Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүңүз). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Суюк биопсия (СБ) - биомедициналык тармакта тездик менен популярдуулукка ээ болуп жаткан түшүнүк. Бул түшүнүк негизинен ар кандай ткандарда клетка өлгөндөн кийин майда фрагменттер катары бөлүнүп чыккан айлануучу клеткадан тышкаркы ДНКнын (ccfDNA) фрагменттерин аныктоого негизделген. Бул фрагменттердин аз бөлүгү бөтөн (чет элдик) ткандардан же организмдерден келип чыгат. Учурдагы ишибизде биз бул түшүнүктү деңиз суусун чыпкалоо жөндөмдүүлүгү жогору болгон күзөтчү түр болгон мидияларга колдондук. Биз деңиз жээгиндеги экосистемалардын биологиялык ар түрдүүлүгү жөнүндө маалымат берүү үчүн ар кандай булактардан айлана-чөйрөнүн ДНК фрагменттерин кармоо үчүн мидиялардын табигый чыпкалар катары иштөө жөндөмүн колдонобуз. Биздин жыйынтыктарыбыз мидия гемолимфасында 1ден 5 кбга чейинки өлчөмдөгү ДНК фрагменттери бар экенин көрсөтүп турат. Мылтык менен ырааттуулукту аныктоо көптөгөн ДНК фрагменттери бөтөн микробдук келип чыгышы бар экенин көрсөттү. Алардын ичинен биз бактериялардын, архейлердин жана вирустардын ДНК фрагменттерин, анын ичинде жээктеги деңиз экосистемаларында кеңири таралган ар кандай кожоюндарды жуктурган вирустарды таптык. Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөөбүз мидияларга колдонулган LB түшүнүгү деңиз жээгиндеги экосистемалардагы микробдук ар түрдүүлүк жөнүндө бай, бирок али изилдене элек билим булагын билдирерин көрсөтүп турат.
Климаттын өзгөрүшүнүн (КӨ) деңиз экосистемаларынын биологиялык ар түрдүүлүгүнө тийгизген таасири изилдөөнүн тездик менен өсүп жаткан багыты болуп саналат. Глобалдык жылуулук маанилүү физиологиялык стресстерди гана жаратпастан, деңиз организмдеринин жылуулук туруктуулугунун эволюциялык чектерин да төмөндөтүп, бир катар түрлөрдүн жашоо чөйрөсүнө таасир этип, аларды жагымдуу шарттарды издөөгө түртөт [1, 2]. Метазоалардын биологиялык ар түрдүүлүгүнө таасир этүүдөн тышкары, КӨ кожоюн менен микробдун өз ара аракеттенүүсүнүн назик балансын бузат. Бул микробдук дисбактериоз деңиз экосистемаларына олуттуу коркунуч келтирет, анткени ал деңиз организмдерин жугуштуу патогендерге көбүрөөк дуушар кылат [3, 4]. СС массалык өлүмдөрдө маанилүү ролду ойнойт деп эсептелет, бул дүйнөлүк деңиз экосистемаларын башкаруу үчүн олуттуу көйгөй болуп саналат [5, 6]. Бул көптөгөн деңиз түрлөрүнүн экономикалык, экологиялык жана азыктык таасирин эске алганда маанилүү маселе. Бул, айрыкча, ККнын таасири тезирээк жана олуттуу болгон уюлдук аймактарда жашаган кош моллюскалуулар үчүн туура [6, 7]. Чындыгында, Mytilus spp. сыяктуу кош моллюскалуулар ККнын деңиз экосистемаларына тийгизген таасирин көзөмөлдөө үчүн кеңири колдонулат. Таң калыштуусу, алардын ден соолугун көзөмөлдөө үчүн салыштырмалуу көп сандагы биомаркерлер иштелип чыккан, көбүнчө ферменттик активдүүлүккө же клетканын жашоого жөндөмдүүлүгү жана фагоцитоздук активдүүлүк сыяктуу клеткалык функцияларга негизделген функционалдык биомаркерлерди камтыган эки баскычтуу ыкма колдонулат [8]. Бул ыкмаларга ошондой эле деңиз суусунун көп көлөмүн сиңиргенден кийин жумшак ткандарда топтолгон белгилүү бир басым индикаторлорунун концентрациясын өлчөө кирет. Бирок, кош капкалуулардын жогорку чыпкалоо жөндөмдүүлүгү жана жарым ачык кан айлануу системасы бейтаптарды башкаруунун жөнөкөй жана минималдуу инвазивдүү ыкмасы болгон суюк биопсия (СБ) концепциясын колдонуп, жаңы гемолимфа биомаркерлерин иштеп чыгууга мүмкүнчүлүк берет. кан үлгүлөрү [9, 10]. Адамдын СБсында бир нече түрдөгү кан айлануу молекулаларын табууга мүмкүн болсо да, бул концепция негизинен плазмадагы кан айлануудагы клеткадан тышкаркы ДНКнын (ccfDNA) фрагменттерин ДНКнын секвенирлөө анализине негизделген. Чындыгында, адамдын плазмасында кан айлануудагы ДНКнын болушу 20-кылымдын ортосунан бери белгилүү [11], бирок акыркы жылдары гана жогорку өндүрүмдүүлүктөгү секвенирлөө ыкмаларынын пайда болушу СБДНКга негизделген клиникалык диагнозго алып келди. Бул айлануучу ДНК фрагменттеринин болушу жарым-жартылай клетка өлгөндөн кийин геномдук ДНКнын (ядролук жана митохондриялык) пассивдүү бөлүнүп чыгышына байланыштуу. Ден соолугу чың адамдарда ккфДНКнын концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиялары бар же стресске кабылган бейтаптарда 5–10 эсе көбөйүшү мүмкүн, бул ткандардын жабыркашына алып келет. Ден соолугу чың адамдарда ккфДНКнын концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиялары бар же стресске кабылган бейтаптарда 5–10 эсе көбөйүшү мүмкүн, бул ткандардын жабыркашына алып келет. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), бирок мүмкүн повышаться в 5-10 раз у различной патологиясы же подвергающихся стресске, приводящему к повреждению тканей. Дени сак адамдарда кккДНКнын концентрациясы кадимкидей төмөн (<10 нг/мл), бирок ал ар кандай патологиялары бар же ткандардын жабыркашына алып келүүчү стресс астында болгон бейтаптарда 5–10 эсеге көбөйүшү мүмкүн.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 戗 戗中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍 损伍损伤Концентрации ccfDNA өтө аз (<10 нг/мл) адамдар үчүн, бирок оорулуулардын 5-10 разда болушу мүмкүн, ар кандай оорулар же стресстер менен ооруп калышы мүмкүн. Ден соолугу чың адамдарда ккфДНКнын концентрациясы адатта төмөн (<10 нг/мл), бирок ар кандай патологиялары же стресси бар бейтаптарда 5-10 эсе көбөйүшү мүмкүн, бул ткандардын жабыркашына алып келет.ccfДНК фрагменттеринин өлчөмү ар кандай болот, бирок адатта 150дөн 200 б.п.ге чейин өзгөрөт. [12]. Өзүнөн алынган ccfДНКны, башкача айтканда, кадимки же трансформацияланган кожоюн клеткаларынан алынган ccfДНКны анализдөө ядролук жана/же митохондриялык геномдо болгон генетикалык жана эпигенетикалык өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн, ошону менен клиниктерге белгилүү бир молекулярдык-максаттуу терапияны тандоого жардам берет [13]. Бирок, ccfДНКны кош бойлуулук учурунда түйүлдүктүн клеткаларынан же трансплантацияланган органдардан алынган ccfДНК сыяктуу чет элдик булактардан алууга болот [14,15,16,17]. ccfДНК ошондой эле инфекциялык агенттин (чет элдик) нуклеин кислоталарынын бар экендигин аныктоо үчүн маанилүү маалымат булагы болуп саналат, бул кан культуралары менен аныкталбаган кеңири таралган инфекцияларды инвазивдүү эмес аныктоого мүмкүндүк берет, инфекцияланган ткандардын инвазивдүү биопсиясынан качат [18]. Акыркы изилдөөлөр чындыгында адамдын канында вирустук жана бактериялык патогендерди аныктоо үчүн колдонула турган маалыматтын бай булагы бар экенин жана адамдын плазмасында табылган ccfДНКнын болжол менен 1% чет элдик экенин көрсөттү [19]. Бул изилдөөлөр организмдин айлануучу микробиомунун биологиялык ар түрдүүлүгүн ccfДНК анализин колдонуу менен баалоого болорун көрсөтүп турат. Бирок, жакында эле бул түшүнүк адамдарда гана жана азыраак деңгээлде башка омурткалууларда колдонулган [20, 21].
Бул макалада биз 35 миллион жыл мурун пайда болгон чоң платонун чокусундагы аралдардын тобу болгон субантарктикалык Кергелен аралдарында кеңири таралган түштүк түрү болгон Aulacomya atraнын ccfDNAсын талдоо үчүн LB потенциалын колдонобуз. Жанар тоо атылышы. In vitro эксперименталдык системасын колдонуп, биз деңиз суусундагы ДНК фрагменттери мидиялар тарабынан тез эле сиңирилип, гемолимфа бөлүмүнө кирерин аныктадык. Мылтык менен ырааттуулукту аныктоо мидия гемолимфасы ccfDNAсында өзүнүн жана өзүнөн-өзү келип чыккан ДНК фрагменттери, анын ичинде симбиотикалык бактериялар жана муздак жанар тоо деңизинин жээк экосистемаларына мүнөздүү биомдордон алынган ДНК фрагменттери бар экенин көрсөттү. Гемолимфа ccfDNAсында ошондой эле ар кандай кожоюн диапазондору бар вирустардан алынган вирустук ырааттуулуктар бар. Ошондой эле, биз сөөктүү балыктар, деңиз актиниялары, балырлар жана курт-кумурскалар сыяктуу көп клеткалуу жаныбарлардын ДНК фрагменттерин таптык. Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөө LB концепциясын деңиз омурткасыздарына ийгиликтүү колдонсо болорун көрсөтүп турат, бул деңиз экосистемаларында бай геномдук репертуарды түзүү үчүн.
Чоңдору (узундугу 55-70 мм) Mytilus platensis (M. platensis) жана Aulacomya atra (A. atra) 2018-жылдын декабрь айында Порт-о-Франстын таштуу жээктеринен (049°21.235 түштүк кеңдик, 070°13.490 чыгыш кеңдик) чогултулган. Башка чоң көк мидиялар (Mytilus spp.) коммерциялык жеткирүүчүдөн (PEI Mussel King Inc., Принс Эдвард аралы, Канада) алынып, 10–20 л 32‰ жасалма туздуу суусу бар (4°C) температурасы көзөмөлдөнгөн (4°C) аэрацияланган резервуарга жайгаштырылган. (жасалма деңиз тузу Reef Crystal, Instant Ocean, Вирджиния, АКШ). Ар бир эксперимент үчүн ар бир раковинанын узундугу жана салмагы өлчөнгөн.
Бул программа үчүн акысыз ачык мүмкүндүк алуу протоколу онлайн режиминде жеткиликтүү (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Кыскача айтканда, LB гемолимфа сүрөттөлгөндөй [22] уурдоочу булчуңдардан чогултулган. Гемолимфа 1200 × g ылдамдыкта 3 мүнөт центрифугалоо менен тазаланган, үстүнкү катмар колдонулганга чейин (-20°C) тоңдурулган. cfDNAны бөлүп алуу жана тазалоо үчүн үлгүлөр (1,5-2,0 мл) эритип, өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык NucleoSnap cfDNA комплекти (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) менен иштетилген. ccfDNA андан ары талдоо жүргүзүлгөнгө чейин -80°C температурада сакталган. Айрым эксперименттерде ccfDNA QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада) аркылуу бөлүнүп алынган жана тазаланган. Тазаланган ДНК стандарттуу PicoGreen анализи аркылуу сандык жактан аныкталган. Изоляцияланган ccfДНКнын фрагменттик бөлүштүрүлүшү Agilent 2100 биоанализаторун (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Калифорния) колдонуп, капиллярдык электрофорез аркылуу жогорку сезгичтиктеги ДНК комплектин колдонуу менен талданды. Анализ өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык 1 мкл ccfДНК үлгүсүн колдонуу менен жүргүзүлдү.
Гемолимфа ccfДНК фрагменттерин секвенирлөө үчүн Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 комплектинин Illumina DNA Mix комплектин колдонуп, мылтык китепканаларын даярдаган. Стандарттуу адаптер (BioO) колдонулган. Чийки маалымат файлдары NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 жана SRR8924809) дан жеткиликтүү. Негизги окуу сапаты FastQC [23] колдонуу менен бааланган. Trimmomatic [24] кесүүчү адаптерлер жана сапатсыз окуулар үчүн колдонулган. Жупташкан учтары бар мылтык окуулары дал келбестиктерди болтурбоо үчүн FLASH узунураак бир окууларга бириктирилген, минималдуу 20 bp кайталанышы менен [25]. Бириктирилген окуулар BLASTN менен кош капкалуу NCBI таксономия маалымат базасын колдонуу менен аннотацияланган (e мааниси < 1e−3 жана 90% гомология), ал эми аз татаалдыктагы ырааттуулуктарды маскировкалоо DUST [26] колдонуу менен жүргүзүлгөн. Бириктирилген окуулар BLASTN менен кош капкалуу NCBI таксономия маалымат базасын колдонуу менен аннотацияланган (e мааниси < 1e−3 жана 90% гомология), ал эми аз татаалдыктагы ырааттуулуктарды маскировкалоо DUST [26] колдонуу менен жүргүзүлгөн. Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование кийинчерээк көп нерсеге жетишүү [26]. Бирге окулган маалыматтар NCBI кош капкалуу таксономия маалымат базасын колдонуу менен BLASTN менен белгиленди (e мааниси < 1e-3 жана 90% гомология), ал эми татаалдыгы төмөн ырааттуулукту маскировкалоо DUST [26] колдонуу менен аткарылды.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释）用BLASTN 注释（并的读）2ST进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 合并 唶2掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотирование с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование кийин следовательностей мүмкүн эмес сложенности [26]. Бирге окулган маалыматтар NCBI эки капкактуу таксономиялык маалымат базасын колдонуу менен BLASTN менен белгиленди (e мааниси <1e-3 жана 90% гомология), ал эми татаалдыгы төмөн ырааттуулукту маскировкалоо DUST [26] колдонуу менен аткарылды.Окуу куралдары эки топко бөлүндү: кош капкалуу ырааттуулуктарга байланыштуу (бул жерде өзүнчө окуу куралдары деп аталат) жана байланышпаган (өзүнчө окуу куралдары эмес). Контигдерди түзүү үчүн эки топ MEGAHITти колдонуу менен өзүнчө чогултулган [27]. Ошол эле учурда, келгин микробиом окуу куралдарынын таксономиялык бөлүштүрүлүшү Kraken2 [28] колдонуу менен классификацияланган жана Галактикадагы Krona тегерек диаграммасы менен графикалык түрдө көрсөтүлгөн [29, 30]. Биздин алдын ала эксперименттерибизден оптималдуу кмерлер кмерлер-59 деп аныкталган. Андан кийин өзүн-өзү байланыштыргандар акыркы аннотация үчүн BLASTN (эки капкактуу NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен дал келтирүү жолу менен аныкталган. Андан кийин өзүн-өзү байланыштыргандар акыркы аннотация үчүн BLASTN (эки капкактуу NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен дал келтирүү жолу менен аныкталган. Затем собственные контиги були идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Андан кийин акыркы аннотация үчүн өзүн-өзү камтыгандар BLASTN (NCBI кош капкалуу маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен дал келтирүү жолу менен аныкталган.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем були идентификациялоону собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Андан кийин өзүн-өзү байланыштыруучулар BLASTN (NCBI кош капкалуу маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен дал келтирүү аркылуу акыркы аннотация үчүн аныкталган. Ошол эле учурда, өз алдынча эмес топтун контигдери BLASTN (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен белгиленди. Ошол эле учурда, өз алдынча эмес топтун контигдери BLASTN (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология) менен белгиленди. Параллельно чужеродные групповые контиги жана аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ошол эле учурда, чет элдик топтордун контигдери BLASTN (NT NCBI маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен белгиленди.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ошол эле учурда, өз алдынча топко кирбеген контигдер BLASTN (nt NCBI маалымат базасы, e мааниси <1e-10 жана 60% гомология) менен белгиленди. BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq белок NCBI маалымат базаларын колдонуу менен өзүнөн-өзү байланышпаган бөлүкчөлөрдө жүргүзүлдү (e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq белок NCBI маалымат базаларын колдонуу менен өзүнөн-өзү байланышпаган бөлүкчөлөрдө жүргүзүлдү (e мааниси < 1e−10 жана 60% гомология). BLASTX ошондой эле проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr жана RefSeq NCBI (значение e <1e-10 жана гомология 60%). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq NCBI белок маалымат базаларын колдонуу менен өзүнөн-өзү байланышпаган бөлүкчөлөрдө жүргүзүлдү (e мааниси < 1e-10 жана 60% гомология).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr жана RefSeq NCBI (значение e <1e-10 жана гомология 60%). BLASTX ошондой эле nr жана RefSeq NCBI белок маалымат базаларын колдонуу менен өзүнөн-өзү байланышпаган бөлүкчөлөрдө жүргүзүлдү (e мааниси <1e-10 жана 60% гомология).Өзүн-өзү байланыштырбаган BLASTN жана BLASTX пулдары акыркы байланыштарды билдирет (кошумча файлды караңыз).
ПТР үчүн колдонулган праймерлер S1 таблицасында келтирилген. ccfДНКнын максаттуу гендерин күчөтүү үчүн Taq ДНК полимеразасы (Bio Basic Canada, Markham, ON) колдонулган. Төмөнкү реакция шарттары колдонулган: 95°C температурада 3 мүнөт денатурация, 1 мүнөт 95°C, күйгүзүү температурасын 1 мүнөткө коюу, 72°C температурада 1 мүнөт узартуу, 35 цикл жана акырында 10 мүнөттүн ичинде 72°C. . ПТР продуктулары 95 В чыңалууда SYBRTM коопсуз ДНК гелдик боёгу (Invitrogen, Берлингтон, ON, Канада) камтылган агароз гелдеринде (1,5%) электрофорез аркылуу бөлүнгөн.
Мидиялар (Mytilus spp.) 500 мл кычкылтек менен байытылган деңиз суусуна (32 PSU) 4°C температурада 24 саат бою акклиматизацияланган. Адамдын галектин-7 кДНК ырааттуулугун коддогон кошумча камтылган плазмиддик ДНК (NCBI кирүү номери L07769) флаконго 190 мкг/мкл акыркы концентрацияда кошулган. ДНК кошулбастан ошол эле шарттарда инкубацияланган мидиялар контролдук болгон. Үчүнчү контролдук резервуарда мидиясыз ДНК болгон. Деңиз суусундагы ДНКнын сапатын көзөмөлдөө үчүн, көрсөтүлгөн убакта ар бир резервуардан деңиз суусунун үлгүлөрү (20 мкл; үч кайталоо) алынган. Плазмиддик ДНКны көзөмөлдөө үчүн, LB мидиялары көрсөтүлгөн убакытта чогултулуп, qPCR жана ddPCR аркылуу талданган. Деңиз суусунун туздуулугу жогору болгондуктан, бардык ПЦР анализдеринин алдында аликвоттор ПЦР сапаттагы сууда (1:10) суюлтулган.
Санариптик тамчы ПЦР (ddPCR) BioRad QX200 протоколу (Миссиссауга, Онтарио, Канада) аркылуу жүргүзүлдү. Оптималдуу температураны аныктоо үчүн температура профилин колдонуңуз (S1 таблицасы). Тамчылар QX200 тамчы генератору (BioRad) аркылуу түзүлдү. ddPCR төмөнкүдөй жүргүзүлдү: 95°C 5 мүнөт, 95°C 30 секунд 50 цикл жана берилген күйгүзүү температурасы 1 мүнөт жана 72°C 30 секунд, 4°C 5 мүнөт жана 90°C 5 мүнөттүн ичинде. Тамчылардын саны жана оң реакциялар (көчүрмөлөрдүн саны/мкл) QX200 тамчы окугуч (BioRad) аркылуу өлчөнгөн. 10 000ден аз тамчылары бар үлгүлөр четке кагылган. ddPCR иштетилген сайын үлгүнү көзөмөлдөө жүргүзүлгөн эмес.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) жана LGALS7 спецификалык праймерлерин колдонуу менен жүргүзүлдү. Бардык сандык ПЦРлар QuantiFast SYBR Green PCR комплектин (QIAGEN) колдонуу менен 20 мклде жүргүзүлдү. qPCR 95°C температурада 15 мүнөттүк инкубация менен башталды, андан кийин 95°C температурада 10 секунд жана 60°C температурада 60 секунд бою 40 цикл бир маалымат чогултуу менен жүргүзүлдү. Эрүү ийри сызыктары qPCRдин аягында 95°C температурада 5 секунд, 65°C температурада 60 секунд жана 97°C температурада удаалаш өлчөөлөрдү колдонуу менен түзүлдү. Ар бир qPCR, контролдук үлгүлөрдөн тышкары, үч нускада жүргүзүлдү.
Мидиялар жогорку чыпкалоо ылдамдыгы менен белгилүү болгондуктан, биз алгач деңиз суусунда болгон ДНК фрагменттерин чыпкалап, кармап тура алабы же жокпу, изилдедик. Ошондой эле, бул фрагменттердин жарым ачык лимфа системасында топтолобу же жокпу деген суроого кызыктык. Биз бул маселени көк мидия резервуарларына кошулган эрүүчү ДНК фрагменттеринин тагдырын көзөмөлдөө менен эксперименталдык түрдө чечтик. ДНК фрагменттерин көзөмөлдөөнү жеңилдетүү үчүн, биз адамдын галектин-7 генин камтыган бөтөн (өзүнө эмес) плазмидалык ДНКны колдондук. ddPCR деңиз суусунда жана мидияларда плазмидалык ДНК фрагменттерин көзөмөлдөйт. Биздин жыйынтыктар көрсөткөндөй, эгерде деңиз суусундагы ДНК фрагменттеринин саны мидиялар жок учурда убакыттын өтүшү менен (7 күнгө чейин) салыштырмалуу туруктуу бойдон калса, анда мидиялар болгондо бул деңгээл 8 сааттын ичинде дээрлик толугу менен жок болуп кеткен (1a, b-сүрөт). Экзогендик ДНКнын фрагменттери клапан ичиндеги суюктукта жана гемолимфада 15 мүнөттүн ичинде оңой табылды (1c-сүрөт). Бул фрагменттерди таасирден кийин 4 саатка чейин аныктоого болот. ДНК фрагменттерине карата бул чыпкалоо активдүүлүгү бактериялардын жана балырлардын чыпкалоо активдүүлүгүнө окшош [31]. Бул жыйынтыктар мидиялар өздөрүнүн суюктук бөлүмдөрүндө бөтөн ДНКны чыпкалап, топтой аларын көрсөтүп турат.
Деңиз суусундагы плазмидалык ДНКнын салыштырмалуу концентрациясы мидиялардын катышуусунда (А) же жоктугунда (В), ddPCR менен өлчөнөт. А вариантында жыйынтыктар пайыз менен көрсөтүлөт, кутучалардын чек аралары 75 жана 25-перцентилдерди билдирет. Логарифмдик ийри сызык кызыл түстө көрсөтүлгөн, ал эми боз түскө боёлгон аймак 95% ишеним аралыгын билдирет. В вариантында кызыл сызык орточо маанини, ал эми көк сызык концентрация үчүн 95% ишеним аралыгын билдирет. C Плазмидалык ДНК кошулгандан кийин ар кайсы убакта мидиялардын гемолимфасында жана клапан суюктугунда плазмидалык ДНКнын топтолушу. Жыйынтыктар аныкталган абсолюттук көчүрмөлөр/мл (±SE) катары берилет.
Андан кийин, биз антропогендик таасири чектелүү алыскы аралдар тобу болгон Кергелен аралдарындагы мидия керебеттеринен чогултулган мидиялардагы ccfDNAнын келип чыгышын изилдедик. Бул максатта мидия гемолимфаларынан алынган cccDNA адамдын cccDNAсын тазалоо үчүн кеңири колдонулган ыкмалар менен бөлүнүп алынып, тазаланган [32, 33]. Мидиялардагы гемолимфа ccfDNAнын орточо концентрациясы гемолимфанын бир млге төмөнкү микрограмм диапазонунда экенин аныктадык (S2 таблицасын, Кошумча маалыматты караңыз). Бул концентрация диапазону дени сак адамдарга караганда алда канча чоң (миллилитрге төмөн нанограмм), бирок сейрек учурларда, рак менен ооругандарда ccfDNAнын деңгээли миллилитрге бир нече микрограммга жетиши мүмкүн [34, 35]. Гемолимфа ccfDNAнын өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүн талдоо бул фрагменттердин өлчөмү боюнча абдан айырмаланарын, 1000 б.п.дан 1000 б.п.га чейин, 5000 б.п.га чейин экенин көрсөттү (2-сүрөт). Ушул сыяктуу натыйжалар кремний диоксидине негизделген QIAamp Investigator Kitти колдонуу менен алынган, бул ыкма соттук-медициналык илимде ccfDNAны кошо алганда, төмөнкү концентрациядагы ДНК үлгүлөрүнөн геномдук ДНКны тез бөлүп алуу жана тазалоо үчүн кеңири колдонулган [36].
Мидия гемолимфасынын репрезентативдик ccfДНК электрофореграммасы. NucleoSnap Plasma Kit (үстү жагында) жана QIAamp ДНК изилдөөчү комплекти менен алынган. Мидиялардагы гемолимфа ccfДНК концентрациясынын (±SE) бөлүштүрүлүшүн көрсөткөн B Скрипка диаграммасы. Кара жана кызыл сызыктар тиешелүүлүгүнө жараша медиананы жана биринчи жана үчүнчү квартилдерди билдирет.
Адамдардагы жана приматтардагы ккфДНКнын болжол менен 1%ы чет элдик булактан алынган [21, 37]. Эки капкактуу моллюскалардын жарым ачык кан айлануу системасын, микробдорго бай деңиз суусун жана мидия ккфДНКсынын өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүн эске алып, биз мидия гемолимфа ккфДНКсында бай жана ар түрдүү микробдук ДНК камтылышы мүмкүн деген гипотеза чыгардык. Бул гипотезаны текшерүү үчүн биз Кергелен аралдарынан чогултулган Аулакомья атра үлгүлөрүнөн алынган гемолимфа ккфДНКсын секвенирледик, натыйжада 10 миллиондон ашык окуулар алынды, алардын 97,6% сапатты көзөмөлдөөдөн өттү. Андан кийин окуулар BLASTN жана NCBI эки капкактуу моллюскалардын маалымат базаларын колдонуу менен өз алдынча жана өз алдынча эмес булактарга жараша классификацияланды (S1-сүрөт, Кошумча маалымат).
Адамдарда ядролук жана митохондриялык ДНК канга бөлүнүп чыгышы мүмкүн [38]. Бирок, ушул изилдөөдө A. atra геному секвенирленбеген же сүрөттөлбөгөндүктөн, мидиялардын ядролук геномдук ДНКсын деталдуу сүрөттөө мүмкүн болгон жок. Бирок, биз кош капкалуу китепкананы колдонуп, өзүбүздүн келип чыгышыбыздан келип чыккан бир катар ccfDNA фрагменттерин аныктай алдык (S2-сүрөт, Кошумча маалымат). Ошондой эле, секвенирленген A. atra гендерин багытталган ПЦР амплификациясы аркылуу өзүбүздүн келип чыгышыбыздан келип чыккан ДНК фрагменттеринин бар экендигин тастыктадык (3-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, A. atra митохондриялык геному коомдук маалымат базаларында жеткиликтүү болгондуктан, A. atra гемолимфасында митохондриялык ccfDNA фрагменттеринин бар экендигинин далилдерин табууга болот. Митохондриялык ДНК фрагменттеринин бар экендиги ПЦР амплификациясы менен тастыкталды (3-сүрөт).
ПТР менен күчөтүлгөн A. atra (кызыл чекиттер – запастык номери: SRX5705969) жана M. platensis (көк чекиттер – запастык номери: SRX5705968) гемолимфасында ар кандай митохондриялык гендер болгон. Сүрөт Breton et al., 2011 B булагынан алынган. A. atraдан алынган гемолимфанын үстүнкү катмарын күчөтүү FTA кагазында сакталган. ПТР аралашмасын камтыган ПТР түтүгүнө түз кошуу үчүн 3 мм перфораторду колдонуңуз.
Деңиз суусундагы микробдук заттардын көптүгүн эске алуу менен, биз башында гемолимфадагы микробдук ДНК ырааттуулугун мүнөздөөгө көңүл бурдук. Бул үчүн биз эки башка стратегияны колдонобуз. Биринчи стратегияда BLAST жана башка куралдар менен салыштырууга боло турган тактык менен микробдук ырааттуулукту аныктай алган алгоритмге негизделген ырааттуулукту классификациялоо программасы Kraken2 колдонулган [28]. 6719дан ашык окуу бактериялык келип чыгышы аныкталган, ал эми 124 жана 64 тиешелүүлүгүнө жараша архейлерден жана вирустардан алынган (4-сүрөт). Эң көп бактериялык ДНК фрагменттери Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) жана Bacteroidetes (17%) болгон (4a-сүрөт). Бул бөлүштүрүү деңиз көк мидиясынын микробиомунун мурунку изилдөөлөрүнө дал келет [39, 40]. Гаммапротеобактериялар көптөгөн Vibrionalesти кошо алганда, Proteobacteriaлардын негизги классы болгон (44%) (4b-сүрөт). ddPCR ыкмасы A. atra гемолимфасынын ccfДНКсында Вибрио ДНК фрагменттеринин бар экендигин тастыктады (4c-сүрөт) [41]. ccfДНКнын бактериялык келип чыгышы жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн кошумча ыкма колдонулган (S2-сүрөт, Кошумча маалымат). Бул учурда, бири-бирине дал келген окуулар жупташкан учтуу окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана 1e−3 e мааниси жана >90% гомологиясы бар чектөө колдонулуп, өз алдынча (эки капкактуу) же өз алдынча эмес келип чыккан деп классификацияланган. Бул учурда, бири-бирине дал келген окуулар жупташкан учтуу окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана 1e−3 e мааниси жана >90% гомологиясы бар чектөө колдонулуп, өз алдынча (эки капкактуу) же өз алдынча эмес келип чыккан деп классификацияланган. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и был классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) же чужие по происхождению с использованием BLASTN жана значения с гомей 190-%. Бул учурда, бири-бирине дал келген окуулар жупташтырылган окуулар катары чогултулуп, BLASTN жана 1e-3 e маанисин колдонуу жана >90% гомология менен кесүү аркылуу жергиликтүү (эки капкактуу) же оригиналдуу эмес деп классификацияланган.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 佚用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами жана классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) же несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ологи и 19%. Бул учурда, бири-бирине дал келген окуулар жупташтырылган окуулар катары чогултулуп, e BLASTN жана 1e-3 маанилерин жана гомологиялык босого >90% колдонуу менен өздүк (эки капкактуу) же оригиналдуу эмес деп классификацияланган.A. atra геному азырынча секвенирленбегендиктен, биз MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ассемблеринин de novo ассемблер стратегиясын колдондук. Жалпысынан 147 188 контиг көз каранды (эки капкактуу) келип чыгышы катары аныкталган. Андан кийин бул контигдер BLASTN жана BLASTX колдонуу менен 1e-10 e-маанилери менен жарылган. Бул стратегия бизге A. atra ccfDNAда бар болгон 482 эки капкактуу эмес фрагменттерди аныктоого мүмкүндүк берди. Бул ДНК фрагменттеринин жарымынан көбү (57%) бактериялардан, негизинен сульфотрофтук симбионтторду кошо алганда, желбезек симбионтторунан жана желбезек симбионттору Solemya velumдан алынган (5-сүрөт).
Түр деңгээлиндеги салыштырмалуу көптүк. B Эки негизги филанын (Firmicutes жана Proteobacteria) микробдук ар түрдүүлүгү. ddPCRдин репрезентативдик амплификациясы C Vibrio spp. A. Үч атра гемолимфасындагы 16S рРНК генинин (көк) фрагменттери.
Жалпысынан чогултулган 482 контиг талданды. Метагеномдук контиг аннотацияларынын (прокариоттор жана эукариоттор) таксономиялык бөлүштүрүлүшүнүн жалпы профили. B BLASTN жана BLASTX тарабынан аныкталган бактериялык ДНК фрагменттеринин деталдуу бөлүштүрүлүшү.
Kraken2 анализи ошондой эле мидиялардын ccf ДНКсында архейдик ДНК фрагменттери, анын ичинде Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) жана Thaurmarcheota (11%) ДНК фрагменттери бар экенин көрсөттү (6a-сүрөт). Калифорниялык мидиялардын микробдук коомчулугунда мурда табылган Euryarchaeota жана Crenarchaeotaдан алынган ДНК фрагменттеринин болушу таң калыштуу эмес [42]. Euryarchaeota көбүнчө экстремалдык шарттар менен байланышканы менен, азыр Euryarchaeota да, Crenarcheota да деңиз криогендик чөйрөсүндөгү эң кеңири таралган прокариоттордун катарына кирери таанылды [43, 44]. Кергелен платосундагы түбүндөгү агып чыгуулардан метандын кеңири агып чыгышы [45] жана Кергелен аралдарынын жээгинде байкалган микробдук метандын мүмкүн болгон өндүрүшү [46] жөнүндө жакында эле кабарлангандарды эске алганда, мидияларда метаногендик микроорганизмдердин болушу таң калыштуу эмес.
Андан кийин көңүлүбүз ДНК вирустарынан алынган көрсөткүчтөргө бурулду. Биз билгенден, бул мидиялардын вирус курамын изилдөөнүн биринчи жолу максатсыз жүргүзүлгөн изилдөөсү. Күтүлгөндөй, биз бактериофагдардын (Caudovirales) ДНК фрагменттерин таптык (6b-сүрөт). Бирок, эң кеңири таралган вирустук ДНК нуклеоцитовирустардын бир түрүнөн, ошондой эле ядролук цитоплазмалык чоң ДНК вирусу (NCLDV) деп аталат, ал башка вирустардын ичинен эң чоң геномго ээ. Бул түрдүн ичинде ДНК тизмектеринин көпчүлүгү Mimimidoviridae (58%) жана Poxviridae (21%) тукумдарына таандык, алардын табигый ээлери омурткалуулар жана муунак буттуулар, ал эми бул ДНК тизмектеринин аз бөлүгү белгилүү вирусологиялык балырларга таандык. Деңиз эукариоттук балырларын жугузат. Тизмелер ошондой эле белгилүү вирустук уруулардын ичинен эң чоң геном өлчөмүнө ээ болгон гигант вирус болгон Пандора вирусунан алынган. Кызыктуусу, гемолимфа ccfДНК секвенирлөөсү менен аныкталгандай, вирус жуктуруп алган деп белгилүү болгон кожоюндардын диапазону салыштырмалуу чоң болгон (S3-сүрөт, Кошумча маалымат). Ага Baculoviridae жана Iridoviridae сыяктуу курт-кумурскаларды жуктурган вирустар, ошондой эле амебаларды, балырларды жана омурткалууларды жуктурган вирустар кирет. Ошондой эле, биз Pithovirus sibericum геномуна дал келген ырааттуулуктарды таптык. Питовирустар (ошондой эле "зомби вирустары" деп да аталат) биринчи жолу Сибирдеги 30 000 жылдык түбөлүк тоңдон бөлүнүп алынган [47]. Ошентип, биздин жыйынтыктар бул вирустардын бардык заманбап түрлөрү жок болуп кетпегенин [48] жана бул вирустар алыскы субарктикалык деңиз экосистемаларында болушу мүмкүн экенин көрсөткөн мурунку отчетторго дал келет.
Акырында, биз башка көп клеткалуу жаныбарлардын ДНК фрагменттерин таба алабызбы же жокпу, текшердик. BLASTN жана BLASTX аркылуу nt, nr жана RefSeq китепканалары (геномдук жана белок) менен жалпысынан 482 бөтөн контиг аныкталды. Биздин жыйынтыктар көп клеткалуу жаныбарлардын ccfДНКсынын бөтөн фрагменттеринин арасында сөөк сөөктөрүнүн ДНКсы басымдуулук кылаарын көрсөтүп турат (5-сүрөт). Курт-кумурскалардын жана башка түрлөрдүн ДНК фрагменттери да табылган. ДНК фрагменттеринин салыштырмалуу чоң бөлүгү аныкталган эмес, балким, кургактыктагы түрлөргө салыштырмалуу геномдук маалымат базаларында көп сандаган деңиз түрлөрүнүн аз көрсөтүлүшүнө байланыштуу болушу мүмкүн [49].
Бул макалада биз LB концепциясын мидияларга колдонобуз, гемолимфанын ccfDNA атып ырааттуулугун аныктоо деңиз жээгиндеги экосистемалардын курамы жөнүндө түшүнүк бере алат деп ырастайбыз. Атап айтканда, биз 1) мидия гемолимфасында салыштырмалуу чоң (~1-5 кб) айлануучу ДНК фрагменттеринин салыштырмалуу жогорку концентрациясы (микрограмм деңгээли) бар экенин аныктадык; 2) бул ДНК фрагменттери көз карандысыз жана көз карандысыз эмес; 3) Бул ДНК фрагменттеринин чет элдик булактарынын арасынан биз бактериялык, архейалдык жана вирустук ДНКны, ошондой эле башка көп клеткалуу жаныбарлардын ДНКсын таптык; 4) Бул чет элдик ccfDNA фрагменттеринин гемолимфада топтолушу тез жүрөт жана мидиялардын ички чыпкалоо активдүүлүгүнө салым кошот. Жыйынтыктап айтканда, биздин изилдөөбүз азырынча негизинен биомедицина тармагында колдонулуп келген LB концепциясы күзөтчү түрлөрү менен алардын айлана-чөйрөсүнүн ортосундагы өз ара аракеттенүүнү жакшыраак түшүнүү үчүн колдонула турган бай, бирок изилденбеген билим булагын коддой турганын көрсөтүп турат.
Приматтардан тышкары, чычкандарда, иттерде, мышыктарда жана жылкыларда ccfДНКнын бөлүнүп чыгышы жөнүндө кабарланган [50, 51, 52]. Бирок, биздин билишибизче, биздин изилдөө ачык кан айлануу системасы бар деңиз түрлөрүндө ccfДНКнын аныкталышы жана ырааттуулугу жөнүндө биринчи жолу кабарлаган изилдөө болуп саналат. Мидиялардын бул анатомиялык өзгөчөлүгү жана чыпкалоо жөндөмү, жок дегенде жарым-жартылай, башка түрлөргө салыштырмалуу кан айлануудагы ДНК фрагменттеринин ар кандай өлчөмдөгү мүнөздөмөлөрүн түшүндүрүшү мүмкүн. Адамдарда кан айлануудагы ДНК фрагменттеринин көпчүлүгү 150дөн 200 б.п. чейинки өлчөмдөгү кичинекей фрагменттер болуп саналат, алардын максималдуу чокусу 167 б.п. [34, 53]. ДНК фрагменттеринин кичинекей, бирок олуттуу бөлүгүнүн өлчөмү 300дөн 500 б.п.ге чейин, ал эми болжол менен 5% 900 б.п.дан узунураак [54]. Мындай өлчөмдөгү бөлүштүрүүнүн себеби, плазмадагы ccfDNAнын негизги булагы клетка өлүмүнүн натыйжасында пайда болот, бул клетка өлүмүнөн же дени сак адамдарда кан айлануу клеткаларынын некрозунан же рак менен ооругандарда шишик клеткаларынын апоптозунан (кан айлануу шишик ДНКсы деп аталат) келип чыгат. , ctDNA). Мидиялардан тапкан гемолимфа ccfDNAнын өлчөмдөгү бөлүштүрүлүшү 1000ден 5000 б.п.ге чейин болгон, бул мидия ccfDNAсынын келип чыгышы башка экенин көрсөтүп турат. Бул логикалык гипотеза, анткени мидиялар жарым ачык кан тамыр системасына ээ жана микробдук геномдук ДНКнын жогорку концентрациясын камтыган деңиз суу чөйрөсүндө жашашат. Чындыгында, экзогендик ДНКны колдонгон лабораториялык эксперименттерибиз мидиялар деңиз суусунда ДНК фрагменттерин топтой турганын, жок дегенде бир нече сааттан кийин клеткалар тарабынан сиңирилгенден кийин бузулаарын жана/же бөлүнүп чыгып,/же ар кандай уюмдарда сакталаарын көрсөттү. Клеткалардын (прокариоттук жана эукариоттук) сейрек кездешүүсүн эске алганда, клапан ичиндеги бөлүктөрдү колдонуу өз алдынча булактардан да, чет элдик булактардан да алынган ккфДНКнын көлөмүн азайтат. Эки капкактуу тубаса иммунитеттин жана кан айлануудагы фагоциттердин көп санынын маанисин эске алуу менен, биз атүгүл чет элдик ккфДНК да микроорганизмдерди жана/же клеткалык калдыктарды жутканда чет элдик ДНКны топтогон кан айлануудагы фагоциттерге бай деген гипотезаны дагы бир жолу айттык. Жалпысынан алганда, биздин жыйынтыктар эки капкактуу гемолимфа ккфДНК молекулярдык маалыматтын уникалдуу сактагычы экенин жана алардын күзөтчү түр катары статусун бекемдей турганын көрсөтүп турат.
Биздин маалыматтар бактериялардан алынган гемолимфа ccfДНК фрагменттерин секвенирлөө жана талдоо кожоюн бактерия флорасы жана айланадагы деңиз экосистемасында болгон бактериялар жөнүндө негизги маалымат бере аларын көрсөтүп турат. Атуу секвенирлөө ыкмалары салттуу 16S рРНК идентификациялоо ыкмалары колдонулганда байкалбай калмак A. atra gill комменсалдык бактерияларынын ырааттуулугун аныктады, бул жарым-жартылай шилтеме китепканасынын бир жактуулугунан улам болду. Чындыгында, Кергелендеги бир эле мидия катмарындагы M. platensisтен чогултулган LB маалыматтарын колдонуубуз желбиректер менен байланышкан бактериялык симбионттордун курамы эки мидия түрү үчүн тең бирдей экенин көрсөттү (S4-сүрөт, Кошумча маалымат). Эки генетикалык жактан ар башка мидиялардын бул окшоштугу Кергелендин муздак, күкүрттүү жана жанар тоолуу чөкмөлөрүндөгү бактериялык жамааттардын курамын чагылдырышы мүмкүн [55, 56, 57, 58]. Порт-о-Франс жээги сыяктуу биологиялык турбатталган жээк аймактарынан мидияларды чогултууда күкүрттү азайтуучу микроорганизмдердин жогорку деңгээли жакшы сүрөттөлгөн [59]. Дагы бир мүмкүнчүлүк - комменсалдык мидия флорасы горизонталдык жугуудан жабыркашы мүмкүн [60, 61]. Деңиз чөйрөсү, деңиз түбүнүн бети жана мидиялардагы симбиотикалык бактериялардын курамынын ортосундагы байланышты аныктоо үчүн көбүрөөк изилдөө жүргүзүү керек. Бул изилдөөлөр учурда уланууда.
Гемолимфа ccfДНКсынын узундугу жана концентрациясы, тазалоонун оңойлугу жана тез секвенирлөөнү камсыз кылган жогорку сапат деңиз жээк экосистемаларындагы биологиялык ар түрдүүлүктү баалоо үчүн мидия ccfДНКсын колдонуунун көптөгөн артыкчылыктарынын бири болуп саналат. Бул ыкма белгилүү бир экосистемадагы вирустук жамааттарды (виромаларды) мүнөздөө үчүн өзгөчө натыйжалуу [62, 63]. Бактериялардан, археялардан жана эукариоттордон айырмаланып, вирустук геномдордо 16S ырааттуулуктары сыяктуу филогенетикалык жактан сакталган гендер жок. Биздин жыйынтыктар мидия сыяктуу индикатор түрлөрдөн алынган суюк биопсияларды жээктеги деңиз экосистемаларында жашаган кожоюндарды жуктургандыгы белгилүү болгон салыштырмалуу көп сандагы ccfДНК вирус фрагменттерин аныктоо үчүн колдонсо болорун көрсөтүп турат. Буга жөнөкөйлөрдү, муунак буттууларды, курт-кумурскаларды, өсүмдүктөрдү жана бактериялык вирустарды (мисалы, бактериофагдарды) жуктургандыгы белгилүү вирустар кирет. Кергелендеги ошол эле мидия катмарында чогултулган көк мидиялардын (M. platensis) гемолимфа ccfДНК виромун изилдегенде окшош бөлүштүрүү табылган (S2-таблица, Кошумча маалымат). ccfДНКны мылтык менен ырааттуулукка келтирүү чындыгында адамдардын же башка түрлөрдүн вирусомун изилдөөдө күч алып жаткан жаңы ыкма болуп саналат [21, 37, 64]. Бул ыкма, айрыкча, кош тизмектүү ДНК вирустарын изилдөө үчүн пайдалуу, анткени Балтимордогу эң ар түрдүү жана кеңири вирустар классын билдирген бардык кош тизмектүү ДНК вирустарынын арасында бир дагы ген сакталган эмес [65]. Бул вирустардын көпчүлүгү классификацияланбаган бойдон калууда жана вирус дүйнөсүнүн таптакыр белгисиз бөлүгүнөн келген вирустарды камтышы мүмкүн болсо да [66], биз A. atra жана M. platensis мидияларынын вирусомдору жана кожоюн диапазондору эки түрдүн ортосунда тураарын аныктадык. окшош (S3-сүрөттү, кошумча маалыматты караңыз). Бул окшоштук таң калыштуу эмес, анткени ал айлана-чөйрөдөгү ДНКны сиңирүүдө селективдүүлүктүн жоктугун чагылдырышы мүмкүн. Учурда РНК вирусомун мүнөздөө үчүн тазаланган РНКны колдонуу менен келечектеги изилдөөлөр зарыл.
Биздин изилдөөдө биз Коварски жана кесиптештеринин [37] эмгегинен ылайыкташтырылган абдан катуу конвейерди колдондук, алар жергиликтүү ccfDNA чогултуудан мурун жана андан кийин топтолгон окууларды жана контингдерди эки баскычтуу жок кылууну колдонушкан, натыйжада карталанбаган окуулардын жогорку үлүшү пайда болгон. Ошондуктан, биз бул карталанбаган окуулардын айрымдарынын дагы эле өз келип чыгышы болушу мүмкүн экенин жокко чыгара албайбыз, негизинен бизде бул мидия түрүнүн шилтеме геному жок болгондуктан. Биз ошондой эле бул конвейерди колдондук, анткени биз өз алдынча жана өз алдынча эмес окуулардын ортосундагы химералардан жана Illumina MiSeq PE75 тарабынан түзүлгөн окуу узундугунан кооптонгонбуз. Карталанбаган окуулардын көпчүлүгүнүн дагы бир себеби, деңиз микробдорунун көпчүлүгү, айрыкча Кергуэлен сыяктуу алыскы аймактарда, аннотацияланбаган. Биз ccfDNA фрагментинин узундугу адамдын ccfDNAсына окшош деп болжолдоп, Illumina MiSeq PE75 колдондук. Келечектеги изилдөөлөр үчүн, гемолимфанын ccfDNAсы адамдарга жана/же сүт эмүүчүлөргө караганда узунураак окула тургандыгын көрсөткөн жыйынтыктарыбызды эске алуу менен, биз узунураак ccfDNA фрагменттери үчүн ылайыктуураак секвенирлөө платформасын колдонууну сунуштайбыз. Бул практика тереңирээк талдоо үчүн көбүрөөк көрсөткүчтөрдү аныктоону бир топ жеңилдетет. Учурда жеткиликтүү болбогон толук A. atra ядролук геномунун ырааттуулугун алуу ccfDNAны өз алдынча жана өз алдынча эмес булактардан айырмалоого да чоң жардам берет. Изилдөөбүз мидияларга суюк биопсия концепциясын колдонуу мүмкүнчүлүгүнө багытталгандыктан, бул концепция келечектеги изилдөөлөрдө колдонулгандыктан, мидиялардын микробдук ар түрдүүлүгүн изилдөө үчүн бул ыкманын потенциалын жогорулатуу үчүн жаңы куралдар жана түтүктөр иштелип чыгат деп үмүттөнөбүз. деңиз экосистемасы.
Инвазивдүү эмес клиникалык биомаркер катары, адамдын плазмасындагы ccfDNAнын жогорку деңгээли ар кандай оорулар, ткандардын жабыркашы жана стресстик шарттар менен байланыштуу [67,68,69]. Бул көбөйүү ткандардын жабыркашынан кийин өзүнүн келип чыгышы бар ДНК фрагменттеринин бөлүнүп чыгышы менен байланыштуу. Биз бул маселени курч жылуулук стрессин колдонуп чечтик, анда мидиялар кыска убакытка 30 °C температурага дуушар болду. Бул анализди үч көз карандысыз экспериментте үч башка мидия түрүнө жүргүздүк. Бирок, курч жылуулук стрессинен кийин ccfDNA деңгээлинде эч кандай өзгөрүү тапкан жокпуз (S5-сүрөттү, кошумча маалыматты караңыз). Бул ачылыш, жок дегенде жарым-жартылай, мидиялардын жарым-жартылай ачык кан айлануу системасына ээ экендигин жана жогорку чыпкалоо активдүүлүгүнө байланыштуу көп өлчөмдөгү бөтөн ДНКны топтой тургандыгын түшүндүрүшү мүмкүн. Башка жагынан алганда, мидиялар, көптөгөн омурткасыздар сыяктуу эле, стресстен улам ткандардын жабыркашына туруктуураак болушу мүмкүн, ошону менен алардын гемолимфасында ccfDNAнын бөлүнүп чыгышын чектейт [70, 71].
Бүгүнкү күнгө чейин суу экосистемаларындагы биологиялык ар түрдүүлүктүн ДНК анализи негизинен айлана-чөйрөнүн ДНКсын (eDNA) метабаркоддоого багытталган. Бирок, бул ыкма, адатта, праймерлер колдонулганда биологиялык ар түрдүүлүктү анализдөөдө чектелүү болот. Мылтык менен ырааттуулукту колдонуу ПЦРдин чектөөлөрүн жана праймерлердин топтомдорун бир жактуу тандоону айланып өтөт. Ошентип, кандайдыр бир мааниде, биздин ыкма жакында колдонулган жогорку өндүрүмдүүлүктөгү eDNA мылтык менен ырааттуулукту аныктоо ыкмасына жакыныраак, ал фрагменттелген ДНКны түз ырааттуулукка келтирип, дээрлик бардык организмдерди талдай алат [72, 73]. Бирок, LBны стандарттуу eDNA ыкмаларынан айырмалаган бир катар фундаменталдык маселелер бар. Албетте, eDNA менен LBнын ортосундагы негизги айырмачылык - табигый чыпкалоочу хостторду колдонуу. eDNAны изилдөө үчүн табигый чыпка катары губкалар жана кош моллюскалар (Dresseina spp.) сыяктуу деңиз түрлөрүн колдонуу жөнүндө кабарланган [74, 75]. Бирок, Дрейсенанын изилдөөсүндө ДНК алынган ткандардын биопсиялары колдонулган. LBден алынган ccfДНКны анализдөө үчүн ткандардын биопсиясы, eDNA же ткандардын биопсиясы менен байланышкан атайын жана кээде кымбат жабдуулар жана логистика талап кылынбайт. Чындыгында, жакында эле биз LBден алынган ccfДНКны муздак чынжырды сактабастан FTA колдоосу менен сактоого жана талдоого болорун билдирдик, бул алыскы аймактардагы изилдөөлөр үчүн чоң кыйынчылык болуп саналат [76]. Суюк биопсиялардан ccfДНКны бөлүп алуу да жөнөкөй жана мылтыктын секвенирлөөсү жана ПЦР анализи үчүн жогорку сапаттагы ДНКны камсыз кылат. Бул eDNA анализи менен байланышкан кээ бир техникалык чектөөлөрдү эске алганда чоң артыкчылык [77]. Үлгү алуу ыкмасынын жөнөкөйлүгү жана арзандыгы узак мөөнөттүү мониторинг программалары үчүн да өзгөчө ылайыктуу. Жогорку чыпкалоо жөндөмүнөн тышкары, кош моллюскалардын дагы бир белгилүү өзгөчөлүгү - алардын былжырынын химиялык мукополисахариддик курамы, ал вирустардын сиңишине өбөлгө түзөт [78, 79]. Бул кош моллюскаларды белгилүү бир суу экосистемасындагы биологиялык ар түрдүүлүктү жана климаттын өзгөрүшүнүн таасирин мүнөздөө үчүн идеалдуу табигый чыпкага айлантат. Кожоюндан алынган ДНК фрагменттеринин болушу eDNAга салыштырмалуу ыкманын чектөөсү катары каралышы мүмкүн болсо да, eDNAга салыштырмалуу мындай нативдүү ccfDNAга ээ болуунун баасы саламаттыкты сактоо изилдөөлөрү үчүн жеткиликтүү болгон маалыматтын көптүгү менен бир эле учурда түшүнүктүү. офсеттик кожоюн. Буга кожоюндун геномуна интеграцияланган вирустук ырааттуулуктардын болушу кирет. Бул мидиялар үчүн өзгөчө маанилүү, анткени кош капкалууларда горизонталдык жол менен жутулган лейкемиялык ретровирустар бар [80, 81]. LBнин eDNAга караганда дагы бир артыкчылыгы - ал гемолимфадагы кан айлануу клеткаларынын фагоцитардык активдүүлүгүн пайдаланат, ал микроорганизмдерди (жана алардын геномдорун) жутат. Фагоцитоз - кош капкалуулардагы кан клеткаларынын негизги функциясы [82]. Акырында, ыкма мидиялардын жогорку чыпкалоо жөндөмдүүлүгүн (орточо 1,5 л/саат деңиз суусу) жана эки күндүк кан айлануусун пайдаланат, бул деңиз суусунун ар кандай катмарларынын аралашуусун көбөйтөт, бул гетерологиялык eDNAны кармоого мүмкүндүк берет. [83, 84]. Ошентип, мидиялардын ccfDNA анализи мидиялардын азыктык, экономикалык жана экологиялык таасирин эске алганда кызыктуу багыт болуп саналат. Адамдардан чогултулган LB анализине окшош, бул ыкма экзогендик заттарга жооп катары кожоюн ДНКсындагы генетикалык жана эпигенетикалык өзгөрүүлөрдү өлчөө мүмкүнчүлүгүн ачат. Мисалы, нанопоралуу секвенирлөөнү колдонуу менен жергиликтүү ccfDNAда геном боюнча метилдөө анализин жүргүзүү үчүн үчүнчү муундагы секвенирлөө технологияларын караштырса болот. Бул процессти мидия ccfDNA фрагменттеринин узундугу химиялык трансформациялардын кереги жок бир секвенирлөө процессинен геном боюнча ДНК метилдөө анализин жүргүзүүгө мүмкүндүк берген узак окуу секвенирлөө платформалары менен идеалдуу түрдө шайкеш келиши менен жеңилдетүүгө болот.85,86] Бул кызыктуу мүмкүнчүлүк, анткени ДНК метилдөө үлгүлөрү айлана-чөйрөнүн стрессине болгон жоопту чагылдырып, көптөгөн муундар бою сакталып калаары көрсөтүлгөн. Ошондуктан, ал климаттын өзгөрүшүнө же булгоочу заттарга дуушар болгондон кийинки реакцияны жөнгө салуучу негизги механизмдер жөнүндө баалуу түшүнүк бере алат [87]. Бирок, LB колдонуу чектөөсүз эмес. Албетте, бул экосистемада индикатордук түрлөрдүн болушун талап кылат. Жогоруда айтылгандай, берилген экосистеманын биологиялык ар түрдүүлүгүн баалоо үчүн LB колдонуу үчүн булактан алынган ДНК фрагменттеринин бар экендигин эске алган катуу биоинформатикалык түтүк талап кылынат. Дагы бир чоң көйгөй - деңиз түрлөрү үчүн эталондук геномдордун болушу. Деңиз сүт эмүүчүлөрдүн геномдору долбоору жана жакында түзүлгөн Fish10k долбоору [88] сыяктуу демилгелер келечекте мындай анализди жүргүзүүгө көмөктөшөт деп үмүттөнөбүз. LB концепциясын деңиз чыпкалоочу организмдерге колдонуу секвенирлөө технологиясындагы акыркы жетишкендиктерге да шайкеш келет, бул аны экологиялык стресске жооп катары деңиз жашоо чөйрөсүнүн ден соолугу жөнүндө маанилүү маалымат берүү үчүн көп омдук биомаркерлерди иштеп чыгууга абдан ылайыктуу кылат.
Геномдук ырааттуулук маалыматтары NCBI ырааттуулук окуу архивине https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 дареги боюнча Bioprojects SRR8924808 бөлүмүнө сакталган.
Бриерли А.С., Кингсфорд М.Ж. Климаттын өзгөрүшүнүн деңиз жашоосуна жана экосистемаларына тийгизген таасири. Коул Биология. 2009; 19: P602–P614.
Гисси Э, Манеа Э, Мазарис А.Д., Фраскетти С, Альпаниду В, Бевилакуа С ж.б. Климаттын өзгөрүшүнүн жана башка жергиликтүү стресс факторлорунун деңиз чөйрөсүнө тийгизген таасиринин айкалышын карап көрүңүз. жалпы илимий чөйрө. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, ж.б. ). Биринчи марттын илими. 2020;7:48.
Серонт Л., Никастро К.Р., Зарди Г.И., Гобервилл Э. Кайталануучу жылуулук стрессинин шарттарында ысыкка чыдамдуулуктун төмөндөшү көк мидиялардын жайкы өлүмүнүн жогорку көрсөткүчүн түшүндүрөт. Илимий отчет 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сиепиелски А.М., Нуссле С., Сервантес-Йошида К., Хван Ж.Л., Хубер Э.Р. жана башкалар. Жаныбарлардын өлүмүнүн жыштыгындагы, себептериндеги жана көлөмүндөгү акыркы өзгөрүүлөр. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Бир нече түргө тиешелүү эмес козгогучтар Pinna nobilisтин массалык өлүмүнө себеп болушу мүмкүн. Жашоо. 2020;10:238.
Брэдли М, Коутс С.Ж., Дженкинс Э., О'Хара Т.М. Климаттын өзгөрүшүнүн Арктиканын зооноздук ооруларына тийгизген потенциалдуу таасири. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Бейер Дж., Грин NW, Брукс С., Аллан И.Ж., Руус А., Гомес Т. жана башкалар. Көк мидиялар (Mytilus edulis spp.) жээктеги булганууну көзөмөлдөөдө сигналдык организмдер катары: сереп. Март Айлана-чөйрөнү коргоо журналы 2017; 130:338-65.
Сиравенья Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Суюк биопсияны ракты дарылоодо интеграциялоо. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван JCM, Масси К, Гарсия-Корбачо Ж, Мульер Ф, Брентон ЖД, Калдас К ж.б. Суюк биопсия менен жетилүү: шишик ДНКсынын айланышына мүмкүндүк берет. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метайс П. Адам плазмасындагы нуклеин кислоталары. Soc Biol туунду компанияларынын жыйындарынын протоколдору. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А.Ж., Унгерер В., Холденридер С. Ракты дарылоодо молекулярдык маркер катары клеткасыз ДНКнын жаңы ролу. Биомолярдык анализдин сандык көрсөткүчү. 2019;17:100087.
Игнатиадис М., Следж Г.В., Джеффри С.С. Суюк биопсия клиникага кирет – ишке ашыруу маселелери жана келечектеги кыйынчылыктар. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент ИЛ., Редман К.В. жана башкалар. Түйүлдүктүн ДНКсы эненин плазмасында жана кан сары суусунда болот. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Ж., Шоу Г.М., Стивенсон Д.К., Куэйк С.Р. Кош бойлуулук учурунда аялдардын канындагы клеткадан тышкаркы РНКны колдонуу менен кош бойлуулуктун жүрүшүн жана анын татаалдашууларын изилдөө. Допедиатрия. 2020;8:605219.
Оллерих М, Шервуд К, Кеоун П, Шютц Э, Бек Ж, Стегбауэр Ж жана башкалар. Суюк биопсия: бөйрөк трансплантатындагы аллогендик жабыркоолорду аныктоо үчүн донордук клеткасыз ДНК колдонулат. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Пренаталдык диагностикадагы инновациялар: эненин плазма геномунун секвенирлениши. Анна М.Д. 2016;67:419-32.
Гу В, Дэн Х, Ли М, Суку ЮД, Аревало С, Страйк Д ж.б. Инфекцияланган дене суюктуктарын кийинки муундагы метагеномдук секвенирлөө менен патогендерди тез аныктоо. Nat Medicine. 2021;27:115-24.