Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
La biòpsia líquida (BL) és un concepte que està guanyant popularitat ràpidament en el camp biomèdic. El concepte es basa principalment en la detecció de fragments d'ADN extracel·lular circulant (ADNcc), que s'alliberen principalment com a petits fragments després de la mort cel·lular en diversos teixits. Una petita proporció d'aquests fragments provenen de teixits o organismes estranys (estrangers). En el treball actual, hem aplicat aquest concepte als musclos, una espècie sentinella coneguda per la seva alta capacitat de filtració d'aigua de mar. Utilitzem la capacitat dels musclos d'actuar com a filtres naturals per capturar fragments d'ADN ambiental de diverses fonts per proporcionar informació sobre la biodiversitat dels ecosistemes costaners marins. Els nostres resultats mostren que l'hemolimfa dels musclos conté fragments d'ADN que varien molt en mida, d'1 a 5 kb. La seqüenciació per escopeta va mostrar que un gran nombre de fragments d'ADN són d'origen microbià estrany. Entre ells, vam trobar fragments d'ADN de bacteris, arquees i virus, inclosos virus que se sap que infecten una varietat d'hostes que es troben habitualment en els ecosistemes marins costaners. En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte de LB aplicat als musclos representa una font de coneixement rica però encara inexplorada sobre la diversitat microbiana en els ecosistemes marins costaners.
L'impacte del canvi climàtic (CC) en la biodiversitat dels ecosistemes marins és una àrea de recerca en ràpid creixement. L'escalfament global no només causa importants tensions fisiològiques, sinó que també empeny els límits evolutius de l'estabilitat tèrmica dels organismes marins, afectant l'hàbitat de diverses espècies, cosa que els obliga a buscar condicions més favorables [1, 2]. A més d'afectar la biodiversitat dels metazous, el CC altera el delicat equilibri de les interaccions hoste-microbi. Aquesta disbacteriosi microbiana representa una greu amenaça per als ecosistemes marins, ja que fa que els organismes marins siguin més susceptibles als patògens infecciosos [3, 4]. Es creu que els SS tenen un paper important en les morts massives, cosa que representa un problema greu per a la gestió dels ecosistemes marins globals [5, 6]. Aquest és un tema important donats els impactes econòmics, ecològics i nutricionals de moltes espècies marines. Això és especialment cert per als bivalves que viuen a les regions polars, on els efectes del CK són més immediats i greus [6, 7]. De fet, bivalves com Mytilus spp. s'utilitzen àmpliament per controlar els efectes del CC en els ecosistemes marins. No és sorprenent que s'hagi desenvolupat un nombre relativament gran de biomarcadors per controlar la seva salut, sovint utilitzant un enfocament de dos nivells que implica biomarcadors funcionals basats en l'activitat enzimàtica o funcions cel·lulars com la viabilitat cel·lular i l'activitat fagocítica [8]. Aquests mètodes també inclouen la mesura de la concentració d'indicadors de pressió específics que s'acumulen en els teixits tous després de l'absorció de grans quantitats d'aigua de mar. Tanmateix, l'alta capacitat de filtració i el sistema circulatori semiobert dels bivalves ofereixen l'oportunitat de desenvolupar nous biomarcadors d'hemolimfa utilitzant el concepte de biòpsia líquida (LB), un enfocament senzill i mínimament invasiu per a la gestió de mostres de sang [9, 10]. Tot i que es poden trobar diversos tipus de molècules circulants en LB humà, aquest concepte es basa principalment en l'anàlisi de seqüenciació d'ADN de fragments d'ADN extracel·lular circulant (ccfDNA) en plasma. De fet, la presència d'ADN circulant en plasma humà es coneix des de mitjans del segle XX [11], però només en els darrers anys l'aparició de mètodes de seqüenciació d'alt rendiment ha conduït al diagnòstic clínic basat en ccfDNA. La presència d'aquests fragments d'ADN circulant es deu en part a l'alliberament passiu d'ADN genòmic (nuclear i mitocondrial) després de la mort cel·lular. En individus sans, la concentració de ccfDNA normalment és baixa (<10 ng/mL), però pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients que pateixen diverses patologies o sotmesos a estrès, la qual cosa provoca danys als teixits. En individus sans, la concentració de ccfDNA normalment és baixa (<10 ng/mL), però pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients que pateixen diverses patologies o sotmesos a estrès, la qual cosa provoca danys als teixits. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться повышаться 10 в больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждениюй. En persones sanes, la concentració de cccDNA normalment és baixa (<10 ng/mL), però pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients amb diverses patologies o sota estrès que provoca danys als teixits.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致承受压力的患者中可增加5-10在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 扅理 或 扅理 或 扅中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны 10 увелича ны 10 пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Les concentracions de ccfDNA solen ser baixes (<10 ng/ml) en individus sans, però poden augmentar de 5 a 10 vegades en pacients amb diverses patologies o estrès, cosa que provoca danys als teixits.La mida dels fragments de ccfDNA varia àmpliament, però normalment oscil·la entre 150 i 200 pb. [12]. L'anàlisi del ccfDNA autoderivat, és a dir, el ccfDNA de cèl·lules hostes normals o transformades, es pot utilitzar per detectar canvis genètics i epigenètics presents en el genoma nuclear i/o mitocondrial, ajudant així els clínics a seleccionar teràpies específiques dirigides a moleculars [13]. Tanmateix, el ccfDNA es pot obtenir de fonts estranyes com el ccfDNA de cèl·lules fetals durant l'embaràs o d'òrgans trasplantats [14,15,16,17]. El ccfDNA també és una font important d'informació per detectar la presència d'àcids nucleics d'un agent infecciós (estrany), cosa que permet la detecció no invasiva d'infeccions generalitzades no identificades per hemocultius, evitant la biòpsia invasiva del teixit infectat [18]. Estudis recents han demostrat que la sang humana conté una rica font d'informació que es pot utilitzar per identificar patògens virals i bacterians, i que aproximadament l'1% del ccfDNA que es troba al plasma humà és d'origen estrany [19]. Aquests estudis demostren que la biodiversitat del microbioma circulant d'un organisme es pot avaluar mitjançant l'anàlisi de ccfDNA. Tanmateix, fins fa poc, aquest concepte s'utilitzava exclusivament en humans i, en menor mesura, en altres vertebrats [20, 21].
En aquest article, utilitzem el potencial LB per analitzar el ccfDNA d'Aulacomya atra, una espècie meridional que es troba habitualment a les illes Kerguelen subantàrtiques, un grup d'illes a la part superior d'un gran altiplà que es va formar fa 35 milions d'anys. En una erupció volcànica. Mitjançant un sistema experimental in vitro, vam descobrir que els fragments d'ADN de l'aigua de mar són absorbits ràpidament pels musclos i entren al compartiment de l'hemolimfa. La seqüenciació amb escopeta ha demostrat que el ccfDNA de l'hemolimfa dels musclos conté fragments d'ADN d'origen propi i no propi, incloent-hi bacteris simbiòtics i fragments d'ADN de biomes típics dels ecosistemes costaners marins volcànics freds. El ccfDNA de l'hemolimfa també conté seqüències virals derivades de virus amb diferents rangs d'hostes. També vam trobar fragments d'ADN d'animals multicel·lulars com ara peixos ossis, anemones de mar, algues i insectes. En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte LB es pot aplicar amb èxit als invertebrats marins per generar un ric repertori genòmic en els ecosistemes marins.
Es van recollir adults (55-70 mm de llargada) de Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) de les costes rocoses intermareals de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Illes Kerguelen el desembre de 2018. Altres musclos blaus adults (Mytilus spp.) es van obtenir d'un proveïdor comercial (PEI Mussel King Inc., Illa del Príncep Eduard, Canadà) i es van col·locar en un tanc airejat amb temperatura controlada (4 °C) que contenia 10-20 L de salmorra artificial al 32‰ (sal marina artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virgínia, EUA). Per a cada experiment, es va mesurar la longitud i el pes de les closques individuals.
Un protocol d'accés obert i gratuït per a aquest programa està disponible en línia (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Breument, es va recollir hemolimfa LB dels músculs abductors tal com es descriu [22]. L'hemolimfa es va clarificar per centrifugació a 1200 × g durant 3 minuts, el sobrenedant es va congelar (-20 °C) fins al seu ús. Per a l'aïllament i la purificació del cfDNA, es van descongelar i processar mostres (1,5-2,0 ml) amb el kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segons les instruccions del fabricant. El ccfDNA es va emmagatzemar a -80 °C fins a la seva anàlisi posterior. En alguns experiments, el ccfDNA es va aïllar i purificar amb el kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadà). L'ADN purificat es va quantificar mitjançant un assaig estàndard PicoGreen. La distribució de fragments del ccfDNA aïllat es va analitzar mitjançant electroforesi capil·lar utilitzant un bioanalitzador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) i un kit d'ADN d'alta sensibilitat. L'assaig es va realitzar utilitzant 1 µl de la mostra de ccfDNA segons les instruccions del fabricant.
Per a la seqüenciació de fragments de ccfDNA d'hemolimfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadà) va preparar biblioteques shotgun utilitzant el kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75. Es va utilitzar un adaptador estàndard (BioO). Els fitxers de dades en brut estan disponibles a l'arxiu de lectura de seqüències del NCBI (SRR8924808 i SRR8924809). La qualitat de lectura bàsica es va avaluar mitjançant FastQC [23]. S'ha utilitzat Trimmomatic [24] per a adaptadors de retall i lectures de mala qualitat. Les lectures shotgun amb extrems aparellats es van fusionar FLASH en lectures individuals més llargues amb una superposició mínima de 20 bp per evitar desajustos [25]. Les lectures fusionades es van anotar amb BLASTN utilitzant una base de dades de taxonomia NCBI de bivalves (valor e < 1e−3 i 90% d'homologia), i l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat es va realitzar mitjançant DUST [26]. Les lectures fusionades es van anotar amb BLASTN utilitzant una base de dades de taxonomia NCBI de bivalves (valor e < 1e−3 i 90% d'homologia), i l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat es va realitzar mitjançant DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных такисон таки двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Les lectures agrupades es van anotar amb BLASTN utilitzant la base de dades de taxonomia de bivalves del NCBI (valor e < 1e-3 i 90% d'homologia), i l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat es va realitzar mitjançant DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌并的诌并的诌数，，数，D6）进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ｈ 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой Ѕннотированы двустворчатых моллюсков NCBI (значение i <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельй ностелогии сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Les lectures agrupades es van anotar amb BLASTN utilitzant la base de dades taxonòmica de bivalves del NCBI (valor e <1e-3 i 90% d'homologia), i l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat es va realitzar mitjançant DUST [26].Les lectures es van dividir en dos grups: relacionades amb seqüències de bivalves (aquí anomenades autolectures) i no relacionades (no autolectures). Es van assemblar dos grups per separat utilitzant MEGAHIT per generar contigs [27]. Mentrestant, la distribució taxonòmica de les lectures del microbioma alienígena es va classificar utilitzant Kraken2 [28] i es va representar gràficament mitjançant un gràfic circular de Krona a Galaxy [29, 30]. Es va determinar que els kmers òptims eren kmers-59 a partir dels nostres experiments preliminars. Els autocontigs es van identificar mitjançant l'alineació amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e < 1e−10 i 60% d'homologia) per a una anotació final. Els autocontigs es van identificar mitjançant l'alineació amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e < 1e−10 i 60% d'homologia) per a una anotació final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база даннытх двхуставо моллюсков NCBI, значение i <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Els autocontigs es van identificar mitjançant la coincidència amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia) per a l'anotació final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтиги для окончательной аннотации путем сол BLAS данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Els autocontigs es van identificar per a l'anotació final mitjançant la coincidència amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). En paral·lel, els contigs de grups no propis es van anotar amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor d'e < 1e−10 i 60% d'homologia). En paral·lel, els contigs de grups no propis es van anotar amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor d'e < 1e−10 i 60% d'homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN <1e-10 i гомология 60%). En paral·lel, els contigs de grups estranys es van anotar amb BLASTN (base de dades NT NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASTN NCBI, значение i <1e-10 и гомология 60%). En paral·lel, els contigs de grup no propi es van anotar amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). BLASTX també es va dur a terme en contigs no propis utilitzant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e < 1e−10 i 60% d'homologia). BLASTX també es va dur a terme en contigs no propis utilitzant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e < 1e−10 i 60% d'homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeq nr. e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis utilitzant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 i 60% d'homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） 性还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） 性 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безнка NC e nr BI (Ref. <1e-10 i гомология 60%). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis utilitzant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e <1e-10 i 60% d'homologia).Els grups BLASTN i BLASTX de contigs no autocontigs representen els contigs finals (vegeu el fitxer suplementari).
Els encebadors utilitzats per a la PCR es mostren a la Taula S1. Es va utilitzar la Taq ADN polimerasa (Bio Basic Canada, Markham, ON) per amplificar els gens diana del ccfDNA. Es van utilitzar les condicions de reacció següents: desnaturalització a 95 °C durant 3 minuts, 95 °C durant 1 minut, temperatura de recuit ajustada durant 1 minut, elongació a 72 °C durant 1 minut, 35 cicles i finalment 72 °C en 10 minuts. Els productes de la PCR es van separar per electroforesi en gels d'agarosa (1,5%) que contenien SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadà) a 95 V.
Els musclos (Mytilus spp.) es van aclimatar en 500 ml d'aigua de mar oxigenada (32 PSU) durant 24 hores a 4 °C. Es va afegir ADN plasmídic que contenia un insert que codifica la seqüència d'ADNc de la galectina-7 humana (número d'accés del NCBI L07769) al vial a una concentració final de 190 μg/μl. Els musclos incubats en les mateixes condicions sense addició d'ADN van ser el control. El tercer tanc de control contenia ADN sense musclos. Per controlar la qualitat de l'ADN a l'aigua de mar, es van prendre mostres d'aigua de mar (20 μl; tres repeticions) de cada tanc a l'hora indicada. Per a la traçabilitat de l'ADN plasmídic, es van recol·lectar musclos LB a l'hora indicada i es van analitzar mitjançant qPCR i ddPCR. A causa de l'alt contingut en sal de l'aigua de mar, es van diluir alíquotes en aigua de qualitat PCR (1:10) abans de tots els assaigs de PCR.
La PCR digital de gotes (ddPCR) es va realitzar mitjançant el protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadà). Utilitzeu el perfil de temperatura per determinar la temperatura òptima (Taula S1). Les gotes es van generar mitjançant un generador de gotes QX200 (BioRad). La ddPCR es va dur a terme de la següent manera: 95 °C durant 5 min, 50 cicles de 95 °C durant 30 s i una temperatura de recuit determinada durant 1 min i 72 °C durant 30 s, 4 °C durant 5 min i 90 °C en 5 minuts. El nombre de gotes i reaccions positives (nombre de còpies/µl) es van mesurar mitjançant un lector de gotes QX200 (BioRad). Es van rebutjar les mostres amb menys de 10.000 gotes. El control de patró no es va realitzar cada vegada que es va executar la ddPCR.
La qPCR es va dur a terme utilitzant Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austràlia) i encebadors específics per a LGALS7. Totes les PCR quantitatives es van realitzar en 20 µl utilitzant el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). La qPCR es va iniciar amb una incubació de 15 minuts a 95 °C seguida de 40 cicles a 95 °C durant 10 segons i a 60 °C durant 60 segons amb una sola recollida de dades. Les corbes de fusió es van generar utilitzant mesures successives a 95 °C durant 5 s, 65 °C durant 60 s i 97 °C al final de la qPCR. Cada qPCR es va realitzar per triplicat, excepte per a les mostres de control.
Com que els musclos són coneguts per la seva alta taxa de filtració, primer vam investigar si podien filtrar i retenir fragments d'ADN presents a l'aigua de mar. També ens interessava saber si aquests fragments s'acumulen al seu sistema limfàtic semiobert. Vam resoldre aquest problema experimentalment traçant el destí dels fragments d'ADN solubles afegits als tancs de musclos blaus. Per facilitar el seguiment dels fragments d'ADN, vam utilitzar ADN plasmídic estrany (no propi) que conté el gen humà de la galectina-7. La ddPCR rastreja fragments d'ADN plasmídic a l'aigua de mar i als musclos. Els nostres resultats mostren que si la quantitat de fragments d'ADN a l'aigua de mar es mantenia relativament constant al llarg del temps (fins a 7 dies) en absència de musclos, aleshores, en presència de musclos, aquest nivell gairebé desapareixia completament en 8 hores (Fig. 1a, b). Els fragments d'ADN exogen es van detectar fàcilment en 15 minuts en líquid intravalvular i hemolimfa (Fig. 1c). Aquests fragments encara es podien detectar fins a 4 hores després de l'exposició. Aquesta activitat de filtratge respecte als fragments d'ADN és comparable a l'activitat de filtratge dels bacteris i les algues [31]. Aquests resultats suggereixen que els musclos poden filtrar i acumular ADN estrany en els seus compartiments fluids.
Concentracions relatives d'ADN plasmídic en aigua de mar en presència (A) o absència (B) de musclos, mesurades per ddPCR. A A, els resultats s'expressen com a percentatges, amb les vores de les caselles representant els percentils 75 i 25. La corba logarítmica ajustada es mostra en vermell i l'àrea ombrejada en gris representa l'interval de confiança del 95%. A B, la línia vermella representa la mitjana i la línia blava representa l'interval de confiança del 95% per a la concentració. C Acumulació d'ADN plasmídic a l'hemolimfa i al líquid valvular dels musclos en diferents moments després de l'addició d'ADN plasmídic. Els resultats es presenten com a còpies absolutes detectades/mL (±SE).
A continuació, vam investigar l'origen del ccfDNA en musclos recollits de muscloseres a les illes Kerguelen, un grup remot d'illes amb influència antropogènica limitada. Per a aquest propòsit, es va aïllar i purificar el cccDNA de les hemolimfes de musclos mitjançant mètodes que s'utilitzen habitualment per purificar el cccDNA humà [32, 33]. Vam trobar que les concentracions mitjanes de ccfDNA d'hemolimfa en musclos es troben en el rang baix de micrograms per ml d'hemolimfa (vegeu la Taula S2, Informació suplementària). Aquest rang de concentracions és molt més gran que en persones sanes (nanograms baixos per mil·lilitre), però en casos rars, en pacients amb càncer, el nivell de ccfDNA pot arribar a diversos micrograms per mil·lilitre [34, 35]. Una anàlisi de la distribució de mida del ccfDNA d'hemolimfa va mostrar que aquests fragments varien molt en mida, des de 1000 bp fins a 1000 bp fins a 5000 bp (Fig. 2). Es van obtenir resultats similars utilitzant el kit QIAamp Investigator basat en sílice, un mètode utilitzat habitualment en ciència forense per aïllar i purificar ràpidament l'ADN genòmic de mostres d'ADN de baixa concentració, inclòs el ccfDNA [36].
Electroforegrama representatiu de ccfDNA de l'hemolimfa de musclo. Extret amb el kit de plasma NucleoSnap (a dalt) i el kit QIAamp DNA Investigator. B Gràfic de violí que mostra la distribució de les concentracions de ccfDNA de l'hemolimfa (±SE) en els musclos. Les línies negra i vermella representen la mitjana i el primer i tercer quartils, respectivament.
Aproximadament l'1% del ccfDNA en humans i primats té una font estranya [21, 37]. Donat el sistema circulatori semiobert dels bivalves, l'aigua de mar rica en microbis i la distribució de mida del ccfDNA de musclo, vam plantejar la hipòtesi que el ccfDNA de l'hemolimfa de musclo pot contenir un conjunt ric i divers d'ADN microbià. Per provar aquesta hipòtesi, vam seqüenciar el ccfDNA de l'hemolimfa de mostres d'Aulacomya atra recollides a les Illes Kerguelen, donant més de 10 milions de lectures, el 97,6% de les quals van superar el control de qualitat. Les lectures es van classificar després segons les fonts pròpies i no pròpies utilitzant les bases de dades de bivalves BLASTN i NCBI (Fig. S1, informació suplementària).
En humans, tant l'ADN nuclear com el mitocondrial es poden alliberar al torrent sanguini [38]. Tanmateix, en el present estudi no va ser possible descriure en detall l'ADN genòmic nuclear dels musclos, atès que el genoma d'A. atra no s'ha seqüenciat ni descrit. No obstant això, vam poder identificar diversos fragments de ccfDNA del nostre propi origen utilitzant la biblioteca de bivalves (Fig. S2, informació suplementària). També vam confirmar la presència de fragments d'ADN del nostre propi origen mitjançant l'amplificació per PCR dirigida dels gens d'A. atra que es van seqüenciar (Fig. 3). De la mateixa manera, atès que el genoma mitocondrial d'A. atra està disponible en bases de dades públiques, es poden trobar proves de la presència de fragments de ccfDNA mitocondrial a l'hemolimfa d'A. atra. La presència de fragments d'ADN mitocondrial es va confirmar mitjançant l'amplificació per PCR (Fig. 3).
Diversos gens mitocondrials estaven presents a l'hemolimfa d'A. atra (punts vermells - número d'inventari: SRX5705969) i M. platensis (punts blaus - número d'inventari: SRX5705968) amplificats per PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificació del sobrenedant d'hemolimfa d'A. atra Emmagatzemat en paper FTA. Utilitzeu un punxó de 3 mm per afegir directament al tub de PCR que conté la barreja de PCR.
Donat l'abundant contingut microbià a l'aigua de mar, inicialment ens vam centrar en la caracterització de les seqüències d'ADN microbià a l'hemolimfa. Per fer-ho, utilitzem dues estratègies diferents. La primera estratègia va utilitzar Kraken2, un programa de classificació de seqüències basat en algoritmes que pot identificar seqüències microbianes amb una precisió comparable a BLAST i altres eines [28]. Es va determinar que més de 6719 lectures eren d'origen bacterià, mentre que 124 i 64 eren d'arquees i virus, respectivament (Fig. 4). Els fragments d'ADN bacterià més abundants van ser Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Aquesta distribució és coherent amb estudis previs del microbioma del musclo blau marí [39, 40]. Els gammaproteobacteria van ser la classe principal de Proteobacteria (44%), incloent-hi moltes Vibrionales (Fig. 4b). El mètode ddPCR va confirmar la presència de fragments d'ADN de Vibrio al ccfDNA de l'hemolimfa d'A. atra (Fig. 4c) [41]. Per obtenir més informació sobre l'origen bacterià del ccfDNA, es va adoptar un enfocament addicional (Fig. S2, informació suplementària). En aquest cas, les lectures que se superposaven es van assemblar com a lectures d'extrems aparellats i es van classificar com a d'origen propi (bivalves) o no propi mitjançant BLASTN i un valor e de 1e−3 i un tall amb una homologia >90%. En aquest cas, les lectures que se superposaven es van assemblar com a lectures d'extrems aparellats i es van classificar com a d'origen propi (bivalves) o no propi mitjançant BLASTN i un valor e de 1e−3 i un tall amb una homologia >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использование м зованием зованием зованием зованием зование 1 Происхождению отсечения с гомологией> 90%. En aquest cas, les lectures superposades es van recollir com a lectures d'aparellament i es van classificar com a natives (bivalves) o no originals mitjançant BLASTN i un valor e de 1e-3 i un tall amb una homologia >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 用 用 用 的 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классиками и класыникасы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использований e BLAS 1e-3 i порога гомологии> 90%. En aquest cas, les lectures superposades es van recollir com a lectures d'aparellament i es van classificar com a pròpies (bivalves) o no originals utilitzant valors d'e BLASTN i 1e-3 i un llindar d'homologia >90%.Com que el genoma d'A. atra encara no s'ha seqüenciat, hem utilitzat l'estratègia d'assemblatge de novo de l'assemblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). S'han identificat un total de 147.188 contigs com a dependents (bivalves) de l'origen. Aquests contigs s'han explotat amb valors e d'1e-10 utilitzant BLASTN i BLASTX. Aquesta estratègia ens ha permès identificar 482 fragments no bivalves presents al ccfDNA d'A. atra. Més de la meitat (57%) d'aquests fragments d'ADN es van obtenir de bacteris, principalment de simbionts branquials, inclosos els simbionts sulfotròfics, i de simbionts branquials Solemya velum (Fig. 5).
Abundància relativa a nivell de tipus. B Diversitat microbiana de dos fílums principals (Firmicutes i Proteobacteria). Amplificació representativa de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragments del gen 16S rRNA (blau) en tres hemolimfes atra.
Es van analitzar un total de 482 contigs recollits. Perfil general de la distribució taxonòmica de les anotacions de contigs metagenòmics (procariotes i eucariotes). B Distribució detallada dels fragments d'ADN bacterià identificats per BLASTN i BLASTX.
L'anàlisi de Kraken2 també va mostrar que el ccfDNA del musclo contenia fragments d'ADN arqueal, incloent-hi fragments d'ADN d'Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). La presència de fragments d'ADN derivats d'Euryarchaeota i Crenarchaeota, que anteriorment es trobaven a la comunitat microbiana dels musclos californians, no hauria de sorprendre [42]. Tot i que Euryarchaeota sovint s'associa amb condicions extremes, ara es reconeix que tant Euryarchaeota com Crenarcheota es troben entre els procariotes més comuns en l'entorn criogènic marí [43, 44]. La presència de microorganismes metanogènics en els musclos no és sorprenent, donats els informes recents d'extenses fuites de metà de fuites del fons de l'altiplà de Kerguelen [45] i la possible producció microbiana de metà observada davant la costa de les illes Kerguelen [46].
La nostra atenció es va centrar llavors en les lectures de virus d'ADN. Segons el nostre coneixement, aquest és el primer estudi fora de l'objectiu del contingut de virus dels musclos. Com era d'esperar, vam trobar fragments d'ADN de bacteriòfags (Caudovirales) (Fig. 6b). Tanmateix, l'ADN viral més comú prové d'un fílum de nucleocitovirus, també conegut com el virus d'ADN gran citoplasmàtic nuclear (NCLDV), que té el genoma més gran de tots els virus. Dins d'aquest fílum, la majoria de les seqüències d'ADN pertanyen a les famílies Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), els hostes naturals de les quals inclouen vertebrats i artròpodes, mentre que una petita proporció d'aquestes seqüències d'ADN pertany a algues virològiques conegudes. Infecta algues eucariotes marines. Les seqüències també es van obtenir del virus Pandora, el virus gegant amb la mida de genoma més gran de tots els gèneres virals coneguts. Curiosament, la gamma d'hostes que se sap que estan infectats amb el virus, determinada per la seqüenciació de ccfDNA de l'hemolimfa, era relativament gran (Figura S3, Informació suplementària). Inclou virus que infecten insectes com ara Baculoviridae i Iridoviridae, així com virus que infecten amebes, algues i vertebrats. També hem trobat seqüències que coincideixen amb el genoma del Pithovirus sibericum. Els pitovirus (també coneguts com a "virus zombis") es van aïllar per primera vegada del permafrost de 30.000 anys d'antiguitat a Sibèria [47]. Per tant, els nostres resultats són consistents amb informes anteriors que mostren que no totes les espècies modernes d'aquests virus estan extintes [48] i que aquests virus poden estar presents en ecosistemes marins subàrtics remots.
Finalment, vam fer proves per veure si podíem trobar fragments d'ADN d'altres animals multicel·lulars. Es van identificar un total de 482 contigs estranys mitjançant BLASTN i BLASTX amb biblioteques nt, nr i RefSeq (genòmica i de proteïnes). Els nostres resultats mostren que entre els fragments estranys de ccfDNA d'animals multicel·lulars predomina l'ADN d'ossos ossis (Fig. 5). També s'han trobat fragments d'ADN d'insectes i altres espècies. No s'ha identificat una part relativament gran dels fragments d'ADN, possiblement a causa de la infrarepresentació d'un gran nombre d'espècies marines a les bases de dades genòmiques en comparació amb les espècies terrestres [49].
En aquest article, apliquem el concepte de LB als musclos, argumentant que la seqüenciació de ccfDNA de l'hemolimfa pot proporcionar informació sobre la composició dels ecosistemes costaners marins. En particular, hem descobert que 1) l'hemolimfa del musclo conté concentracions relativament altes (nivells de micrograms) de fragments d'ADN circulant relativament grans (~1-5 kb); 2) aquests fragments d'ADN són independents i no independents; 3) Entre les fonts estranyes d'aquests fragments d'ADN, hem trobat ADN bacterià, arqueal i viral, així com ADN d'altres animals multicel·lulars; 4) L'acumulació d'aquests fragments de ccfDNA estranys a l'hemolimfa es produeix ràpidament i contribueix a l'activitat de filtratge intern dels musclos. En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte de LB, que fins ara s'ha aplicat principalment en el camp de la biomedicina, codifica una font de coneixement rica però inexplorada que es pot utilitzar per comprendre millor la interacció entre les espècies sentinelles i el seu entorn.
A més dels primats, s'ha descrit l'aïllament de ccfDNA en mamífers, com ara ratolins, gossos, gats i cavalls [50, 51, 52]. Tanmateix, segons el nostre coneixement, el nostre estudi és el primer a informar de la detecció i seqüenciació de ccfDNA en espècies marines amb un sistema de circulació oberta. Aquesta característica anatòmica i la capacitat de filtratge dels musclos poden, almenys en part, explicar les diferents característiques de mida dels fragments d'ADN circulants en comparació amb altres espècies. En humans, la majoria dels fragments d'ADN que circulen per la sang són fragments petits que oscil·len entre els 150 i els 200 pb amb un pic màxim de 167 pb [34, 53]. Una petita però significativa part dels fragments d'ADN tenen una mida d'entre 300 i 500 pb, i aproximadament el 5% superen els 900 pb [54]. La raó d'aquesta distribució de mida és que la principal font de ccfDNA al plasma es produeix com a resultat de la mort cel·lular, ja sigui a causa de la mort cel·lular o de la necrosi de les cèl·lules hematopoètiques circulants en individus sans o a causa de l'apoptosi de cèl·lules tumorals en pacients amb càncer (conegut com a ADN tumoral circulant, ctDNA). La distribució de mida del ccfDNA de l'hemolimfa que vam trobar als musclos oscil·lava entre 1000 i 5000 pb, cosa que suggereix que el ccfDNA del musclo té un origen diferent. Aquesta és una hipòtesi lògica, ja que els musclos tenen un sistema vascular semiobert i viuen en ambients aquàtics marins que contenen altes concentracions d'ADN genòmic microbià. De fet, els nostres experiments de laboratori amb ADN exogen han demostrat que els musclos acumulen fragments d'ADN a l'aigua de mar; almenys després d'unes hores es degraden després de l'absorció cel·lular i/o s'alliberen i/o s'emmagatzemen en diverses organitzacions. Donada la raresa de les cèl·lules (tant procariotes com eucariotes), l'ús de compartiments intravalvulars reduirà la quantitat de ccfDNA de fonts pròpies, així com de fonts estranyes. Considerant la importància de la immunitat innata dels bivalves i el gran nombre de fagòcits circulants, vam plantejar la hipòtesi que fins i tot el ccfDNA estrany s'enriqueix en fagòcits circulants que acumulen ADN estrany després de la ingestió de microorganismes i/o restes cel·lulars. En conjunt, els nostres resultats mostren que el ccfDNA de l'hemolimfa bivalve és un repositori únic d'informació molecular i reforça el seu estatus com a espècie sentinella.
Les nostres dades indiquen que la seqüenciació i l'anàlisi de fragments de ccfDNA de l'hemolimfa derivats de bacteris poden proporcionar informació clau sobre la flora bacteriana de l'hoste i els bacteris presents a l'ecosistema marí circumdant. Les tècniques de seqüenciació per trets han revelat seqüències del bacteri comensal A. atra gill que no s'haurien detectat si s'haguessin utilitzat mètodes convencionals d'identificació de 16S rRNA, en part a causa d'un biaix de biblioteca de referència. De fet, el nostre ús de dades LB recollides de M. platensis a la mateixa capa de musclos a Kerguelen va mostrar que la composició dels simbionts bacterians associats a les brànquies era la mateixa per a ambdues espècies de musclos (Fig. S4, Informació suplementària). Aquesta similitud de dos musclos genèticament diferents pot reflectir la composició de les comunitats bacterianes als dipòsits freds, sulfurosos i volcànics de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. S'han descrit bé nivells més alts de microorganismes reductors de sofre en la recol·lecció de musclos de zones costaneres bioturbades [59], com ara la costa de Port-au-France. Una altra possibilitat és que la flora comensal dels musclos es pugui veure afectada per la transmissió horitzontal [60, 61]. Cal més recerca per determinar la correlació entre el medi marí, la superfície del fons marí i la composició dels bacteris simbiòtics en els musclos. Aquests estudis estan actualment en curs.
La longitud i la concentració del ccfDNA de l'hemolimfa, la seva facilitat de purificació i l'alta qualitat per permetre una seqüenciació ràpida per escopeta són alguns dels molts avantatges d'utilitzar el ccfDNA de musclo per avaluar la biodiversitat en els ecosistemes costaners marins. Aquest enfocament és especialment eficaç per caracteritzar les comunitats virals (viromes) en un ecosistema determinat [62, 63]. A diferència dels bacteris, les arquees i els eucariotes, els genomes virals no contenen gens conservats filogenèticament com les seqüències 16S. Els nostres resultats indiquen que les biòpsies líquides d'espècies indicadores com els musclos es poden utilitzar per identificar un nombre relativament gran de fragments de virus ccfDNA que se sap que infecten hostes que normalment habiten els ecosistemes marins costaners. Això inclou virus que se sap que infecten protozous, artròpodes, insectes, plantes i virus bacterians (per exemple, bacteriòfags). Es va trobar una distribució similar quan vam examinar el viroma ccfDNA de l'hemolimfa dels musclos blaus (M. platensis) recollits a la mateixa capa de musclos a Kerguelen (Taula S2, Informació suplementària). La seqüenciació per emissió de ccfDNA és, sens dubte, un nou enfocament que està guanyant impuls en l'estudi del viroma dels humans o d'altres espècies [21, 37, 64]. Aquest enfocament és particularment útil per estudiar virus d'ADN bicatenari, ja que no es conserva cap gen únic entre tots els virus d'ADN bicatenari, representant la classe de virus més diversa i àmplia de Baltimore [65]. Tot i que la majoria d'aquests virus romanen sense classificar i poden incloure virus d'una part completament desconeguda del món viral [66], vam trobar que els viromes i els rangs d'hostes dels musclos A. atra i M. platensis es troben entre les dues espècies, de manera similar (vegeu la figura S3, informació addicional). Aquesta similitud no és sorprenent, ja que pot reflectir una manca de selectivitat en l'absorció de l'ADN present al medi ambient. Actualment es necessiten futurs estudis amb ARN purificat per caracteritzar el viroma d'ARN.
En el nostre estudi, vam utilitzar un procés molt rigorós adaptat del treball de Kowarski i els seus col·legues [37], que van utilitzar una eliminació en dos passos de lectures agrupades i contigs abans i després de l'acoblament del ccfDNA natiu, donant lloc a una alta proporció de lectures no mapades. Per tant, no podem descartar que algunes d'aquestes lectures no mapades encara puguin tenir el seu propi origen, principalment perquè no tenim un genoma de referència per a aquesta espècie de musclo. També vam utilitzar aquest procés perquè ens preocupaven les quimeres entre les lectures pròpies i les no pròpies i les longituds de lectura generades per l'Illumina MiSeq PE75. Una altra raó per a la majoria de lectures no cartografiades és que gran part dels microbis marins, especialment en zones remotes com Kerguelen, no han estat anotats. Vam utilitzar l'Illumina MiSeq PE75, assumint longituds de fragments de ccfDNA similars a les del ccfDNA humà. Per a futurs estudis, atès els nostres resultats que mostren que el ccfDNA de l'hemolimfa té lectures més llargues que els humans i/o els mamífers, recomanem utilitzar una plataforma de seqüenciació més adequada per a fragments de ccfDNA més llargs. Aquesta pràctica facilitarà molt la identificació de més indicis per a una anàlisi més profunda. L'obtenció de la seqüència completa del genoma nuclear d'A. atra, actualment no disponible, també facilitaria enormement la discriminació del ccfDNA de fonts pròpies i no pròpies. Atès que la nostra recerca s'ha centrat en la possibilitat d'aplicar el concepte de biòpsia líquida als musclos, esperem que, a mesura que aquest concepte s'utilitzi en futures investigacions, es desenvolupin noves eines i processos per augmentar el potencial d'aquest mètode per estudiar la diversitat microbiana dels musclos de l'ecosistema marí.
Com a biomarcador clínic no invasiu, els nivells elevats de ccfDNA en plasma humà s'associen amb diverses malalties, danys tissulars i condicions d'estrès [67,68,69]. Aquest augment s'associa amb l'alliberament de fragments d'ADN del seu propi origen després del dany tissular. Vam abordar aquest problema utilitzant estrès tèrmic agut, en què els musclos van ser exposats breument a una temperatura de 30 °C. Vam realitzar aquesta anàlisi en tres tipus diferents de musclos en tres experiments independents. Tanmateix, no vam trobar cap canvi en els nivells de ccfDNA després de l'estrès tèrmic agut (vegeu la Figura S5, informació addicional). Aquest descobriment pot explicar, almenys en part, el fet que els musclos tenen un sistema circulatori semiobert i acumulen grans quantitats d'ADN estrany a causa de la seva alta activitat de filtratge. D'altra banda, els musclos, com molts invertebrats, poden ser més resistents al dany tissular induït per l'estrès, limitant així l'alliberament de ccfDNA a la seva hemolimfa [70, 71].
Fins ara, l'anàlisi d'ADN de la biodiversitat en ecosistemes aquàtics s'ha centrat principalment en el metacodificació d'ADN ambiental (eDNA). Tanmateix, aquest mètode sol ser limitat en l'anàlisi de biodiversitat quan s'utilitzen encebadors. L'ús de la seqüenciació shotgun evita les limitacions de la PCR i la selecció esbiaixada de conjunts d'encebadors. Així, en cert sentit, el nostre mètode s'acosta més al mètode de seqüenciació Shotgun d'eDNA d'alt rendiment utilitzat recentment, que és capaç de seqüenciar directament ADN fragmentat i analitzar gairebé tots els organismes [72, 73]. Tanmateix, hi ha una sèrie de qüestions fonamentals que distingeixen LB dels mètodes estàndard d'eDNA. Per descomptat, la principal diferència entre l'eDNA i LB és l'ús d'hostes filtres naturals. S'ha informat de l'ús d'espècies marines com esponges i bivalves (Dreisseina spp.) com a filtre natural per estudiar l'eDNA [74, 75]. Tanmateix, l'estudi de Dreissena va utilitzar biòpsies de teixit de les quals es va extreure ADN. L'anàlisi de ccfDNA de LB no requereix biòpsia de teixit, equips especialitzats i de vegades cars ni logística associada a l'eDNA o la biòpsia de teixit. De fet, recentment vam informar que el ccfDNA de LB es pot emmagatzemar i analitzar amb suport FTA sense mantenir una cadena de fred, cosa que representa un repte important per a la recerca en zones remotes [76]. L'extracció de ccfDNA de biòpsies líquides també és senzilla i proporciona ADN d'alta qualitat per a la seqüenciació per escopeta i l'anàlisi PCR. Això és un gran avantatge, tenint en compte algunes de les limitacions tècniques associades a l'anàlisi d'eDNA [77]. La simplicitat i el baix cost del mètode de mostreig també són particularment adequats per a programes de seguiment a llarg termini. A més de la seva alta capacitat de filtratge, una altra característica ben coneguda dels bivalves és la composició química de mucopolisacàrids del seu moc, que promou l'absorció de virus [78, 79]. Això fa que els bivalves siguin un filtre natural ideal per caracteritzar la biodiversitat i l'impacte del canvi climàtic en un ecosistema aquàtic determinat. Tot i que la presència de fragments d'ADN derivats de l'hoste es pot veure com una limitació del mètode en comparació amb l'eDNA, el cost associat a tenir un ccfDNA natiu com aquest en comparació amb l'eDNA és simultàniament comprensible per la gran quantitat d'informació disponible per a estudis de salut de l'hoste compensat. Això inclou la presència de seqüències virals integrades al genoma de l'hoste. Això és especialment important per als musclos, donada la presència de retrovirus leucèmics de transmissió horitzontal en els bivalves [80, 81]. Un altre avantatge del LB respecte a l'eDNA és que explota l'activitat fagocítica de les cèl·lules sanguínies circulants a l'hemolimfa, que engoleix microorganismes (i els seus genomes). La fagocitosi és la funció principal de les cèl·lules sanguínies en els bivalves [82]. Finalment, el mètode aprofita l'alta capacitat de filtratge dels musclos (mitjana d'1,5 l/h d'aigua de mar) i la circulació de dos dies, que augmenten la barreja de diferents capes d'aigua de mar, permetent la captura d'eDNA heteròleg. [83, 84]. Per tant, l'anàlisi de ccfDNA de musclos és una via interessant donats els impactes nutricionals, econòmics i ambientals dels musclos. De manera similar a l'anàlisi de LB recollit d'humans, aquest mètode també obre la possibilitat de mesurar els canvis genètics i epigenètics en l'ADN hoste en resposta a substàncies exògenes. Per exemple, es poden preveure tecnologies de seqüenciació de tercera generació per realitzar anàlisis de metilació de tot el genoma en ccfDNA natiu mitjançant la seqüenciació de nanoporus. Aquest procés s'hauria de facilitar pel fet que la longitud dels fragments de ccfDNA de musclo és idealment compatible amb plataformes de seqüenciació de lectura llarga que permeten l'anàlisi de metilació de l'ADN de tot el genoma a partir d'una sola execució de seqüenciació sense necessitat de transformacions químiques.85,86] Aquesta és una possibilitat interessant, ja que s'ha demostrat que els patrons de metilació de l'ADN reflecteixen una resposta a l'estrès ambiental i persisteixen durant moltes generacions. Per tant, pot proporcionar informació valuosa sobre els mecanismes subjacents que governen la resposta després de l'exposició al canvi climàtic o als contaminants [87]. Tanmateix, l'ús de LB no està exempt de limitacions. No cal dir que això requereix la presència d'espècies indicadores a l'ecosistema. Com s'ha esmentat anteriorment, l'ús de LB per avaluar la biodiversitat d'un ecosistema determinat també requereix una canonada bioinformàtica rigorosa que tingui en compte la presència de fragments d'ADN de la font. Un altre problema important és la disponibilitat de genomes de referència per a espècies marines. S'espera que iniciatives com el Projecte Genomes de Mamífers Marins i el projecte Fish10k, recentment establert [88], facilitin aquesta anàlisi en el futur. L'aplicació del concepte LB als organismes marins que s'alimenten per filtració també és compatible amb els darrers avenços en tecnologia de seqüenciació, cosa que el fa molt adequat per al desenvolupament de biomarcadors multi-ohm per proporcionar informació important sobre la salut dels hàbitats marins en resposta a l'estrès ambiental.
Les dades de seqüenciació del genoma s'han dipositat a l'arxiu de lectura de seqüències del NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sota el nom de Bioprojectes SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacte del canvi climàtic en la vida marina i els ecosistemes. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Considereu els impactes combinats del canvi climàtic i altres factors d'estrès locals sobre el medi marí. Entorn científic general. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ciència del primer de març. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La reducció de la tolerància a la calor en condicions repetitives d'estrès tèrmic explica l'alta mortalitat estival dels musclos blaus. Informe científic 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Canvis recents en la freqüència, les causes i l'abast de les morts d'animals. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Múltiples patògens no específics de l'espècie poden haver causat la mortalitat massiva de Pinna nobilis. La vida. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impacte potencial del canvi climàtic en les malalties zoonòtiques de l'Àrtic. Int J Circumpolar Health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Musclos blaus (Mytilus edulis spp.) com a organismes senyal en el control de la contaminació costanera: una revisió. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integració de la biòpsia líquida en el tractament del càncer. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maduració de la biòpsia líquida: permet que l'ADN tumoral circuli. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Àcids nucleics en plasma humà. Actes de reunions de les filials de Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nou paper per a l'ADN lliure de cèl·lules com a marcador molecular per al tractament del càncer. Quantificació de l'anàlisi biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS La biòpsia líquida entra a la clínica: problemes d'implementació i reptes futurs. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i altres. L'ADN fetal és present al plasma i sèrum matern. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudi del curs de l'embaràs i les seves complicacions mitjançant ARN extracel·lular circulant a la sang de les dones durant l'embaràs. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biòpsia líquida: s'utilitza ADN lliure de cèl·lules del donant per detectar lesions al·logèniques en un empelt de ronyó. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovacions en diagnòstic prenatal: seqüenciació del genoma del plasma matern. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Detecció ràpida de patògens amb seqüenciació metagenòmica de nova generació de fluids corporals infectats. Nat Medicine. 2021;27:115-24.