Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रस्तुत करू.
लिक्विड बायोप्सी (LB) ही बायोमेडिकल क्षेत्रात झपाट्याने लोकप्रिय होत असलेली एक संकल्पना आहे. ही संकल्पना मुख्यत्वे रक्ताभिसरणातील बाह्यपेशीय डीएनएच्या (ccfDNA) तुकड्यांच्या शोधावर आधारित आहे, जे विविध ऊतींमधील पेशींच्या मृत्यूनंतर लहान तुकड्यांच्या स्वरूपात बाहेर पडतात. या तुकड्यांपैकी एक लहान भाग बाह्य ऊती किंवा जीवांपासून आलेला असतो. सध्याच्या कामात, आम्ही ही संकल्पना शिंपल्यांवर लागू केली आहे, जी समुद्राचे पाणी गाळण्याच्या उच्च क्षमतेसाठी ओळखली जाणारी एक सूचक प्रजाती आहे. सागरी किनारी परिसंस्थांच्या जैवविविधतेबद्दल माहिती देण्यासाठी, आम्ही विविध स्रोतांमधून पर्यावरणीय डीएनएचे तुकडे पकडण्याकरिता नैसर्गिक फिल्टर म्हणून काम करण्याच्या शिंपल्यांच्या क्षमतेचा वापर करतो. आमच्या निष्कर्षांनुसार, शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फमध्ये १ ते ५ किलोबेस (kb) पर्यंतच्या विविध आकारांचे डीएनएचे तुकडे आढळतात. शॉटगन सिक्वेन्सिंगने दाखवले की डीएनएच्या तुकड्यांपैकी मोठा भाग बाह्य सूक्ष्मजैविक मूळचा आहे. त्यामध्ये, आम्हाला जीवाणू, आर्किया आणि विषाणूंचे डीएनएचे तुकडे आढळले, ज्यात किनारी सागरी परिसंस्थांमध्ये सामान्यतः आढळणाऱ्या विविध यजमानांना संक्रमित करणाऱ्या विषाणूंचाही समावेश आहे. सारांशतः, आमचा अभ्यास हे दाखवून देतो की शिंपल्यांना लागू केलेली LB ची संकल्पना ही सागरी किनारी परिसंस्थांमधील सूक्ष्मजैविक विविधतेबद्दलच्या ज्ञानाचा एक समृद्ध परंतु अद्याप अज्ञात स्रोत आहे.
सागरी परिसंस्थांच्या जैवविविधतेवर हवामान बदलाचा (CC) होणारा परिणाम हे संशोधनाचे एक वेगाने वाढणारे क्षेत्र आहे. जागतिक तापमानवाढीमुळे केवळ महत्त्वाचे शारीरिक ताणच निर्माण होत नाहीत, तर सागरी जीवांच्या औष्णिक स्थिरतेच्या उत्क्रांतीच्या मर्यादाही ओलांडल्या जातात, ज्यामुळे अनेक प्रजातींच्या अधिवासावर परिणाम होतो आणि त्यांना अधिक अनुकूल परिस्थिती शोधण्यास प्रवृत्त केले जाते [1, 2]. मेटाझोअन्सच्या (बहुपेशीय जीवांच्या) जैवविविधतेवर परिणाम करण्याव्यतिरिक्त, हवामान बदल यजमान-सूक्ष्मजीव आंतरक्रियांचे नाजूक संतुलन बिघडवतो. हा सूक्ष्मजैविक असंतुलन सागरी परिसंस्थांसाठी एक गंभीर धोका निर्माण करतो, कारण तो सागरी जीवांना संसर्गजन्य रोगजनकांसाठी अधिक संवेदनशील बनवतो [3, 4]. असे मानले जाते की मोठ्या प्रमाणावरील मृत्यूंमध्ये हवामान बदल महत्त्वाची भूमिका बजावतो, जी जागतिक सागरी परिसंस्थांच्या व्यवस्थापनासाठी एक गंभीर समस्या आहे [5, 6]. अनेक सागरी प्रजातींवर होणारे आर्थिक, पर्यावरणीय आणि पौष्टिक परिणाम पाहता हा एक महत्त्वाचा मुद्दा आहे. हे विशेषतः ध्रुवीय प्रदेशात राहणाऱ्या द्विकपाटी जीवांच्या बाबतीत खरे आहे, जिथे हवामान बदलाचे परिणाम अधिक तात्काळ आणि गंभीर असतात [6, 7]. खरं तर, मायटिलस प्रजातींसारखे द्विकपाटी जीव... सागरी परिसंस्थेवर हवामान बदलाच्या परिणामांचे निरीक्षण करण्यासाठी यांचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. साहजिकच, त्यांच्या आरोग्यावर लक्ष ठेवण्यासाठी तुलनेने मोठ्या संख्येने बायोमार्कर विकसित केले गेले आहेत, ज्यात अनेकदा एन्झायमॅटिक क्रियाकलाप किंवा पेशींची व्यवहार्यता आणि फॅगोसाइटिक क्रियाकलाप [8] यांसारख्या पेशीय कार्यांवर आधारित कार्यात्मक बायोमार्करचा समावेश असलेल्या द्वि-स्तरीय दृष्टिकोनाचा वापर केला जातो. या पद्धतींमध्ये मोठ्या प्रमाणात समुद्राचे पाणी शोषल्यानंतर मऊ उतींमध्ये जमा होणाऱ्या विशिष्ट दाब निर्देशकांच्या सांद्रतेचे मोजमाप देखील समाविष्ट आहे. तथापि, द्विकपाटी प्राण्यांची उच्च गाळण क्षमता आणि अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली, लिक्विड बायोप्सी (LB) या संकल्पनेचा वापर करून नवीन हेमोलिम्फ बायोमार्कर विकसित करण्याची संधी प्रदान करते, जी रुग्ण व्यवस्थापनासाठी एक सोपी आणि किमान आक्रमक पद्धत आहे. रक्ताचे नमुने [9, 10]. मानवी LB मध्ये अनेक प्रकारचे फिरणारे रेणू आढळू शकतात, तरीही ही संकल्पना प्रामुख्याने प्लाझ्मामधील फिरणाऱ्या बाह्यकोशिकीय डीएनए (ccfDNA) तुकड्यांच्या डीएनए अनुक्रमण विश्लेषणावर आधारित आहे. खरं तर, मानवी प्लाझ्मामध्ये फिरणाऱ्या डीएनएचे अस्तित्व २० व्या शतकाच्या मध्यापासून ज्ञात आहे [11], परंतु अलिकडच्या वर्षांतच हाय-थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग पद्धतींच्या आगमनामुळे ccfDNA वर आधारित क्लिनिकल निदान शक्य झाले आहे. या फिरणाऱ्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती अंशतः पेशी मृत्यूनंतर जीनोमिक डीएनए (केंद्रकीय आणि मायटोकॉन्ड्रियल) च्या निष्क्रिय प्रकाशनामुळे असते. निरोगी व्यक्तींमध्ये ccfDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL) परंतु विविध आजारांनी ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते 5-10 पटीने वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते. निरोगी व्यक्तींमध्ये ccfDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL) परंतु विविध आजारांनी ग्रस्त असलेल्या किंवा तणावाखाली असलेल्या रुग्णांमध्ये ते 5-10 पटीने वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. निरोगी लोकांमध्ये cccDNA चे प्रमाण सामान्यतः कमी असते (<10 ng/mL), परंतु विविध आजार असलेल्या रुग्णांमध्ये किंवा ऊतींचे नुकसान करणाऱ्या तणावाखाली ते 5 ते 10 पटीने वाढू शकते.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渞0-5受压力渞倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 曭叀 或 承受 厗增加 5-10 倍, 从而 组织。 . 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцымистом. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. निरोगी व्यक्तींमध्ये ccfDNA चे प्रमाण सहसा कमी असते (<10 ng/ml), परंतु विविध आजार किंवा तणाव असलेल्या रुग्णांमध्ये ते 5-10 पटीने वाढू शकते, ज्यामुळे ऊतींचे नुकसान होते.ccfDNA तुकड्यांचा आकार मोठ्या प्रमाणात बदलतो, परंतु सामान्यतः तो 150 ते 200 bp पर्यंत असतो. [12]. स्वतःपासून मिळवलेल्या ccfDNA चे विश्लेषण, म्हणजेच सामान्य किंवा रूपांतरित यजमान पेशींमधील ccfDNA, केंद्रकीय आणि/किंवा मायटोकाँड्रियल जीनोममध्ये असलेले अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदल शोधण्यासाठी वापरले जाऊ शकते, ज्यामुळे डॉक्टरांना विशिष्ट आण्विक-लक्ष्यित उपचार निवडण्यास मदत होते [13]. तथापि, ccfDNA बाह्य स्रोतांकडून देखील मिळवता येते, जसे की गर्भधारणेदरम्यान गर्भाच्या पेशींमधून किंवा प्रत्यारोपित अवयवांमधून [14,15,16,17]. ccfDNA हे संसर्गजन्य घटकाच्या (बाह्य) न्यूक्लिक आम्लांची उपस्थिती शोधण्यासाठी माहितीचा एक महत्त्वाचा स्रोत आहे, ज्यामुळे रक्त संवर्धनाने (blood cultures) न ओळखल्या गेलेल्या व्यापक संसर्गाचे बिन-आक्रमक पद्धतीने निदान करता येते आणि संक्रमित ऊतींची आक्रमक बायोप्सी टाळता येते [18]. अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की मानवी रक्तामध्ये माहितीचा एक समृद्ध स्रोत असतो ज्याचा उपयोग विषाणूजन्य आणि जिवाणूजन्य रोगजनकांना ओळखण्यासाठी केला जाऊ शकतो आणि मानवी प्लाझ्मामध्ये आढळणाऱ्या ccfDNA पैकी सुमारे 1% बाह्य मूळ असलेले असते [19]. या अभ्यासांमधून असे दिसून येते की ccfDNA विश्लेषणाचा वापर करून जीवाच्या रक्ताभिसरणातील मायक्रोबायोमच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन केले जाऊ शकते. तथापि, अलीकडेपर्यंत, ही संकल्पना केवळ मानवांमध्ये आणि काही प्रमाणात इतर पृष्ठवंशी प्राण्यांमध्ये वापरली जात होती [20, 21].
प्रस्तुत शोधनिबंधात, आम्ही ऑलाकोमिया अट्रा (Aulacomya atra) या दक्षिण प्रजातीच्या ccfDNA चे विश्लेषण करण्यासाठी LB पोटेन्शिअलचा वापर करतो. ही प्रजाती साधारणपणे उप-अंटार्क्टिक केर्गुएलन बेटांवर आढळते, जो ३५ दशलक्ष वर्षांपूर्वी ज्वालामुखीच्या उद्रेकातून तयार झालेल्या एका मोठ्या पठारावरील बेटांचा समूह आहे. एका इन विट्रो प्रायोगिक प्रणालीचा वापर करून, आम्हाला असे आढळले की समुद्राच्या पाण्यातील डीएनएचे तुकडे शिंपल्यांद्वारे त्वरीत घेतले जातात आणि हिमोलिम्फ विभागात प्रवेश करतात. शॉटगन सिक्वेन्सिंगने असे दाखवले आहे की शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फमधील ccfDNA मध्ये स्वतःच्या आणि परक्या स्रोतांचे डीएनए तुकडे असतात, ज्यात सहजीवी जीवाणू आणि थंड ज्वालामुखी सागरी किनारी परिसंस्थांसाठी वैशिष्ट्यपूर्ण असलेल्या बायोम्समधील डीएनए तुकड्यांचा समावेश आहे. हिमोलिम्फमधील ccfDNA मध्ये वेगवेगळ्या यजमान श्रेणींच्या विषाणूंपासून मिळवलेले व्हायरल सिक्वेन्सेस देखील असतात. आम्हाला अस्थिमय मासे, सी ॲनिमोन्स, शैवाल आणि कीटक यांसारख्या बहुपेशीय प्राण्यांचे डीएनए तुकडे देखील आढळले. निष्कर्षतः, आमचा अभ्यास हे सिद्ध करतो की सागरी परिसंस्थांमध्ये एक समृद्ध जीनोमिक भांडार निर्माण करण्यासाठी LB संकल्पना सागरी अपृष्ठवंशी प्राण्यांवर यशस्वीरित्या लागू केली जाऊ शकते.
डिसेंबर २०१८ मध्ये केर्गुएलन बेटांवरील पोर्ट-ओ-फ्रान्स (०४९°२१.२३५ द, ०७०°१३.४९० पू) येथील भरती-ओहोटीच्या खडकाळ किनाऱ्यावरून प्रौढ (५५-७० मिमी लांब) मायटिलस प्लॅटेन्सिस (एम. प्लॅटेन्सिस) आणि ऑलाकोमिया अट्रा (ए. अट्रा) गोळा करण्यात आले. इतर प्रौढ निळे शिंपले (मायटिलस प्रजाती) एका व्यावसायिक पुरवठादाराकडून (पीईआय मसेल किंग इंक., प्रिन्स एडवर्ड आयलंड, कॅनडा) मिळवण्यात आले आणि त्यांना ३२‰ कृत्रिम खाऱ्या पाण्याचे (कृत्रिम समुद्री मीठ रीफ क्रिस्टल, इन्स्टंट ओशन, व्हर्जिनिया, यूएसए) १०-२० लिटर असलेल्या, तापमान-नियंत्रित (४°से) आणि हवा खेळवलेल्या टाकीत ठेवण्यात आले. प्रत्येक प्रयोगासाठी, प्रत्येक शिंपल्याच्या कवचाची लांबी आणि वजन मोजण्यात आले.
या प्रोग्रामसाठी एक विनामूल्य ओपन ऍक्सेस प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध आहे (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). थोडक्यात, वर्णन केल्याप्रमाणे [22] ॲबडक्टर स्नायूंमधून LB हिमोलिम्फ गोळा करण्यात आले. 3 मिनिटांसाठी 1200×g वर सेंट्रीफ्यूगेशन करून हिमोलिम्फ स्वच्छ करण्यात आले, आणि सुपरनॅटंट वापरापर्यंत गोठवण्यात आले (-20°C). cfDNA च्या विलगीकरण आणि शुद्धीकरणासाठी, नमुने (1.5-2.0 मिली) वितळवून निर्मात्याच्या सूचनांनुसार न्यूक्लियोस्नॅप cfDNA किट (मॅचेरी-नागेल, बेथलेहेन, पीए) वापरून त्यावर प्रक्रिया करण्यात आली. पुढील विश्लेषणापर्यंत ccfDNA -80°C वर साठवण्यात आले. काही प्रयोगांमध्ये, QIAamp DNA इन्व्हेस्टिगेटर किट (QIAGEN, टोरोंटो, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून ccfDNA चे विलगीकरण आणि शुद्धीकरण करण्यात आले. शुद्ध केलेल्या DNA चे प्रमाण एका मानक पिकोग्रीन चाचणीचा वापर करून मोजण्यात आले. विलग केलेल्या ccfDNA च्या तुकड्यांच्या वितरणाचे विश्लेषण, हाय सेन्सिटिव्हिटी डीएनए किट वापरून अ‍ॅजिलेंट 2100 बायोअ‍ॅनालायझर (अ‍ॅजिलेंट टेक्नॉलॉजीज इंक., सांता क्लारा, सीए) द्वारे केशिका विद्युतविद्युत विश्लेषणाने (capillary electrophoresis) करण्यात आले. ही चाचणी उत्पादकाच्या सूचनांनुसार ccfDNA नमुन्याच्या 1 µl चा वापर करून करण्यात आली.
हिमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांच्या सिक्वेन्सिंगसाठी, जेनोम क्यूबेक (मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कॅनडा) ने इल्युमिना MiSeq PE75 किटच्या इल्युमिना डीएनए मिक्स किटचा वापर करून शॉटगन लायब्ररी तयार केल्या. एक स्टँडर्ड अडॅप्टर (BioO) वापरण्यात आला. कच्च्या डेटा फाइल्स NCBI सिक्वेन्स रीड आर्काइव्ह (SRR8924808 आणि SRR8924809) वर उपलब्ध आहेत. FastQC [23] वापरून मूलभूत रीडिंग गुणवत्तेचे मूल्यांकन केले गेले. अडॅप्टर्स आणि कमी गुणवत्तेच्या रीड्सना क्लिप करण्यासाठी ट्रिमोमॅटिक [24] वापरण्यात आले आहे. मिसमॅचेस टाळण्यासाठी [25], पेअर्ड एंड्स असलेल्या शॉटगन रीड्सना कमीतकमी 20 bp च्या ओव्हरलॅपसह लांब सिंगल रीड्समध्ये फ्लॅश मर्ज केले गेले. बायव्हाल्व्ह NCBI टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN द्वारे मर्ज केलेल्या रीड्सचे एनोटेशन केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी-गुंतागुंतीच्या सिक्वेन्सचे मास्किंग केले गेले. बायव्हाल्व्ह NCBI टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e−3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN द्वारे मर्ज केलेल्या रीड्सचे एनोटेशन केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी-गुंतागुंतीच्या सिक्वेन्सचे मास्किंग केले गेले. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатюх двустворчатюх 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]. NCBI बायव्हाल्व्ह टॅक्सोनॉमी डेटाबेस (e व्हॅल्यू < 1e-3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह पूल्ड रीड्सचे एनोटेशन केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी जटिलतेचे अनुक्रम मास्किंग केले गेले.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读买数据库（e 值< 1e-3进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合幨 分类 读湰]进行 复杂度 序列 的.。 . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчать данных (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [२६]. NCBI बायव्हाल्व्ह टॅक्सोनॉमिक डेटाबेस (e व्हॅल्यू <1e-3 आणि 90% होमोलॉजी) वापरून BLASTN सह पूल्ड रीड्सचे एनोटेशन केले गेले आणि DUST [26] वापरून कमी जटिलतेचे अनुक्रम मास्किंग केले गेले.रीड्सचे दोन गटांमध्ये विभाजन केले गेले: बायव्हाल्व्ह सिक्वेन्सशी संबंधित (येथे सेल्फ-रीड्स म्हटले आहे) आणि असंबंधित (नॉन-सेल्फ-रीड्स). कॉन्टिग्स तयार करण्यासाठी दोन्ही गटांना MEGAHIT वापरून स्वतंत्रपणे असेम्बल केले गेले [27]. दरम्यान, एलियन मायक्रोबायोम रीड्सचे टॅक्सोनॉमिक वितरण Kraken2 [28] वापरून वर्गीकृत केले गेले आणि Galaxy [29, 30] वर क्रोना पाय चार्टद्वारे आलेखाद्वारे दर्शविले गेले. आमच्या प्राथमिक प्रयोगांमधून, kmers-59 हे सर्वोत्तम kmers असल्याचे निश्चित केले गेले. नंतर अंतिम एनोटेशनसाठी BLASTN (बायव्हाल्व्ह NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) सह अलाइनमेंट करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. नंतर अंतिम एनोटेशनसाठी BLASTN (बायव्हाल्व्ह NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) सह अलाइनमेंट करून सेल्फ कॉन्टिग्स ओळखले गेले. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. नंतर अंतिम एनोटेशनसाठी BLASTN (NCBI बायव्हाल्व्ह डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) विरुद्ध जुळवून सेल्फ-कॉन्टिग्स ओळखण्यात आले.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). नंतर BLASTN (NCBI बायव्हाल्व्ह डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) विरुद्ध जुळवून अंतिम एनोटेशनसाठी सेल्फ-कॉन्टिग्स ओळखले गेले. त्याच वेळी, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सचे BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून एनोटेशन केले गेले. त्याच वेळी, नॉनसेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सचे BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू < 1e−10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून एनोटेशन केले गेले. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои). त्याचबरोबर, फॉरेन ग्रुप कॉन्टिग्सचे BLASTN (NT NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून एनोटेशन करण्यात आले.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt < NCBI, гомология 60%). त्याच वेळी, नॉन-सेल्फ ग्रुप कॉन्टिग्सचे BLASTN (nt NCBI डेटाबेस, e व्हॅल्यू <1e-10 आणि 60% होमोलॉजी) वापरून एनोटेशन केले गेले. nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील आयोजित केले गेले (e मूल्य < 1e−10 आणि 60% समरूपता). nr आणि RefSeq प्रोटीन NCBI डेटाबेस वापरून नॉनसेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील आयोजित केले गेले (e मूल्य < 1e−10 आणि 60% समरूपता). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). nr आणि RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील केले गेले (e मूल्य < 1e-10 आणि 60% समरूपता).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60%). nr आणि RefSeq NCBI प्रोटीन डेटाबेस वापरून नॉन-सेल्फ कॉन्टिग्सवर BLASTX देखील केले गेले (e मूल्य <1e-10 आणि 60% समरूपता).नॉन-सेल्फ-कॉन्टिग्सचे BLASTN आणि BLASTX पूल्स अंतिम कॉन्टिग्स दर्शवतात (पूरक फाइल पहा).
पीसीआरसाठी वापरलेले प्रायमर्स तक्ता S1 मध्ये सूचीबद्ध आहेत. ccfDNA लक्ष्य जनुकांचे प्रवर्धन करण्यासाठी Taq DNA पॉलिमरेज (बायो बेसिक कॅनडा, मार्खम, ओएन) वापरण्यात आले. खालील अभिक्रिया परिस्थिती वापरण्यात आली: ९५°C वर ३ मिनिटांसाठी डीनॅचुरेशन, ९५°C वर १ मिनिट, १ मिनिटासाठी सेट ॲनीलिंग तापमान, ७२°C वर १ मिनिटासाठी इलॉन्गेशन, ३५ सायकल्स, आणि शेवटी १० मिनिटांच्या आत ७२°C. पीसीआर उत्पादने ९५ V वर SYBRTM सेफ डीएनए जेल स्टेन (इन्व्हिट्रोजन, बर्लिंग्टन, ओएन, कॅनडा) असलेल्या ॲगारोज जेलमध्ये (१.५%) इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारे वेगळी करण्यात आली.
शिंपले (मायटिलस प्रजाती) ५०० मिली ऑक्सिजनयुक्त सागरी पाण्यात (३२ पीएसयू) ४°C तापमानावर २४ तासांसाठी अनुकूलित करण्यात आले. मानवी गॅलेक्टिन-७ सीडीएनए अनुक्रम (एनसीबीआय ॲक्सेशन क्रमांक L07769) एन्कोड करणारा इन्सर्ट असलेले प्लास्मिड डीएनए १९० μg/μl च्या अंतिम सांद्रतेवर कुपीमध्ये टाकण्यात आले. डीएनए न टाकता त्याच परिस्थितीत उबवलेले शिंपले नियंत्रक म्हणून वापरण्यात आले. तिसऱ्या नियंत्रक टाकीमध्ये शिंपल्यांशिवाय डीएनए होता. सागरी पाण्यातील डीएनएच्या गुणवत्तेचे निरीक्षण करण्यासाठी, प्रत्येक टाकीतून सूचित वेळेनुसार सागरी पाण्याचे नमुने (२० μl; तीन पुनरावृत्ती) घेण्यात आले. प्लास्मिड डीएनएच्या शोधक्षमतेसाठी, एलबी शिंपले सूचित वेळेनुसार काढण्यात आले आणि त्यांचे क्यूपीसीआर (qPCR) व डीडीपीसीआर (ddPCR) द्वारे विश्लेषण करण्यात आले. सागरी पाण्यातील क्षारांचे प्रमाण जास्त असल्यामुळे, सर्व पीसीआर चाचण्यांपूर्वी अलिक्वॉट्स पीसीआर दर्जाच्या पाण्यात (१:१०) विरल करण्यात आले.
बायोराड QX200 प्रोटोकॉल (मिसिसागा, ओंटारियो, कॅनडा) वापरून डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (ddPCR) करण्यात आले. इष्टतम तापमान निश्चित करण्यासाठी तापमान प्रोफाइलचा वापर करा (तक्ता S1). QX200 ड्रॉप जनरेटर (बायोराड) वापरून थेंब तयार केले गेले. ddPCR खालीलप्रमाणे पार पाडण्यात आले: ५ मिनिटांसाठी ९५°C, त्यानंतर ५० आवर्तने (cycles) ज्यात ३० सेकंदांसाठी ९५°C आणि १ मिनिटासाठी दिलेले ॲनीलिंग तापमान, ३० सेकंदांसाठी ७२°C, ५ मिनिटांसाठी ४°C आणि ५ मिनिटांच्या आत ९०°C यांचा समावेश होता. QX200 ड्रॉप रीडर (बायोराड) वापरून थेंबांची संख्या आणि सकारात्मक प्रतिक्रिया (प्रतींची संख्या/µl) मोजण्यात आल्या. १०,००० पेक्षा कमी थेंब असलेले नमुने नाकारण्यात आले. प्रत्येक वेळी ddPCR चालवताना पॅटर्न नियंत्रण केले गेले नाही.
रोटर-जीन® 3000 (कॉर्बेट रिसर्च, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) आणि LGALS7 विशिष्ट प्राइमर्स वापरून qPCR केले गेले. सर्व क्वांटिटेटिव्ह PCRs क्वांटीफास्ट SYBR ग्रीन PCR किट (QIAGEN) वापरून 20 µl मध्ये केले गेले. qPCR ची सुरुवात 95°C वर 15 मिनिटांच्या इनक्यूबेशनने झाली, त्यानंतर 95°C वर 10 सेकंदांसाठी आणि 60°C वर 60 सेकंदांसाठी 40 सायकल्स आणि एकदा डेटा संकलन केले गेले. qPCR च्या शेवटी 95°C वर 5 सेकंदांसाठी, 65°C वर 60 सेकंदांसाठी आणि 97°C वर सलग मोजमाप वापरून मेल्टिंग कर्व्ह तयार केले गेले. कंट्रोल सॅम्पल्स वगळता, प्रत्येक qPCR तीन वेळा केले गेले.
शिंपले त्यांच्या उच्च गाळण क्षमतेसाठी ओळखले जात असल्याने, आम्ही सर्वप्रथम हे तपासले की ते समुद्राच्या पाण्यात असलेले डीएनएचे तुकडे गाळून टिकवून ठेवू शकतात का. हे तुकडे त्यांच्या अर्ध-खुल्या लसिका प्रणालीमध्ये जमा होतात की नाही, यातही आम्हाला रस होता. निळ्या शिंपल्यांच्या टाक्यांमध्ये टाकलेल्या विद्राव्य डीएनएच्या तुकड्यांचे काय होते याचा मागोवा घेऊन आम्ही हा प्रश्न प्रायोगिकरित्या सोडवला. डीएनएच्या तुकड्यांचा मागोवा घेणे सोपे व्हावे यासाठी, आम्ही मानवी गॅलेक्टिन-७ जनुक असलेले बाह्य (स्व-नसलेले) प्लास्मिड डीएनए वापरले. डीडीपीसीआर (ddPCR) समुद्राच्या पाण्यात आणि शिंपल्यांमध्ये प्लास्मिड डीएनएच्या तुकड्यांचा मागोवा घेते. आमच्या निष्कर्षांनुसार, शिंपल्यांच्या अनुपस्थितीत समुद्राच्या पाण्यातील डीएनएच्या तुकड्यांचे प्रमाण कालांतराने (७ दिवसांपर्यंत) तुलनेने स्थिर राहिले, तर शिंपल्यांच्या उपस्थितीत हे प्रमाण ८ तासांच्या आत जवळजवळ पूर्णपणे नाहीसे झाले (आकृती १अ,ब). बाह्य डीएनएचे तुकडे झडपेतील द्रव आणि हिमोलिम्फमध्ये १५ मिनिटांच्या आत सहजपणे आढळले (आकृती १क). संपर्कात आल्यानंतर ४ तासांपर्यंतही हे तुकडे शोधता येत होते. डीएनए तुकड्यांच्या संदर्भातील ही गाळण्याची क्रिया जीवाणू आणि शैवाल यांच्या गाळण्याच्या क्रियेशी तुलना करण्याजोगी आहे [31]. या परिणामांवरून असे सूचित होते की शिंपले त्यांच्या द्रव भागांमध्ये बाह्य डीएनए गाळू आणि जमा करू शकतात.
शिंपल्यांच्या उपस्थितीत (A) किंवा अनुपस्थितीत (B) समुद्राच्या पाण्यात प्लास्मिड डीएनएची सापेक्ष सांद्रता, जी ddPCR द्वारे मोजली गेली. A मध्ये, निकाल टक्केवारीत दर्शविले आहेत, ज्यामध्ये चौकटींच्या सीमा ७५ वे आणि २५ वे पर्सेन्टाइल दर्शवतात. जुळवलेला लॉगरिदमिक वक्र लाल रंगात दर्शविला आहे, आणि राखाडी रंगात छायांकित केलेला भाग ९५% विश्वासार्हता अंतराल दर्शवतो. B मध्ये, लाल रेषा सरासरी दर्शवते आणि निळी रेषा सांद्रतेसाठी ९५% विश्वासार्हता अंतराल दर्शवते. C प्लास्मिड डीएनए टाकल्यानंतर वेगवेगळ्या वेळी शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फ आणि व्हॅल्व्ह्युलर द्रवामध्ये प्लास्मिड डीएनएचे संचयन. निकाल प्रति मिली (±SE) मध्ये आढळलेल्या निरपेक्ष प्रती म्हणून सादर केले आहेत.
पुढे, आम्ही मर्यादित मानवी प्रभाव असलेल्या दुर्गम बेटांच्या समूहातील, केर्गुएलन बेटांवरील शिंपल्यांच्या थरांमधून गोळा केलेल्या शिंपल्यांमधील ccfDNA च्या उगमाचा तपास केला. या उद्देशासाठी, मानवी cccDNA शुद्ध करण्यासाठी सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या पद्धती [32, 33] वापरून शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फमधून cccDNA वेगळे करून शुद्ध केले गेले. आम्हाला आढळले की शिंपल्यांमधील हिमोलिम्फ ccfDNA ची सरासरी सांद्रता कमी मायक्रोग्राम प्रति मिली हिमोलिम्फ श्रेणीत आहे (तक्ता S2, पूरक माहिती पहा). सांद्रतेची ही श्रेणी निरोगी लोकांपेक्षा (कमी नॅनोग्राम प्रति मिलीलीटर) खूप मोठी आहे, परंतु क्वचित प्रसंगी, कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये, ccfDNA ची पातळी अनेक मायक्रोग्राम प्रति मिलीलीटरपर्यंत पोहोचू शकते [34, 35]. हिमोलिम्फ ccfDNA च्या आकार वितरणाच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की हे तुकडे आकारात खूप भिन्न आहेत, जे 1000 bp ते 1000 bp पासून 5000 bp पर्यंत आहेत (आकृती 2). ccfDNA [36] सह कमी एकाग्रतेच्या डीएनए नमुन्यांमधून जीनोमिक डीएनए जलदपणे वेगळे करण्यासाठी आणि शुद्ध करण्यासाठी न्यायवैद्यक विज्ञानात सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या पद्धती, सिलिका-आधारित QIAamp इन्व्हेस्टिगेटर किट वापरून असेच परिणाम प्राप्त झाले.
शिंपल्याच्या हिमोलिम्फमधील ccfDNA चा प्रातिनिधिक इलेक्ट्रोफोरेग्राम. न्यूक्लियोस्नॅप प्लाझ्मा किट (वर) आणि QIAamp DNA इन्व्हेस्टिगेटर किट वापरून काढलेले. B शिंपल्यांमधील हिमोलिम्फ ccfDNA सांद्रतेचे (±SE) वितरण दर्शवणारा व्हायोलिन प्लॉट. काळ्या आणि लाल रेषा अनुक्रमे मध्यक आणि पहिला व तिसरा चतुर्थक दर्शवतात.
मानव आणि प्राइमेट्समधील अंदाजे १% ccfDNA चा स्रोत बाह्य असतो [२१, ३७]. द्विकपाटी प्राण्यांची अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली, सूक्ष्मजीवांनी समृद्ध सागरी पाणी आणि शिंपल्यांच्या ccfDNA च्या आकाराचे वितरण लक्षात घेता, आम्ही असा अंदाज लावला की शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फमधील ccfDNA मध्ये सूक्ष्मजैविक DNA चा एक समृद्ध आणि वैविध्यपूर्ण साठा असू शकतो. या अंदाजाची चाचणी घेण्यासाठी, आम्ही केर्गुएलन बेटांवरून गोळा केलेल्या ऑलाकोमिया अट्राच्या नमुन्यांमधील हिमोलिम्फ ccfDNA चे अनुक्रमण केले, ज्यातून १० दशलक्षाहून अधिक रीड्स मिळाले, त्यापैकी ९७.६% गुणवत्ता नियंत्रणात उत्तीर्ण झाले. त्यानंतर BLASTN आणि NCBI द्विकपाटी डेटाबेस वापरून या रीड्सचे स्व-स्रोत आणि पर-स्रोत यानुसार वर्गीकरण करण्यात आले (आकृती S1, पूरक माहिती).
मानवांमध्ये, न्यूक्लियर आणि मायटोकाँड्रियल डीएनए दोन्ही रक्तप्रवाहात सोडले जाऊ शकतात [38]. तथापि, प्रस्तुत अभ्यासात, शिंपल्यांच्या न्यूक्लियर जीनोमिक डीएनएचे तपशीलवार वर्णन करणे शक्य झाले नाही, कारण ए. अट्रा जीनोमचे अनुक्रमण किंवा वर्णन केलेले नाही. तथापि, आम्ही बायव्हाल्व्ह लायब्ररीचा वापर करून आमच्या स्वतःच्या मूळचे अनेक ccfDNA तुकडे ओळखण्यास सक्षम झालो (आकृती S2, पूरक माहिती). ज्या ए. अट्रा जनुकांच्या अनुक्रमणाचे काम झाले होते, त्यांचे निर्देशित पीसीआर प्रवर्धन करून आम्ही आमच्या स्वतःच्या मूळच्या डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी केली (आकृती 3). त्याचप्रमाणे, ए. अट्राचा मायटोकाँड्रियल जीनोम सार्वजनिक डेटाबेसमध्ये उपलब्ध असल्याने, ए. अट्राच्या हिमोलिम्फमध्ये मायटोकाँड्रियल ccfDNA तुकड्यांच्या उपस्थितीचा पुरावा मिळू शकतो. पीसीआर प्रवर्धनाद्वारे मायटोकाँड्रियल डीएनए तुकड्यांच्या उपस्थितीची पुष्टी करण्यात आली (आकृती 3).
पीसीआरद्वारे प्रवर्धित केलेल्या ए. अट्रा (लाल ठिपके – स्टॉक क्रमांक: SRX5705969) आणि एम. प्लॅटेन्सिस (निळे ठिपके – स्टॉक क्रमांक: SRX5705968) यांच्या हिमोलिम्फमध्ये विविध मायटोकाँड्रियल जनुके उपस्थित होती. आकृती ब्रेटन इत्यादी, २०११ मधून रूपांतरित. ब. ए. अट्राच्या हिमोलिम्फ सुपरनॅटंटचे प्रवर्धन. एफटीए पेपरवर साठवलेले. पीसीआर मिक्स असलेल्या पीसीआर ट्यूबमध्ये थेट टाकण्यासाठी ३ मिमी पंच वापरा.
समुद्राच्या पाण्यात सूक्ष्मजीवांचे प्रमाण मुबलक असल्याने, आम्ही सुरुवातीला हिमोलिम्फमधील सूक्ष्मजैविक डीएनए अनुक्रमांच्या वैशिष्ट्यीकरणावर लक्ष केंद्रित केले. हे करण्यासाठी, आम्ही दोन वेगवेगळ्या पद्धती वापरल्या. पहिल्या पद्धतीत Kraken2 चा वापर केला, जो एक अल्गोरिदम-आधारित अनुक्रम वर्गीकरण प्रोग्राम आहे आणि BLAST व इतर साधनांच्या तुलनेत सूक्ष्मजैविक अनुक्रम ओळखू शकतो [28]. 6719 पेक्षा जास्त रीड्स जिवाणूंच्या मूळचे असल्याचे निश्चित झाले, तर 124 आणि 64 अनुक्रमे आर्किया आणि विषाणूंचे होते (आकृती 4). सर्वात मुबलक प्रमाणात आढळणारे जिवाणू डीएनए तुकडे फर्मिक्युट्स (46%), प्रोटिओबॅक्टेरिया (27%), आणि बॅक्टेरॉइडेट्स (17%) होते (आकृती 4a). हे वितरण सागरी निळ्या शिंपल्याच्या मायक्रोबायोमच्या मागील अभ्यासांशी सुसंगत आहे [39, 40]. गॅमाप्रोटिओबॅक्टेरिया हा प्रोटिओबॅक्टेरियाचा मुख्य वर्ग होता (44%), ज्यामध्ये अनेक व्हायब्रिओनेल्सचा समावेश होता (आकृती 4b). ddPCR पद्धतीने A. atra च्या हिमोलिम्फमधील ccfDNA मध्ये Vibrio DNA तुकड्यांची उपस्थिती निश्चित केली (आकृती 4c) [41]. ccfDNA च्या जिवाणूजन्य उगमाबद्दल अधिक माहिती मिळवण्यासाठी, एक अतिरिक्त दृष्टिकोन अवलंबला गेला (आकृती S2, पूरक माहिती). या प्रकरणात, ओव्हरलॅप झालेले रीड्स पेअर्ड-एंड रीड्स म्हणून असेंबल केले गेले आणि BLASTN व 1e−3 च्या e व्हॅल्यू आणि >90% होमोलॉजीच्या कटऑफचा वापर करून त्यांचे स्व (बायव्हाल्व्ह) किंवा परके मूळ म्हणून वर्गीकरण केले गेले. या प्रकरणात, ओव्हरलॅप झालेले रीड्स पेअर्ड-एंड रीड्स म्हणून असेंबल केले गेले आणि BLASTN व 1e−3 च्या e व्हॅल्यू आणि >90% होमोलॉजीच्या कटऑफचा वापर करून त्यांचे स्व (बायव्हाल्व्ह) किंवा परके मूळ म्हणून वर्गीकरण केले गेले. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с %> гомой. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर्ड-एंडेड रीड्स म्हणून गोळा केले गेले आणि BLASTN आणि 1e-3 च्या e व्हॅल्यू आणि >90% होमोलॉजीच्या कटऑफचा वापर करून नेटिव्ह (बायव्हाल्व्ह) किंवा नॉन-ओरिजिनल म्हणून वर्गीकृत केले गेले.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 使用 ब्लास्टन 和 和1> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. या प्रकरणात, ओव्हरलॅपिंग रीड्स पेअर्ड-एंडेड रीड्स म्हणून गोळा केले गेले आणि e BLASTN आणि 1e-3 व्हॅल्यूज आणि >90% च्या होमोलॉजी थ्रेशोल्डचा वापर करून स्वतःचे (बायव्हाल्व्ह) किंवा गैर-मूळ म्हणून वर्गीकृत केले गेले.ए. अट्रा जीनोमचे अनुक्रमण अद्याप झालेले नसल्यामुळे, आम्ही मेगाहिट नेक्स्ट जनरेशन सिक्वेन्सिंग (NGS) असेम्बलरची 'डी नोवो असेम्ब्ली' पद्धत वापरली. एकूण १४७,१८८ कॉन्टिग्स मूळचे अवलंबून (बायव्हाल्व्ह) म्हणून ओळखले गेले आहेत. त्यानंतर, ब्लास्टएन (BLASTN) आणि ब्लास्टएक्स (BLASTX) वापरून १e-१० च्या ई-व्हॅल्यूसह या कॉन्टिग्सचे एक्सप्लोडिंग करण्यात आले. या पद्धतीमुळे आम्हाला ए. अट्रा ccfDNA मध्ये उपस्थित असलेले ४८२ नॉन-बायव्हाल्व्ह तुकडे ओळखता आले. यापैकी निम्म्याहून अधिक (५७%) डीएनए तुकडे जीवाणूंपासून, प्रामुख्याने कल्ल्यांवरील सहजीवी जीवाणूंपासून, ज्यात सल्फोट्रॉफिक सहजीवी जीवाणूंचा समावेश आहे, आणि कल्ल्यांवरील सहजीवी जीवाणू सोलेम्या वेलम (Solemya velum) पासून प्राप्त झाले होते (आकृती ५).
प्रकार स्तरावरील सापेक्ष विपुलता. B दोन मुख्य संघांची (फर्मिक्युट्स आणि प्रोटिओबॅक्टेरिया) सूक्ष्मजैविक विविधता. ddPCR चे प्रातिनिधिक प्रवर्धन C व्हिब्रिओ प्रजाती. A. तीन अट्रा हिमोलिम्फमधील 16S rRNA जनुकाचे तुकडे (निळे).
एकूण ४८२ गोळा केलेल्या कॉन्टिग्सचे विश्लेषण करण्यात आले. मेटाजेनोमिक कॉन्टिग ॲनोटेशन्सच्या वर्गीकरणशास्त्रीय वितरणाचे सामान्य प्रोफाइल (प्रोकॅरियोट्स आणि युकॅरियोट्स). B BLASTN आणि BLASTX द्वारे ओळखलेल्या बॅक्टेरियल डीएनए तुकड्यांचे तपशीलवार वितरण.
क्रॅकेन२ (Kraken2) विश्लेषणातून असेही दिसून आले की शिंपल्यांच्या ccfDNA मध्ये आर्किअल डीएनएचे तुकडे होते, ज्यात युरीआर्किओटा (६५%), क्रेनआर्किओटा (२४%), आणि थॉरमार्किओटा (११%) यांच्या डीएनए तुकड्यांचा समावेश होता (आकृती ६अ). कॅलिफोर्नियातील शिंपल्यांच्या सूक्ष्मजीव समुदायात पूर्वी आढळलेल्या युरीआर्किओटा आणि क्रेनआर्किओटापासून तयार झालेल्या डीएनए तुकड्यांची उपस्थिती आश्चर्यकारक नसावी [४२]. जरी युरीआर्किओटा अनेकदा अत्यंत प्रतिकूल परिस्थितीशी संबंधित असले तरी, आता हे ओळखले जाते की युरीआर्किओटा आणि क्रेनआर्किओटा दोन्ही सागरी क्रायोजेनिक वातावरणातील सर्वात सामान्य प्रोकॅरिओट्सपैकी आहेत [४३, ४४]. केर्गुएलन पठारावरील तळाच्या गळतीतून मोठ्या प्रमाणात मिथेन गळती झाल्याच्या अलीकडील अहवालांमुळे [४५] आणि केर्गुएलन बेटांच्या किनाऱ्याजवळ सूक्ष्मजैविक मिथेन उत्पादनाचे निरीक्षण केल्यामुळे [४६], शिंपल्यांमध्ये मिथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवांची उपस्थिती आश्चर्यकारक नाही.
त्यानंतर आमचे लक्ष डीएनए विषाणूंच्या नमुन्यांकडे वळले. आमच्या माहितीनुसार, शिंपल्यांमधील विषाणूंच्या प्रमाणाचा हा पहिलाच लक्ष्येतर अभ्यास आहे. अपेक्षेप्रमाणे, आम्हाला बॅक्टेरिओफेजेसचे (कॉडोविरालेस) डीएनए तुकडे आढळले (आकृती ६ब). तथापि, सर्वात सामान्य विषाणूजन्य डीएनए हा न्यूक्लियोसायटोव्हायरसच्या फायलममधून येतो, ज्याला न्यूक्लियर सायटोप्लाज्मिक लार्ज डीएनए व्हायरस (NCLDV) असेही ओळखले जाते, आणि ज्याचा जीनोम कोणत्याही विषाणूपेक्षा सर्वात मोठा आहे. या फायलममध्ये, बहुतेक डीएनए अनुक्रम मिमिमिडोविरिडे (५८%) आणि पॉक्सविरिडे (२१%) या कुळांचे आहेत, ज्यांचे नैसर्गिक यजमान पृष्ठवंशीय आणि संधिपाद प्राणी आहेत, तर या डीएनए अनुक्रमांचा एक छोटासा भाग ज्ञात विषाणूजन्य शैवालांचा आहे. हे शैवाल सागरी युकेरियोटिक शैवालांना संक्रमित करतात. हे अनुक्रम पॅन्डोरा विषाणूपासून देखील मिळवले गेले, जो कोणत्याही ज्ञात विषाणू प्रजातींपैकी सर्वात मोठ्या जीनोम आकाराचा महाकाय विषाणू आहे. मनोरंजक म्हणजे, हिमोलिम्फ ccfDNA अनुक्रमणाद्वारे निश्चित केल्यानुसार, विषाणूने संक्रमित झालेल्या यजमानांची श्रेणी तुलनेने मोठी होती (आकृती S3, पूरक माहिती). यामध्ये बॅकुलोविरिडे आणि इरिडोविरिडे सारख्या कीटकांना संक्रमित करणारे विषाणू, तसेच अमिबा, शैवाल आणि पृष्ठवंशी प्राण्यांना संक्रमित करणारे विषाणू समाविष्ट आहेत. आम्हाला पिथोव्हायरस सायबेरिकम जीनोमशी जुळणारे अनुक्रम देखील आढळले. पिटोव्हायरस (ज्यांना "झोम्बी विषाणू" म्हणूनही ओळखले जाते) सर्वप्रथम सायबेरियातील ३०,००० वर्षे जुन्या पर्माफ्रॉस्टमधून वेगळे केले गेले होते [47]. अशाप्रकारे, आमचे निष्कर्ष पूर्वीच्या अहवालांशी सुसंगत आहेत, जे दर्शवतात की या विषाणूंच्या सर्व आधुनिक प्रजाती नामशेष झालेल्या नाहीत [48] आणि हे विषाणू दुर्गम उपआर्क्टिक सागरी परिसंस्थांमध्ये उपस्थित असू शकतात.
शेवटी, आम्ही इतर बहुपेशीय प्राण्यांचे डीएनए तुकडे शोधू शकतो का हे तपासले. nt, nr आणि RefSeq लायब्ररी (जीनोमिक आणि प्रथिने) वापरून BLASTN आणि BLASTX द्वारे एकूण ४८२ परकीय कॉन्टिग्स ओळखले गेले. आमच्या निष्कर्षांवरून असे दिसून येते की बहुपेशीय प्राण्यांच्या ccfDNA च्या परकीय तुकड्यांमध्ये हाडांच्या डीएनएचे प्राबल्य आहे (आकृती ५). कीटक आणि इतर प्रजातींचे डीएनए तुकडे देखील आढळले आहेत. डीएनए तुकड्यांचा एक तुलनेने मोठा भाग ओळखला गेला नाही, कदाचित भूचर प्रजातींच्या तुलनेत जीनोमिक डेटाबेसमध्ये मोठ्या संख्येने सागरी प्रजातींचे कमी प्रतिनिधित्व असल्यामुळे [४९].
प्रस्तुत शोधनिबंधात, आम्ही शिंपल्यांवर एलबी संकल्पना लागू करतो आणि असा युक्तिवाद करतो की हिमोलिम्फमधील ccfDNA चे शॉट सिक्वेन्सिंग सागरी किनारी परिसंस्थांच्या रचनेबद्दल अंतर्दृष्टी देऊ शकते. विशेषतः, आम्हाला असे आढळले की १) शिंपल्यांच्या हिमोलिम्फमध्ये तुलनेने मोठ्या (~१-५ kb) फिरणाऱ्या डीएनए तुकड्यांचे प्रमाण (मायक्रोग्राम पातळीवर) तुलनेने जास्त असते; २) हे डीएनए तुकडे स्वतंत्र आणि गैर-स्वतंत्र दोन्ही प्रकारचे असतात; ३) या डीएनए तुकड्यांच्या बाह्य स्रोतांमध्ये, आम्हाला जिवाणू, आर्कियल आणि विषाणूंचा डीएनए, तसेच इतर बहुपेशीय प्राण्यांचा डीएनए आढळला; ४) या बाह्य ccfDNA तुकड्यांचा हिमोलिम्फमध्ये संचय वेगाने होतो आणि तो शिंपल्यांच्या अंतर्गत गाळण क्रियेत योगदान देतो. निष्कर्षतः, आमचा अभ्यास हे सिद्ध करतो की एलबी संकल्पना, जी आतापर्यंत प्रामुख्याने जैववैद्यकशास्त्राच्या क्षेत्रात लागू केली गेली आहे, तिच्यामध्ये ज्ञानाचा एक समृद्ध परंतु अज्ञात स्रोत दडलेला आहे, ज्याचा उपयोग सूचक प्रजाती आणि त्यांचे पर्यावरण यांच्यातील परस्परसंबंध अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी केला जाऊ शकतो.
प्राइमेट्स व्यतिरिक्त, उंदीर, कुत्रे, मांजरे आणि घोडे यांसारख्या सस्तन प्राण्यांमध्ये ccfDNA वेगळे केल्याचे नोंदवले गेले आहे [50, 51, 52]. तथापि, आमच्या माहितीनुसार, खुली रक्ताभिसरण प्रणाली असलेल्या सागरी प्रजातींमध्ये ccfDNA शोधणे आणि त्याचे अनुक्रमण करणे याबद्दलचा आमचा अभ्यास हा पहिलाच आहे. शिंपल्यांचे हे शारीरिक वैशिष्ट्य आणि गाळण्याची क्षमता, इतर प्रजातींच्या तुलनेत रक्ताभिसरणातील डीएनए तुकड्यांच्या वेगवेगळ्या आकार वैशिष्ट्यांचे, किमान काही प्रमाणात, स्पष्टीकरण देऊ शकते. मानवांमध्ये, रक्तात फिरणारे बहुतेक डीएनए तुकडे 150 ते 200 bp आकाराचे लहान तुकडे असतात, ज्यामध्ये 167 bp चा कमाल आकार असतो [34, 53]. डीएनए तुकड्यांचा एक लहान पण महत्त्वपूर्ण भाग 300 ते 500 bp आकाराचा असतो आणि सुमारे 5% तुकडे 900 bp पेक्षा जास्त लांब असतात [54]. या आकार वितरणाचे कारण असे आहे की प्लाझ्मामधील ccfDNA चा मुख्य स्रोत पेशी मृत्यूमुळे निर्माण होतो, जो निरोगी व्यक्तींमध्ये रक्ताभिसरण करणाऱ्या रक्तपेशींच्या (हेमॅटोपोएटिक सेल्स) पेशी मृत्यूमुळे किंवा नेक्रोसिसमुळे, किंवा कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये ट्यूमर पेशींच्या एपोप्टोसिसमुळे (ज्याला सर्क्युलेटिंग ट्यूमर डीएनए, ctDNA म्हणतात) होतो. शिंपल्यांमध्ये आम्हाला आढळलेल्या हिमोलिम्फ ccfDNA चे आकार वितरण १००० ते ५००० bp पर्यंत होते, जे सूचित करते की शिंपल्यांच्या ccfDNA चा उगम वेगळा आहे. ही एक तर्कसंगत गृहीतक आहे, कारण शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली रक्तवहिन्यांची प्रणाली असते आणि ते सूक्ष्मजीवांच्या जीनोमिक डीएनएच्या उच्च सांद्रता असलेल्या सागरी जलीय वातावरणात राहतात. खरं तर, बाह्य डीएनए वापरून केलेल्या आमच्या प्रयोगशाळेतील प्रयोगांनी हे दाखवून दिले आहे की शिंपले समुद्राच्या पाण्यात डीएनएचे तुकडे जमा करतात, जे पेशींमध्ये शोषले गेल्यानंतर आणि/किंवा बाहेर टाकल्यानंतर आणि/किंवा विविध संरचनांमध्ये साठवले गेल्यानंतर किमान काही तासांनी विघटित होतात. पेशींची (प्रोकॅरियोटिक आणि युकॅरियोटिक दोन्ही) दुर्मिळता लक्षात घेता, इंट्राव्हाल्व्ह्युलर कंपार्टमेंट्सच्या वापरामुळे स्व-स्रोत तसेच बाह्य स्रोतांकडून येणाऱ्या ccfDNA चे प्रमाण कमी होईल. बायव्हाल्व्हच्या जन्मजात प्रतिकारशक्तीचे महत्त्व आणि रक्ताभिसरणातील फॅगोसाइट्सची मोठी संख्या लक्षात घेता, आम्ही पुढे असा तर्क मांडला की, सूक्ष्मजीव आणि/किंवा पेशीय अवशेषांचे सेवन केल्यावर बाह्य डीएनए जमा करणाऱ्या रक्ताभिसरणातील फॅगोसाइट्समध्ये बाह्य ccfDNA सुद्धा समृद्ध होते. एकंदरीत, आमचे निष्कर्ष दर्शवतात की बायव्हाल्व्हच्या हिमोलिम्फमधील ccfDNA हे आण्विक माहितीचे एक अद्वितीय भांडार आहे आणि ते 'सेंटिनेल प्रजाती' म्हणून त्यांच्या स्थानाला बळकटी देते.
आमच्या डेटावरून असे दिसून येते की, जीवाणूंपासून मिळवलेल्या हिमोलिम्फ ccfDNA तुकड्यांचे अनुक्रमण आणि विश्लेषण हे यजमान जीवाणू समूह आणि सभोवतालच्या सागरी परिसंस्थेमध्ये उपस्थित असलेल्या जीवाणूंबद्दल महत्त्वाची माहिती देऊ शकते. शॉट सिक्वेन्सिंग तंत्राने A. atra च्या कल्ल्यांमधील सहजीवी जीवाणूंचे अनुक्रम उघड केले आहेत, जे पारंपरिक 16S rRNA ओळख पद्धती वापरल्यास, अंशतः संदर्भ लायब्ररीच्या पक्षपातामुळे लक्षात आले नसते. खरं तर, केर्गुएलन येथील त्याच शिंपल्यांच्या थरातून M. platensis मधून गोळा केलेल्या LB डेटाच्या आमच्या वापरावरून असे दिसून आले की, दोन्ही शिंपल्यांच्या प्रजातींसाठी कल्ल्यांशी संबंधित जीवाणू सहजीवकांची रचना सारखीच होती (आकृती S4, पूरक माहिती). दोन अनुवांशिकदृष्ट्या भिन्न शिंपल्यांमधील हे साम्य केर्गुएलनच्या थंड, गंधकयुक्त आणि ज्वालामुखीय ठेवांमधील जीवाणू समुदायांच्या रचनेचे प्रतिबिंब असू शकते [55, 56, 57, 58]. पोर्ट-ओ-फ्रान्सच्या किनाऱ्यासारख्या, जैविक घुसळण झालेल्या किनारी भागांतून शिंपले काढताना सल्फर-कमी करणाऱ्या सूक्ष्मजीवांचे उच्च प्रमाण आढळून आले आहे [59]. दुसरी शक्यता अशी आहे की शिंपल्यांमधील सहजीवी जीवाणूसमूह क्षैतिज प्रसारणामुळे प्रभावित होऊ शकतो [60, 61]. सागरी पर्यावरण, समुद्राच्या तळाचा पृष्ठभाग आणि शिंपल्यांमधील सहजीवी जीवाणूंची रचना यांच्यातील सहसंबंध निश्चित करण्यासाठी अधिक संशोधनाची आवश्यकता आहे. हे अभ्यास सध्या सुरू आहेत.
सागरी किनारी परिसंस्थांमधील जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी शिंपल्यांच्या ccfDNA चा वापर करण्याच्या अनेक फायद्यांपैकी काही फायदे म्हणजे, हिमोलिम्फ ccfDNA ची लांबी आणि प्रमाण, त्याच्या शुद्धीकरणाची सुलभता आणि जलद शॉटगन सिक्वेन्सिंगसाठी आवश्यक असलेली उच्च गुणवत्ता. ही पद्धत दिलेल्या परिसंस्थेतील विषाणू समुदायांचे (व्हायरोम्स) वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी विशेषतः प्रभावी आहे [62, 63]. जीवाणू, आर्किया आणि युकेरियोट्सच्या विपरीत, विषाणूंच्या जीनोममध्ये 16S सिक्वेन्ससारखे फायलोजेनेटिकली संरक्षित जनुके नसतात. आमचे निष्कर्ष सूचित करतात की शिंपल्यांसारख्या सूचक प्रजातींमधून घेतलेल्या लिक्विड बायोप्सीचा उपयोग, किनारी सागरी परिसंस्थांमध्ये सामान्यतः वास्तव्य करणाऱ्या यजमानांना संक्रमित करणाऱ्या ccfDNA विषाणूंच्या तुकड्यांची तुलनेने मोठी संख्या ओळखण्यासाठी केला जाऊ शकतो. यामध्ये प्रोटोझोआ, आर्थ्रोपॉड्स, कीटक, वनस्पती आणि जीवाणूजन्य विषाणू (उदा., बॅक्टेरिओफेजेस) यांना संक्रमित करणाऱ्या विषाणूंचा समावेश आहे. केर्गुएलन येथील त्याच शिंपल्यांच्या थरातून गोळा केलेल्या निळ्या शिंपल्यांच्या (M. platensis) हिमोलिम्फ ccfDNA व्हायरोमची तपासणी केली असता, आम्हाला असेच वितरण आढळले (तक्ता S2, पूरक माहिती). ccfDNA चे शॉटगन सिक्वेन्सिंग ही खरोखरच मानव किंवा इतर प्रजातींच्या व्हायरोमच्या अभ्यासात गती मिळवणारी एक नवीन पद्धत आहे [21, 37, 64]. ही पद्धत विशेषतः दुहेरी-सूत्र असलेल्या डीएनए विषाणूंच्या अभ्यासासाठी उपयुक्त आहे, कारण बाल्टिमोरमधील विषाणूंचा सर्वात वैविध्यपूर्ण आणि व्यापक वर्ग दर्शविणाऱ्या सर्व दुहेरी-सूत्र असलेल्या डीएनए विषाणूंमध्ये कोणतेही एक जनुक संरक्षित नसते [65]. जरी यापैकी बहुतेक विषाणू अवर्गीकृत असले आणि त्यात विषाणूंच्या जगाच्या पूर्णपणे अज्ञात भागातील विषाणूंचा समावेश असू शकतो [66], तरी आम्हाला आढळले की A. atra आणि M. platensis या शिंपल्यांचे व्हायरोम आणि यजमान श्रेणी या दोन प्रजातींच्या दरम्यान सारख्याच प्रकारे येतात (आकृती S3, अतिरिक्त माहिती पहा). हे साम्य आश्चर्यकारक नाही, कारण ते पर्यावरणात असलेल्या डीएनएच्या ग्रहणातील निवडकतेच्या अभावाला प्रतिबिंबित करू शकते. आरएनए व्हायरोमचे वैशिष्ट्य समजून घेण्यासाठी, शुद्ध केलेल्या आरएनएचा वापर करून भविष्यात अभ्यास करण्याची सध्या गरज आहे.
आमच्या अभ्यासात, आम्ही कोवारस्की आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांच्या [37] कामातून स्वीकारलेली एक अत्यंत कठोर पाइपलाइन वापरली, ज्यांनी मूळ ccfDNA च्या असेंब्लीच्या आधी आणि नंतर पूल्ड रीड्स आणि कॉन्टिग्सचे दोन-टप्प्यांचे डिलीशन वापरले, ज्यामुळे अनमॅप्ड रीड्सचे प्रमाण जास्त राहिले. त्यामुळे, आम्ही ही शक्यता नाकारू शकत नाही की यापैकी काही अनमॅप्ड रीड्सचा उगम अजूनही वेगळा असू शकतो, कारण आमच्याकडे या शिंपल्याच्या प्रजातीसाठी संदर्भ जीनोम नाही. आम्ही ही पाइपलाइन यासाठीही वापरली कारण आम्हाला सेल्फ आणि नॉन-सेल्फ रीड्समधील कायमेरा आणि इल्युमिना MiSeq PE75 द्वारे निर्माण होणाऱ्या रीडच्या लांबीबद्दल चिंता होती. बहुसंख्य अनचार्टेड रीड्सचे आणखी एक कारण म्हणजे बहुतेक सागरी सूक्ष्मजीव, विशेषतः केर्गुएलनसारख्या दुर्गम भागांतील, एनोटेट केलेले नाहीत. आम्ही मानवी ccfDNA प्रमाणेच ccfDNA फ्रॅगमेंटची लांबी गृहीत धरून इल्युमिना MiSeq PE75 वापरले. भविष्यातील अभ्यासांसाठी, आमच्या निष्कर्षांनुसार हिमोलिम्फ ccfDNA मध्ये मानव आणि/किंवा सस्तन प्राण्यांपेक्षा लांब रीड्स (reads) असल्याचे दिसून आल्यामुळे, आम्ही लांब ccfDNA तुकड्यांसाठी अधिक योग्य असलेल्या सिक्वेन्सिंग प्लॅटफॉर्मचा वापर करण्याची शिफारस करतो. या पद्धतीमुळे सखोल विश्लेषणासाठी अधिक संकेत ओळखणे खूप सोपे होईल. सध्या अनुपलब्ध असलेला संपूर्ण A. atra न्यूक्लियर जीनोम सिक्वेन्स मिळवल्यास, स्व-स्रोत आणि पर-स्रोत ccfDNA मधील फरक ओळखणे देखील मोठ्या प्रमाणात सुलभ होईल. आमचे संशोधन शिंपल्यांवर लिक्विड बायोप्सीची संकल्पना लागू करण्याच्या शक्यतेवर केंद्रित असल्यामुळे, आम्हाला आशा आहे की भविष्यातील संशोधनात ही संकल्पना वापरली जाईल तसतसे, शिंपल्यांच्या सागरी परिसंस्थेतील सूक्ष्मजैविक विविधतेचा अभ्यास करण्यासाठी या पद्धतीची क्षमता वाढवण्यासाठी नवीन साधने आणि कार्यप्रणाली विकसित केल्या जातील.
एक नॉन-इनवेसिव्ह क्लिनिकल बायोमार्कर म्हणून, मानवी प्लाझ्मामधील ccfDNA ची वाढलेली पातळी विविध रोग, ऊतींचे नुकसान आणि तणावपूर्ण परिस्थितींशी संबंधित आहे [67,68,69]. ही वाढ ऊतींच्या नुकसानीनंतर स्वतःच्या मूळच्या डीएनए तुकड्यांच्या मुक्ततेशी संबंधित आहे. आम्ही तीव्र उष्णतेच्या तणावाचा वापर करून या समस्येचा अभ्यास केला, ज्यामध्ये शिंपल्यांना थोड्या काळासाठी 30 °C तापमानाला ठेवण्यात आले. आम्ही तीन वेगवेगळ्या प्रकारच्या शिंपल्यांवर तीन स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये हे विश्लेषण केले. तथापि, आम्हाला तीव्र उष्णतेच्या तणावानंतर ccfDNA च्या पातळीत कोणताही बदल आढळला नाही (आकृती S5, अतिरिक्त माहिती पहा). हा शोध, किमान काही प्रमाणात, या वस्तुस्थितीचे स्पष्टीकरण देऊ शकतो की शिंपल्यांमध्ये अर्ध-खुली रक्ताभिसरण प्रणाली असते आणि त्यांच्या उच्च गाळण क्रियेमुळे ते मोठ्या प्रमाणात बाह्य डीएनए जमा करतात. दुसरीकडे, अनेक अपृष्ठवंशी प्राण्यांप्रमाणे, शिंपले तणावामुळे होणाऱ्या ऊतींच्या नुकसानीस अधिक प्रतिरोधक असू शकतात, ज्यामुळे त्यांच्या हिमोलिम्फमध्ये ccfDNA ची मुक्तता मर्यादित होते [70, 71].
आजपर्यंत, जलीय परिसंस्थांमधील जैवविविधतेचे डीएनए विश्लेषण मुख्यत्वे पर्यावरणीय डीएनए (eDNA) मेटाबारकोडिंगवर केंद्रित आहे. तथापि, जेव्हा प्रायमर्स वापरले जातात तेव्हा ही पद्धत सामान्यतः जैवविविधता विश्लेषणात मर्यादित ठरते. शॉटगन सिक्वेन्सिंगचा वापर पीसीआरच्या मर्यादा आणि प्रायमर सेट्सच्या पक्षपाती निवडीवर मात करतो. अशाप्रकारे, एका अर्थाने, आमची पद्धत अलीकडे वापरल्या जाणाऱ्या हाय-थ्रूपुट eDNA शॉटगन सिक्वेन्सिंग पद्धतीच्या अधिक जवळ आहे, जी खंडित डीएनएचे थेट सिक्वेन्सिंग करण्यास आणि जवळजवळ सर्व जीवांचे विश्लेषण करण्यास सक्षम आहे [७२, ७३]. तथापि, असे अनेक मूलभूत मुद्दे आहेत जे एलबीला मानक eDNA पद्धतींपासून वेगळे करतात. अर्थात, eDNA आणि एलबीमधील मुख्य फरक म्हणजे नैसर्गिक फिल्टर होस्टचा वापर. eDNA च्या अभ्यासासाठी नैसर्गिक फिल्टर म्हणून स्पंज आणि बायव्हाल्व्ह (ड्रेसेना प्रजाती) सारख्या सागरी प्रजातींचा वापर नोंदवला गेला आहे [७४, ७५]. तथापि, ड्रेसेनाच्या अभ्यासात ऊतींच्या बायोप्सीचा वापर केला गेला, ज्यामधून डीएनए काढण्यात आला होता. LB मधून ccfDNA च्या विश्लेषणासाठी eDNA किंवा टिश्यू बायोप्सीशी संबंधित टिश्यू बायोप्सी, विशेष आणि काहीवेळा महागडी उपकरणे आणि लॉजिस्टिक्सची आवश्यकता नसते. खरं तर, आम्ही अलीकडेच अहवाल दिला आहे की LB मधील ccfDNA कोल्ड चेन न राखता FTA च्या साहाय्याने साठवले आणि विश्लेषण केले जाऊ शकते, जे दुर्गम भागातील संशोधनासाठी एक मोठे आव्हान आहे [76]. लिक्विड बायोप्सीमधून ccfDNA काढणे देखील सोपे आहे आणि ते शॉटगन सिक्वेन्सिंग आणि PCR विश्लेषणासाठी उच्च दर्जाचे DNA प्रदान करते. eDNA विश्लेषणाशी संबंधित काही तांत्रिक मर्यादा लक्षात घेता हा एक मोठा फायदा आहे [77]. नमुना घेण्याच्या पद्धतीची साधेपणा आणि कमी खर्च दीर्घकालीन देखरेख कार्यक्रमांसाठी देखील विशेषतः योग्य आहे. त्यांच्या उच्च गाळण क्षमतेव्यतिरिक्त, बायव्हाल्व्हचे आणखी एक सुप्रसिद्ध वैशिष्ट्य म्हणजे त्यांच्या श्लेष्माची रासायनिक म्युकोपोलिसॅकराइड रचना, जी विषाणूंच्या शोषणास प्रोत्साहन देते [78, 79]. यामुळे बायव्हाल्व्ह हे जैवविविधतेचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी आणि दिलेल्या जलीय परिसंस्थेतील हवामान बदलाच्या परिणामाचे मूल्यांकन करण्यासाठी एक आदर्श नैसर्गिक फिल्टर बनतात. जरी eDNA च्या तुलनेत यजमान-व्युत्पन्न DNA तुकड्यांची उपस्थिती या पद्धतीची एक मर्यादा म्हणून पाहिली जाऊ शकते, तरीही आरोग्य अभ्यासासाठी उपलब्ध असलेल्या प्रचंड माहितीमुळे eDNA च्या तुलनेत अशा मूळ ccfDNA शी संबंधित खर्च एकाच वेळी समजण्यासारखा आहे. यामध्ये यजमानाच्या जीनोममध्ये एकत्रित झालेल्या विषाणू अनुक्रमांची उपस्थिती समाविष्ट आहे. द्विकपाटी प्राण्यांमध्ये क्षैतिजरित्या प्रसारित होणाऱ्या ल्युकेमिक रेट्रोव्हायरसच्या उपस्थितीमुळे हे विशेषतः शिंपल्यांसाठी महत्त्वाचे आहे [80, 81]. eDNA च्या तुलनेत LB चा आणखी एक फायदा म्हणजे तो हिमोलिम्फमधील फिरणाऱ्या रक्तपेशींच्या भक्षक क्रियेचा उपयोग करतो, ज्या सूक्ष्मजीवांना (आणि त्यांच्या जीनोमला) गिळंकृत करतात. द्विकपाटी प्राण्यांमध्ये भक्षण ही रक्तपेशींची मुख्य क्रिया आहे [82]. शेवटी, ही पद्धत शिंपल्यांच्या उच्च गाळण क्षमतेचा (सरासरी 1.5 लिटर/तास समुद्राचे पाणी) आणि दोन दिवसांच्या अभिसरणाचा फायदा घेते, ज्यामुळे समुद्राच्या पाण्याच्या विविध थरांचे मिश्रण वाढते, ज्यामुळे भिन्न eDNA मिळवणे शक्य होते. [83, 84]. त्यामुळे, शिंपल्यांचे पौष्टिक, आर्थिक आणि पर्यावरणीय परिणाम लक्षात घेता, शिंपल्यांच्या ccfDNA चे विश्लेषण हा एक मनोरंजक मार्ग आहे. मानवांमधून गोळा केलेल्या LB च्या विश्लेषणाप्रमाणेच, ही पद्धत देखील बाह्य पदार्थांच्या प्रतिसादात यजमान DNA मधील अनुवांशिक आणि एपिजेनेटिक बदल मोजण्याची शक्यता निर्माण करते. उदाहरणार्थ, नॅनोपोर सिक्वेन्सिंगचा वापर करून मूळ ccfDNA मध्ये जीनोम-व्यापी मेथिलेशन विश्लेषण करण्यासाठी तिसऱ्या पिढीच्या सिक्वेन्सिंग तंत्रज्ञानाचा विचार केला जाऊ शकतो. ही प्रक्रिया या वस्तुस्थितीमुळे सुलभ झाली पाहिजे की शिंपल्यांच्या ccfDNA तुकड्यांची लांबी लाँग-रीड सिक्वेन्सिंग प्लॅटफॉर्मशी आदर्शपणे सुसंगत आहे, जे रासायनिक परिवर्तनांची आवश्यकता न भासता एकाच सिक्वेन्सिंग रनमधून जीनोम-व्यापी DNA मेथिलेशन विश्लेषणास परवानगी देतात. [85,86] ही एक मनोरंजक शक्यता आहे, कारण असे दिसून आले आहे की DNA मेथिलेशन नमुने पर्यावरणीय ताणाला दिलेला प्रतिसाद दर्शवतात आणि अनेक पिढ्यांपर्यंत टिकून राहतात. म्हणून, हवामान बदल किंवा प्रदूषकांच्या संपर्कात आल्यानंतर प्रतिसाद नियंत्रित करणाऱ्या मूळ यंत्रणांबद्दल ते मौल्यवान अंतर्दृष्टी प्रदान करू शकते [87]. तथापि, LB चा वापर मर्यादांशिवाय नाही. हे सांगण्याची गरज नाही की, यासाठी परिसंस्थेमध्ये सूचक प्रजातींची उपस्थिती आवश्यक आहे. वर नमूद केल्याप्रमाणे, दिलेल्या परिसंस्थेच्या जैवविविधतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी एलबी (LB) वापरण्याकरिता एका कठोर बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइनची देखील आवश्यकता असते, जी स्रोताकडील डीएनए (DNA) तुकड्यांच्या उपस्थितीचा विचार करते. दुसरी मोठी समस्या म्हणजे सागरी प्रजातींसाठी संदर्भ जीनोमची उपलब्धता. अशी आशा आहे की मरीन मॅमल जीनोम्स प्रोजेक्ट आणि अलीकडेच स्थापित फिश10k प्रोजेक्ट [88] यांसारखे उपक्रम भविष्यात अशा विश्लेषणास सुलभ करतील. सागरी फिल्टर-फीडिंग जीवांवर एलबी (LB) संकल्पनेचा वापर सिक्वेन्सिंग तंत्रज्ञानातील नवीनतम प्रगतीशी सुसंगत आहे, ज्यामुळे पर्यावरणीय ताणाच्या प्रतिसादात सागरी अधिवासांच्या आरोग्याविषयी महत्त्वपूर्ण माहिती प्रदान करण्यासाठी मल्टी-ओम बायोमार्करच्या विकासासाठी ते अत्यंत योग्य ठरते.
जीनोम सिक्वेन्सिंग डेटा बायोप्रोजेक्ट्स SRR8924808 अंतर्गत NCBI सिक्वेन्स रीड आर्काइव्ह https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 मध्ये जमा करण्यात आला आहे.
ब्रियरली एएस, किंग्सफोर्ड एमजे हवामान बदलाचा सागरी जीवनावर आणि परिसंस्थांवर होणारा परिणाम. कोल बायोलॉजी. २००९; १९: पी६०२–पी६१४.
गिसी ई, मानेआ ई, माझारिस एडी, फ्राशेट्टी एस, अल्म्पनिडू व्ही, बेविलाक्वा एस, आणि इतर. सागरी पर्यावरणावरील हवामान बदल आणि इतर स्थानिक ताणतणावांच्या एकत्रित परिणामांचा विचार करा. सामान्य वैज्ञानिक पर्यावरण. २०२१;७५५:१४२५६४.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). पहिल्या मार्चचे विज्ञान. 2020; 7:48.
सेरॉन्ट एल, निकॅस्ट्रो सीआर, झार्डी जीआय, गोबरविले ई. वारंवार उष्णतेच्या ताणतणावाखाली उष्णता सहन करण्याची क्षमता कमी झाल्यामुळे निळ्या शिंपल्यांचा उन्हाळ्यात जास्त मृत्यूदर होतो. वैज्ञानिक अहवाल 2019; 9:17498.
फे एसबी, सिपिएल्स्की एएम, नुस्ले एस, सर्व्हेंटेस-योशिदा के, ह्वान जेएल, ह्युबर ईआर, आणि इतर. प्राण्यांच्या मृत्यूची वारंवारता, कारणे आणि व्याप्तीमधील अलीकडील बदल. प्रोक नॅशनल अकॅड सायन्स यूएसए. २०१५;११२:१०८३-८.
स्कार्पा एफ, सन्ना डी, अझेना I, मुगेट्टी डी, सेरुती एफ, होसेनी एस, एट अल. बहुविध गैर-प्रजाती-विशिष्ट रोगजनकांमुळे पिना नोबिलिसचा सामूहिक मृत्यू झाला असावा. जीवन. 2020; 10:238.
ब्रॅडली एम, कौट्स एसजे, जेन्किन्स ई, ओ'हारा टीएम. आर्क्टिकमधील प्राण्यांपासून मानवामध्ये पसरणाऱ्या रोगांवर हवामान बदलाचा संभाव्य परिणाम. आंतरराष्ट्रीय ध्रुवीय आरोग्य जर्नल. २००५; ६४:४६८–७७.
बेयर जे., ग्रीन एनडब्ल्यू, ब्रूक्स एस., ॲलन आयजे, रुस ए., गोमेझ टी. आणि इतर. किनारी प्रदूषण निरीक्षणात संकेत जीव म्हणून निळे शिंपले (मायटिलस एडुलिस प्रजाती): एक आढावा. मरीन एन्व्हायर्नमेंटल रिसर्च 2017; 130:338-65.
सिरावेग्ना जी, मार्सोनी एस, सिएना एस, बार्डेली ए. कर्करोग उपचारात लिक्विड बायोप्सीचे एकत्रीकरण. नॅट रिव्ह्यू क्लीन ऑन्कॉल. 2017; 14:531–48.
वान जेसीएम, मॅसी सी, गार्सिया-कॉर्बाचो जे, मौलियर एफ, ब्रेंटन जेडी, काल्डास सी, आणि इतर. लिक्विड बायोप्सी मॅचुरेशन: ट्यूमर डीएनएला फिरण्यास अनुमती देते. नॅट रिव्ह्यू कॅन्सर. २०१७;१७:२२३–३८.
मँडेल पी., मेटास पी. मानवी प्लाझ्मामधील न्यूक्लिक आम्ल. सोसायटी ऑफ बायोलॉजीच्या उपकंपन्यांच्या बैठकीचे इतिवृत्त. १९४८; १४२:२४१-३.
ब्रॉन्कहॉर्स्ट एजे, उंगेरर डब्ल्यू, होल्डनरायडर एस. कर्करोग उपचारासाठी आण्विक मार्कर म्हणून सेल-फ्री डीएनएची नवीन भूमिका. बायोमोलर विश्लेषणाचे परिमाणीकरण. 2019;17:100087.
इग्नाटियाडिस एम., स्लेज जीडब्ल्यू, जेफ्री एसएस लिक्विड बायोप्सीचा क्लिनिकमध्ये प्रवेश – अंमलबजावणीतील समस्या आणि भविष्यातील आव्हाने. नॅट रिव्ह्यू क्लिन ऑन्कॉल. २०२१; १८:२९७–३१२.
लो वायएम, कॉर्बेटा एन., चेंबरलेन पीएफ, राय डब्ल्यू., सार्जेंट आयएल, रेडमन सीडब्ल्यू आणि इतर. गर्भाचा डीएनए मातेच्या प्लाझ्मा आणि सीरममध्ये आढळतो. लॅन्सेट. १९९७; ३५०:४८५-७.
मुफारे एमएन, वोंग आरजे, शॉ जीएम, स्टीव्हन्सन डीके, क्वेक एसआर गर्भधारणेदरम्यान महिलांच्या रक्तातील फिरत्या बाह्यकोशिकीय आरएनएचा वापर करून गर्भधारणेचा अभ्यास आणि त्यातील गुंतागुंत. डोपीडियाट्रिक्स. 2020;8:605219.
ओलेरिच एम, शेरवुड के, किओन पी, शुट्झ ई, बेक जे, स्टेगबाउर जे, आणि इतर. लिक्विड बायोप्सी: किडनी ग्राफ्टमधील ॲलोजेनिक घाव शोधण्यासाठी दाता सेल-फ्री डीएनएचा वापर. नॅट रिव्ह्यू नेफ्रॉल. २०२१; १७:५९१–६०३.
जुआन एफसी, लो वायएम प्रसवपूर्व निदानातील नवकल्पना: मातृ प्लाझ्मा जीनोम अनुक्रमण. अ‍ॅना एमडी. 2016;67:419-32.
गु डब्ल्यू, डेंग एक्स, ली एम, सुकू वायडी, अरेवालो एस, स्ट्राइक डी, आणि इतर. संक्रमित शारीरिक द्रव्यांच्या नेक्स्ट-जनरेशन मेटाजेनोमिक सिक्वेन्सिंगद्वारे जलद रोगजनक शोध. नॅट मेडिसिन. २०२१;२७:११५-२४.