Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်တဲ့အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။ သင်အသုံးပြုနေသောဘရောက်ဆာဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှုအကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ဤအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို တင်ဆက်ပါမည်။
Liquid biopsy (LB) သည် ဇီဝဆေးပညာနယ်ပယ်တွင် လျင်မြန်စွာ ရေပန်းစားလာသော အယူအဆတစ်ခုဖြစ်သည်။ သဘောတရားသည် အဓိကအားဖြင့် တစ်ရှူးအမျိုးမျိုးရှိ ဆဲလ်သေပြီးနောက် သေးငယ်သောအပိုင်းအစများအဖြစ် ထုတ်ပေးသည့် ပျံ့နှံ့နေသော extracellular DNA (ccfDNA) ၏အပိုင်းအစများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းအပေါ် အခြေခံသည်။ ဤအပိုင်းအစများ၏ သေးငယ်သော အချိုးအစားသည် နိုင်ငံခြား (နိုင်ငံခြား) တစ်ရှူးများ သို့မဟုတ် သက်ရှိများမှ အစပြုပါသည်။ လက်ရှိအလုပ်တွင်၊ ၎င်းတို့၏မြင့်မားသောပင်လယ်ရေစစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းကြောင့်လူသိများသောဂုံးမျိုးစိတ်များတွင်ဤအယူအဆကိုအသုံးပြုထားသည်။ အဏ္ဏဝါကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို ပေးဆောင်ရန် အရင်းအမြစ်အမျိုးမျိုးမှ သဘာဝပတ်ဝန်းကျင် DNA အပိုင်းအစများကို ဖမ်းယူရန် သဘာဝစစ်ထုတ်မှုများအဖြစ် လုပ်ဆောင်ရန် ဂုံးများ၏စွမ်းရည်ကို ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ mussel hemolymph သည် 1 မှ 5 kb မှ အရွယ်အစားအလွန်ကွာခြားသည့် DNA အပိုင်းအစများပါရှိသည်။ သေနတ်ဖြင့် ချိန်ညှိခြင်းတွင် DNA အပိုင်းအစ အများအပြားသည် နိုင်ငံခြား ရောဂါပိုးမွှားများ၏ မူလဇစ်မြစ်ဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ၎င်းတို့အနက်မှ ဘက်တီးရီးယား၊ archaea နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်များမှ DNA အပိုင်းအစများကို ကမ်းရိုးတန်းအဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်တွင် တွေ့ရလေ့ရှိသော ဘုံအိမ်ရှင်အမျိုးမျိုးကို ကူးစက်နိုင်သော ဗိုင်းရပ်စ်များအပါအဝင် ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးများမှ တွေ့ရှိပါသည်။ နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် ဂုံးများနှင့်ပတ်သက်သော LB အယူအဆသည် ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များရှိ အဏုဇီဝမျိုးကွဲများအကြောင်း ကြွယ်ဝသော်လည်း မစူးစမ်းရသေးသည့် အသိပညာအရင်းအမြစ်ကို ကိုယ်စားပြုကြောင်း သရုပ်ပြပါသည်။
ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု (CC) ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုသည် အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများအပေါ် လျင်မြန်စွာကြီးထွားလာနေသော သုတေသနနယ်ပယ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ကမ္ဘာကြီးပူနွေးလာမှုသည် အရေးကြီးသော ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုများကို ဖြစ်စေရုံသာမက အဏ္ဏဝါသက်ရှိများ၏ အပူချိန်တည်ငြိမ်မှု၏ ဆင့်ကဲပြောင်းလဲမှုဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များကိုလည်း တွန်းအားပေးကာ မျိုးစိတ်ပေါင်းများစွာ၏ နေထိုင်ရာနေရာကို ထိခိုက်စေကာ ၎င်းတို့အား ပိုမိုသာယာသော အခြေအနေများကို ရှာဖွေရန် လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ [1၊ 2] metazoans များ၏ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို ထိခိုက်စေသည့်အပြင်၊ CC သည် လက်ခံသူ-ရောဂါပိုးမွှား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု၏ သိမ်မွေ့သောဟန်ချက်ကို အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ ဤ microbial dysbacteriosis သည် အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များကို ဆိုးရွားသော ခြိမ်းခြောက်မှုတစ်ခု ဖြစ်စေသောကြောင့် အဏ္ဏဝါသက်ရှိများ ကူးစက်နိုင်သော ရောဂါပိုးများ [3, 4] ကို ပို၍ ခံနိုင်ရည်ရှိစေသည်။ SS သည် အစုလိုက်အပြုံလိုက်သေဆုံးမှုတွင် အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်သည်ဟု ယုံကြည်ရပြီး၊ ယင်းသည် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာအဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်စီမံခန့်ခွဲမှုအတွက် ဆိုးရွားသောပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည် [5၊ 6]။ အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်များစွာ၏ စီးပွားရေး၊ ဂေဟစနစ်နှင့် အာဟာရဆိုင်ရာ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကြောင့် ဤသည်မှာ အရေးကြီးသောကိစ္စရပ်ဖြစ်သည်။ အထူးသဖြင့် CK ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် ပိုမိုပြင်းထန်ပြီး ပြင်းထန်သည့် ဝင်ရိုးစွန်းဒေသများတွင်နေထိုင်သော bivalves များအတွက် အထူးမှန်ကန်ပါသည်။ တကယ်တော့ Mytilus spp လိုမျိုး bivaves တွေပါ။ အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်အပေါ် CC ၏သက်ရောက်မှုများကို စောင့်ကြည့်ရန် တွင်ကျယ်စွာအသုံးပြုကြသည်။ အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ၊ ဆဲလ်ရှင်သန်နိုင်စွမ်းနှင့် phagocytic လုပ်ဆောင်ချက် [8] ကဲ့သို့သော အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက် သို့မဟုတ် ဆဲလ်များ၏လုပ်ဆောင်မှုအပေါ်အခြေခံ၍ လုပ်ဆောင်နိုင်သော biomarkers များပါ၀င်သည့် နှစ်ဆင့်ချဉ်းကပ်မှုဖြင့် ၎င်းတို့၏ကျန်းမာရေးကို စောင့်ကြည့်ရန် ဇီဝအမှတ်အသားအများအပြားကို တီထွင်ထုတ်လုပ်ထားသည်။ ဤနည်းလမ်းများတွင် ပင်လယ်ရေအမြောက်အမြားကို စုပ်ယူပြီးနောက် ပျော့ပျောင်းသောတစ်ရှူးများတွင် စုပုံနေသည့် သီးခြားဖိအားညွှန်းကိန်းများ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုင်းတာခြင်းလည်း ပါဝင်သည်။ သို့သော်၊ မြင့်မားသော filtration စွမ်းရည်နှင့် bivalves များ၏ semi-open သွေးလည်ပတ်မှုစနစ်သည် liquid biopsy (LB) အယူအဆကို အသုံးပြု၍ လူနာစီမံခန့်ခွဲမှုအတွက် ရိုးရှင်းပြီး အနည်းဆုံး ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်သည့် ချဉ်းကပ်မှုပုံစံကို အသုံးပြု၍ hemolymph biomarkers အသစ်များကို ဖော်ထုတ်ရန် အခွင့်အလမ်းပေးပါသည်။ သွေးနမူနာများ [၉၊ ၁၀]။ လူ့ LB တွင် လည်ပတ်နေသော မော်လီကျူးအမျိုးအစားများစွာကို တွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း၊ ဤအယူအဆသည် ပလာစမာရှိ extracellular DNA (ccfDNA) အပိုင်းအစများ၏ DNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအပေါ် အခြေခံသည်။ တကယ်တော့၊ လူ့ပလာစမာတွင် ပျံ့နှံ့နေသော DNA ပါဝင်မှုကို 20 ရာစု အလယ်ပိုင်းကတည်းက သိထားသော်လည်း မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်းတွင် မြင့်မားသော ဆင့်ကဲဆက်ခြင်းနည်းလမ်းများ ပေါ်ထွန်းလာခြင်းကြောင့် ccfDNA ကို အခြေခံ၍ ဆေးစစ်ချက်အဖြေကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ဤပျံ့နှံ့နေသော DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းသည် ဆဲလ်သေပြီးနောက် မျိုးရိုးဗီဇ DNA (နျူကလီးယားနှင့် မီတိုဟွန်ဒရီရယ်) ၏ passive ထုတ်ပေးမှုကြောင့် ဖြစ်သည်။ ကျန်းမာသောလူများတွင် ccfDNA ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည်ပုံမှန်အားဖြင့်နည်းပါးသည် (<10 ng/mL) ဖြစ်သော်လည်း အမျိုးမျိုးသောရောဂါဗေဒဆိုင်ရာရောဂါများခံစားနေရသောလူနာများတွင် (သို့) စိတ်ဖိစီးမှုခံရသောလူနာများတွင် 5-10 ဆတိုးလာနိုင်သည်။ ကျန်းမာသောလူများတွင် ccfDNA ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည်ပုံမှန်အားဖြင့်နည်းပါးသည် (<10 ng/mL) ဖြစ်သော်လည်း အမျိုးမျိုးသောရောဂါဗေဒဆိုင်ရာရောဂါများခံစားနေရသောလူနာများတွင် (သို့) စိတ်ဖိစီးမှုခံရသောလူနာများတွင် 5-10 ဆတိုးလာနိုင်သည်။ У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 ральруы патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ကျန်းမာသောလူများတွင် cccDNA ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည်ပုံမှန်အားဖြင့်နည်းပါးသည် (<10 ng/mL) ဖြစ်သော်လည်း၊ အမျိုးမျိုးသောရောဂါများသို့မဟုတ်တစ်သျှူးများကိုထိခိုက်စေသောစိတ်ဖိစီးမှုအောက်တွင်လူနာများတွင် ၅ မှ ၁၀ ဆအထိတိုးလာနိုင်သည်။在健康个体中，ccfDNA的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患倅5倍，从而导致组织损伤။在健康个体中，ccfdna的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承受厸力患5-10倍，从而组织。。 损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раиз упт различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA အာရုံစူးစိုက်မှုသည် အများအားဖြင့် (<10 ng/ml) နည်းပါးသော်လည်း ကျန်းမာသောလူများတွင် (<10 ng/ml) နည်းပါးသော်လည်း အမျိုးမျိုးသောရောဂါများ သို့မဟုတ် စိတ်ဖိစီးမှုများရှိသော လူနာများတွင် 5-10-ဆ တိုးနိုင်ပြီး တစ်သျှူးများပျက်စီးစေသည်။ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ အရွယ်အစားသည် ကျယ်ပြန့်စွာ ကွဲပြားသော်လည်း များသောအားဖြင့် 150 bp မှ 200 bp အထိ ရှိတတ်သည်။ [12]။ ကိုယ်တိုင်မှဆင်းသက်လာသော ccfDNA၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ ပုံမှန် သို့မဟုတ် အသွင်ပြောင်းထားသောအိမ်ရှင်ဆဲလ်များမှ ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် နျူကလီးယားနှင့်/သို့မဟုတ် mitochondrial genome တွင်ရှိနေသော မျိုးရိုးဗီဇနှင့် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို ရှာဖွေဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်ပြီး၊ ထို့ကြောင့် ဆေးခန်းများမှ တိကျသော မော်လီကျူးပစ်မှတ်ထားသော ကုထုံးများ [13] ကိုရွေးချယ်ရန် ကူညီပေးသည်။ သို့သော်၊ ccfDNA ကို ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ်အတွင်း သန္ဓေသားဆဲလ်များမှ ccfDNA ကဲ့သို့သော နိုင်ငံခြားရင်းမြစ်များမှ သို့မဟုတ် အစားထိုးထားသော ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါများ [14,15,16,17] တို့မှ ရရှိနိုင်သည်။ ccfDNA သည် ကူးစက်နိုင်သော အေးဂျင့် (နိုင်ငံခြား) ၏ နျူကလိစ်အက်ဆစ် ပါဝင်မှုကို ထောက်လှမ်းရန် အရေးကြီးသော သတင်းရင်းမြစ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး သွေးယဉ်ကျေးမှုဖြင့် မသတ်မှတ်ထားသော ပျံ့နှံ့နေသော ကူးစက်ရောဂါများကို ထိုးဖောက်စစ်ဆေးနိုင်ခြင်း [18]။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများက လူ့သွေးတွင် ဗိုင်းရပ်စ်နှင့် ဘက်တီးရီးယားပိုးမွှားများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် အချက်အလက်များ ကြွယ်ဝစွာပါဝင်ကြောင်းနှင့် လူ့ပလာစမာတွင် တွေ့ရှိရသည့် ccfDNA ၏ 1% ခန့်သည် နိုင်ငံခြားရင်းမြစ်ဖြစ်သည် [19]။ ဤလေ့လာမှုများသည် ccfDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ သက်ရှိများ၏ ပျံ့နှံ့နေသော သေးငယ်သောဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို အကဲဖြတ်နိုင်ကြောင်း သရုပ်ပြသည်။ သို့သော်လည်း မကြာသေးမီအထိ၊ ဤအယူအဆကို လူသားများတွင် သီးသန့်အသုံးပြုခဲ့ပြီး အခြားသော ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများ [20၊ 21]၊
လက်ရှိစာတမ်းတွင်၊ လွန်ခဲ့သောနှစ်ပေါင်း 35 သန်းက ကုန်းပြင်မြင့်ပေါ်ရှိ ကျွန်းစုအုပ်စုတစ်ခုဖြစ်သည့် subantarctic Kerguelen ကျွန်းစုတွင် တွေ့ရလေ့ရှိသည့် တောင်ဘက်မျိုးစိတ်ဖြစ်သည့် Aulacomya atra ၏ ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် LB အလားအလာကို ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုပါသည်။ မီးတောင်ပေါက်ကွဲမှု။ in vitro စမ်းသပ်မှုစနစ်အား အသုံးပြု၍ ပင်လယ်ရေရှိ DNA အပိုင်းအစများကို ဂုံးများက လျင်မြန်စွာ စုပ်ယူကာ hemolymph အခန်းထဲသို့ ဝင်ရောက်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ သေနတ်ပစ်ခတ်မှု ဆက်တိုက်ပြုလုပ်ခြင်းတွင် ကမာကောင် hemolymph ccfDNA တွင် ၎င်း၏ကိုယ်ပိုင်နှင့် ကိုယ်ပိုင်မဟုတ်သော DNA အပိုင်းအစများ ပါဝင်ကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတွင် symbiotic ဘက်တီးရီးယားများနှင့် အေးသောမီးတောင်ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်များ၏ ပုံမှန် biomes များမှ DNA အပိုင်းအစများ ပါဝင်သည်။ Hemolymph ccfDNA တွင် မတူညီသော host ranges ရှိသည့် ဗိုင်းရပ်စ်များမှ ဆင်းသက်လာသော ဗိုင်းရပ်စ် sequence များပါရှိသည်။ အရိုးငါးများ၊ ပင်လယ်ပိုးမွှားများ၊ ရေညှိများနှင့် အင်းဆက်ပိုးမွှားများကဲ့သို့သော ဆဲလ်ပေါင်းစုံမှ DNA အပိုင်းအစများကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် LB အယူအဆကို အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်တွင် ကြွယ်ဝသော မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်မှုတစ်ခုဖန်တီးရန် အဏ္ဏဝါကျောရိုးမဲ့များထံ အောင်မြင်စွာအသုံးချနိုင်ကြောင်း သရုပ်ပြပါသည်။
အရွယ်ရောက်ပြီးသူများ (55-70 မီလီမီတာ) Mytilus platensis (M. platensis) နှင့် Aulacomya atra (A. atra) ကို Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.) မှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ 2018 ခုနှစ် ဒီဇင်ဘာလတွင် Kerguelen ကျွန်းစုများ။ အခြားသော အရွယ်ရောက်ပြီးသူ အပြာရောင် ဂုံးကောင်များ (Mytilus spp.) ကို စီးပွားဖြစ် ပေးသွင်းသူ (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ထံမှ ရယူပြီး ဆားရည်အတု 10-20 L ၏ 32‰ ဆားရည်အတု ပါဝင်သော အပူချိန် ထိန်းချုပ်ထားသော (4°C) တွင် ထည့်ထားသည်။ (ပင်လယ်ဆားအတု Reef Crystal၊ Instant Ocean၊ Virginia၊ USA)။ စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီအတွက် အခွံတစ်ခုချင်းစီ၏ အလျားနှင့် အလေးချိန်ကို တိုင်းတာသည်။
ဤပရိုဂရမ်အတွက် အခမဲ့ဖွင့်သုံးခွင့် ပရိုတိုကောကို အွန်လိုင်း (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1) တွင် ရရှိနိုင်ပါသည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ LB hemolymph ကို ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ခိုးယူသည့်ကြွက်သားများမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ hemolymph ကို 1200×g တွင် 3 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ရှင်းလင်းခဲ့ပြီး၊ supernatant ကို အသုံးပြုသည်အထိ (-20°C) အေးခဲထားသည်။ cfDNA ၏ သီးခြားခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် သန့်စင်ခြင်းအတွက်၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်အရ နမူနာ (1.5-2.0 ml) ကို NucleoSnap cfDNA အစုံ (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ကို အသုံးပြု၍ သုတ်လိမ်းပြီး စီမံဆောင်ရွက်ခဲ့ပါသည်။ ccfDNA ကို -80°C တွင် ထပ်မံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးသည်အထိ သိမ်းဆည်းထားသည်။ အချို့သောစမ်းသပ်မှုများတွင် ccfDNA ကို QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN၊ Toronto, Ontario, Canada) ကို အသုံးပြု၍ သီးခြားခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ခဲ့သည်။ သန့်စင်ထားသော DNA သည် စံ PicoGreen စစ်ဆေးမှုကို အသုံးပြု၍ အရေအတွက်ကို တိုင်းတာသည်။ အထီးကျန် ccfDNA ၏ အပိုင်းအစများ ဖြန့်ဖြူးမှုကို Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) အသုံးပြု၍ သွေးကြောမျှင် electrophoresis ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားပါသည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်အရ စစ်ဆေးမှုသည် ccfDNA နမူနာ၏ 1 µl ကိုအသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
hemolymph ccfDNA အပိုင်းအစများကို စီစစ်ရန်အတွက်၊ Génome Québec (Montreal၊ Quebec၊ Canada) သည် Illumina MiSeq PE75 kit ၏ Illumina DNA Mix အစုံကို အသုံးပြု၍ သေနတ်ပစ်သေနတ်စာကြည့်တိုက်များကို ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ စံဒက်တာ (BioO) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဒေတာအကြမ်းဖိုင်များကို NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 နှင့် SRR8924809) မှ ရရှိနိုင်ပါသည်။ FastQC [23] ကို အသုံးပြု၍ အခြေခံ စာဖတ်အရည်အသွေးကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ Trimmomatic [24] ကို အဒက်တာများညှပ်ခြင်းနှင့် အရည်အသွေးညံ့ဖျင်းသော ဖတ်ရှုခြင်းအတွက် အသုံးပြုထားသည်။ တွဲထားသော အစွန်းများဖြင့် ဖတ်ထားသော သေနတ်ပစ်ချက်များအား FLASH သည် မကိုက်ညီမှုများကို ရှောင်ရှားရန် အနည်းဆုံး ထပ်နေသော 20 bp ဖြင့် ပိုရှည်သော single reads များအဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ပေါင်းစည်းထားသော ဖတ်ရှုမှုများကို BLASTN ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည့် bivalve NCBI Taxonomy ဒေတာဘေ့စ် (e value < 1e−3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြုပြီး ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော အတွဲများကို ဖုံးကွယ်ထားသည့် DUST [26] ကို အသုံးပြုထားသည်။ ပေါင်းစည်းထားသော ဖတ်ရှုမှုများကို BLASTN ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည့် bivalve NCBI Taxonomy ဒေတာဘေ့စ် (e value < 1e−3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြုပြီး ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော အတွဲများကို ဖုံးကွယ်ထားသည့် DUST [26] ကို အသုံးပြုထားသည်။ Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двуслтвор (значение e < 1e-3 နှင့် 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпольностей низкой сложности было выпольнеспам [၂၆]။ ပေါင်းစည်းထားသောဖတ်စာများကို NCBI bivalve taxonomy ဒေတာဘေ့စ် (e value < 1e-3 နှင့် 90% homology) ကို အသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် မှတ်စုပြုထားပြီး ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော အစီအမံများကို DUST [26] ဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။使用双壳类NCBI 分类数据库 (e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数用 并使进行低复杂度序列的掩蔽။使用双壳类 ncbi 分类（（<1e-3和 90%同源）用用用注释合并读数，幨俽6用 ဖုန်မှုန့်复杂度序列的。。。掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽掩蔽潩蔽掩掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы даннылвсус NCBI (значение e <1e-3 နှင့် 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпосьностей низкой сложности было выпосьненно [၂၆]။ ပေါင်းစည်းထားသောဖတ်မှုများကို NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 နှင့် 90% homology) ကိုအသုံးပြု၍ BLASTN ဖြင့် မှတ်စုမှတ်ထားပြီး DUST [26] ကိုအသုံးပြု၍ ရှုပ်ထွေးမှုနည်းသော sequence masking ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ဖတ်ရှုမှုများကို အုပ်စုနှစ်စု ခွဲခြားထားသည်- bivalve sequences (ဤနေရာတွင် ကိုယ်တိုင်ဖတ်ခြင်းဟုခေါ်သည်) နှင့် မသက်ဆိုင်သော (ကိုယ်တိုင်မဖတ်ခြင်း) တို့နှင့် သက်ဆိုင်ပါသည်။ contigs [27] ကို ဖန်တီးရန် MEGAHIT ကို အသုံးပြု၍ အဖွဲ့နှစ်ဖွဲ့ သီးခြားစီ စုရုံးခဲ့ကြသည်။ ဤအတောအတွင်း၊ ဂြိုလ်သားအဏုဇီဝများဖတ်ခြင်း၏အစီအစဥ်ခွဲဝေမှုကို Kraken2 [28] ကိုအသုံးပြု၍ ခွဲခြားထားပြီး Galaxy [29၊ 30] ရှိ Krona pie chart ဖြင့် ဂရပ်ဖစ်ပုံဖော်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ပဏာမစမ်းသပ်မှုများမှ အကောင်းဆုံး ကီလိုမီတာများကို kmers-59 အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် နောက်ဆုံးမှတ်စုတစ်ခုအတွက် BLASTN (bivalve NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ အီးတန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% တူညီမှု) တို့နှင့် ချိန်ညှိခြင်းဖြင့် Self contigs များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် နောက်ဆုံးမှတ်စုတစ်ခုအတွက် BLASTN (bivalve NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ အီးတန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% တူညီမှု) တို့နှင့် ချိန်ညှိခြင်းဖြင့် Self contigs များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данныюх двустворча двустворча значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. နောက်ဆုံးမှတ်ချက်အတွက် BLASTN (NCBI bivalve database၊ e value <1e-10 နှင့် 60% homology) တို့နှင့် ကိုက်ညီခြင်းဖြင့် Self-contigs များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库၊ အီး 值< 1e-10 和60%同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释။然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库၊ အီး 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления NBI с для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)။ ထို့နောက် BLASTN (NCBI bivalve ဒေတာဘေ့စ်၊ အီးတန်ဖိုး <1e-10 နှင့် 60% တူညီမှု) တို့ကို ယှဉ်တွဲခြင်းဖြင့် နောက်ဆုံးမှတ်စာအတွက် Self-contigs များကို ရှာဖွေဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ တဆက်တည်းတွင်၊ ကိုယ်ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သောအဖွဲ့၏ဆက်နွှယ်မှုများကို BLASTN (nt NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ e တန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% တူညီမှု) ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည်။ တဆက်တည်းတွင်၊ ကိုယ်ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သောအဖွဲ့၏ဆက်နွှယ်မှုများကို BLASTN (nt NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ e တန်ဖိုး < 1e−10 နှင့် 60% တူညီမှု) ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည်။ Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, зна <чиоя-1гоме 60%)။ တဆက်တည်းတွင်၊ နိုင်ငံခြားအဖွဲ့အစည်းများကို BLASTN (NT NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ အီးတန်ဖိုး <1e-10 နှင့် 60% တူညီမှု) ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသည်။平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值<1e-10和60%同源性）注释非自身组重叠群။平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e值<1e-10和60%同源性）注释非自身组重叠群။ Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (базачни даненны) <1e-10 နှင့် гомология 60%)။ တဆက်တည်းတွင်၊ ကိုယ်ကျိုးမဖက်သောအဖွဲ့ contigs များကို BLASTN (nt NCBI ဒေတာဘေ့စ်၊ အီးတန်ဖိုး <1e-10 နှင့် 60% တူညီမှု) ဖြင့် မှတ်သားထားသည်။ BLASTX သည် nr နှင့် RefSeq ပရိုတင်း NCBI ဒေတာဘေ့စ်များ (e value < 1e−10 နှင့် 60% homology) ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော contigs များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ BLASTX သည် nr နှင့် RefSeq ပရိုတင်း NCBI ဒေတာဘေ့စ်များ (e value < 1e−10 နှင့် 60% homology) ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော contigs များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (зна<1e-1e) гомология 60%)။ BLASTX ကို nr နှင့် RefSeq NCBI ပရိုတိန်းဒေတာဘေ့စ်များ (e value < 1e-10 နှင့် 60% တူညီမှု) ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော contigs များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 倧源)还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX(e 值< 1e-10 和60% 倧源) BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значиогом 60%)။ BLASTX သည် nr နှင့် RefSeq NCBI ပရိုတင်းဒေတာဘေ့စ်များ (e value <1e-10 နှင့် 60% တူညီမှု) ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော contigs များတွင်လည်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။BLASTN နှင့် BLASTX အစုများသည် ကိုယ်တိုင်မဟုတ်သော contigs များ၏ နောက်ဆုံး contigs ကိုကိုယ်စားပြုသည် (နောက်ဆက်တွဲဖိုင်ကိုကြည့်ပါ)။
PCR အတွက်အသုံးပြုသော primers များကို Table S1 တွင်ဖော်ပြထားပါသည်။ Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada၊ Markham၊ ON) ကို ccfDNA ပစ်မှတ် ဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ အောက်ပါတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကိုအသုံးပြုခဲ့သည်- 3 မိနစ်အတွက် 95°C တွင် denaturation၊ 95°C အတွက် 1 မိနစ်၊ annealing temperature ကို 1 မိနစ်၊ elongation 72°C တွင် 1 မိနစ်၊ 35 cycles နှင့် နောက်ဆုံးတွင် 10 မိနစ်အတွင်း 72°C ။ . PCR ထုတ်ကုန်များကို 95 V တွင် SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen၊ Burlington၊ ON၊ Canada) တွင်ပါဝင်သော agarose gels (1.5%) တွင် electrophoresis ဖြင့် ပိုင်းခြားထားပါသည်။
ဂုံးကောင်များ (Mytilus spp.) ကို 500 ml အောက်ဆီဂျင်ပါသော ပင်လယ်ရေ (32 PSU) တွင် 4°C တွင် 24 နာရီကြာ ခံနိုင်ရည်ရှိအောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ လူသား galectin-7 cDNA အစီအစဉ် (NCBI ချိတ်ဆက်မှုနံပါတ် L07769) ကို ကုဒ်ကုဒ်ထည့်သွင်းထားသည့် ပလတ်စမစ် DNA ကို နောက်ဆုံးပြင်းအား 190 μg/μl တွင် ပုလင်းထဲသို့ ထည့်ထားသည်။ DNA ထပ်တိုးခြင်းမရှိဘဲ တူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင် ပေါက်ဖွားလာသော ဂုံးများကို ထိန်းချုပ်နိုင်ခဲ့သည်။ တတိယ ထိန်းချုပ်ကန်တွင် ဂုံးများမပါသော DNA ပါရှိသည်။ ပင်လယ်ရေရှိ DNA အရည်အသွေးကို စောင့်ကြည့်ရန်အတွက် ပင်လယ်ရေနမူနာများ (20 μl; ထပ်ခါတလဲလဲ သုံးကြိမ်) ကို သတ်မှတ်ထားသည့်အချိန်တွင် ကန်တစ်ခုစီမှ ယူဆောင်သွားခဲ့သည်။ plasmid DNA ခြေရာခံနိုင်မှုအတွက်၊ LB mussels များကို ညွှန်ပြသည့်အချိန်များတွင် ရိတ်သိမ်းပြီး qPCR နှင့် ddPCR တို့မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။ ပင်လယ်ရေ၏ဆားပါဝင်မှုမြင့်မားသောကြောင့် PCR စစ်ဆေးမှုအားလုံးမတိုင်မီ PCR အရည်အသွေးရေ (1:10) တွင် aliquots များကို ရောနှောထားသည်။
ဒစ်ဂျစ်တယ်အစက် PCR (ddPCR) ကို BioRad QX200 ပရိုတိုကော (Mississauga၊ Ontario၊ Canada) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အကောင်းဆုံးအပူချိန် (Table S1) ကို ဆုံးဖြတ်ရန် အပူချိန်ပရိုဖိုင်ကို အသုံးပြုပါ။ အစက်များကို QX200 drop generator (BioRad) ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ ddPCR ကို အောက်ပါအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်- 5 မိနစ်အတွက် 95°C၊ 30s အတွက် 95°C ၏ 50 cycles နှင့် annealing temperature ကို 1 min နှင့် 30 s အတွက် 72°C၊ 5 မိနစ်အတွက် 4°C နှင့် 5 မိနစ်အတွင်း 90°C တို့ဖြစ်သည်။ ကျဆင်းမှုအရေအတွက်နှင့် အပြုသဘောတုံ့ပြန်မှုများ (မိတ္တူအရေအတွက်/µl) ကို QX200 drop reader (BioRad) ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ အစက် ၁၀,၀၀၀ အောက်ရှိသော နမူနာများကို ပယ်ချခဲ့သည်။ ddPCR ကို run တိုင်း Pattern ထိန်းချုပ်မှု မလုပ်ဆောင်ပါ။
qPCR သည် Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research၊ Sydney၊ Australia) နှင့် LGALS7 သီးခြား primers တို့ကို အသုံးပြုထားသည်။ Quantitative SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ကို အသုံးပြု၍ ပမာဏ PCR အားလုံးကို 20 µl ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ qPCR ကို 95°C တွင် 15 min incubation ဖြင့် စတင်ခဲ့ပြီး 95°C တွင် 10 စက္ကန့်ကြာ 40 cycles နှင့် 60°C တွင် data collection တစ်ခုဖြင့် စက္ကန့် 60 ကြာသည်။ အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးများကို 5 စက္ကန့်အတွက် 95°C၊ 60s အတွက် 65°C နှင့် qPCR အဆုံးတွင် 97°C တွင် ဆက်တိုက်တိုင်းတာမှုများကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ qPCR တစ်ခုစီကို ထိန်းချုပ်နမူနာများမှလွဲ၍ triplicate ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ဂုံးကောင်များသည် ၎င်းတို့၏ စစ်ထုတ်မှုနှုန်း မြင့်မားသောကြောင့် လူသိများသောကြောင့်၊ ၎င်းတို့သည် ပင်လယ်ရေတွင် ရှိနေသည့် DNA အပိုင်းအစများကို စစ်ထုတ်ပြီး ထိန်းသိမ်းနိုင်မလား။ ဤအပိုင်းအစများသည် ၎င်းတို့၏ semi-open lymphatic system တွင် ဤအပိုင်းအစများ စုပုံနေခြင်းရှိမရှိကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ စိတ်ဝင်စားခဲ့ကြသည်။ အပြာရောင် mussel ကန်များတွင် ထည့်ထားသော ပျော်ဝင်နိုင်သော DNA အပိုင်းအစများ၏ ကံကြမ္မာကို ခြေရာခံခြင်းဖြင့် ဤပြဿနာကို စမ်းသပ်ဖြေရှင်းခဲ့သည်။ DNA အပိုင်းအစများကို ခြေရာခံရာတွင် လွယ်ကူချောမွေ့စေရန်၊ လူသား galectin-7 ဗီဇပါရှိသော နိုင်ငံခြား (ကိုယ်တိုင်မဟုတ်) plasmid DNA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ddPCR သည် ပင်လယ်ရေနှင့် ဂုံးများတွင် ပလာစမစ် DNA အပိုင်းအစများကို ခြေရာခံသည်။ ပင်လယ်ရေထဲတွင် DNA အပိုင်းအစများ အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ (၇ ရက်အထိ) ဆက်တိုက် တည်ရှိနေပါက ဂုံးများရောက်ရှိနေချိန်တွင် ဤအဆင့်သည် ၈ နာရီအတွင်း လုံးဝပျောက်ကွယ်လုနီးပါးဖြစ်သည် (ပုံ ၁၊ ခ)။ ပြင်ပမှ DNA အပိုင်းအစများကို အတွင်းပိုင်းအရည်နှင့် သွေးတွင်းအရည်များ (ပုံ။ 1c) တွင် 15 မိနစ်အတွင်း အလွယ်တကူ တွေ့ရှိနိုင်သည်။ ဤအပိုင်းအစများကို ထိတွေ့ပြီးနောက် ၄ နာရီအထိ တွေ့ရှိနိုင်သေးသည်။ DNA အပိုင်းအစများနှင့်စပ်လျဉ်း၍ ဤစစ်ထုတ်ခြင်းလုပ်ဆောင်ချက်သည် ဘက်တီးရီးယားနှင့် ရေညှိများ၏ စစ်ထုတ်ခြင်းလုပ်ဆောင်ချက် [31] နှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သည်။ ဤရလဒ်များအရ ဂုံးကောင်များသည် ၎င်းတို့၏ အရည်ခန်းများတွင် နိုင်ငံခြား DNA ကို စစ်ထုတ်နိုင်ပြီး စုပုံနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
ပင်လယ်ရေထဲတွင် ပလတ်စမစ် DNA ၏ ဆွေမျိုးပါဝင်မှု (A) သို့မဟုတ် ဂုံးများမရှိခြင်း (B) ကို ddPCR ဖြင့် တိုင်းတာသည်။ A တွင်၊ ရလဒ်များကို ရာခိုင်နှုန်းများအဖြစ် ဖော်ပြပြီး 75th နှင့် 25th percentiles များကို ကိုယ်စားပြုသည့် သေတ္တာများ၏ နယ်နိမိတ်များဖြင့် ဖော်ပြသည်။ တပ်ဆင်ထားသော လော့ဂရစ်သမ်မျဉ်းကွေးကို အနီရောင်ဖြင့် ပြသထားပြီး မီးခိုးရောင်ဖြင့် အရိပ်ရသော ဧရိယာသည် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလကို ကိုယ်စားပြုသည်။ B တွင်၊ အနီရောင်မျဉ်းသည် ပျမ်းမျှအား ကိုယ်စားပြုပြီး အပြာလိုင်းသည် အာရုံစူးစိုက်မှုအတွက် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလကို ကိုယ်စားပြုသည်။ C plasmid DNA ပေါင်းထည့်ပြီးနောက် မတူညီသောအချိန်များတွင် hemolymph နှင့် valvular အရည်များတွင် plasmid DNA စုဆောင်းခြင်း။ ရလဒ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော ပကတိမိတ္တူများ/mL (±SE) အဖြစ် တင်ပြပါသည်။
ထို့နောက်၊ မနုဿဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ သြဇာလွှမ်းမိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသော ဝေးလံခေါင်သီသော ကျွန်းစုအုပ်စုဖြစ်သည့် Kerguelen ကျွန်းများရှိ ကုံးခင်းများမှ ကောက်ယူထားသော ဂုံးများတွင် ccfDNA ၏ မူလဇစ်မြစ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ ဤရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ mussel hemolymphs မှ cccDNA ကို လူသား cccDNA သန့်စင်ရန် အသုံးများသောနည်းလမ်းများဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ခဲ့သည်။ ဂုံးများတွင် ပျမ်းမျှ hemolymph ccfDNA ပါဝင်မှုသည် မီလီမီတာ hemolymph အကွာအဝေးတွင် မိုက်ခရိုဂရမ် နည်းပါးကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (ဇယား S2၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်ကို ကြည့်ပါ)။ ဤပါဝင်မှုပမာဏသည် ကျန်းမာသောလူများတွင် (မီလီလီတာတစ်ခုလျှင် နာနိုဂရမ်နည်းပါးသည်) ထက် များစွာပိုကြီးသော်လည်း ရှားပါးသောကိစ္စများတွင် ကင်ဆာလူနာများတွင် ccfDNA အဆင့်သည် မီလီလီတာတစ်ခုလျှင် မိုက်ခရိုဂရမ်များစွာအထိ ရောက်ရှိနိုင်သည်။ hemolymph ccfDNA ၏ အရွယ်အစား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ဤအပိုင်းအစများသည် 1000 bp မှ 1000 bp အထိ အရွယ်အစား အလွန်ကွာခြားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ 5000 bp အထိ (ပုံ။ 2)။ ccfDNA [36] အပါအဝင် အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသော DNA နမူနာများမှ မျိုးရိုးဗီဇ DNA ကို လျင်မြန်စွာခွဲထုတ်ပြီး သန့်စင်ရန် မှုခင်းသိပ္ပံတွင် အသုံးများသည့် စီလီကာအခြေခံ QIAamp Investigator Kit ကို အသုံးပြု၍ အလားတူရလဒ်များကို ရရှိခဲ့သည်။
mussel hemolymph ၏ ကိုယ်စားလှယ် ccfDNA electrophoregram NucleoSnap Plasma Kit (အပေါ်ပိုင်း) နှင့် QIAamp DNA Investigator Kit ဖြင့် ထုတ်ယူသည်။ B သည် ဂုံးများတွင် hemolymph ccfDNA ပြင်းအား (±SE) ပျံ့နှံ့မှုကို ပြသသည့် ဇာတ်ကွက်။ အနက်ရောင်နှင့် အနီရောင်မျဉ်းများသည် အလယ်အလတ်နှင့် ပထမနှင့် တတိယ ကွာတားများကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် လူနှင့်မျောက်ဝံများတွင် ccfDNA ၏ 1% သည် နိုင်ငံခြားရင်းမြစ် [21၊ 37] ရှိသည်။ bivalves များ၏တစ်ပိုင်းပွင့်သောသွေးလည်ပတ်မှုစနစ်၊ အဏုဇီဝများကြွယ်ဝသောပင်လယ်ရေနှင့် mussel ccfDNA ၏အရွယ်အစားဖြန့်ဝေမှုအရ၊ mussel hemolymph ccfDNA တွင် အဏုဇီဝ DNA ကြွယ်ဝပြီး ကွဲပြားသောရေကန်များပါဝင်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယူဆပါသည်။ ဤယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Kerguelen ကျွန်းများမှ စုဆောင်းထားသော Aulacomya atra နမူနာများမှ hemolymph ccfDNA ကို စီစဥ်ထားပြီး ဖတ်ရှုမှု 10 သန်းကျော်ရရှိကာ 97.6% သည် အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုကို ကျော်ဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက်ဖတ်ရှုမှုများကို BLASTN နှင့် NCBI bivalve ဒေတာဘေ့စ်များ (ပုံ။ S1၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်များ) ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်နှင့်ကိုယ်မဟုတ်သောရင်းမြစ်များအလိုက် အမျိုးအစားခွဲခြားထားပါသည်။
လူသားများတွင် နျူကလီးယားနှင့် mitochondrial DNA နှစ်မျိုးလုံးကို သွေးကြောထဲသို့ ထုတ်လွှတ်နိုင်သည် [38]။ သို့သော်လည်း လက်ရှိလေ့လာမှုတွင် A. atra genome ကို စီစဥ်ထားခြင်း သို့မဟုတ် ဖော်ပြခြင်းမပြုသောကြောင့် ဂုံးများ၏ နျူကလီးယား ဗီဇ DNA ကို အသေးစိတ်ဖော်ပြရန် မဖြစ်နိုင်ပါ။ သို့သော်၊ bivalve စာကြည့်တိုက် (ပုံ။ S2၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်) ကိုအသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့၏ကိုယ်ပိုင်မူလအစ ccfDNA အပိုင်းအစများစွာကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပါသည်။ A. atra မျိုးရိုးဗီဇများကို ညွှန်ကြားထားသည့် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ မူရင်း DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေကြောင်းကိုလည်း အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 3)။ အလားတူ၊ A. atra ၏ mitochondrial genome ကို အများသူငှာ ဒေတာဘေ့စ်များတွင် ရရှိနိုင်သောကြောင့် A. atra ၏ hemolymph တွင် mitochondrial ccfDNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းအတွက် အထောက်အထားများကို ရှာဖွေနိုင်သည်။ mitochondrial DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကို PCR ချဲ့ထွင်ခြင်း (ပုံ 3) ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။
PCR မှချဲ့ထွင်ထားသော A. atra (အနီရောင်အစက်များ – စတော့နံပါတ်- SRX5705969) နှင့် M. platensis (အပြာအစက်များ – စတော့နံပါတ်- SRX5705968) ၏ mitochondrial အမျိုးမျိုးသော genes များတွင် ရှိနေပါသည်။ Breton et al., 2011 B A. atra မှ hemolymph supernatant ကို ချဲ့ထွင်ခြင်း FTA စာရွက်ပေါ်တွင် သိမ်းဆည်းထားသော ပုံ။ PCR ရောနှောပါရှိသော PCR ပြွန်သို့ တိုက်ရိုက်ထည့်ရန် 3 မီလီမီတာ ဖောက်စက်ကို အသုံးပြုပါ။
ပင်လယ်ရေတွင် ပေါများသော ရောဂါပိုးမွှားများ ပါဝင်မှု ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် hemolymph ရှိ အဏုဇီဝ DNA အမျိုးအစားများ ၏ ဝိသေသလက္ခဏာများကို ကနဦးတွင် အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။ ဒါကိုလုပ်ဖို့၊ မတူညီတဲ့ နည်းဗျူဟာနှစ်ခုကို အသုံးပြုပါတယ်။ ပထမနည်းဗျူဟာသည် BLAST နှင့် အခြားကိရိယာများ [28] နှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော တိကျမှန်ကန်မှုဖြင့် microbial sequences များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည့် algorithm-based sequence classification program တစ်ခုဖြစ်သော Kraken2 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဖတ်ရှုမှုပေါင်း 6719 ကျော်သည် ဘက်တီးရီးယား၏မူရင်းဖြစ်ရန် ဆုံးဖြတ်ထားပြီး 124 နှင့် 64 တို့သည် archaea နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်များမှ အသီးသီးဖြစ်သည် (ပုံ 4)။ အပေါများဆုံး ဘက်တီးရီးယား DNA အပိုင်းအစများမှာ Firmicutes (46%)၊ Proteobacteria (27%) နှင့် Bacteroidetes (17%) (ပုံ 4a) တို့ဖြစ်သည်။ ဤဖြန့်ဖြူးမှုသည် ပင်လယ်ပြာရောင် mussel microbiome [39၊ 40] ၏ ယခင်လေ့လာမှုများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ Gammaproteobacteria သည် Vibrionales အများအပြား (ပုံ. 4b) အပါအဝင် Proteobacteria (44%) ၏ အဓိက လူတန်းစားဖြစ်သည်။ ddPCR နည်းလမ်းသည် A. atra hemolymph (ပုံ. 4c) [41] ၏ ccfDNA တွင် Vibrio DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ ccfDNA ၏ ဘက်တီးရီးယား မူလဇစ်မြစ်အကြောင်း အချက်အလက်များ ပိုမိုရရှိရန် နောက်ထပ်ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခု (ပုံ။ S2၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်)။ ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်များကိုအတွဲလိုက်-အဆုံးဖတ်ခြင်းအဖြစ် စုစည်းထားပြီး BLASTN နှင့် 1e−3 ၏ e တန်ဖိုးကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်ပိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် ကိုယ်ပိုင်မူရင်းအဖြစ် ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားပြီး 90% တူညီသောအမျိုးအစားနှင့် ဖြတ်တောက်ထားသည်။ ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်များကိုအတွဲလိုက်-အဆုံးဖတ်ခြင်းအဖြစ် စုစည်းထားပြီး BLASTN နှင့် 1e−3 ၏ e တန်ဖိုးကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်ပိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် ကိုယ်ပိုင်မူရင်းအဖြစ် ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားပြီး 90% တူညီသောအမျိုးအစားနှင့် ဖြတ်တောက်ထားသည်။ В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицирова (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечи0ния % ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်ရှုမှုများကို တွဲပြီးဖတ်ထားသည့်စာများအဖြစ် စုဆောင်းပြီး BLASTN နှင့် 1e-3 ၏ e တန်ဖိုးတို့ကို အသုံးပြု၍ မူရင်း (bivalve) သို့မဟုတ် မူရင်းမဟုတ်သောအဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားကာ 90% သံတူကြောင်းကွဲဖြင့် ဖြတ်တောက်ထားသည်။在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源။在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用使用使用 blastn的咼 1 90%同源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицироввсбты (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3го и 9 пгирого ဤကိစ္စတွင်၊ ထပ်နေသောဖတ်ရှုမှုများကို e BLASTN နှင့် 1e-3 တန်ဖိုးများနှင့် သံယောဇဉ်အဆင့်> 90% ကိုအသုံးပြု၍ ကိုယ်ပိုင် (bivalves) သို့မဟုတ် မူရင်းမဟုတ်သူများအဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားထားသည်။A. atra ဂျီနိုမ်ကို စီမစီရသေးသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler ၏ de novo စည်းဝေးပွဲနည်းဗျူဟာကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ စုစုပေါင်း 147,188 contigs ကိုမှီခို (bivalves) ၏ဇာစ်မြစ်အဖြစ်သတ်မှတ်ထားသည်။ ထို့နောက် အဆိုပါ contigs များကို BLASTN နှင့် BLASTX ကိုအသုံးပြု၍ 1e-10 ၏ e-values ​​များဖြင့် ပေါက်ကွဲခဲ့သည်။ ဤနည်းဗျူဟာသည် A. atra ccfDNA တွင်ပါရှိသော bivalve မဟုတ်သောအပိုင်းအစ ၄၈၂ ခုကို ဖော်ထုတ်နိုင်စေခဲ့သည်။ ဤ DNA အပိုင်းအစများ၏ ထက်ဝက်ကျော် (57%) ကျော်သည် sulfotrophic symbionts များအပါအဝင် ပါးစပ်သားပေါက်များဖြစ်သည့် ဘက်တီးရီးယားများမှ ရရှိကြပြီး၊ နှင့် gill symbionts Solemya velum (ပုံ. 5) တို့မှ ရရှိသည်။
အမျိုးအစားအဆင့်တွင် နှိုင်းရကြွယ်ဝမှု။ B သည် အဏုဇီဝ ကွဲပြားမှု ပင်မ ဖီလာ နှစ်ခု (Firmicutes နှင့် Proteobacteria)။ ddPCR C Vibrio spp ၏ ကိုယ်စားလှယ် ချဲ့ထွင်ခြင်း။ A. atra hemolymph သုံးခုရှိ 16S rRNA ဗီဇ (အပြာ) အပိုင်းအစများ။
စုစု ပေါင်း ၄၈၂ ခုကို လေ့လာဆန်းစစ်ခဲ့သည်။ metagenomic contig မှတ်ချက်များ (prokaryotes နှင့် eukaryotes) ၏ အထွေထွေပရိုဖိုင်။ B BLASTN နှင့် BLASTX မှ ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော ဘက်တီးရီးယား DNA အပိုင်းအစများကို အသေးစိတ် ဖြန့်ဖြူးခြင်း။
Kraken2 ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင်လည်း Mussel ccfDNA တွင် Euryarchaeota (65%)၊ Crenarchaeota (24%) နှင့် Thaurmarcheota (11%) (ပုံ. 6a) အပါအဝင် ရှေးဟောင်း DNA အပိုင်းအစများပါ၀င်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ကယ်လီဖိုးနီးယား ဂုံးကောင်များ၏ အဏုဇီဝအသိုက်အဝန်းတွင် ယခင်က တွေ့ရှိခဲ့သည့် Euryarchaeota နှင့် Crenarchaeota တို့မှ ဆင်းသက်လာသော DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းသည် အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ [42]။ Euryarchaeota သည် ပြင်းထန်သောအခြေအနေများနှင့် မကြာခဏဆက်စပ်နေသော်လည်း Euryarchaeota နှင့် Crenarcheota နှစ်မျိုးစလုံးသည် အဏ္ဏဝါ cryogenic ပတ်ဝန်းကျင်တွင် အသုံးအများဆုံး prokaryotes များထဲတွင် ပါဝင်ကြောင်း ယခုအခါ အသိအမှတ်ပြုထားပါသည်။ Kerguelen Plateau [45] နှင့် Kerguelen ကျွန်းများကမ်းရိုးတန်းအနီးတွင် တွေ့ရှိရသော အဏုဇီဝမီသိန်းထွက်ရှိမှု မကြာသေးမီက ထွက်ပေါ်လာသော မီသိန်းပေါက်ကြားမှုများမှ ကျယ်ပြန့်သော မီသိန်း ယိုစိမ့်မှုသတင်းများ ထွက်ပေါ်လာခြင်းအတွက် ဂုံးများတွင် မီသန်းနစ်ဇီဝသက်ရှိများ ရှိနေခြင်းသည် အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည် DNA ဗိုင်းရပ်စ်များမှ ဖတ်ရှုခြင်းဆီသို့ ပြောင်းလဲသွားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ အသိဥာဏ်အကောင်းဆုံးအတွက်၊ ဤသည်မှာ ဂုံးများ၏ ဗိုင်းရပ်စ်ပါဝင်မှုကို ပထမဆုံးပစ်မှတ်ထားလေ့လာခြင်းဖြစ်သည်။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ဘက်တီးရီးယားပိုးမွှားများ (Caudovirales) (ပုံ. 6b) ၏ DNA အပိုင်းအစများကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ သို့သော်လည်း အဖြစ်အများဆုံး ဗိုင်းရပ်စ် DNA သည် မည်သည့်ဗိုင်းရပ်စ်၏ အကြီးဆုံး ဂျီနိုမ်ပါရှိသော နျူကလိယ cytoplasmic ကြီးမားသော DNA ဗိုင်းရပ်စ် (NCLDV) ဟုလည်း ခေါ်သော nucleocytoviruses phylum မှ လာပါသည်။ ဤ phylum အတွင်းရှိ DNA အမျိုးအနွယ်အများစုသည် Mimimidoviridae (58%) နှင့် Poxviridae (21%) တို့ဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့တွင် ကျောရိုးရှိ ကျောရိုးရှိ တိရစ္ဆာန်များနှင့် အနုစိပ်များ ပါ၀င်ပြီး အဆိုပါ DNA အမျိုးအစားများ၏ အချိုးအစား အနည်းငယ်သည် လူသိများသော ဗိုင်းရပ်စ်ရေညှိများနှင့် သက်ဆိုင်ပါသည်။ ပင်လယ် eukaryotic ရေညှိများကို ကူးစက်သည်။ မျိုးဆက်များကို သိရှိထားသည့် ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးစိတ်၏ အကြီးဆုံး ဂျီနိုဆိုဒ်အရွယ်အစားရှိသည့် ဧရာမဗိုင်းရပ်စ် ပန်ဒိုရာ ဗိုင်းရပ်စ်မှလည်း ရရှိခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ hemolymph ccfDNA စီစစ်မှုဖြင့် ဆုံးဖြတ်ထားသည့်အတိုင်း ဗိုင်းရပ်စ်ကူးစက်ခံရသည်ဟု သိထားသည့် host များ၏ အတိုင်းအတာသည် အတော်လေး ကြီးမားသည် (ပုံ S3၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်)။ ၎င်းတွင် Baculoviridae နှင့် Iridoviridae ကဲ့သို့သော အင်းဆက်ပိုးမွှားများကို ကူးစက်သည့် ဗိုင်းရပ်စ်များအပြင် အမီဘာ၊ ရေညှိနှင့် ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများကို ကူးစက်သည့် ဗိုင်းရပ်စ်များ ပါဝင်သည်။ Pithovirus sibericum genome နှင့် ကိုက်ညီသော sequences များကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ Pitoviruses (“ဖုတ်ကောင်ဗိုင်းရပ်စ်များ” ဟုလည်းလူသိများသည်) သည် Siberia ရှိ နှစ် 30,000 သက်တမ်းရှိ permafrost [47] မှ ပထမဆုံးခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် ဤဗိုင်းရပ်စ်များ၏ ခေတ်မီမျိုးစိတ်အားလုံးမဟုတ် [48] မျိုးသုဉ်းပျောက်ကွယ်သွားကြောင်းပြသသည့် ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့် ကိုက်ညီနေပြီး အဆိုပါဗိုင်းရပ်စ်များသည် ဝေးလံခေါင်သီသော subarctic အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်တွင် ရှိနေနိုင်သည်ဟု ဖော်ပြထားသည်။
နောက်ဆုံးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အခြားသော ဆဲလ်မျိုးစုံ တိရစ္ဆာန်များမှ DNA အပိုင်းအစများကို ရှာဖွေနိုင်မလား။ NT၊ nr နှင့် RefSeq စာကြည့်တိုက်များ (မျိုးရိုးဗီဇနှင့် ပရိုတိန်း) ဖြင့် BLASTN နှင့် BLASTX တို့မှ စုစုပေါင်းနိုင်ငံခြားသားဆက်နွယ်မှု ၄၈၂ ခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ ဆဲလ်ပေါင်းစုံတိရစ္ဆာန်များ၏ ccfDNA ၏ နိုင်ငံခြားအပိုင်းအစများကြားတွင် အရိုးအရိုးများ၏ DNA သည် လွှမ်းမိုးနေသည် (ပုံ ၅)။ အင်းဆက်များနှင့် အခြားမျိုးစိတ်များမှ DNA အပိုင်းအစများကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ကုန်းနေမျိုးစိတ်များ [49] နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မျိုးရိုးဗီဇဒေတာဘေ့စ်များတွင် အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်အများအပြား၏ ကိုယ်စားပြုမှုနည်းပါးခြင်းကြောင့် DNA အပိုင်းအစများ၏ ကြီးမားသောအစိတ်အပိုင်းကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခြင်းမရှိသေးပေ။
လက်ရှိစာတမ်းတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LB အယူအဆကို ဂုံးများသို့ အသုံးချပြီး hemolymph ccfDNA ရိုက်ချက်ဖြင့် အဏ္ဏဝါကမ်းရိုးတန်းဂေဟစနစ်၏ဖွဲ့စည်းပုံကို ထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်သည်ဟု စောဒကတက်ပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ 1) mussel hemolymph တွင် ပျံ့နှံ့နေသော DNA အပိုင်းအစများ (~1-5 kb) ၏ အတော်လေးမြင့်မားသော ပြင်းအားများ (မိုက်ခရိုဂရမ်အဆင့်များ) ပါ၀င်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိရပါသည်။ 2) ဤ DNA အပိုင်းအစများသည် သီးခြားဖြစ်ပြီး သီးခြားမဟုတ်သော 3) ဤ DNA အပိုင်းအစများ၏ နိုင်ငံခြားရင်းမြစ်များထဲတွင် ဘက်တီးရီးယား၊ ရှေးဟောင်းပစ္စည်းနှင့် ဗိုင်းရပ်စ် DNA အပြင် အခြားသော multicellular တိရိစ္ဆာန်များ၏ DNA များကိုလည်း တွေ့ရှိရပါသည်။ 4) hemolymph တွင် ဤနိုင်ငံခြား ccfDNA အပိုင်းအစများ စုပုံနေခြင်းသည် လျင်မြန်စွာ ဖြစ်ပေါ်ပြီး ဂုံးများ၏ အတွင်းပိုင်း စစ်ထုတ်ခြင်း လုပ်ဆောင်ချက်ကို အထောက်အကူပြုသည်။ နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် ဇီဝဆေးပညာနယ်ပယ်တွင် ယခုအချိန်အထိ အဓိကကျင့်သုံးနေသည့် LB အယူအဆသည် ကြွယ်ဝသော်လည်း ရှာဖွေမစူးစမ်းရသေးသည့် အသိပညာရင်းမြစ်တစ်ခုကို ကုဒ်လုပ်ထားသည့် တိရစ္ဆာန်မျိုးစိတ်များနှင့် ၎င်းတို့၏ပတ်ဝန်းကျင်ကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာနားလည်စေရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် ကြွယ်ဝသော အသိပညာအရင်းအမြစ်ကို ကုဒ်လုပ်ထားသည်။
မျောက်ဝံများအပြင်၊ ကြွက်များ၊ ခွေးများ၊ ကြောင်များနှင့် မြင်းများအပါအဝင် နို့တိုက်သတ္တဝါများတွင် ccfDNA သီးခြားထားရှိမှုကို အစီရင်ခံထားသည်။ သို့သော် ကျွန်ုပ်တို့၏အသိပညာအတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်များတွင် ccfDNA ၏ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနှင့် စီတန်းခြင်းကို အစီရင်ခံတင်ပြသည့် ပထမဆုံးသော လည်ပတ်မှုစနစ်ဖြစ်သည်။ ဂုံးများ၏ ခန္ဓာဗေဒဆိုင်ရာ အင်္ဂါရပ်နှင့် စစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းသည် အနည်းဆုံး တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် ပျံ့နှံ့နေသော DNA အပိုင်းအစများ၏ အရွယ်အစား လက္ခဏာများကို အခြားမျိုးစိတ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ရှင်းပြနိုင်ပါသည်။ လူသားများတွင် ပျံ့နှံ့နေသော DNA အပိုင်းအစအများစုသည် 150 bp မှ 200 bp အရွယ်အစားရှိ သေးငယ်သောအပိုင်းအစများဖြစ်သည်။ အမြင့်ဆုံး 167 bp [34, 53] ဖြင့်။ DNA အပိုင်းအစများ၏ သေးငယ်သော်လည်း သိသာထင်ရှားသော အစိတ်အပိုင်းသည် အရွယ်အစား 300 နှင့် 500 bp ကြားရှိပြီး 5% ခန့်မှာ 900 bp ထက် ပိုရှည်သည်။ [၅၄]။ ဤအရွယ်အစားဖြန့်ဖြူးရခြင်းအကြောင်းရင်းမှာ ပလာစမာရှိ ccfDNA ၏အဓိကရင်းမြစ်မှာ ဆဲလ်သေခြင်းကြောင့်ဖြစ်စေ သို့မဟုတ် ကျန်းမာသောလူများတွင် ပျံ့နှံ့နေသော hematopoietic ဆဲလ်များ၏ necrosis ကြောင့်ဖြစ်စေ သို့မဟုတ် ကင်ဆာလူနာများတွင် အကျိတ်ဆဲလ်များ apoptosis ကြောင့်ဖြစ်စေ (လည်ပတ်နေသောအကျိတ် DNA ဟုခေါ်သည်)။ , ctDNA)။ mussels တွင်တွေ့ရှိရသော hemolymph ccfDNA ၏အရွယ်အစား ဖြန့်ဖြူးမှုသည် 1000 မှ 5000 bp မှ ကွာသည် ၊ Mussels များတွင် semi-open vascular system ရှိပြီး microbial genomic DNA မြင့်မားစွာပါဝင်သည့် အဏ္ဏဝါရေနေပတ်ဝန်းကျင်တွင် နေထိုင်သောကြောင့်၊ ဤသည်မှာ ယုတ္တိယူဆချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ အမှန်တော့၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် ဆဲလ်လူလာစုပ်ယူမှုနှင့်/သို့မဟုတ် စွန့်ထုတ်ပြီး/သို့မဟုတ် အဖွဲ့အစည်းအမျိုးမျိုးတွင် သိမ်းဆည်းပြီးနောက် အနည်းဆုံး နာရီအနည်းငယ်အကြာတွင် ပင်လယ်ရေထဲတွင် DNA အပိုင်းအစများ စုပုံနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ ဓာတ်ခွဲခန်းစမ်းသပ်ချက်တွင် ပြသခဲ့သည်။ ဆဲလ်များ၏ရှားပါးမှု (prokaryotic နှင့် eukaryotic နှစ်မျိုးလုံး) ကြောင့် intravalvular compartments များကိုအသုံးပြုခြင်းသည် ကိုယ်ပိုင်ရင်းမြစ်များမှသာမက နိုင်ငံခြားရင်းမြစ်များမှ ccfDNA ပမာဏကို လျော့နည်းစေမည်ဖြစ်သည်။ bivalve innate immunity ၏ အရေးပါမှုနှင့် လည်ပတ်နေသော phagocytes အများအပြားကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခြင်းဖြင့် နိုင်ငံခြား ccfDNA သည် အဏုဇီဝသက်ရှိများနှင့်/သို့မဟုတ် ဆယ်လူလာအပျက်အစီးများကို စားသုံးမိသောအခါတွင် နိုင်ငံခြား DNA များစုပုံနေသော လည်ပတ်နေသော phagocytes တွင် ကြွယ်ဝသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ထပ်မံယူဆပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက bivalve hemolymph ccfDNA သည် ထူးခြားသော မော်လီကျူးအချက်အလက်များ၏ သိုလှောင်မှုဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့၏ တင်းကြပ်သောမျိုးစိတ်အဖြစ် ၎င်းတို့၏အဆင့်အတန်းကို အားဖြည့်ပေးကြောင်း ပြသပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များအရ ဘက်တီးရီးယားမှရရှိသော hemolymph ccfDNA အပိုင်းအစများကို စီစစ်ခြင်းနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် အိမ်ရှင်ဘက်တီးရီးယားသစ်ပင်ပန်းမန်များနှင့် ပတ်ဝန်းကျင်အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်တွင်ရှိသော ဘက်တီးရီးယားများအကြောင်း အဓိကအချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များက ဖော်ပြသည်။ သမားရိုးကျ 16S rRNA ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနည်းလမ်းများကို အသုံးပြုခဲ့လျှင် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် ရည်ညွှန်းစာကြည့်တိုက်၏ ဘက်လိုက်မှုကြောင့် လွတ်သွားမည့် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ဘက်တီးရီးယား A. atra gill ၏ ဆက်တိုက်ရိုက်ချက်နည်းပညာများကို ထုတ်ဖော်ပြသခဲ့သည်။ တကယ်တော့၊ Kerguelen မှာရှိတဲ့ တူညီတဲ့ mussel အလွှာမှာ M. platensis မှ စုဆောင်းရရှိတဲ့ LB ဒေတာကို အသုံးပြုခြင်းဟာ သွားပိုးကောင်မျိုးစိတ်နှစ်ခုလုံးအတွက် တူညီတဲ့ gill-ဆက်စပ်ဘက်တီးရီးယား symbionts ရဲ့ ပါဝင်မှုကို ပြသခဲ့တယ် (ပုံ။ S4၊ နောက်ဆက်တွဲ အချက်အလက်)။ မျိုးရိုးဗီဇကွဲပြားသော ဂုံးနှစ်ကောင်၏ ဤဆင်တူမှုသည် Kerguelen [55၊ 56၊ 57၊ 58] ၏ အေးသော၊ ဆာလဖာရတ်နှင့် မီးတောင်အနည်အနှစ်များတွင် ဘက်တီးရီးယားတို့၏ဖွဲ့စည်းမှုကို ထင်ဟပ်စေနိုင်သည်။ Port-au-France ကမ်းရိုးတန်းကဲ့သို့သော bioturbated ကမ်းရိုးတန်းဒေသများမှ ဂုံးများကို ရိတ်သိမ်းသောအခါတွင် ဆာလဖာ-လျှော့ချပေးသည့် အဏုဇီဝများ မြင့်မားသောအဆင့်ကို ကောင်းစွာဖော်ပြထားပါသည်။ နောက်ဖြစ်နိုင်ချေတစ်ခုကတော့ ကျယ်ပြောလှတဲ့ mussel flora ဟာ အလျားလိုက်ကူးစက်ခြင်း [60၊ 61] ကြောင့် ထိခိုက်နိုင်ပါတယ်။ အဏ္ဏဝါပတ်ဝန်းကျင်၊ ပင်လယ်ကြမ်းပြင် မျက်နှာပြင်နှင့် ဂုံးရှိ symbiotic ဘက်တီးရီးယားများ၏ ပါဝင်မှုအကြား ဆက်စပ်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် နောက်ထပ် သုတေသနပြုရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤလေ့လာမှုများကို လက်ရှိလုပ်ဆောင်နေပါသည်။
hemolymph ccfDNA ၏ အရှည်နှင့် အာရုံစူးစိုက်မှု ၊ ၎င်း၏ သန့်စင်မှု လွယ်ကူခြင်းနှင့် လျင်မြန်သော သေနတ်များ စီစစ်ခြင်းကို ခွင့်ပြုရန် အရည်အသွေး မြင့်မားခြင်းသည် ပင်လယ်ကမ်းရိုးတန်း ဂေဟစနစ်များတွင် ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို အကဲဖြတ်ရန် mussel ccfDNA ကို အသုံးပြုခြင်း၏ အကျိုးကျေးဇူးများစွာထဲမှ အချို့ဖြစ်သည်။ ဤချဉ်းကပ်မှုသည် ပေးထားသည့်ဂေဟစနစ်တစ်ခုတွင် ဗိုင်းရပ်စ်အသိုင်းအဝိုင်းများ (ဗိုင်းရပ်စ်များ) ကို အသွင်လက္ခဏာပြရန်အတွက် အထူးသဖြင့် ထိရောက်သည်။ ဘက်တီးရီးယား၊ archaea နှင့် eukaryotes တို့နှင့်မတူဘဲ၊ ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးရိုးဗီဇများတွင် 16S အမျိုးအစားများကဲ့သို့သော ဇီဝကမ္မထိန်းသိမ်းထားသော ဗီဇများမပါဝင်ပါ။ ကမ်းရိုးတန်းအဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်များနေထိုင်လေ့ရှိသည့် အိမ်ရှင်များကို ကူးစက်ရန် သိထားသည့် ccfDNA ဗိုင်းရပ်စ်အပိုင်းအစများ အများအပြားကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ ဂုံးကဲ့သို့သော ညွှန်ပြမျိုးစိတ်များမှ အရည်များကို အသားစယူစစ်ဆေးခြင်းကို အသုံးပြုနိုင်သည်။ ၎င်းတွင် ပရိုတိုဇွာ၊ arthropods၊ အင်းဆက်များ၊ အပင်များနှင့် ဘက်တီးရီးယား ဗိုင်းရပ်စ်များ (ဥပမာ- ဘက်တီးရီးယားပိုးမွှား) ကို ကူးစက်နိုင်သော ဗိုင်းရပ်စ်များ ပါဝင်သည်။ Kerguelen (Table S2၊ နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်) တွင် တူညီသော mussel အလွှာတွင် စုဆောင်းထားသော အပြာရောင်ဂုံးများ (M. platensis) ၏ hemolymph ccfDNA virome ကို စစ်ဆေးသောအခါ အလားတူဖြန့်ဖြူးမှုကို တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ ccfDNA ၏ သေနတ်ဖြင့် ချိန်ညှိခြင်းသည် လူသားများ သို့မဟုတ် အခြားမျိုးစိတ်များ [21၊ 37၊ 64] ကို လေ့လာရာတွင် အရှိန်အဟုန်ရရှိသည့် ချဉ်းကပ်မှုအသစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ Baltimore တွင် အကွဲပြားဆုံးနှင့် အကျယ်ပြန့်ဆုံးသော ဗိုင်းရပ်စ်အမျိုးအစားများကို ကိုယ်စားပြုသည့် နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA ဗိုင်းရပ်စ်အားလုံးတွင် မျိုးဗီဇတစ်ခုတည်းကို ထိန်းသိမ်းထားခြင်းမရှိသောကြောင့် ဤချဉ်းကပ်နည်းသည် အထူးအသုံးဝင်ပါသည်။ ဤဗိုင်းရပ်စ်အများစုသည် အမျိုးအစားခွဲခြားခြင်းမရှိဘဲ ဆက်လက်တည်ရှိနေသော်လည်း ဗိုင်းရပ်စ်ကမ္ဘာ၏ လုံးဝမသိရသေးသော အစိတ်အပိုင်းမှ ဗိုင်းရပ်စ်များပါ၀င်သော်လည်း၊ ဂုံးကောင်ရေ A. atra နှင့် M. platensis တို့၏ viromes နှင့် host ranges များသည် မျိုးစိတ်နှစ်ခုကြားတွင် ကျရောက်နေသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။ အလားတူ (ပုံ S3၊ အပိုအချက်အလက်များကိုကြည့်ပါ)။ ဤဆင်တူမှုသည် အံ့သြစရာမဟုတ်ပါ၊ အကြောင်းမှာ ၎င်းသည် ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ DNA ၏ စုပ်ယူမှုတွင် ရွေးချယ်နိုင်စွမ်းမရှိခြင်းကို ထင်ဟပ်စေသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ သန့်စင်ထားသော RNA ကို အသုံးပြု၍ အနာဂတ်လေ့လာမှုများသည် RNA virome ၏လက္ခဏာရပ်ဖြစ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Kowarski နှင့် လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များ [37] ၏အလုပ်မှ ပေါင်းစပ်ထားသော ဖတ်ခြင်းနှင့် contigs များကို နှစ်ဆင့်ဖျက်ခြင်းအား အသုံးပြုကာ မူရင်း ccfDNA ၏ စုစည်းမှုမပြီးမီနှင့် အပြီးတွင် ပေါင်းစပ်ထားသော ဖတ်စာများ၏ အချိုးအစားများစွာကို ရရှိစေသည့် အလွန်ပြင်းထန်သော ပိုက်လိုင်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤကုံးမျိုးစိတ်များအတွက် ရည်ညွှန်းထားသော ဂျီနိုအာမရှိသောကြောင့် ဤမြေပုံညွှန်းမထားသောစာအချို့တွင် ၎င်းတို့၏မူလအစရှိနေဆဲဖြစ်နိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့မငြင်းနိုင်ပါ။ ကိုယ်တိုင်နှင့် ကိုယ်တိုင်မဖတ်ခြင်းကြားရှိ chimeras နှင့် Illumina MiSeq PE75 မှထုတ်ပေးသော ဖတ်ရှုမှုအရှည်တို့ကို ကျွန်ုပ်တို့က စိုးရိမ်သောကြောင့် ဤပိုက်လိုင်းကို အသုံးပြုပါသည်။ ဇယားမတင်ထားသော ဖတ်ရှုမှုအများစုအတွက် နောက်ထပ်အကြောင်းရင်းတစ်ခုမှာ အထူးသဖြင့် Kerguelen ကဲ့သို့သော ဝေးလံခေါင်သီသောဒေသများတွင် အဏ္ဏဝါအဏုဇီဝပိုးအများအပြားကို မှတ်သားထားခြင်းမရှိပါ။ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသား ccfDNA နှင့်ဆင်တူသော ccfDNA အစိတ်စိတ်အမွှာမွှာအရှည်များကို Illumina MiSeq PE75 ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ အနာဂတ်လေ့လာမှုများအတွက်၊ hemolymph ccfDNA သည် လူသားများနှင့်/သို့မဟုတ် နို့တိုက်သတ္တဝါများထက် ပိုရှည်ကြောင်းပြသသော ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ၊ ပိုရှည်သော ccfDNA အပိုင်းအစများအတွက် ပိုမိုသင့်လျော်သော sequencing platform ကိုအသုံးပြုရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ဤအလေ့အကျင့်သည် ပိုမိုနက်ရှိုင်းသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ညွှန်ပြချက်များကို ဖော်ထုတ်ရန် ပိုမိုလွယ်ကူစေသည်။ လက်ရှိမရရှိနိုင်သေးသော ပြီးပြည့်စုံသော A. atra nuclear genome sequence ကို ရယူခြင်းသည် ccfDNA ၏ ကိုယ်နှင့်ကိုယ်မဟုတ်သော ရင်းမြစ်များမှ ခွဲခြားဆက်ဆံခြင်းကို များစွာလွယ်ကူချောမွေ့စေပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏သုတေသနပြုချက်သည် ဂုံးများသို့အရည်အသားစဥ်စစ်ဆေးခြင်းသဘောတရားကိုအသုံးချနိုင်ခြေအပေါ်အလေးပေးထားပြီး၊ ဤအယူအဆကိုအနာဂတ်သုတေသနတွင်အသုံးပြုသည်နှင့်အမျှ၊ ဂုံးများ၏အဏုဇီဝမျိုးကွဲကွဲပြားမှုကိုလေ့လာရန် ဤနည်းလမ်း၏အလားအလာကိုတိုးမြင့်လာစေရန်အတွက်ကိရိယာများနှင့်ပိုက်လိုင်းအသစ်များကိုတီထွင်ထုတ်လုပ်နိုင်လိမ့်မည်ဟုမျှော်လင့်ပါသည်။ အဏ္ဏဝါဂေဟစနစ်။
ထိုးဖောက်မဟုတ်သော ဆေးခန်းသုံး biomarker တစ်ခုအနေဖြင့်၊ မြင့်မားသောလူ့ပလာစမာအဆင့် ccfDNA သည် ရောဂါအမျိုးမျိုး၊ တစ်သျှူးပျက်စီးမှုနှင့် စိတ်ဖိစီးမှုအခြေအနေများ [67,68,69] တို့နှင့်ဆက်စပ်နေသည်။ ဤတိုးလာမှုသည် တစ်သျှူးပျက်စီးပြီးနောက် ၎င်း၏မူလအစ DNA အပိုင်းအစများ ထွက်လာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ ဂုံးကောင်များသည် အပူချိန် 30 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်နှင့် ခဏတာထိတွေ့နိုင်သော စူးရှသော အပူဖိစီးမှုကို အသုံးပြု၍ ဤပြဿနာကို ဖြေရှင်းခဲ့ပါသည်။ အမှီအခိုကင်းသော စမ်းသပ်မှု သုံးခုတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ သို့သော်၊ စူးရှသော အပူဖိစီးမှုပြီးနောက် ccfDNA အဆင့်များတွင် ပြောင်းလဲမှုတစ်စုံတစ်ရာမတွေ့ပါ (ပုံ S5၊ အပိုအချက်အလက်ကိုကြည့်ပါ)။ ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုသည် အနည်းဆုံးအားဖြင့်၊ ဂုံးကောင်များတွင် တစ်ပိုင်းပွင့်သော သွေးလည်ပတ်မှုစနစ်ရှိပြီး ၎င်းတို့၏ စစ်ထုတ်မှု မြင့်မားမှုကြောင့် နိုင်ငံခြား DNA အများအပြား စုပုံနေကြောင်း၊ အနည်းဆုံး တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ရှင်းပြနိုင်သည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ ဂုံးများသည် ကျောရိုးမဲ့သတ္တဝါများစွာကဲ့သို့ပင် ဖိစီးမှုဖြစ်စေသော တစ်ရှူးများပျက်စီးမှုကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိနိုင်ပြီး ယင်းကြောင့် ၎င်းတို့၏ hemolymph တွင် ccfDNA ထုတ်ပေးမှုကို ကန့်သတ်ထားသည်။
ယနေ့အထိ၊ ရေနေဂေဟစနစ်များရှိ ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများ၏ DNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် သဘာဝပတ်ဝန်းကျင် DNA (eDNA) metabarcoding တွင် အဓိကအာရုံစိုက်ထားသည်။ သို့သော်၊ primer ကိုအသုံးပြုသောအခါတွင် ဤနည်းလမ်းကို ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ကန့်သတ်ထားသည်။ သေနတ်ပစ်သေနတ်ကို စီစစ်အသုံးပြုခြင်းသည် PCR ၏ကန့်သတ်ချက်များနှင့် primer အစုံများကို ဘက်လိုက်ရွေးချယ်ခြင်းတို့ကို ရှောင်တိမ်းသည်။ ထို့ကြောင့် တစ်နည်းအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းသည် မကြာသေးမီက အသုံးပြုခဲ့သော high-throughput eDNA Shotgun sequencing method နှင့် ပိုမိုနီးစပ်သည်၊ ၎င်းသည် အစိတ်စိတ်အမွှာမွှာကွဲနေသော DNA ကို တိုက်ရိုက်စီတန်းပြီး သက်ရှိအားလုံးနီးပါး [72၊ 73] ကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်သည်။ သို့သော်၊ LB ကို စံ eDNA နည်းလမ်းများနှင့် ခွဲခြားနိုင်သော အခြေခံပြဿနာများစွာရှိသည်။ ဟုတ်ပါတယ်၊ eDNA နှင့် LB အကြား အဓိက ကွာခြားချက်မှာ သဘာဝ စစ်ထုတ်ကိရိယာများ အသုံးပြုခြင်း ဖြစ်သည်။ eDNA ကိုလေ့လာရန်အတွက် သဘာဝစစ်ထုတ်မှုအဖြစ် ရေမြှုပ်များနှင့် bivalves များ (Dresseina spp.) ကဲ့သို့သော အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်များကို အသုံးပြုကြောင်း အစီရင်ခံတင်ပြခဲ့သည် [74၊ 75] သို့သော်၊ Dreissena ၏လေ့လာမှုသည် DNA ထုတ်ယူသည့် တစ်သျှူးအသားစဥ်များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ LB မှ ccfDNA ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် တစ်သျှူးအသားစဥ်စစ်ဆေးခြင်း ၊ အထူးပြုပြီး တခါတရံ စျေးကြီးသော စက်ကိရိယာများနှင့် eDNA သို့မဟုတ် တစ်ရှူးအသားစဥ်နှင့်ဆက်စပ်သော ထောက်ပံ့ပို့ဆောင်ရေး မလိုအပ်ပါ။ အမှန်မှာ၊ LB မှ ccfDNA သည် အအေးကွင်းဆက်ကို မထိန်းသိမ်းဘဲ FTA ပံ့ပိုးမှုဖြင့် သိမ်းဆည်းနိုင်ပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်ကြောင်း၊ ဝေးလံသောဒေသများရှိ သုတေသနအတွက် အဓိကစိန်ခေါ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည့် အအေးကွင်းဆက်တစ်ခုကို မထိန်းသိမ်းထားနိုင်ဟု မကြာသေးမီက ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံထားပါသည်။ အရည်အသားစဥ်စစ်ဆေးခြင်းမှ ccfDNA ကို ထုတ်ယူခြင်းသည်လည်း ရိုးရှင်းပြီး သေနတ်နှင့် ချိန်ညှိခြင်းနှင့် PCR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် အရည်အသွေးမြင့် DNA ကို ပေးပါသည်။ eDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု [77] နှင့်ဆက်စပ်သော နည်းပညာဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များအချို့ကို ပေးသောကြောင့် ဤအရာသည် ကြီးစွာသော အကျိုးကျေးဇူးဖြစ်သည်။ နမူနာယူနည်း၏ ရိုးရှင်းမှုနှင့် ကုန်ကျစရိတ်သက်သာခြင်းသည်လည်း ရေရှည်စောင့်ကြည့်ရေးပရိုဂရမ်များအတွက် အထူးသင့်လျော်ပါသည်။ ၎င်းတို့၏ မြင့်မားသော စစ်ထုတ်နိုင်စွမ်းအပြင်၊ bivalves ၏ လူသိများသော အင်္ဂါရပ်မှာ ၎င်းတို့၏ ချွဲများ၏ ဓာတု mucopolysaccharide ပါဝင်မှုဖြစ်ပြီး ဗိုင်းရပ်စ်များ၏ စုပ်ယူမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည့် [78, 79] ဖြစ်သည်။ ယင်းက bivalves များသည် ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်နှင့် ပေးထားသည့် ရေနေဂေဟစနစ်ရှိ ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ သက်ရောက်မှုများအတွက် စံပြသဘာဝစစ်ထုတ်မှုတစ်ခု ဖြစ်စေသည်။ လက်ခံရရှိသည့် DNA အပိုင်းအစများ ရှိနေခြင်းကို eDNA နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နည်းလမ်း၏ ကန့်သတ်ချက်တစ်ခုအဖြစ် ရှုမြင်နိုင်သော်လည်း eDNA နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ထိုကဲ့သို့သော မူရင်း ccfDNA ရှိခြင်းနှင့် ဆက်စပ်သော ကုန်ကျစရိတ်သည် ကျန်းမာရေးလေ့လာမှုများအတွက် ရရှိနိုင်သော အချက်အလက်များစွာအတွက် တစ်ပြိုင်နက် နားလည်နိုင်ပါသည်။ ထေရဌာ။ ၎င်းတွင် host host ၏ genome တွင် ပေါင်းစပ်ထားသော ဗိုင်းရပ်စ် sequences များ ပါဝင်နေပါသည်။ bivalves [80၊ 81] တွင် အလျားလိုက် ကူးစက်နိုင်သော leukemic retroviruses များရှိနေခြင်းကြောင့် ၎င်းသည် ဂုံးများအတွက် အထူးအရေးကြီးပါသည်။ eDNA ထက် LB ၏နောက်ထပ်အားသာချက်တစ်ခုမှာ ၎င်းသည် အဏုဇီဝသက်ရှိများ (နှင့် ၎င်းတို့၏ ဂျီနိုမ်) များကို စုပ်ယူထားသည့် hemolymph အတွင်းရှိ သွေးဆဲလ်များ၏ phagocytic လုပ်ဆောင်ချက်ကို အသုံးချခြင်း ဖြစ်သည်။ Phagocytosis သည် bivalves ရှိသွေးဆဲလ်များ၏အဓိကလုပ်ဆောင်မှုဖြစ်သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ အဆိုပါနည်းလမ်းသည် ဂုံးများ၏ မြင့်မားသောစစ်ထုတ်နိုင်စွမ်း (ပင်လယ်ရေ၏ပျမ်းမျှ 1.5 လီတာ/တစ်နာရီ) နှင့် မတူညီသောပင်လယ်ရေအလွှာများရောစပ်မှုကို တိုးမြင့်စေသည့် နှစ်ရက်ကြာလည်ပတ်မှု၏ အကျိုးကျေးဇူးကို အသုံးချကာ ကွဲပြားသော eDNA ကို ဖမ်းယူနိုင်စေသည်။ [၈၃၊ ၈၄]။ ထို့ကြောင့်၊ mussel ccfDNA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ဂုံးများ၏ အာဟာရ၊ စီးပွားရေးနှင့် သဘာဝပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ သက်ရောက်မှုများကိုပေးသော စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော လမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ လူသားများထံမှစုဆောင်းရရှိသော LB ၏ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းနှင့်အလားတူ၊ ဤနည်းလမ်းသည် မျိုးရိုးဗီဇနှင့် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို တိုင်းတာရန် ဖြစ်နိုင်ခြေကို ပွင့်စေပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ nanopore sequencing ကို အသုံးပြု၍ မူလ ccfDNA တွင် genome-wide methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ရန် တတိယမျိုးဆက် sequencing နည်းပညာများကို မျှော်မှန်းနိုင်သည်။ mussel ccfDNA အပိုင်းအစများ၏ အရှည်သည် ဂျီနိုမီကျယ်ပြန့်သော DNA methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို တစ်ခုတည်းသော sequencing လည်ပတ်မှုမှ ခွင့်ပြုပေးသော ဂျီနိုမ်ကျယ်ပြန့်သော DNA methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ခွင့်ပြုသည့် ကြာရှည်စွာဖတ်ထားသော sequencing ပလပ်ဖောင်းများနှင့် ကိုက်ညီမှုရှိစေရန်အတွက် ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို ပံ့ပိုးပေးသင့်သည်။85,86] ဤသည်မှာ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသော ဖြစ်နိုင်ခြေတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ၎င်းသည် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု သို့မဟုတ် လေထုညစ်ညမ်းမှုကို ထိတွေ့ပြီးနောက် တုံ့ပြန်မှုကို ထိန်းချုပ်သည့် အရင်းခံယန္တရားများကို အဖိုးတန်ထိုးထွင်းသိမြင်မှုကို ပေးစွမ်းနိုင်သည်။ သို့သော် LB ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အကန့်အသတ်မရှိပေ။ ဒါက ဂေဟစနစ်ထဲမှာ ညွှန်ပြတဲ့မျိုးစိတ်တွေ ရှိနေဖို့ လိုပါတယ်။ အထက်တွင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း LB ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် ပေးထားသောဂေဟစနစ်၏ဇီဝမျိုးစုံမျိုးကွဲများကိုအကဲဖြတ်ရန်အရင်းအမြစ်မှ DNA အပိုင်းအစများရှိနေခြင်းကိုထည့်သွင်းစဉ်းစားသည့် ခိုင်မာသောဇီဝသတင်းအချက်အလက်ပိုက်လိုင်းတစ်ခုလိုအပ်ပါသည်။ နောက်ထပ်အဓိကပြဿနာမှာ အဏ္ဏဝါမျိုးစိတ်များအတွက် ရည်ညွှန်းဂျီနိုမ်များရရှိနိုင်မှုဖြစ်သည်။ Marine Mammal Genomes ပရောဂျက်နှင့် မကြာသေးမီက တည်ထောင်ထားသော Fish10k ပရောဂျက် [88] ကဲ့သို့သော အစပျိုးမှုများသည် အနာဂတ်တွင် ယင်းကဲ့သို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေမည်ဟု မျှော်လင့်ပါသည်။ LB အယူအဆကို အဏ္ဏဝါစစ်ထုတ်သည့်သက်ရှိများထံ အသုံးချခြင်းသည် ပေါင်းစပ်နည်းပညာတွင် နောက်ဆုံးပေါ် တိုးတက်မှုများနှင့် လိုက်ဖက်ညီပြီး သဘာဝပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်ရန်အတွက် အဏ္ဏဝါနေထိုင်ရာများ၏ ကျန်းမာရေးဆိုင်ရာ အရေးကြီးသောအချက်အလက်များကို ပံ့ပိုးပေးရန်အတွက် multi-ohm biomarkers များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် ကောင်းစွာသင့်လျော်ပါသည်။
Bioprojects SRR8924808 အောက်ရှိ ဂျီနိုမ် စီစစ်ခြင်းဒေတာကို NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 တွင် အပ်နှံထားပါသည်။
Brierley AS၊ Kingsford MJ အဏ္ဏဝါသက်ရှိများနှင့် ဂေဟစနစ်များအပေါ် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ သက်ရောက်မှု။ ကိုးလ်ဇီဝဗေဒ။ ၂၀၀၉; 19- P602–P614။
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ ပေါင်းစပ်သက်ရောက်မှုများနှင့် အဏ္ဏဝါပတ်ဝန်းကျင်အပေါ် အခြားဒေသဆိုင်ရာ ဖိအားများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါ။ အထွေထွေသိပ္ပံပတ်ဝန်းကျင်။ 2021;755:142564။
Carella F၊ Antuofermo E၊ Farina S၊ Salati F၊ Mandas D၊ Prado P၊ et al။ ) သိပ္ပံ ပဋ္ဌမတ္တာ။ 2020; ၇:၄၈။
Seront L၊ Nicastro CR၊ Zardi GI၊ Goberville E. ထပ်ခါတလဲလဲ အပူဒဏ်ခံနိုင်သော အခြေအနေများအောက်တွင် အပူဒဏ်ခံနိုင်ရည်ကို လျှော့ချပေးသည့် အပြာရောင်ဂုံးများ၏ နွေရာသီတွင် သေဆုံးမှု မြင့်မားမှုကို ရှင်းပြသည်။ သိပ္ပံနည်းကျအစီရင်ခံစာ 2019; ၉:၁၇၄၉၈။
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. တိရစ္ဆာန်သေဆုံးမှု၏ ကြိမ်နှုန်း၊ အကြောင်းရင်းနှင့် အတိုင်းအတာတို့တွင် လတ်တလောပြောင်းလဲမှုများ။ Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:1083-8။
Scarpa F၊ Sanna D၊ Azzena I၊ Mughetti D၊ Cerruti F၊ Hosseini S၊ et al။ မျိုးစိတ်-သတ်သတ်မှတ်မှတ်မဟုတ်သော ရောဂါပိုးအများအပြားသည် Pinna nobilis ၏အစုလိုက်အပြုံလိုက်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ဘဝ။ 2020; 10:238။
Bradley M၊ Coutts SJ၊ Jenkins E၊ O'Hara TM။ အာတိတ်တိရစ္ဆာန်ရုံရောဂါများပေါ်တွင် ရာသီဥတုပြောင်းလဲမှု၏ အလားအလာသက်ရောက်မှု။ Int J Circumpolar ကျန်းမာရေး။ ၂၀၀၅; ၆၄:၄၆၈–၇၇။
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. ကမ်းရိုးတန်းလေထုညစ်ညမ်းမှုစောင့်ကြည့်ရေးတွင် အချက်ပြသက်ရှိများအဖြစ် အပြာရောင်ဂုံးကောင်များ (Mytilus edulis spp.)- သုံးသပ်ချက်။ Mar Environ Res 2017; ၁၃၀:၃၃၈-၆၅။
Siravegna G၊ Marsoni S၊ Siena S၊ Bardelli A. ကင်ဆာကုသမှုတွင် အရည် အသားစယူခြင်း ပေါင်းစပ်ခြင်း။ နတ် Rev Clean Oncol ။ 2017; ၁၄:၅၃၁–၄၈။
Wan JCM၊ Massie C၊ Garcia-Corbacho J၊ Mouliere F၊ Brenton JD၊ Caldas C၊ et al. အရည် အသားစယူစစ်ဆေးခြင်း ရင့်ကျက်ခြင်း- အကျိတ် DNA လည်ပတ်မှုကို ခွင့်ပြုသည်။ နတ် Rev Cancer။ ၂၀၁၇;၁၇:၂၂၃–၃၈။
Mandel P., Metais P. Nucleic acids လူ့ပလာစမာတွင်။ Soc Biol လုပ်ငန်းခွဲများ၏ အစည်းအဝေးမှတ်တမ်းများ။ 1948; ၁၄၂:၂၄၁-၃။
Bronkhorst AJ၊ Ungerer W၊ Holdenrieder S. ကင်ဆာကုသမှုအတွက် မော်လီကျူးအမှတ်အသားအဖြစ် ဆဲလ်ကင်းမဲ့ DNA အတွက် အခန်းကဏ္ဍအသစ်။ ဇီဝမိုလာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပမာဏ။ 2019;17:100087။
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy ဆေးခန်းသို့ ဝင်ရောက်သည် - အကောင်အထည်ဖော်မှုဆိုင်ရာ ပြဿနာများနှင့် အနာဂတ်စိန်ခေါ်မှုများ။ နတ် Rev Clin Oncol ။ 2021; ၁၈:၂၉၇–၃၁၂။
Lo YM၊ Corbetta N.၊ Chamberlain PF၊ Rai W.၊ Sargent IL၊ Redman CW နှင့် အခြားအရာများ။ သန္ဓေသား DNA သည် မိခင်ပလာစမာနှင့် သွေးရည်ကြည်တွင် ရှိနေသည်။ ဓား။ ၁၉၉၇; ၃၅၀:၄၈၅-၇။
Mufarray MN၊ Wong RJ၊ Shaw GM၊ Stevenson DK၊ Quake SR တို့သည် ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ်အတွင်း အမျိုးသမီးများ၏သွေးထဲတွင် extracellular RNA လှည့်ပတ်အသုံးပြုခြင်း၏ နောက်ဆက်တွဲပြဿနာများကို ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ် လေ့လာခြင်း။ ကလေးအထူးကု။ 2020; 8:605219။
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. အရည်အသားစဥ်စစ်ဆေးခြင်း- အလှူရှင်ဆဲလ်မပါသော DNA ကို ကျောက်ကပ်ဖောက်ထွင်းမှုတွင် Allogeneic lesions ကိုရှာဖွေရန် အသုံးပြုသည်။ နတ် Rev Nephrol ။ 2021; ၁၇:၅၉၁–၆၀၃။
Juan FC၊ Lo YM သည် ကိုယ်ဝန်ဆောင်စဉ်ရောဂါရှာဖွေခြင်းအတွက် ဆန်းသစ်တီထွင်မှုများ- မိခင်ပလာစမာဂျီနိုမ် စီစစ်ခြင်း Anna MD ၂၀၁၆;၆၇:၄၁၉-၃၂။
Gu W၊ Deng X၊ Lee M၊ Sucu YD၊ Arevalo S၊ Stryke D၊ et al. ရောဂါပိုးရှိသော ကိုယ်တွင်းအရည်များကို မျိုးဆက်သစ် metagenomic sequencing ဖြင့် လျင်မြန်သော ရောဂါပိုးရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်း။ နတ်ဆေးတက္ကသိုလ်။ ၂၀၂၁;၂၇:၁၁၅-၂၄။