA methylation ပုံစံများသည် ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာဖိစီးမှုအပေါ် တုံ့ပြန်မှုကို ထင်ဟပ်စေပြီး မျိုးဆက်များစွာ တည်တံ့နေကြောင်း ပြသထားသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု သို့မဟုတ် ညစ်ညမ်းမှုများ ထိတွေ့ပြီးနောက် တုံ့ပြန်မှုကို ထိန်းချုပ်သည့် အခြေခံယန္တရားများအကြောင်း အဖိုးတန်ထိုးထွင်းသိမြင်မှုကို ပေးစွမ်းနိုင်သည် [87]။ သို့သော် LB ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် ကန့်သတ်ချက်များမရှိဘဲမဟုတ်ပါ။ ပြောစရာမလိုပါဘူး၊ ဒါက ဂေဟစနစ်မှာ အညွှန်းကိန်းမျိုးစိတ်တွေ ရှိနေဖို့ လိုအပ်ပါတယ်။ အထက်မှာ ဖော်ပြခဲ့သလိုပဲ၊ LB ကိုအသုံးပြုပြီး ပေးထားတဲ့ ဂေဟစနစ်ရဲ့ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲတွေကို အကဲဖြတ်ဖို့အတွက် အရင်းအမြစ်ကနေ DNA အပိုင်းအစတွေ ရှိနေတာကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားတဲ့ တိကျတဲ့ ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ ပိုက်လိုင်းတစ်ခုလည်း လိုအပ်ပါတယ်။ နောက်ထပ် အဓိကပြဿနာတစ်ခုကတော့ ရေနေမျိုးစိတ်တွေအတွက် ရည်ညွှန်းဂျီနိုမ်တွေ ရရှိနိုင်မှုပါပဲ။ Marine Mammal Genomes Project နဲ့ မကြာသေးမီက တည်ထောင်ခဲ့တဲ့ Fish10k project [88] လိုမျိုး အစီအစဉ်တွေက အနာဂတ်မှာ ဒီလိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေလိမ့်မယ်လို့ မျှော်လင့်ရပါတယ်။ LB သဘောတရားကို ရေနေ filter-feeding သက်ရှိတွေမှာ အသုံးချခြင်းဟာ sequencing နည်းပညာရဲ့ နောက်ဆုံးပေါ်တိုးတက်မှုတွေနဲ့လည်း ကိုက်ညီပြီး ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်တဲ့အနေနဲ့ ရေနေနေရင်းဒေသတွေရဲ့ ကျန်းမာရေးအကြောင်း အရေးကြီးတဲ့အချက်အလက်တွေကို ပေးစွမ်းဖို့ multi-ohm biomarkers တွေ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေးအတွက် သင့်တော်ပါတယ်။
ဂျီနိုမ် အစီအစဉ်ဒေတာကို Bioprojects SRR8924808 အောက်ရှိ NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 တွင် သိမ်းဆည်းထားပါသည်။
Brierley AS၊ Kingsford MJ ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှုသည် ရေနေသတ္တဝါများနှင့် ဂေဟစနစ်များအပေါ် သက်ရောက်မှု။ Cole Biology။ ၂၀၀၉; ၁၉: P602–P614။
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှုနှင့် အခြားဒေသတွင်းဖိစီးမှုများ၏ ရေနေပတ်ဝန်းကျင်အပေါ် ပေါင်းစပ်သက်ရောက်မှုများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါ။ အထွေထွေသိပ္ပံပတ်ဝန်းကျင်။ ၂၀၂၁;၇၅၅:၁၄၂၅၆၄။
Carella F၊ Antuofermo E၊ Farina S၊ Salati F၊ Mandas D၊ Prado P၊ et al။ ) သိပ္ပံ ပဋ္ဌမတ္တာ။ 2020; ၇:၄၈။
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. ထပ်ခါတလဲလဲ အပူဒဏ်အခြေအနေများအောက်တွင် အပူဒဏ်ခံနိုင်ရည် လျော့နည်းသွားခြင်းသည် အပြာရောင်မုတ်ကောင်များ၏ နွေရာသီသေဆုံးမှုနှုန်း မြင့်မားရခြင်းကို ရှင်းပြသည်။ ၂၀၁၉ ခုနှစ် သိပ္ပံအစီရင်ခံစာ; ၉:၁၇၄၉၈။
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. တိရစ္ဆာန်သေဆုံးမှုကြိမ်နှုန်း၊ အကြောင်းရင်းများနှင့် အတိုင်းအတာတို့တွင် မကြာသေးမီက ပြောင်းလဲမှုများ။ Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F၊ Sanna D၊ Azzena I၊ Mughetti D၊ Cerruti F၊ Hosseini S၊ et al။ မျိုးစိတ်-သတ်သတ်မှတ်မှတ်မဟုတ်သော ရောဂါပိုးအများအပြားသည် Pinna nobilis ၏အစုလိုက်အပြုံလိုက်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ဘဝ။ 2020; 10:238။
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. အာတိတ်ဒေသရှိ တိရစ္ဆာန်များမှ ကူးစက်တတ်သော ရောဂါများအပေါ် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ အလားအလာရှိသော သက်ရောက်မှု။ Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. ကမ်းရိုးတန်းညစ်ညမ်းမှုစောင့်ကြည့်ခြင်းတွင် အချက်ပြသက်ရှိများအဖြစ် Blue mussels (Mytilus edulis spp.) - ပြန်လည်သုံးသပ်ချက်။ Mar Environ Res 2017; 130:338-65။
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. ကင်ဆာကုသမှုတွင် အရည်တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်းကို ပေါင်းစပ်အသုံးပြုခြင်း။ Nat Rev Clean Oncol. ၂၀၁၇; ၁၄:၅၃၁–၄၈။
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. အရည်တစ်ရှူးစစ်ဆေးခြင်း ရင့်ကျက်ခြင်း- အကျိတ် DNA လည်ပတ်စေရန် ခွင့်ပြုသည်။ Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P.၊ Metais P. လူ့ပလာစမာရှိ နျူကလီအက်ဆစ်များ။ Soc Biol လက်အောက်ခံကုမ္ပဏီများ၏ အစည်းအဝေးမှတ်တမ်း။ ၁၉၄၈; ၁၄၂:၂၄၁-၃။
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. ကင်ဆာကုသမှုအတွက် မော်လီကျူးအမှတ်အသားအဖြစ် ဆဲလ်ကင်းစင်သော DNA အတွက် အခန်းကဏ္ဍအသစ်။ ဇီဝမိုလာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း။ ၂၀၁၉;၁၇:၁၀၀၀၈၇။
Ignatiadis M.၊ Sledge GW၊ Jeffrey SS အရည်တစ်သျှူးစစ်ဆေးခြင်းသည် ဆေးခန်းသို့ ဝင်ရောက်လာခြင်း - အကောင်အထည်ဖော်မှုဆိုင်ရာ ပြဿနာများ နှင့် အနာဂတ်စိန်ခေါ်မှုများ။ Nat Rev Clin Oncol။ ၂၀၂၁; ၁၈:၂၉၇–၃၁၂။
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW နှင့် အခြားသူများ။ သန္ဓေသား DNA သည် မိခင်၏ပလာစမာနှင့် သွေးရည်ကြည်တွင် ရှိနေသည်။ Lancet. 1997; 350:485-7။
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ်အတွင်း အမျိုးသမီးများ၏ သွေးထဲတွင် လည်ပတ်နေသော ဆဲလ်ပြင်ပ RNA ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်ဝန်ဆောင်ခြင်းဖြစ်စဉ်နှင့် ၎င်း၏ နောက်ဆက်တွဲပြဿနာများကို လေ့လာခြင်း။ Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. အရည်တစ်သျှူးစစ်ဆေးခြင်း- ကျောက်ကပ်အစားထိုးကုသမှုတွင် allogeneic lesions များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် donor cell-free DNA ကို အသုံးပြုသည်။ Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC၊ Lo YM မွေးဖွားခြင်းမပြုမီ ရောဂါရှာဖွေရေးတွင် ဆန်းသစ်တီထွင်မှုများ- မိခင်၏ ပလာစမာ မျိုးရိုးဗီဇ အစီအစဉ်ရှာဖွေခြင်း။ Anna MD။ ၂၀၁၆;၆၇:၄၁၉-၃၂။
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. ကူးစက်ခံထားရသော ခန္ဓာကိုယ်အရည်များ၏ နောက်မျိုးဆက် metagenomic sequencing ဖြင့် ရောဂါပိုးများကို လျင်မြန်စွာ ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်း။ Nat Medicine. 2021;27:115-24.