Daalụ maka ịga leta Nature.com. Ụdị ihe nchọgharị ị na-eji nwere nkwado CSS pere mpe. Maka ahụmịhe kachasị mma, anyị na-akwado ka ị jiri ihe nchọgharị emelitere (ma ọ bụ gbanyụọ Ọnọdụ Ndakọrịta na Internet Explorer). Ka ọ dị ugbu a, iji hụ na nkwado na-aga n'ihu, anyị ga-egosi saịtị ahụ na-enweghị ụdị na JavaScript.
Nnyocha mmiri mmiri (LB) bụ echiche nke na-aghọwanye ewu ewu n'ọhịa ọgwụ. Echiche a dabere na nchọpụta nke iberibe DNA na-agagharị na extracellular (ccfDNA), nke a na-ewepụtakarị dị ka obere iberibe mgbe mkpụrụ ndụ nwụrụ n'ime anụ ahụ dị iche iche. Obere akụkụ nke iberibe ndị a sitere na anụ ahụ ma ọ bụ ihe ndị dị ndụ si mba ọzọ (mba ọzọ). N'ọrụ ugbu a, anyị etinyela echiche a n'ọrụ na mussels, ụdị sentinel a maara maka ikike nzacha mmiri dị elu ha. Anyị na-eji ikike mussels arụ ọrụ dị ka nzacha eke iji jide iberibe DNA gburugburu ebe obibi site na ọtụtụ isi mmalite iji nye ozi gbasara ụdịdị dị iche iche nke gburugburu ebe obibi mmiri. Nsonaazụ anyị na-egosi na mussel hemolymph nwere iberibe DNA nke dị iche na nha, site na 1 ruo 5 kb. Usoro égbè gosiri na ọtụtụ iberibe DNA sitere na nje bacteria si mba ọzọ. N'ime ha, anyị hụrụ iberibe DNA sitere na nje bacteria, archaea, na nje virus, gụnyere nje virus a maara na ha na-ebute ọtụtụ ndị ọbịa nke a na-ahụkarị na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri. Na mmechi, nnyocha anyị na-egosi na echiche nke LB e ji mee mussels na-anọchite anya isi iyi ihe ọmụma bara ụba mana a ka na-enyochabeghị banyere ụdị dị iche iche nke nje bacteria na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri.
Mmetụta nke mgbanwe ihu igwe (CC) na ụdị ndụ dị iche iche nke gburugburu ebe obibi mmiri bụ ebe a na-eme nnyocha ngwa ngwa. Okpomọkụ ụwa abụghị naanị na ọ na-akpata nrụgide dị mkpa nke anụ ahụ, kamakwa ọ na-akwali oke evolushọn nke nkwụsi ike okpomọkụ nke ihe ndị dị ndụ n'oké osimiri, na-emetụta ebe obibi nke ọtụtụ ụdị, na-akpali ha ịchọ ọnọdụ dị mma karị [1, 2]. Na mgbakwunye na imetụta ụdị dị iche iche nke metazoans, CC na-emebi nguzozi dị nro nke mmekọrịta ndị ọbịa na nje bacteria. Dysbacteriosis nje a na-etinye nnukwu ihe iyi egwu nye gburugburu ebe obibi mmiri ka ọ na-eme ka ihe ndị dị ndụ n'oké osimiri dịkwuo mfe ibute nje ndị na-efe efe [3, 4]. A kwenyere na SS na-arụ ọrụ dị mkpa na ọnwụ oke, nke bụ nsogbu dị oke njọ maka njikwa gburugburu ebe obibi mmiri zuru ụwa ọnụ [5, 6]. Nke a bụ okwu dị mkpa ebe ọ bụ na mmetụta akụ na ụba, gburugburu ebe obibi na nri nke ọtụtụ ụdị mmiri. Nke a bụ eziokwu karịsịa maka bivalves bi na mpaghara polar, ebe mmetụta nke CK dị ngwa ngwa ma dị njọ [6, 7]. N'ezie, a na-eji bivalves dị ka Mytilus spp. eme ihe nke ukwuu iji nyochaa mmetụta nke CC na gburugburu ebe obibi mmiri. Ọ bụghị ihe ijuanya na e mepụtala ọtụtụ ihe ngosi biomarkers iji nyochaa ahụike ha, na-ejikarị usoro abụọ nke gụnyere ihe ngosi biomarkers ọrụ dabere na ọrụ enzymatic ma ọ bụ ọrụ sel dịka ndụ sel na ọrụ phagocytic [8]. Ụzọ ndị a gụnyekwara nha nke mkpokọta nke ihe ngosi nrụgide kpọmkwem nke na-agbakọta na anụ ahụ dị nro mgbe a mụsịrị nnukwu mmiri oké osimiri. Agbanyeghị, ikike nzacha dị elu na sistemụ mgbasa ọbara ọkara-emeghe nke bivalves na-enye ohere ịmepụta ihe ngosi hemolymph ọhụrụ site na iji echiche nke mmiri biopsy (LB), ụzọ dị mfe na nke kacha nta iji jikwaa ndị ọrịa. samples ọbara [9, 10]. Ọ bụ ezie na enwere ike ịchọta ọtụtụ ụdị molekul na-agagharị na LB mmadụ, echiche a dabere na nyocha usoro DNA nke iberibe DNA extracellular (ccfDNA) na-agagharị na plasma. N'ezie, a maara ọnụnọ nke DNA na-agagharị na plasma mmadụ kemgbe etiti narị afọ nke 20 [11], mana ọ bụ naanị n'afọ ndị na-adịbeghị anya ka mmalite nke usoro nhazi dị elu emeela ka a chọpụta ọrịa dabere na ccfDNA. Ọnụnọ nke iberibe DNA ndị a na-agagharị bụ n'ihi mwepụta nke DNA genomic (nuklia na mitochondrial) mgbe mkpụrụ ndụ nwụsịrị. N'ime ndị nwere ahụike, ọnụọgụgụ ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL) mana enwere ike ịbawanye ya ugboro 5-10 n'ime ndị ọrịa nwere ọrịa dị iche iche ma ọ bụ ndị nwere nrụgide, nke na-ebute mmebi anụ ahụ. N'ime ndị nwere ahụike, ọnụọgụgụ ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL) mana enwere ike ịbawanye ya ugboro 5-10 n'ime ndị ọrịa nwere ọrịa dị iche iche ma ọ bụ ndị nwere nrụgide, nke na-ebute mmebi anụ ahụ. У здоровых людей концентрасия различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. N'ime ndị nwere ahụike, ọkwa nke cccDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL), mana ọ nwere ike ịbawanye site na ugboro 5-10 n'ime ndị ọrịa nwere ọrịa dị iche iche ma ọ bụ ndị nọ n'okpuru nrụgide nke na-ebute mmebi anụ ahụ..倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （<10 ng/ml）增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ngụkọta ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/ml) n'ime ndị nwere ahụike, mana enwere ike ịbawanye ya ugboro ise ruo iri n'ime ndị ọrịa nwere ọrịa ma ọ bụ nrụgide dị iche iche, nke na-ebute mmebi anụ ahụ.Nha nke iberibe ccfDNA dịgasị iche iche, mana ọ na-abụkarị site na 150 ruo 200 bp. [12]. Enwere ike iji nyocha nke ccfDNA nke onwe ya, ya bụ, ccfDNA sitere na mkpụrụ ndụ ndị ọbịa nkịtị ma ọ bụ ndị gbanwere agbanwe, chọpụta mgbanwe mkpụrụ ndụ ihe nketa na epigenetic dị na mkpụrụ ndụ ihe nketa nuklia na/ma ọ bụ mitochondrial, si otú a na-enyere ndị dọkịta aka ịhọrọ ọgwụgwọ ndị a kapịrị ọnụ maka molekul [13]. Agbanyeghị, enwere ike nweta ccfDNA site na isi mmalite mba ọzọ dị ka ccfDNA site na mkpụrụ ndụ nwa ebu n'afọ n'oge ime ime ma ọ bụ site na akụkụ ahụ e tinyere n'ime ya [14,15,16,17]. ccfDNA bụkwa isi iyi ozi dị mkpa maka ịchọpụta ọnụnọ nke nucleic acids nke ihe na-efe efe (mba ọzọ), nke na-enye ohere ịchọpụta ọrịa ndị na-abụghị nke na-efe efe nke ọdịbendị ọbara na-amataghị, na-ezere biopsy na-awakpo nke anụ ahụ butere ọrịa [18]. Ọmụmụ ihe ndị na-adịbeghị anya egosila n'ezie na ọbara mmadụ nwere isi iyi ozi bara ụba nke enwere ike iji chọpụta nje na nje bacteria, na ihe dị ka 1% nke ccfDNA a na-ahụ na plasma mmadụ sitere na mba ọzọ [19]. Nnyocha ndị a na-egosi na enwere ike inyocha ụdị dị iche iche nke microbiome na-agagharị agagharị nke ihe dị ndụ site na iji nyocha ccfDNA. Agbanyeghị, ruo n'oge na-adịbeghị anya, a na-eji echiche a eme ihe naanị n'ime ụmụ mmadụ, ma n'ókè ụfọdụ, n'ime ụmụ anụmanụ ndị ọzọ [20, 21].
N'akwụkwọ a, anyị na-eji ike LB nyochaa ccfDNA nke Aulacomya atra, ụdị dị na ndịda a na-ahụkarị na agwaetiti Kerguelen dị n'okpuru antarctic, otu agwaetiti dị n'elu nnukwu ala dị larịị nke mepụtara afọ 35 gara aga. mgbawa ugwu mgbawa. Site na iji usoro nnwale in vitro, anyị chọpụtara na mussels na-eburu iberibe DNA dị na mmiri oké osimiri ngwa ngwa ma banye na ngalaba hemolymph. Usoro égbè egosila na mussel hemolymph ccfDNA nwere iberibe DNA nke ya na nke na-abụghị nke onwe ya, gụnyere nje bacteria symbiotic na iberibe DNA sitere na biomes nke a na-ahụkarị na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri. Hemolymph ccfDNA nwekwara usoro nje sitere na nje virus nwere oke nnabata dị iche iche. Anyị chọtakwara iberibe DNA sitere na anụmanụ dị iche iche dị ka azụ̀ ọkpụkpụ, anemones mmiri, algae na ụmụ ahụhụ. Na mmechi, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na enwere ike itinye echiche LB n'ọrụ nke ọma na invertebrates mmiri iji mepụta genomic bara ụba na gburugburu ebe obibi mmiri.
E si n'ụsọ oké osimiri dị n'etiti mmiri nke Port-au-France chịkọta ndị toro eto (55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) na Aulacomya atra (A. atra). Agwaetiti Kerguelen na Disemba 2018. E si n'aka onye na-ere ahịa (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) nweta mussels ndị ọzọ na-acha anụnụ anụnụ (Mytilus spp.) ma tinye ha n'ime tankị aerated nke nwere okpomọkụ (4°C) nke nwere 10-20 L nke 32‰ brine artificial. (nnu mmiri artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Maka nnwale ọ bụla, a tụrụ ogologo na ibu nke shei nke ọ bụla.
Usoro ohere mepere emepe n'efu maka mmemme a dị n'ịntanetị (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). N'ụzọ dị mkpirikpi, a nakọtara hemolymph LB site na akwara ndị na-ejide ya dịka akọwara [22]. A na-eme ka hemolymph ahụ dị ọcha site na centrifugation na 1200 ×g ruo nkeji 3, a na-akpọnwụ ihe na-ekpo ọkụ (-20°C) ruo mgbe ejiri ya. Maka mwepụ na ịsacha cfDNA, a gbazee ma hazie ihe nlele (1.5-2.0 ml) site na iji NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) dịka ntuziaka onye nrụpụta si dị. A na-echekwa ccfDNA na -80°C ruo mgbe nyocha ọzọ. N'ụfọdụ nnwale, a na-ekewapụ ccfDNA ma sachaa ya site na iji QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). A na-eji nyocha PicoGreen ọkọlọtọ tụọ DNA dị ọcha. E jiri electrophoresis capillary electrophoresis nyochaa nkesa nke ccfDNA nke dịpụrụ adịpụ site na iji Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) site na iji High Sensitivity DNA Kit. E jiri 1 µl nke ihe nlele ccfDNA mee nnwale ahụ dịka ntuziaka nke onye nrụpụta si dị.
Maka usoro nke iberibe hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) kwadebere ọbá akwụkwọ egbe site na iji ngwa Illumina DNA Mix nke ngwa Illumina MiSeq PE75. E jiri ihe nkwụnye ọkọlọtọ (BioO). E nwere faịlụ data dị na NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 na SRR8924809). E jiri FastQC [23] nyochaa ịdị mma ọgụgụ bụ isi. Ejirila Trimmomatic [24] mee ihe maka ịkpụ ihe nkwụnye na ọgụgụ na-adịghị mma. E jikọtara agụ egbe nwere nsọtụ abụọ FLASH ka ọ bụrụ ọgụgụ otu ogologo na obere njikọta nke 20 bp iji zere ndakọrịta [25]. E ji BLASTN depụta ihe ndị e jikọtara ọnụ site na iji nchekwa data NCBI Taxonomy bivalve (uru e < 1e−3 na 90% homology), e jikwa DUST [26] mee ihe mkpuchi nke usoro dị mgbagwoju anya dị ala. E ji BLASTN depụta ihe ndị e jikọtara ọnụ site na iji nchekwa data NCBI Taxonomy bivalve (uru e < 1e−3 na 90% homology), e jikwa DUST [26] mee ihe mkpuchi nke usoro dị mgbagwoju anya dị ala. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN. NCBI (значение e <1e-3 na 90% гомологии), а маскирование последовательностей. [26]. E ji BLASTN depụta ihe ndị a na-agụkọta site na iji nchekwa data NCBI bivalve taxonomy (uru e < 1e-3 na 90% homology), e jikwa DUST [26] mee ihe mkpuchi usoro mgbagwoju anya dị ala.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源）掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN. моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей. использованием uzuzu [26]. E ji BLASTN depụta ihe ndị a na-agụkọta site na iji nchekwa data NCBI bivalve taxonomic (uru e <1e-3 na 90% homology), e jikwa DUST [26] mee ihe mkpuchi usoro mgbagwoju anya dị ala.E kewara agụmagụ n'ime otu abụọ: metụtara usoro bivalve (nke a na-akpọ ịgụ onwe onye) na nke na-enweghị njikọ (nke na-abụghị ịgụ onwe onye). E ji MEGAHIT chịkọta otu abụọ iche iche iji mepụta contigs [27]. Ka ọ dị ugbu a, e kewara nkesa taxonomic nke agụmagụ microbiome ndị mba ọzọ site na iji Kraken2 [28] ma gosipụta ya na eserese Krona pie na Galaxy [29, 30]. E kpebiri na kmers kacha mma bụ kmers-59 site na nnwale mbụ anyị. E mechara chọpụta ihe ndị na-akpata onwe ha site na ijikọta BLASTN (nchịkọta data bivalve NCBI, e value < 1e−10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ. E mechara chọpụta ihe ndị na-akpata onwe ha site na ijikọta BLASTN (nchịkọta data bivalve NCBI, e value < 1e−10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. E mechara chọpụta ihe ndị na-akpata onwe ha site na ijikọta na BLASTN (nchịkọta data bivalve nke NCBI, uru e <1e-10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы скачать видео - . . . для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 na гомология 60%). E mechara chọpụta ihe ndị na-akpata onwe ha maka nkọwa ikpeazụ site na ijikọta na BLASTN (nchịkọta data bivalve nke NCBI, uru e <1e-10 na 60% homology). N'otu aka ahụ, e depụtara ndị na-abụghị onwe ha na BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 na 60% homology). N'otu aka ahụ, e depụtara ndị na-abụghị onwe ha na BLASTN (nt NCBI database, e value < 1e−10 na 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN ihe ruru 60%). N'otu aka ahụ, e depụtara ndị otu mba ọzọ na BLASTN (nchekwa data NT NCBI, uru e <1e-10 na 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN. <1e-10 na гомология 60%). N'otu aka ahụ, e depụtara ndị na-abụghị ndị otu onwe ha na BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 na 60% homology). E mekwara BLASTX na nsogbu onwe onye site na iji nchekwa data NCBI protein nr na RefSeq (e value < 1e−10 na 60% homology). E mekwara BLASTX na nsogbu onwe onye site na iji nchekwa data NCBI protein nr na RefSeq (e value < 1e−10 na 60% homology). BLASTX был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr na RefSeq NCBI0 ihe ruru 60%). E mekwara BLASTX na nsogbu ndị na-abụghị nke onwe ha site na iji nchekwa data protein nr na RefSeq NCBI (e value < 1e-10 na 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧）还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧） BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr na RefSeq NCBI. ihe ruru 60%). E mekwara BLASTX na nsogbu ndị na-abụghị nke onwe ha site na iji nchekwa data protein nr na RefSeq NCBI (uru e <1e-10 na 60% homology).Ọdọ mmiri BLASTN na BLASTX nke ndị na-anaghị akpata onwe ha na-anọchite anya ndị ikpeazụ (lee faịlụ mgbakwunye).
E depụtara ihe ndị e ji praịmarị eme PCR na Tebụl S1. E jiri Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) mee ka mkpụrụ ndụ ihe nketa ccfDNA dịkwuo elu. E jiri ọnọdụ mmeghachi omume ndị a mee ihe: denaturation na 95°C maka nkeji 3, 95°C maka nkeji 1, setịpụ okpomọkụ annealing maka nkeji 1, ịgbatị na 72°C maka nkeji 1, okirikiri 35, na n'ikpeazụ 72°C n'ime nkeji 10. E kewapụrụ ngwaahịa PCR site na electrophoresis na gel agarose (1.5%) nwere SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) na 95 V.
A na-etinye Mussels (Mytilus spp.) n'ime mmiri mmiri oxygen 500 ml (32 PSU) ruo awa 24 na okpomọkụ 4°C. A gbakwunyere DNA plasmid nke nwere ihe ntinye nke na-egosi usoro galectin-7 cDNA mmadụ (nọmba ntinye NCBI L07769) na vial ahụ na mkpokọta ikpeazụ nke 190 μg/μl. Mussels ndị a kpọchiri n'okpuru otu ọnọdụ ahụ na-enweghị mgbakwunye DNA bụ njikwa. Tankị njikwa nke atọ nwere DNA na-enweghị mussels. Iji nyochaa ịdị mma nke DNA na mmiri mmiri, e wepụtara ihe nlele mmiri mmiri (20 μl; ugboro atọ) site na tankị ọ bụla n'oge akọwapụtara. Maka nchọpụta DNA plasmid, a na-ewe mussels LB n'oge akọwapụtara ma nyochaa ya site na qPCR na ddPCR. N'ihi nnukwu ọdịnaya nnu nke mmiri mmiri, a gwakọtara aliquots na mmiri dị mma PCR (1:10) tupu nyocha PCR niile.
E jiri usoro BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada) mee PCR dijitalụ (ddPCR). Jiri usoro okpomọkụ chọpụta okpomọkụ kachasị mma (Tebụl S1). E ji ihe na-emepụta QX200 drop generator (BioRad) mepụta droplet. E mere ddPCR dịka ndị a: 95°C maka nkeji 5, okirikiri 50 nke 95°C maka sekọnd 30 na okpomọkụ annealing enyere maka nkeji 1 na 72°C maka sekọnd 30, 4°C maka nkeji 5 na 90°C n'ime nkeji 5. E jiri ihe na-agụ QX200 drop reader (BioRad) tụọ ọnụọgụ nke mbelata na mmeghachi omume dị mma (ọnụọgụ nke mbipụta/µl). A jụrụ ihe nlele nwere obere ntụpọ 10,000. Emeghị njikwa ụkpụrụ oge ọ bụla e mere ddPCR.
Ejiri Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) na ihe ngosi LGALS7 pụrụ iche mee qPCR. Ejiri QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) mee PCR niile na 20 µl. E jiri nkeji iri na ise malite qPCR na 95°C wee jiri usoro 40 mee ihe na 95°C maka sekọnd iri na 60°C maka sekọnd iri isii na otu nchịkọta data. E jiri usoro nha na 95°C maka sekọnd ise, 65°C maka sekọnd iri isii, na 97°C na njedebe nke qPCR mepụta usoro agbaze agbaze. E mere qPCR ọ bụla n'ụzọ atọ, ewezuga ihe nlele njikwa.
Ebe ọ bụ na a maara mussels maka oke nzacha ha, anyị buru ụzọ nyochaa ma ha nwere ike ịcha ma debe iberibe DNA dị na mmiri oké osimiri. Anyị nwekwara mmasị ma iberibe ndị a na-agbakọta na sistemụ lymphatic ha nke na-emeghe. Anyị doziri okwu a site na nnwale site n'ịchọpụta akara aka nke iberibe DNA na-agbaze agbaze agbakwunyere na tankị mussel na-acha anụnụ anụnụ. Iji mee ka ọ dị mfe ịchọta iberibe DNA, anyị jiri DNA plasmid mba ọzọ (ọ bụghị nke onwe ya) nke nwere mkpụrụ ndụ ihe nketa galectin-7 mmadụ. ddPCR na-achọpụta iberibe DNA plasmid na mmiri oké osimiri na mussels. Nsonaazụ anyị na-egosi na ọ bụrụ na ọnụọgụ DNA dị na mmiri oké osimiri nọgidere na-agbanwe agbanwe ka oge na-aga (ruo ụbọchị 7) na-enweghị mussels, mgbe ahụ n'ihu mussels, ọkwa a fọrọ nke nta ka ọ pụọ ​​n'ime awa 8 (Foto 1a, b). Achọpụtara iberibe DNA exogenous ngwa ngwa n'ime nkeji 15 na mmiri intravalvular na hemolymph (Foto 1c). Enwere ike ịchọpụta iberibe ndị a ruo awa 4 mgbe ekpughere ha. Ọrụ nzacha a gbasara iberibe DNA yiri ọrụ nzacha nke nje bacteria na algae [31]. Nsonaazụ ndị a na-egosi na mussels nwere ike ịcha ma chịkọta DNA mba ọzọ n'ime akụkụ mmiri ha.
Njupụta dị n'etiti DNA plasmid dị n'ime mmiri oké osimiri n'oge ọnụnọ (A) ma ọ bụ enweghị (B) nke mussels, nke a tụrụ site na ddPCR. Na A, a na-egosipụta nsonaazụ ya dị ka pasentị, yana ókèala nke igbe ndị ahụ na-anọchi anya pasentị nke 75 na nke 25. A na-egosi usoro logarithmic dabara adaba na uhie, ebe agba ntụ ntụ na-anọchi anya oge ntụkwasị obi nke 95%. Na B, ahịrị uhie na-anọchite anya nkezi na ahịrị anụnụ anụnụ na-anọchite anya oge ntụkwasị obi nke 95% maka ntinye. C Nchikọta nke DNA plasmid na hemolymph na mmiri valvular nke mussels n'oge dị iche iche mgbe etinyere DNA plasmid. A na-egosi nsonaazụ dị ka ihe zuru oke achọpụtara/mL (±SE).
Mgbe nke ahụ gasịrị, anyị nyochachara ebe ccfDNA si malite na mussels anakọtara site na akwa mussel na Kerguelen Islands, otu agwaetiti dịpụrụ adịpụ nwere obere mmetụta mmadụ. Maka ebumnuche a, e kewapụrụ cccDNA sitere na mussel hemolymphs site na ụzọ ndị a na-ejikarị eme ka cccDNA mmadụ dị ọcha [32, 33]. Anyị chọpụtara na nkezi mkpokọta hemolymph ccfDNA na mussels dị na obere micrograms kwa ml hemolymph (lee Tebụl S2, Ozi Mgbakwunye). Oke mkpokọta a buru ibu karịa na ndị nwere ahụike (nanogram dị ala kwa millilita), mana n'ọnọdụ ndị a na-adịghị ahụkebe, na ndị ọrịa kansa, ọkwa ccfDNA nwere ike iru ọtụtụ micrograms kwa millilita [34, 35]. Nyocha nke nkesa nha nke hemolymph ccfDNA gosiri na iberibe ndị a dị iche iche nke ukwuu n'ogo, site na 1000 bp ruo 1000 bp. ruo 5000 bp (Fig. 2). E nwetara ihe ndị yiri ya site na iji QIAamp Investigator Kit nke silica, usoro a na-ejikarị eme ihe na sayensị nyocha iji kewapụ ma sachaa DNA genomic ngwa ngwa site na ihe nlele DNA dị ala, gụnyere ccfDNA [36].
E ji NucleoSnap Plasma Kit (elu) na QIAamp DNA Investigator Kit wepụta electrophoregram ccfDNA. B violin slot na-egosi nkesa nke hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) na mussels. Ahịrị ojii na uhie na-anọchite anya etiti na nke mbụ na nke atọ quartiles, n'otu n'otu.
Ihe dị ka 1% nke ccfDNA n'ime mmadụ na anụmanụ nwere isi iyi mba ọzọ [21, 37]. N'ihi usoro mgbasa ozi nke ọkara-emeghe nke bivalves, mmiri oké osimiri bara ụba na nje bacteria, na nha nke mussel ccfDNA, anyị chere na mussel hemolymph ccfDNA nwere ike ịnwe ọdọ mmiri dị iche iche nke DNA nje bacteria. Iji nwalee echiche a, anyị depụtara usoro hemolymph ccfDNA site na ihe nlele Aulacomya atra anakọtara site na Agwaetiti Kerguelen, na-enye ihe karịrị nde ọgụgụ 10, 97.6% nke gafere njikwa mma. E kewara agụmagụ ndị ahụ dịka isi mmalite onwe na nke na-abụghị onwe ha site na iji nchekwa data BLASTN na NCBI bivalve (Fig. S1, Ozi Mgbakwunye).
N'ime ụmụ mmadụ, enwere ike ịtọhapụ DNA nuklia na mitochondrial n'ime ọbara [38]. Agbanyeghị, n'ọmụmụ ihe a, ọ gaghị ekwe omume ịkọwa DNA genomic nuklia nke mussels n'ụzọ zuru ezu, ebe ọ bụ na akọwabeghị ma ọ bụ kọwaa mkpụrụ ndụ ihe nketa A. atra. Agbanyeghị, anyị nwere ike ịchọpụta ọtụtụ iberibe ccfDNA nke anyị sitere na iji ọbá akwụkwọ bivalve (Fig. S2, Ozi Mgbakwunye). Anyị kwadokwara ọnụnọ nke iberibe DNA nke anyị site na mmụba PCR nke mkpụrụ ndụ ihe nketa A. atra ndị ahụ e depụtara n'usoro (Fig. 3). N'otu aka ahụ, ebe ọ bụ na mkpụrụ ndụ ihe nketa mitochondrial nke A. atra dị na nchekwa data ọha, mmadụ nwere ike ịchọta ihe akaebe maka ọnụnọ nke iberibe ccfDNA mitochondrial na hemolymph nke A. atra. E gosipụtara ọnụnọ nke iberibe DNA mitochondrial site na mmụba PCR (Fig. 3).
Mkpụrụ ndụ ihe nketa mitochondrial dị iche iche dị na hemolymph nke A. atra (ntụpọ uhie - nọmba ngwaahịa: SRX5705969) na M. platensis (ntụpọ anụnụ anụnụ - nọmba ngwaahịa: SRX5705968) nke PCR mere ka ọ dịkwuo elu. Foto e si na Breton et al., 2011 B Mmụba nke ihe na-esi na hemolymph pụta site na A. atra E debere ya na akwụkwọ FTA. Jiri punch 3 mm tinye ozugbo na tube PCR nke nwere ngwakọta PCR.
Ebe ọ bụ na ọtụtụ nje dị n'ime mmiri oké osimiri, anyị lere anya na mbụ n'otú e si amata usoro DNA nje dị na hemolymph. Iji mee nke a, anyị na-eji usoro abụọ dị iche iche. Usoro mbụ jiri Kraken2, usoro nhazi usoro dabere na algọridim nke nwere ike ịchọpụta usoro nje dị na izi ezi yiri BLAST na ngwaọrụ ndị ọzọ [28]. A chọpụtara na ihe karịrị ọgụgụ 6719 sitere na nje bacteria, ebe 124 na 64 sitere na archaea na nje virus, n'otu n'otu (Foto 4). Mpekere DNA nje bacteria kachasị baa ụba bụ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), na Bacteroidetes (17%) (Foto 4a). Nkesa a kwekọrọ na ọmụmụ ihe gara aga nke microbiome mmiri na-acha anụnụ anụnụ [39, 40]. Gammaproteobacteria bụ klaasị bụ isi nke Proteobacteria (44%), gụnyere ọtụtụ Vibrionales (Foto 4b). Usoro ddPCR kwadoro ọnụnọ nke iberibe DNA Vibrio na ccfDNA nke A. atra hemolymph (Foto 4c) [41]. Iji nweta ozi ndị ọzọ gbasara mmalite nje bacteria nke ccfDNA, e mere ụzọ ọzọ (Foto S2, Ozi Mgbakwunye). N'okwu a, a na-achịkọta ihe ndị e jikọtara ọnụ dị ka agụmagụ abụọ ma kewaa ha dị ka nke onwe (bivalves) ma ọ bụ nke na-abụghị nke onwe site na iji BLASTN na uru e nke 1e−3 na njedebe ya na homology >90%. N'okwu a, a na-achịkọta ihe ndị e jikọtara ọnụ dị ka agụmagụ abụọ ma kewaa ha dị ka nke onwe (bivalves) ma ọ bụ nke na-abụghị nke onwe site na iji BLASTN na uru e nke 1e−3 na njedebe ya na homology >90%. . . (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению N'okwu a, a chịkọtara agụmagụ ndị na-ejikọta ọnụ dị ka agụmagụ ejiri aka abụọ mee, e wee kewaa ha dị ka nke obodo (bivalve) ma ọ bụ nke na-abụghị nke mbụ site na iji BLASTN na uru e nke 1e-3 ma kewaa ha na homology karịrị 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 . . (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению N'okwu a, a chịkọtara agụmagụ ndị na-ekpuchi ibe ha dị ka agụmagụ ejiri aka abụọ ma kewaa ha dị ka nke ha (bivalves) ma ọ bụ nke na-abụghị nke mbụ site na iji ụkpụrụ e BLASTN na 1e-3 ​​yana oke homology >90%.Ebe ọ bụ na a kabeghị usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa A. atra, anyị jiri usoro mgbakọ de novo nke MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler mee ihe. A chọpụtala ngụkọta nke contigs 147,188 dị ka ndị dabere na (bivalves) nke sitere na ya. E jiri BLASTN na BLASTX gbawaa contigs ndị a. Usoro a nyere anyị ohere ịchọpụta iberibe 482 na-abụghị bivalve dị na A. atra ccfDNA. Ihe karịrị ọkara (57%) nke iberibe DNA ndị a sitere na nje bacteria, ọkachasị site na gill symbionts, gụnyere sulfotrophic symbionts, na site na gill symbionts Solemya velum (Fig. 5).
Oke mmụba dị n'ọkwa ụdị. B Ụdị nje bacteria dị iche iche nke phyla abụọ bụ isi (Firmicutes na Proteobacteria). Nnwale nke ddPCR C Vibrio spp. A. Nkewa nke mkpụrụ ndụ ihe nketa 16S rRNA (acha anụnụ anụnụ) na hemolymph atọ nke atra.
E nyochachara mkpokọta ihe ndị a chịkọtara dị 482. Nkọwa zuru oke nke nkesa taxonomic nke nkọwa metagenomic contig (prokaryotes na eukaryotes). B Nkesa zuru ezu nke iberibe DNA nje bacteria nke BLASTN na BLASTX chọpụtara.
Nnyocha Kraken2 gosikwara na mussel ccfDNA nwere iberibe DNA archaeal, gụnyere iberibe DNA nke Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), na Thaurmarcheota (11%) (Foto 6a). Ọnụnọ nke iberibe DNA sitere na Euryarchaeota na Crenarchaeota, nke a na-ahụbu na obodo microbial nke mussels California, ekwesịghị ịbụ ihe ijuanya [42]. Ọ bụ ezie na a na-ejikọkarị Euryarchaeota na ọnọdụ dị oke njọ, a maara ugbu a na ma Euryarchaeota na Crenarcheota so na prokaryotes kachasị na gburugburu ebe obibi mmiri [43, 44]. Ọnụnọ nke microbial methanogenic na mussels abụghị ihe ijuanya, ebe ọ bụ na akụkọ ndị na-adịbeghị anya banyere nnukwu ntapu methane site na ntapu ala na Kerguelen Plateau [45] na mmepụta methane microbial nwere ike ịhụ n'ụsọ oké osimiri nke Agwaetiti Kerguelen [46].
Nlebara anya anyị wee gaa n'ihe ndị sitere na nje DNA. Dịka anyị maara, nke a bụ ọmụmụ ihe mbụ na-abụghị ihe mgbaru ọsọ nke ọdịnaya nje dị na mussels. Dịka a tụrụ anya ya, anyị hụrụ iberibe DNA nke bacteriophages (Caudovirales) (Foto 6b). Agbanyeghị, DNA nje kachasị na-esi na phylum nke nucleocytoviruses, nke a makwaara dị ka nje DNA cytoplasmic large (NCLDV), nke nwere genome kachasị na nje ọ bụla. N'ime phylum a, ọtụtụ usoro DNA bụ nke ezinụlọ Mimimidoviridae (58%) na Poxviridae (21%), nke ndị ọbịa ha gụnyere vertebrates na arthropods, ebe obere akụkụ nke usoro DNA ndị a bụ nke algae virological a maara. Na-emetụta algae eukaryotic mmiri. E nwetakwara usoro ndị a site na nje Pandora, nnukwu nje nwere nnukwu genome nke ụdị nje ọ bụla a maara. N'ụzọ na-akpali mmasị, oke ndị ọbịa a maara na ha bu nje ahụ, dịka usoro hemolymph ccfDNA si dị, buru ibu (Foto S3, Ozi Mgbakwunye). Ọ gụnyere nje ndị na-ebute ụmụ ahụhụ dịka Baculoviridae na Iridoviridae, yana nje ndị na-ebute amoeba, algae na vertebrates. Anyị hụkwara usoro ndị dabara na genome Pithovirus sibericum. E kewapụrụ Pitoviruses (a makwaara dị ka "virus zombie") na permafrost dị afọ 30,000 na Siberia [47]. Ya mere, nsonaazụ anyị kwekọrọ na akụkọ gara aga na-egosi na ọ bụghị ụdị nje virus ndị a niile nke oge a ka a kpochapụrụ [48] nakwa na nje ndị a nwere ike ịnọ na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'okpuru ala.
N'ikpeazụ, anyị nwalere iji hụ ma anyị nwere ike ịchọta iberibe DNA sitere na anụmanụ ndị ọzọ nwere ọtụtụ sel. BLASTN na BLASTX chọpụtara mkpokọta ihe ndị dị na mba ọzọ 482 yana ọbá akwụkwọ nt, nr na RefSeq (genomic na protein). Nsonaazụ anyị na-egosi na n'ime iberibe ndị mba ọzọ nke ccfDNA nke anụmanụ nwere ọtụtụ sel, DNA nke ọkpụkpụ ọkpụkpụ na-achịkwa (Fig. 5). A chọtakwala iberibe DNA sitere na ụmụ ahụhụ na ụdị ndị ọzọ. Achọpụtabeghị akụkụ dị ukwuu nke iberibe DNA, ikekwe n'ihi enweghị nkọwa zuru oke nke ọtụtụ ụdị mmiri na nchekwa data genomic ma e jiri ya tụnyere ụdị ndị dị n'ụwa [49].
N'akwụkwọ a, anyị na-eji echiche LB eme ihe na mussels, na-arụ ụka na usoro ihe atụ nke hemolymph ccfDNA nwere ike inye nghọta banyere nhazi nke gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri. Karịsịa, anyị chọpụtara na 1) mussel hemolymph nwere oke njupụta dị elu (ọkwa microgram) nke nnukwu iberibe DNA na-agagharị (~ 1-5 kb); 2) DNA ndị a bụ ma ndị nọọrọ onwe ha ma ndị na-anọghị onwe ha 3) N'ime isi mmalite mba ofesi nke iberibe DNA ndị a, anyị hụrụ DNA nje bacteria, archaeal na nje virus, yana DNA nke anụmanụ ndị ọzọ dị iche iche; 4) Nchikọta nke iberibe ccfDNA ndị a si mba ọzọ na hemolymph na-eme ngwa ngwa ma na-enye aka na ọrụ nzacha dị n'ime nke mussels. Na mmechi, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na echiche nke LB, nke etinyerela n'ọrụ karịsịa na ngalaba biomedicine, na-akọwapụta isi iyi ihe ọmụma bara ụba mana a na-enyochabeghị nke enwere ike iji ghọta mmekọrịta dị n'etiti ụdị sentinel na gburugburu ebe obibi ha nke ọma.
Na mgbakwunye na anụmanụ ndị na-eto eto, a kọwapụtala na ccfDNA nọ n'ime anụmanụ na-azụ anụmanụ, gụnyere òké, nkịta, pusi, na ịnyịnya [50, 51, 52]. Agbanyeghị, dịka anyị maara, ọmụmụ ihe anyị bụ nke mbụ kọrọ nchọpụta na usoro nke ccfDNA n'ime ụdị mmiri nwere sistemụ mgbasa ozi mepere emepe. Njirimara anatomical a na ikike nzacha nke mussels nwere ike, ma ọ dịkarịa ala n'akụkụ, kọwaa njirimara nha dị iche iche nke iberibe DNA na-agagharị ma e jiri ya tụnyere ụdị ndị ọzọ. N'ime ụmụ mmadụ, ọtụtụ iberibe DNA na-agagharị n'ọbara bụ obere iberibe dị iche iche site na 150 ruo 200 bp. nwere oke kachasị elu nke 167 bp [34, 53]. Akụkụ obere mana dị mkpa nke iberibe DNA dị n'etiti 300 na 500 bp n'ogo, ihe dị ka 5% dị ogologo karịa 900 bp. [54]. Ihe kpatara nkesa nha a bụ na isi iyi nke ccfDNA na plasma na-eme n'ihi ọnwụ sel, ma ọ bụ n'ihi ọnwụ sel ma ọ bụ n'ihi necrosis nke sel hematopoietic na-agagharị n'ime ndị nwere ahụike ma ọ bụ n'ihi apoptosis nke sel tumor na ndị ọrịa kansa (nke a maara dị ka DNA tumor na-agagharị). , ctDNA). Nkesa nha nke hemolymph ccfDNA nke anyị hụrụ na mussels dị site na 1000 ruo 5000 bp, na-egosi na mussel ccfDNA nwere mmalite dị iche. Nke a bụ echiche ezi uche dị na ya, ebe ọ bụ na mussels nwere sistemụ akwara ọkara mepere emepe ma bi na gburugburu mmiri mmiri nwere nnukwu mkpokọta nke DNA genomic microbial. N'ezie, nnwale ụlọ nyocha anyị na-eji DNA exogenous egosila na mussels na-anakọta iberibe DNA na mmiri oké osimiri, ma ọ dịkarịa ala mgbe awa ole na ole gachara, ha na-emebi mgbe sel nabatara na/ma ọ bụ tọhapụ na/ma ọ bụ chekwaa na òtù dị iche iche. Ebe ọ bụ na mkpụrụ ndụ dị ụkọ (ma prokaryotic ma eukaryotic), ojiji nke ngalaba intravalvular ga-ebelata ọnụọgụ ccfDNA sitere na isi mmalite onwe yana site na isi mmalite mba ọzọ. N'ịtụle mkpa nke mgbochi bivalve na ọnụọgụgụ phagocytes na-agagharị agagharị, anyị chekwara na ọbụna ccfDNA mba ọzọ na-eme ka phagocytes na-agagharị agagharị nke na-agbakọta DNA mba ọzọ mgbe ha riri obere ihe ndị dị ndụ na/ma ọ bụ ihe mkpofu sel. A gbakọrọ ihe anyị chọpụtara, nsonaazụ anyị na-egosi na bivalve hemolymph ccfDNA bụ ebe nchekwa pụrụ iche nke ozi molekul ma na-eme ka ọnọdụ ha sie ike dị ka ụdị sentinel.
Data anyị na-egosi na usoro na nyocha nke iberibe hemolymph ccfDNA sitere na nje nwere ike inye ozi dị mkpa gbasara osisi nje bacteria na nje bacteria dị na gburugburu mmiri gbara ya gburugburu. Usoro usoro ihe nkiri ekpughela usoro nke nje bacteria commensal A. atra gill nke a gaara echefu ma a sị na ejiri usoro nchọpụta 16S rRNA nkịtị mee ihe, n'ihi na akụkụ ya bụ echiche ọbá akwụkwọ ntụaka. N'ezie, ojiji anyị nke data LB anakọtara site na M. platensis n'otu oyi akwa mussel na Kerguelen gosiri na nhazi nke nje bacteria jikọtara na gill bụ otu maka ụdị mussel abụọ ahụ (Fig. S4, Ozi Mgbakwunye). Myirịta a nke mussels abụọ dị iche iche nwere ike igosipụta nhazi nke obodo nje bacteria na ebe oyi, sulfurous, na ugwu mgbawa nke Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Akọwala ọkwa dị elu nke nje bacteria na-ebelata sulfur nke ọma mgbe a na-ewe mussels site na mpaghara mmiri dị ndụ [59], dị ka ụsọ oké osimiri Port-au-France. Ihe ọzọ nwere ike ime bụ na nnyefe kwụ ọtọ nwere ike imetụta osisi mussel commensal [60, 61]. A chọrọ nnyocha ndị ọzọ iji chọpụta njikọ dị n'etiti gburugburu mmiri, elu ala mmiri, na nhazi nke nje bacteria symbiotic na mussels. Ọmụmụ ihe ndị a na-aga n'ihu ugbu a.
Ogologo na njupụta nke hemolymph ccfDNA, ịdị mfe nke ịsacha ya, na ịdị mma dị elu iji kwe ka usoro egbe ngwa ngwa bụ ụfọdụ n'ime ọtụtụ uru dị na iji mussel ccfDNA iji nyochaa ụdị dị iche iche dị na gburugburu ebe obibi mmiri. Ụzọ a dị irè karịsịa maka ịkọwapụta obodo nje (viromes) na gburugburu ebe obibi enyere [62, 63]. N'adịghị ka nje bacteria, archaea, na eukaryotes, genomes nje anaghị enwe mkpụrụ ndụ ihe nketa echekwara phylogenetic dịka usoro 16S. Nsonaazụ anyị na-egosi na enwere ike iji biopsy mmiri mmiri sitere na ụdị ihe ngosi dị ka mussels chọpụta ọnụọgụ dị ukwuu nke iberibe nje ccfDNA nke a maara na ọ na-ebute ndị ọbịa nke na-ebikarị na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri. Nke a gụnyere nje virus a maara na-ebute protozoa, arthropods, ụmụ ahụhụ, osisi, na nje bacteria (dịka ọmụmaatụ, bacteriophages). A chọtara nkesa yiri nke ahụ mgbe anyị lere anya na hemolymph ccfDNA virome nke blue mussels (M. platensis) nke a chịkọtara n'otu oyi akwa mussel na Kerguelen (Tebụl S2, Ozi Mgbakwunye). Usoro egbe nke ccfDNA bụ n'ezie ụzọ ọhụrụ na-enweta mmụba n'ọmụmụ banyere virome nke mmadụ ma ọ bụ ụdị ndị ọzọ [21, 37, 64]. Ụzọ a bara uru karịsịa maka ịmụ banyere nje DNA nwere eriri abụọ, ebe ọ bụ na ọ dịghị otu mkpụrụ ndụ ihe nketa echekwara n'etiti nje DNA niile nwere eriri abụọ, nke na-anọchite anya ụdị nje virus kachasị dị iche iche na Baltimore [65]. Ọ bụ ezie na ọtụtụ n'ime nje ndị a ka bụ ndị a na-anaghị ekewa ma nwee ike ịgụnye nje sitere na akụkụ a na-amaghị ama nke ụwa nje [66], anyị chọpụtara na nje na oke ndị ọbịa nke mussels A. atra na M. platensis na-ada n'etiti ụdị abụọ ahụ. N'otu aka ahụ (lee eserese S3, ozi ndị ọzọ). Myirịta a abụghị ihe ijuanya, n'ihi na ọ nwere ike igosipụta enweghị nhọrọ na nnabata nke DNA dị na gburugburu ebe obibi. Ọmụmụ ihe ndị ga-eme n'ọdịnihu site na iji RNA dị ọcha ugbu a dị mkpa iji mara nje RNA ahụ.
N'ọmụmụ ihe anyị, anyị jiri usoro siri ike nke e si n'ọrụ Kowarski na ndị ọrụ ibe ya [37] mepụta, bụ́ ndị jiri nzọụkwụ abụọ nke iwepụ ihe ndị a na-agụ na ihe ndị na-agakọ tupu na mgbe e mechara nchịkọta nke ccfDNA nke obodo, nke butere nnukwu ọnụọgụgụ agụghị. Ya mere, anyị enweghị ike iwepụ na ụfọdụ n'ime ihe ndị a na-agụghị na map ka nwere ike inwe mmalite nke ha, nke bụ isi n'ihi na anyị enweghị genome ntụaka maka ụdị mussel a. Anyị jikwa usoro a n'ihi na anyị nwere nchegbu maka chimeras dị n'etiti ọgụgụ onwe na nke na-abụghị nke onwe na ogologo ọgụgụ nke Illumina MiSeq PE75 mepụtara. Ihe ọzọ kpatara ọtụtụ ọgụgụ agụghị na map bụ na ọtụtụ nje bacteria dị n'ime mmiri, karịsịa n'ebe ndị dịpụrụ adịpụ dị ka Kerguelen, edebeghị aha. Anyị jiri Illumina MiSeq PE75, na-eche na ogologo iberibe ccfDNA yiri ccfDNA mmadụ. Maka ọmụmụ ihe n'ọdịnihu, ebe anyị na-egosi na hemolymph ccfDNA nwere ogologo ọgụgụ karịa mmadụ na/ma ọ bụ anụmanụ, anyị na-akwado iji usoro nhazi nke dabara adaba maka iberibe ccfDNA dị ogologo. Omume a ga-eme ka ọ dịrị gị mfe ịchọpụta ihe ndị ọzọ na-egosi maka nyocha miri emi. Inweta usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa nuklia A. atra zuru oke nke na-adịghị ugbu a ga-emekwa ka ịkpa ókè nke ccfDNA si n'aka ndị na-abụghị onwe ha na ndị na-abụghị onwe ha dị mfe. Ebe ọ bụ na nnyocha anyị lekwasịrị anya n'o kwere omume itinye echiche nke biopsy mmiri mmiri n'ahụ mussels, anyị nwere olileanya na ebe ọ bụ na a na-eji echiche a eme ihe n'ọmụmụ ihe n'ọdịnihu, a ga-emepụta ngwaọrụ na pipeline ọhụrụ iji mee ka ikike nke usoro a dịkwuo elu iji mụọ ụdị microbial dị iche iche nke mussels. gburugburu ebe obibi mmiri.
Dịka ihe ngosi ahụike na-anaghị emerụ ahụ, mmụba nke ọkwa ccfDNA dị na plasma mmadụ na-ejikọta ya na ọrịa dị iche iche, mmebi anụ ahụ, na ọnọdụ nrụgide [67,68,69]. Mmụba a jikọtara ya na mwepụta nke iberibe DNA nke sitere na ya mgbe anụ ahụ mebiri emebi. Anyị lebara okwu a anya site na iji nrụgide okpomọkụ dị oke njọ, nke a na-ekpughere mussels na okpomọkụ nke 30 °C nwa oge. Anyị mere nyocha a na ụdị mussels atọ dị iche iche na nnwale atọ nwere onwe ha. Agbanyeghị, anyị ahụghị mgbanwe ọ bụla na ọkwa ccfDNA mgbe nrụgide okpomọkụ dị oke njọ gasịrị (lee Foto S5, ozi ndị ọzọ). Nchọpụta a nwere ike ịkọwa, ma ọ dịkarịa ala n'akụkụ ụfọdụ, eziokwu ahụ bụ na mussels nwere sistemụ mgbasa ozi ọkara-emeghe ma na-anakọta nnukwu DNA mba ọzọ n'ihi ọrụ nzacha ha dị elu. N'aka nke ọzọ, mussels, dị ka ọtụtụ invertebrates, nwere ike iguzogide mmebi anụ ahụ nke nrụgide kpatara, si otú a na-egbochi ntọhapụ nke ccfDNA na hemolymph ha [70, 71].
Ruo taa, nyocha DNA nke ụdịdị dị iche iche dị ndụ na gburugburu ebe obibi mmiri lekwasịrị anya karịsịa na metabarcoding DNA gburugburu ebe obibi (eDNA). Agbanyeghị, usoro a na-adịkarị oke na nyocha ụdịdị dị iche iche mgbe ejiri praịma. Ojiji nke usoro égbè na-egbochi oke PCR na nhọrọ nke praịmarị na-enweghị isi. Ya mere, n'otu echiche, usoro anyị dị nso na usoro nhazi eDNA Shotgun dị elu ejiri mee ihe n'oge na-adịbeghị anya, nke nwere ike ịhazi DNA kewara ekewa ozugbo ma nyochaa ihe fọrọ nke nta ka ọ bụrụ ihe niile dị ndụ [72, 73]. Agbanyeghị, enwere ọtụtụ nsogbu ndị bụ isi nke na-eme ka LB dị iche na usoro eDNA ọkọlọtọ. N'ezie, isi ihe dị iche n'etiti eDNA na LB bụ ojiji nke ndị ọbịa nzacha eke. A kọwo na ojiji nke ụdị mmiri dị ka sponge na bivalves (Dresseina spp.) dị ka nzacha eke maka ịmụ eDNA [74, 75]. Agbanyeghị, ọmụmụ Dreissena jiri biopsies anụ ahụ nke e si na DNA wepụta. Nnyocha nke ccfDNA site na LB anaghị achọ biopsy anụ ahụ, ngwa pụrụ iche na mgbe ụfọdụ dị oke ọnụ na usoro njem nke jikọtara ya na eDNA ma ọ bụ biopsy anụ ahụ. N'ezie, anyị kọrọ n'oge na-adịbeghị anya na enwere ike ịchekwa ma nyochaa ccfDNA site na LB site na nkwado FTA na-enweghị idobe yinye oyi, nke bụ nnukwu ihe ịma aka maka nyocha na mpaghara ndị dịpụrụ adịpụ [76]. Iwepụta ccfDNA site na biopsy mmiri mmiri dịkwa mfe ma na-enye DNA dị elu maka usoro shotgun na nyocha PCR. Nke a bụ nnukwu uru ebe enyere ụfọdụ mmachi teknụzụ metụtara nyocha eDNA [77]. Mfe na ọnụ ahịa dị ala nke usoro nlele dịkwa mma karịsịa maka mmemme nlekota ogologo oge. Na mgbakwunye na ikike nzacha dị elu ha, ihe ọzọ a ma ama nke bivalves bụ ihe mejupụtara mucopolysaccharide kemịkalụ nke muco ha, nke na-akwalite nnabata nke nje [78, 79]. Nke a na-eme ka bivalves bụrụ ihe nzacha eke zuru oke maka ịkọwapụta ụdị ihe dị iche iche na mmetụta nke mgbanwe ihu igwe na gburugburu ebe obibi mmiri enyere. Ọ bụ ezie na enwere ike ịhụ ọnụnọ nke iberibe DNA sitere na ndị ọbịa dị ka mmachi nke usoro ahụ ma e jiri ya tụnyere eDNA, ọnụ ahịa metụtara inwe ccfDNA dị otú ahụ ma e jiri ya tụnyere eDNA bụ ihe a na-aghọta n'otu oge maka nnukwu ozi dị maka ọmụmụ ahụike. offset host. Nke a gụnyere ọnụnọ nke usoro nje ndị ejikọtara na genome nke onye ọbịa ahụ. Nke a dị mkpa karịsịa maka mussels, ebe ọ bụ na ọnụnọ nke leukemic retroviruses ebufe na bivalves [80, 81]. Uru ọzọ nke LB karịa eDNA bụ na ọ na-eji ọrụ phagocytic nke mkpụrụ ndụ ọbara na-agagharị na hemolymph, nke na-ejupụta obere nje (na mkpụrụ ndụ ihe nketa ha). Phagocytosis bụ ọrụ bụ isi nke mkpụrụ ndụ ọbara na bivalves [82]. N'ikpeazụ, usoro ahụ na-eji ikike nzacha dị elu nke mussels (nkezi 1.5 l/h nke mmiri oké osimiri) na mgbasa ozi ụbọchị abụọ, nke na-eme ka ngwakọta nke oyi akwa dị iche iche nke mmiri oké osimiri dịkwuo elu, na-enye ohere ijide eDNA heterologous. [83, 84]. Ya mere, nyocha mussel ccfDNA bụ ụzọ na-adọrọ mmasị ebe ọ bụ na ihe oriri, akụ na ụba, na gburugburu ebe obibi nke mussels. Dịka nyocha nke LB anakọtara site n'aka mmadụ, usoro a na-emepekwa ohere nke ịtụ mgbanwe mkpụrụ ndụ ihe nketa na epigenetic na DNA nnabata na nzaghachi maka ihe ndị dị n'èzí. Dịka ọmụmaatụ, enwere ike iche echiche teknụzụ usoro nke ọgbọ nke atọ iji mee nyocha methylation nke genome na ccfDNA obodo site na iji usoro nanopore. Usoro a kwesịrị ịdị mfe site n'eziokwu ahụ bụ na ogologo nke iberibe mussel ccfDNA dakọtara nke ọma na ikpo okwu usoro ogologo oge nke na-enye ohere nyocha methylation DNA dum site na otu usoro usoro na-enweghị mkpa maka mgbanwe kemịkalụ.85,86] Nke a bụ ihe na-adọrọ mmasị, ebe egosiri na ụkpụrụ methylation DNA na-egosipụta nzaghachi nye nrụgide gburugburu ebe obibi ma na-adịgide ruo ọtụtụ ọgbọ. Ya mere, ọ nwere ike inye nghọta bara uru na usoro ndị dị n'okpuru na-achịkwa nzaghachi mgbe ekpughere mgbanwe ihu igwe ma ọ bụ ihe na-emerụ emerụ [87]. Agbanyeghị, ojiji nke LB abụghị ihe na-enweghị oke. Ọ dịghị mkpa ikwu, nke a chọrọ ọnụnọ nke ụdị ihe ngosi na gburugburu ebe obibi. Dịka ekwuru n'elu, iji LB nyochaa ụdịdị dị iche iche nke gburugburu ebe obibi enyere chọrọ usoro bioinformatics siri ike nke na-eburu n'uche ọnụnọ nke iberibe DNA sitere na isi mmalite. Nsogbu ọzọ dị mkpa bụ nnweta mkpụrụ ndụ ihe nketa maka ụdị mmiri. A na-atụ anya na atụmatụ dịka Marine Mammal Genomes Project na ọrụ Fish10k e guzobere n'oge na-adịbeghị anya [88] ga-eme ka nyocha dị otú ahụ dị mfe n'ọdịnihu. Itinye echiche LB n'ọrụ na ihe ndị dị ndụ na-enye nri nzacha mmiri dakọtara na ọganihu kachasị ọhụrụ na teknụzụ usoro, na-eme ka ọ dabara adaba maka mmepe nke multi-ohm biomarkers iji nye ozi dị mkpa gbasara ahụike nke ebe obibi mmiri n'ihi nrụgide gburugburu ebe obibi.
E tinyela data nhazi mkpụrụ ndụ ihe nketa n'ime NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 n'okpuru Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Mmetụta nke mgbanwe ihu igwe na ndụ mmiri na gburugburu ebe obibi. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Tụlee mmetụta nke mgbanwe ihu igwe na ihe ndị ọzọ na-akpata nrụgide mpaghara na gburugburu ebe obibi mmiri. Gburugburu ebe sayensị izugbe. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Sayensị nke mbụ nke March. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Mbelata nnabata okpomọkụ n'okpuru ọnọdụ nrụgide okpomọkụ ugboro ugboro na-akọwa oke ọnwụ nke mussels anụnụ anụnụ n'oge okpomọkụ. Akụkọ sayensị 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, na ndị ọzọ. Mgbanwe ndị na-adịbeghị anya na ugboro ole, ihe kpatara ya na oke ọnwụ anụmanụ. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Ọtụtụ nje ndị na-abụghị ụdịdị akọwapụtara nwere ike butere oke ọnwụ nke Pinna nobilis. Ndụ. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Mmetụta mgbanwe ihu igwe nwere ike inwe na ọrịa anụmanụ Arctic. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blue mussels (Mytilus edulis spp.) dị ka ihe mgbaàmà dị ndụ na nlekota mmetọ n'ụsọ oké osimiri: nyocha. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Njikọta nke biopsy mmiri mmiri n'ọgwụgwọ kansa. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, na ndị ọzọ. Mmiri biopsy ntozu oke: Na-enye ohere ka DNA tumor gbasaa. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asịd Nucleic dị na plasma mmadụ. Nzute nkeji nke ndị enyemaka Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ọrụ ọhụrụ maka DNA enweghị mkpụrụ ndụ dịka ihe nrịbama molekul maka ọgwụgwọ kansa. Ngụkọta nke nyocha biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy abanyela n'ụlọ ọgwụ ahụ - nsogbu mmejuputa na ihe ịma aka n'ọdịnihu. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW na ndị ọzọ. DNA nwa ebu n'afọ dị na plasma na serum nne. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Ọmụmụ ihe gbasara usoro afọ ime na nsogbu ya site na iji RNA na-agagharị n'ime ọbara ụmụ nwanyị n'oge afọ ime. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, na ndị ọzọ. Biopsy mmiri mmiri: A na-eji DNA enweghị mkpụrụ ndụ nye onyinye achọpụta ọnya allogeneic na graft akụrụ. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Mmepụta ihe ọhụrụ na nchọpụta ọrịa nwa ebu n'afọ: usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa plasma nne. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, na ndị ọzọ. Nchọpụta ngwa ngwa nke nje site na usoro metagenomic nke mmiri ahụ butere ọrịa n'ọgbọ na-abịa. Ọgwụ Nat. 2021;27:115-24.