Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جي استعمال ڪيل برائوزر ورزن ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). انهي دوران، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ رينڊر ڪنداسين.
مائع بايوپسي (LB) هڪ اهڙو تصور آهي جيڪو بايو ميڊيڪل فيلڊ ۾ تيزي سان مقبوليت حاصل ڪري رهيو آهي. هي تصور بنيادي طور تي گردش ڪندڙ خارجي سيلولر ڊي اين اي (ccfDNA) جي ٽڪرن جي ڳولا تي ٻڌل آهي، جيڪي بنيادي طور تي مختلف بافتن ۾ سيل جي موت کان پوءِ ننڍڙن ٽڪرن جي طور تي جاري ڪيا ويندا آهن. انهن ٽڪرن جو هڪ ننڍڙو حصو پرڏيهي (غير ملڪي) ٽشوز يا جاندارن مان نڪرندو آهي. موجوده ڪم ۾، اسان هن تصور کي مسلز تي لاڳو ڪيو آهي، هڪ سينٽرل نسل جيڪو انهن جي اعلي سامونڊي پاڻي جي فلٽريشن جي صلاحيت لاءِ مشهور آهي. اسان مسلز جي صلاحيت کي استعمال ڪندا آهيون ته جيئن مختلف ذريعن کان ماحولياتي ڊي اين اي ٽڪرن کي پڪڙي سگهجي ته جيئن سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام جي حياتياتي تنوع بابت معلومات مهيا ڪري سگهجي. اسان جا نتيجا ڏيکارين ٿا ته مسلز هيموليمف ۾ ڊي اين اي ٽڪرا هوندا آهن جيڪي سائيز ۾ تمام گهڻو مختلف هوندا آهن، 1 کان 5 kb تائين. شاٽگن سيڪوئنسنگ ڏيکاري ٿي ته ڊي اين اي ٽڪرن جو هڪ وڏو تعداد پرڏيهي مائڪروبيل اصل جا آهن. انهن مان، اسان بيڪٽيريا، آرڪيا ۽ وائرس مان ڊي اين اي ٽڪرا ڳوليا، جن ۾ وائرس شامل آهن جيڪي ساحلي سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ عام طور تي ملندڙ مختلف ميزبانن کي متاثر ڪرڻ لاءِ سڃاتل آهن. نتيجي ۾، اسان جو مطالعو اهو ظاهر ڪري ٿو ته LB جو تصور جيڪو مڇين تي لاڳو ٿئي ٿو، اهو سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام ۾ مائڪروبيل تنوع بابت ڄاڻ جو هڪ امير پر اڃا تائين اڻ دريافت ٿيل ذريعو آهي.
موسمياتي تبديلي (CC) جو سامونڊي ماحولياتي نظام جي حياتياتي تنوع تي اثر تحقيق جو هڪ تيزي سان وڌندڙ علائقو آهي. گلوبل وارمنگ نه رڳو اهم جسماني دٻاءُ جو سبب بڻجندي آهي، پر سامونڊي جاندارن جي حرارتي استحڪام جي ارتقائي حدن کي به ڌڪيندي آهي، ڪيترن ئي نسلن جي رهائش کي متاثر ڪندي، انهن کي وڌيڪ سازگار حالتن جي ڳولا ڪرڻ لاءِ مجبور ڪندي آهي [1، 2]. ميٽازوئن جي حياتياتي تنوع کي متاثر ڪرڻ کان علاوه، CC ميزبان-مائڪروبيل رابطي جي نازڪ توازن کي خراب ڪري ٿو. هي مائڪروبيل ڊيسبيڪٽيريوسس سامونڊي ماحولياتي نظام لاءِ هڪ سنگين خطرو پيدا ڪري ٿو ڇاڪاڻ ته اهو سامونڊي جاندارن کي متعدي پيٿوجنز لاءِ وڌيڪ حساس بڻائي ٿو [3، 4]. اهو يقين ڪيو وڃي ٿو ته SS وڏي پيماني تي موت ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو، جيڪو عالمي سامونڊي ماحولياتي نظام جي انتظام لاءِ هڪ سنگين مسئلو آهي [5، 6]. اهو هڪ اهم مسئلو آهي ڪيترن ئي سامونڊي نسلن جي معاشي، ماحولياتي ۽ غذائي اثرات کي ڏنو ويو آهي. اهو خاص طور تي قطبي علائقن ۾ رهندڙ بائيوالز لاءِ سچ آهي، جتي CK جا اثر وڌيڪ فوري ۽ سخت آهن [6، 7]. حقيقت ۾، بائيوالز جهڙوڪ مائيٽيلس ايس پي پي. سامونڊي ماحولياتي نظام تي سي سي جي اثرن جي نگراني لاءِ وڏي پيماني تي استعمال ڪيا ويندا آهن. تعجب جي ڳالهه ناهي ته، انهن جي صحت جي نگراني لاءِ نسبتاً وڏي تعداد ۾ بايو مارڪرز تيار ڪيا ويا آهن، اڪثر ڪري اينزيميٽڪ سرگرمي يا سيلولر افعال جهڙوڪ سيل جي حياتي ۽ فاگوسائيٽڪ سرگرمي [8] تي ٻڌل فنڪشنل بايو مارڪرز کي شامل ڪندڙ ٻه-ٽيئر طريقو استعمال ڪندي. انهن طريقن ۾ مخصوص دٻاءُ جي اشارن جي ڪنسنٽريشن جي ماپ پڻ شامل آهي جيڪي سمنڊ جي پاڻي جي وڏي مقدار کي جذب ڪرڻ کان پوءِ نرم بافتن ۾ جمع ٿين ٿا. بهرحال، بائيوالز جي اعليٰ فلٽريشن گنجائش ۽ نيم کليل گردش نظام مائع بايوپسي (LB) جي تصور کي استعمال ڪندي نوان هيموليمف بايو مارڪرز تيار ڪرڻ جو موقعو فراهم ڪن ٿا، جيڪو مريض جي انتظام لاءِ هڪ سادو ۽ گهٽ ۾ گهٽ ناگوار طريقو آهي. رت جا نمونا [9، 10]. جيتوڻيڪ انساني LB ۾ گردش ڪندڙ ماليڪيول جا ڪيترائي قسم ڳولي سگهجن ٿا، هي تصور بنيادي طور تي پلازما ۾ گردش ڪندڙ خارجي سيلولر ڊي اين اي (ccfDNA) ٽڪرن جي ڊي اين اي ترتيب جي تجزيي تي ٻڌل آهي. حقيقت ۾، انساني پلازما ۾ گردش ڪندڙ ڊي اين اي جي موجودگي 20 صدي جي وچ کان معلوم ٿي چڪي آهي [11]، پر اهو صرف تازن سالن ۾ آهي ته هاءِ-ٿرو پُٽ سيڪوئنسنگ طريقن جي آمد ccfDNA جي بنياد تي ڪلينڪل تشخيص جو سبب بڻي آهي. انهن گردش ڪندڙ ڊي اين اي ٽڪرن جي موجودگي جزوي طور تي سيل جي موت کان پوءِ جينومڪ ڊي اين اي (ايٽمي ۽ مائيٽوڪونڊريل) جي غير فعال ڇڏڻ جي ڪري آهي. صحتمند ماڻهن ۾، ccfDNA جي ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندي آهي (<10 ng/mL) پر مختلف بيمارين ۾ مبتلا يا دٻاءُ جو شڪار مريضن ۾ 5-10 ڀيرا وڌي سگهي ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ ٽشو نقصان ٿيندو آهي. صحتمند ماڻهن ۾، ccfDNA جي ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندي آهي (<10 ng/mL) پر مختلف بيمارين ۾ مبتلا يا دٻاءُ جو شڪار مريضن ۾ 5-10 ڀيرا وڌي سگهي ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ ٽشو نقصان ٿيندو آهي. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5-10 раз у больный низкая подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. صحتمند ماڻهن ۾، cccDNA جو ڪنسنٽريشن عام طور تي گهٽ هوندو آهي (<10 ng/mL)، پر اهو مختلف بيمارين وارن مريضن ۾ يا دٻاءُ هيٺ 5-10 ڀيرا وڌي سگهي ٿو جيڪو ٽشو کي نقصان پهچائيندو آهي.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）,但在患有各种病理或承受压力渂受受度通倍، 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 叀曭叀叀增加 5-10 倍، 从而 组织. 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцизимент. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. صحتمند ماڻهن ۾ ccfDNA جي مقدار عام طور تي گهٽ هوندي آهي (<10 ng/ml)، پر مختلف بيمارين يا دٻاءُ وارن مريضن ۾ 5-10 ڀيرا وڌي سگهي ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ ٽشو نقصان پهچندو آهي.ccfDNA جي ٽڪرن جي سائيز وڏي پيماني تي مختلف هوندي آهي، پر عام طور تي 150 کان 200 bp تائين هوندي آهي. [12]. خود نڪتل ccfDNA جو تجزيو، يعني، عام يا تبديل ٿيل ميزبان سيلز مان ccfDNA، نيوڪليئر ۽/يا مائيٽوڪونڊريل جينوم ۾ موجود جينياتي ۽ ايپي جينيٽڪ تبديلين کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو، انهي ڪري ڪلينڪن کي مخصوص ماليڪيولر-ٽارگيٽڊ ٿراپي چونڊڻ ۾ مدد ملندي آهي [13]. بهرحال، ccfDNA غير ملڪي ذريعن جهڙوڪ حمل دوران جنين جي سيلز مان ccfDNA يا ٽرانسپلانٽ ٿيل عضون مان حاصل ڪري سگهجي ٿو [14,15,16,17]. ccfDNA هڪ متعدي ايجنٽ (غير ملڪي) جي نيوڪلڪ ايسڊ جي موجودگي کي ڳولڻ لاءِ معلومات جو هڪ اهم ذريعو پڻ آهي، جيڪو رت جي ڪلچرن پاران سڃاڻپ نه ٿيل وسيع انفيڪشن جي غير جارحتي ڳولا جي اجازت ڏئي ٿو، متاثر ٿيل ٽشو جي ناگوار بايوپسي کان بچڻ [18]. تازين مطالعي مان واقعي ظاهر ٿيو آهي ته انساني رت ۾ معلومات جو هڪ امير ذريعو آهي جيڪو وائرل ۽ بيڪٽيريا پيٿوجنز کي سڃاڻڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو، ۽ اهو ته انساني پلازما ۾ مليل ccfDNA جو تقريباً 1٪ غير ملڪي اصل جو آهي [19]. انهن مطالعي مان ظاهر ٿئي ٿو ته ڪنهن جاندار جي گردش ڪندڙ مائڪرو بايوم جي حياتياتي تنوع جو اندازو ccfDNA تجزيو استعمال ڪندي لڳائي سگهجي ٿو. تاهم، تازو تائين، هي تصور خاص طور تي انسانن ۾ ۽، گهٽ حد تائين، ٻين ڪرنگهي وارن جانورن ۾ استعمال ڪيو ويندو هو [20، 21].
موجوده پيپر ۾، اسان ايل بي جي صلاحيت کي آلاڪوميا ايٽرا جي سي سي ايف ڊي اين اي جو تجزيو ڪرڻ لاءِ استعمال ڪريون ٿا، هڪ ڏکڻ نسل جيڪو عام طور تي سبانٽارڪٽڪ ڪرگولين ٻيٽن ۾ ملي ٿو، هڪ وڏي پليٽو جي مٿان ٻيٽن جو هڪ گروپ جيڪو 35 ملين سال اڳ ٺهيو هو. آتش فشاني ڦاٽڻ. هڪ ان ويٽرو تجرباتي نظام استعمال ڪندي، اسان ڏٺو ته سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ ڊي اين اي جا ٽڪرا جلدي مسلز پاران کنيا ويندا آهن ۽ هيموليمف ڪمپارٽمينٽ ۾ داخل ٿيندا آهن. شاٽگن سيڪوئنسنگ ڏيکاريو آهي ته مسلز هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي ۾ پنهنجي ۽ غير خود اصليت جا ڊي اين اي ٽڪرا شامل آهن، جن ۾ سمبيوٽڪ بيڪٽيريا ۽ ٿڌي آتش فشاني سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام جي عام بايومز مان ڊي اين اي ٽڪرا شامل آهن. هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي ۾ مختلف ميزبان رينجز سان وائرس مان نڪتل وائرل تسلسل پڻ شامل آهن. اسان کي هڏن جي مڇي، سامونڊي اينيمون، الجي ۽ حشرات جهڙن گھڻ-سيلولر جانورن مان ڊي اين اي ٽڪرا پڻ مليا. نتيجي ۾، اسان جو مطالعو اهو ظاهر ڪري ٿو ته ايل بي تصور کي ڪاميابي سان سامونڊي انورٽيبرٽس تي لاڳو ڪري سگهجي ٿو ته جيئن سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ هڪ امير جينومڪ ذخيره پيدا ٿئي.
بالغ (55-70 ملي ميٽر ڊگھا) مائيٽيلس پليٽنس (ايم. پليٽنس) ۽ اولاڪوميا ايٽرا (اي. ايٽرا) پورٽ-او-فرانس جي انٽر ٽائيڊل پٿري ڪنارن (049°21.235 ايس، 070°13.490 اي.) مان گڏ ڪيا ويا. ڊسمبر 2018 ۾ ڪرگولين ٻيٽ. ٻيا بالغ نيري مسلز (مائيٽيلس ايس پي پي) هڪ تجارتي سپلائر (PEI مسلز ڪنگ انڪارپوريٽڊ، پرنس ايڊورڊ ٻيٽ، ڪينيڊا) کان حاصل ڪيا ويا ۽ هڪ ڪنٽرول ٿيل گرمي پد (4°C) هوادار ٽينڪ ۾ رکيا ويا جنهن ۾ 10-20 ليٽر 32‰ مصنوعي برائن شامل آهي. (مصنوعي سامونڊي لوڻ ريف ڪرسٽل، انسٽنٽ اوشن، ورجينيا، آمريڪا). هر تجربي لاءِ، انفرادي خول جي ڊيگهه ۽ وزن ماپيو ويو.
هن پروگرام لاءِ هڪ مفت اوپن رسائي پروٽوڪول آن لائن موجود آهي (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). مختصر طور تي، LB هيموليف کي اغوا ڪندڙ عضون مان گڏ ڪيو ويو جيئن بيان ڪيو ويو آهي [22]. هيموليف کي 1200×g تي سينٽرفيوگيشن ذريعي 3 منٽن لاءِ واضح ڪيو ويو، سپرنيٽنٽ کي استعمال تائين منجمد ڪيو ويو (-20°C). cfDNA جي الڳ ڪرڻ ۽ صاف ڪرڻ لاءِ، نموني (1.5-2.0 ml) کي ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق NucleoSnap cfDNA ڪٽ (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) استعمال ڪندي پگھلايو ويو ۽ پروسيس ڪيو ويو. ccfDNA کي وڌيڪ تجزيو تائين -80°C تي ذخيرو ڪيو ويو. ڪجهه تجربن ۾، ccfDNA کي QIAamp DNA انويسٽيگيٽر ڪٽ (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) استعمال ڪندي الڳ ڪيو ويو ۽ صاف ڪيو ويو. صاف ٿيل DNA کي معياري PicoGreen assay استعمال ڪندي مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. الڳ ٿيل ccfDNA جي ٽڪرن جي ورڇ جو تجزيو ڪيپيلري اليڪٽرروفورسس ذريعي Agilent 2100 بايو اينالائيزر (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ذريعي هڪ اعليٰ حساسيت واري DNA ڪٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق ccfDNA نموني جي 1 µl استعمال ڪندي پرک ڪئي وئي.
هيموليمف ccfDNA ٽڪرن جي ترتيب لاءِ، جينوم ڪيوبيڪ (مونٽريال، ڪيوبيڪ، ڪينيڊا) Illumina MiSeq PE75 ڪٽ جي Illumina DNA Mix ڪٽ استعمال ڪندي شاٽگن لائبريريون تيار ڪيون. هڪ معياري اڊاپٽر (BioO) استعمال ڪيو ويو. خام ڊيٽا فائلون NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ۽ SRR8924809) مان دستياب آهن. FastQC [23] استعمال ڪندي بنيادي پڙهڻ جي معيار جو جائزو ورتو ويو. ٽرموميٽڪ [24] کي ڪلپنگ اڊاپٽر ۽ خراب معيار جي پڙهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو آهي. جوڙيل سرن سان شاٽگن پڙهڻ کي FLASH کي 20 bp جي گهٽ ۾ گهٽ اوورليپ سان ڊگهي سنگل پڙهڻ ۾ ضم ڪيو ويو ته جيئن بي ترتيبي کان بچي سگهجي [25]. ضم ٿيل پڙهڻ کي BLASTN سان هڪ بائيوال NCBI ٽيڪسونومي ڊيٽابيس (e ويليو < 1e−3 ۽ 90% هومولوجي) استعمال ڪندي اينوٽ ڪيو ويو، ۽ گهٽ پيچيدگي واري ترتيبن جي ماسڪنگ DUST [26] استعمال ڪندي ڪئي وئي. ضم ٿيل پڙهڻ کي BLASTN سان هڪ بائيوال NCBI ٽيڪسونومي ڊيٽابيس (e ويليو < 1e−3 ۽ 90% هومولوجي) استعمال ڪندي اينوٽ ڪيو ويو، ۽ گهٽ پيچيدگي واري ترتيبن جي ماسڪنگ DUST [26] استعمال ڪندي ڪئي وئي. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчативых двустворчатих 1e-3 ۽ 90٪ гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. NCBI بائيوالو ٽيڪسونومي ڊيٽابيس (e ويليو < 1e-3 ۽ 90٪ هومولوجي) استعمال ڪندي BLASTN سان پول ٿيل ريڊز کي اينوٽ ڪيو ويو، ۽ DUST [26] استعمال ڪندي گهٽ پيچيدگي واري ترتيب ماسڪنگ ڪئي وئي.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值<1e-3进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湔] dust 忻湰进行 复杂度 序列 的. . . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчать данных (значение e <1e-3 и 90% гомологии)، а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использовательности с использование 6. NCBI بائيوالو ٽيڪسونومڪ ڊيٽابيس (e ويليو <1e-3 ۽ 90٪ هومولوجي) استعمال ڪندي BLASTN سان پول ٿيل ريڊز کي اينوٽ ڪيو ويو، ۽ DUST [26] استعمال ڪندي گهٽ پيچيدگي واري ترتيب ماسڪنگ ڪئي وئي.پڙهڻ کي ٻن گروپن ۾ ورهايو ويو: بائيوالو تسلسل سان لاڳاپيل (هتي خود پڙهڻ سڏيو ويندو آهي) ۽ غير لاڳاپيل (غير خود پڙهڻ). ٻن گروپن کي الڳ الڳ MEGAHIT استعمال ڪندي گڏ ڪيو ويو ته جيئن ڪنٽيگ پيدا ٿين [27]. ساڳئي وقت، اجنبي مائڪرو بايوم پڙهڻ جي ٽيڪسونومڪ ورڇ کي Kraken2 [28] استعمال ڪندي درجه بندي ڪيو ويو ۽ گرافڪ طور تي Galaxy [29، 30] تي ڪرونا پائي چارٽ ذريعي نمائندگي ڪئي وئي. اسان جي ابتدائي تجربن مان بهترين ڪلوميٽر kmers-59 هجڻ جو تعين ڪيو ويو. پوءِ آخري تشريح لاءِ BLASTN (bivalve NCBI ڊيٽابيس، e ويليو < 1e−10 ۽ 60% هومولوجي) سان ترتيب ڏيڻ سان خود ڪنٽيگس جي سڃاڻپ ڪئي وئي. پوءِ آخري تشريح لاءِ BLASTN (bivalve NCBI ڊيٽابيس، e ويليو < 1e−10 ۽ 60% هومولوجي) سان ترتيب ڏيڻ سان خود ڪنٽيگس جي سڃاڻپ ڪئي وئي. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (بيلسٽ <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. پوءِ آخري تشريح لاءِ BLASTN (NCBI بائيوال ڊيٽابيس، e ويليو <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان ملائي پاڻ ۾ ڳنڍجڻ جي سڃاڻپ ڪئي وئي.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库،e 值<1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库،e 值<1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). پوءِ BLASTN (NCBI بائيوالو ڊيٽابيس، اي ويليو <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان ملائي آخري تشريح لاءِ سيلف-ڪونٽيگس جي سڃاڻپ ڪئي وئي. متوازي طور تي، نان سيلف گروپ ڪانٽيگس کي BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، e ويليو < 1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان اينوٽ ڪيو ويو. متوازي طور تي، نان سيلف گروپ ڪانٽيگس کي BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، e ويليو < 1e−10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان اينوٽ ڪيو ويو. Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، значение e <1e-10%06могиология). متوازي طور تي، پرڏيهي گروپ ڪانٽيگس کي BLASTN (NT NCBI ڊيٽابيس، e ويليو <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪيو ويو.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值<1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даных nt NCBI, e مجموعي طور تي 60٪). متوازي طور تي، غير خود گروپ ڪانٽيگس کي BLASTN (nt NCBI ڊيٽابيس، e ويليو <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) سان تشريح ڪيو ويو. BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq پروٽين NCBI ڊيٽابيس (e ويليو < 1e−10 ۽ 60% هومولوجي) استعمال ڪندي نان سيلف ڪانٽيگس تي ڪيو ويو. BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq پروٽين NCBI ڊيٽابيس (e ويليو < 1e−10 ۽ 60% هومولوجي) استعمال ڪندي نان سيلف ڪانٽيگس تي ڪيو ويو. BLASTX ٽاڪس был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI 60 سيڪڙو). BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq NCBI پروٽين ڊيٽابيس (e ويليو < 1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) استعمال ڪندي نان-سيلف ڪانٽيگس تي ڪيو ويو.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1m. 60 سيڪڙو). BLASTX پڻ nr ۽ RefSeq NCBI پروٽين ڊيٽابيس (e ويليو <1e-10 ۽ 60٪ هومولوجي) استعمال ڪندي نان سيلف ڪانٽيگس تي ڪيو ويو.غير خود-ڪانٽگس جا BLASTN ۽ BLASTX پول آخري ڪانٽگس جي نمائندگي ڪن ٿا (ضمني فائل ڏسو).
پي سي آر لاءِ استعمال ٿيندڙ پرائمر ٽيبل ايس 1 ۾ درج ٿيل آهن. ٽاڪ ڊي اين اي پوليمريز (بائيو بيسڪ ڪينيڊا، مارخم، او اين) سي سي ايف ڊي اين اي ٽارگيٽ جينز کي وڌائڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. هيٺ ڏنل رد عمل جون حالتون استعمال ڪيون ويون: 3 منٽن لاءِ 95 ° سي تي ڊينيچريشن، 1 منٽ لاءِ 95 ° سي، 1 منٽ لاءِ اينيلنگ گرمي پد مقرر ڪيو ويو، 1 منٽ لاءِ 72 ° سي تي ڊگهو ڪرڻ، 35 چڪر، ۽ آخرڪار 10 منٽن اندر 72 ° سي. . پي سي آر پراڊڪٽس کي ايگروز جيل (1.5٪) ۾ اليڪٽرروفورسس ذريعي الڳ ڪيو ويو جنهن ۾ SYBRTM سيف ڊي اين اي جيل اسٽين (انويٽروجن، برلنگٽن، او اين، ڪينيڊا) 95 وي تي شامل هئا.
مسلز (Mytilus spp.) کي 500 ml آڪسيجن واري سامونڊي پاڻي (32 PSU) ۾ 24 ڪلاڪن لاءِ 4°C تي ترتيب ڏنو ويو. پلازمڊ ڊي اين اي جنهن ۾ انساني گيليڪٽين-7 cDNA تسلسل (NCBI accession number L07769) کي انڪوڊ ڪندڙ هڪ داخل شامل ڪيو ويو، 190 μg/μl جي آخري ڪنسنٽريشن تي شيشي ۾ شامل ڪيو ويو. ڊي اين اي جي اضافي کان سواءِ ساڳين حالتن ۾ انڪيوبيٽ ٿيل مسلز ڪنٽرول هئا. ٽئين ڪنٽرول ٽينڪ ۾ مسلز کان سواءِ ڊي اين اي شامل هو. سامونڊي پاڻي ۾ ڊي اين اي جي معيار کي مانيٽر ڪرڻ لاءِ، هر ٽينڪ مان اشارو ڪيل وقت تي سامونڊي پاڻي جا نمونا (20 μl؛ ٽي ورجائي) ورتا ويا. پلازمڊ ڊي اين اي جي ٽريڪ ايبلٽي لاءِ، LB مسلز کي اشارو ڪيل وقتن تي ڪٽايو ويو ۽ qPCR ۽ ddPCR ذريعي تجزيو ڪيو ويو. سامونڊي پاڻي ۾ لوڻ جي مقدار وڌيڪ هجڻ جي ڪري، سڀني PCR اسيس کان اڳ aliquots کي PCR معيار جي پاڻي (1:10) ۾ ملائي ڇڏيو ويو.
ڊجيٽل ڊراپلٽ پي سي آر (ڊي ڊي پي سي آر) بايو ريڊ QX200 پروٽوڪول (مِسِساگا، اونٽاريو، ڪينيڊا) استعمال ڪندي ڪيو ويو. بهترين گرمي پد (ٽيبل ايس 1) کي طئي ڪرڻ لاءِ گرمي پد جي پروفائل استعمال ڪريو. قطرا QX200 ڊراپ جنريٽر (بائيو ريڊ) استعمال ڪندي پيدا ڪيا ويا. ڊي ڊي پي سي آر هن ريت ڪيو ويو: 5 منٽن لاءِ 95 ° سي، 30 سيڪنڊن لاءِ 95 ° سي جا 50 چڪر ۽ 1 منٽ لاءِ ڏنل اينيلنگ گرمي پد ۽ 30 سيڪنڊن لاءِ 72 ° سي، 5 منٽن لاءِ 4 ° سي ۽ 5 منٽن اندر 90 ° سي. قطرن جو تعداد ۽ مثبت رد عمل (ڪاپين جو تعداد/µl) QX200 ڊراپ ريڊر (بائيو ريڊ) استعمال ڪندي ماپيا ويا. 10,000 کان گهٽ قطرن وارا نمونا رد ڪيا ويا. هر وقت جڏهن ڊي ڊي پي سي آر هلايو ويو ته پيٽرن ڪنٽرول نه ڪيو ويو.
qPCR روٽر-جين® 3000 (ڪاربيٽ ريسرچ، سڊني، آسٽريليا) ۽ LGALS7 مخصوص پرائمر استعمال ڪندي ڪيو ويو. سڀئي مقداري PCRs QuantiFast SYBR گرين PCR ڪٽ (QIAGEN) استعمال ڪندي 20 μl ۾ ڪيا ويا. qPCR کي 95°C تي 15 منٽ انڪيوبيشن سان شروع ڪيو ويو، جنهن کان پوءِ 95°C تي 10 سيڪنڊن لاءِ 40 چڪر ۽ 60°C تي 60 سيڪنڊن لاءِ هڪ ڊيٽا گڏ ڪرڻ سان. پگھلڻ وارا وکر 5 سيڪنڊن لاءِ 95°C، 60 سيڪنڊن لاءِ 65°C، ۽ qPCR جي آخر ۾ 97°C تي لڳاتار ماپن کي استعمال ڪندي پيدا ڪيا ويا. هر qPCR کي ٽن نقلن ۾ ڪيو ويو، ڪنٽرول نمونن کان سواءِ.
جيئن ته مُسل پنهنجي اعليٰ فلٽريشن ريٽ لاءِ سڃاتا وڃن ٿا، اسان پهريان تحقيق ڪئي ته ڇا اهي سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ موجود ڊي اين اي ٽڪرن کي فلٽر ڪري ۽ برقرار رکي سگهن ٿا. اسان کي ان ۾ به دلچسپي هئي ته ڇا اهي ٽڪرا انهن جي نيم کليل لففيٽڪ سسٽم ۾ جمع ٿين ٿا. اسان هن مسئلي کي تجرباتي طور تي نيري مُسل ٽينڪن ۾ شامل ڪيل حل ٿيندڙ ڊي اين اي ٽڪرن جي قسمت کي ٽريڪ ڪندي حل ڪيو. ڊي اين اي ٽڪرن جي ٽريڪنگ کي آسان بڻائڻ لاءِ، اسان انساني گيليڪٽين-7 جين تي مشتمل پرڏيهي (خود نه) پلازمڊ ڊي اين اي استعمال ڪيو. ڊي ڊي پي سي آر سمنڊ جي پاڻيءَ ۽ مُسلن ۾ پلازمڊ ڊي اين اي ٽڪرن کي ڳولي ٿو. اسان جا نتيجا ڏيکارين ٿا ته جيڪڏهن مُسلن جي غير موجودگي ۾ سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ ڊي اين اي ٽڪرن جي مقدار وقت سان (7 ڏينهن تائين) نسبتاً مستقل رهي، ته پوءِ مُسلن جي موجودگي ۾ هي سطح تقريباً 8 ڪلاڪن اندر مڪمل طور تي غائب ٿي وئي (شڪل 1a، b). خارجي ڊي اين اي جا ٽڪرا اندروني والوولر سيال ۽ هيموليمف (شڪل 1c) ۾ 15 منٽن اندر آساني سان ڳوليا ويا. اهي ٽڪرا اڃا تائين نمائش کان پوءِ 4 ڪلاڪن تائين ڳولي سگهجن ٿا. ڊي اين اي جي ٽڪرن جي حوالي سان هي فلٽرنگ سرگرمي بيڪٽيريا ۽ الجي جي فلٽرنگ سرگرمي جي برابر آهي [31]. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته مسلز پنهنجي سيال حصن ۾ پرڏيهي ڊي اين اي کي فلٽر ۽ گڏ ڪري سگهن ٿا.
سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ پلازمڊ ڊي اين اي جي نسبتي ڪنسنٽريشن، جيڪا مڇين جي موجودگي (A) يا غير موجودگي (B) ۾ ddPCR ذريعي ماپي ويندي آهي. A ۾، نتيجا فيصد جي طور تي ظاهر ڪيا ويا آهن، دٻن جون سرحدون 75 هين ۽ 25 هين فيصد جي نمائندگي ڪنديون آهن. فٽ ٿيل لاگارٿمڪ وکر ڳاڙهي رنگ ۾ ڏيکاريل آهي، ۽ گرين رنگ ۾ ڇانو ڪيل علائقو 95٪ اعتماد جي وقفي جي نمائندگي ڪري ٿو. B ۾، ڳاڙهي لڪير اوسط جي نمائندگي ڪري ٿي ۽ نيري لڪير ڪنسنٽريشن لاءِ 95٪ اعتماد جي وقفي جي نمائندگي ڪري ٿي. C پلازمڊ ڊي اين اي جي اضافي کان پوءِ مختلف وقتن تي مڇين جي هيموليمف ۽ والوولر سيال ۾ پلازمڊ ڊي اين اي جو جمع. نتيجا مطلق ڪاپيون معلوم ٿيل/mL (±SE) جي طور تي پيش ڪيا ويا آهن.
اڳيون، اسان ڪرگولين ٻيٽن تي مسلز جي بسترن مان گڏ ڪيل مسلز ۾ ccfDNA جي اصليت جي جاچ ڪئي، جيڪي ٻيٽن جو هڪ ڏورانهين گروپ آهي جنهن ۾ محدود اينٿروپوجينڪ اثر آهي. هن مقصد لاءِ، مسلز هيموليف مان cccDNA کي الڳ ڪيو ويو ۽ انساني cccDNA کي صاف ڪرڻ لاءِ عام طور تي استعمال ٿيندڙ طريقن سان صاف ڪيو ويو [32، 33]. اسان ڏٺو ته مسلز ۾ اوسط هيموليف ccfDNA ڪنسنٽريشن گهٽ مائڪروگرام في ملي هيموليف رينج ۾ آهن (ٽيبل S2، ضمني معلومات ڏسو). ڪنسنٽريشن جي هي رينج صحتمند ماڻهن جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻي آهي (گهٽ نانوگرام في ملي ليٽر)، پر نادر ڪيسن ۾، ڪينسر جي مريضن ۾، ccfDNA جي سطح ڪيترن ئي مائڪروگرام في ملي ليٽر تائين پهچي سگهي ٿي [34، 35]. هيموليف ccfDNA جي سائيز جي ورڇ جي تجزيي مان ظاهر ٿيو ته اهي ٽڪرا سائيز ۾ تمام گهڻو مختلف آهن، 1000 bp کان 1000 bp تائين. 5000 bp تائين (شڪل 2). ساڳيا نتيجا سليڪا تي ٻڌل QIAamp جاچ ڪندڙ ڪٽ استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا، هڪ طريقو جيڪو عام طور تي فارنسڪ سائنس ۾ استعمال ڪيو ويندو آهي ته جيئن گهٽ ڪنسنٽريشن ڊي اين اي نمونن مان جينومڪ ڊي اين اي کي تيزيءَ سان الڳ ۽ صاف ڪري سگهجي، جنهن ۾ ccfDNA [36] شامل آهن.
مُسل هيموليمف جو نمائندو ccfDNA اليڪٽروفورگرام. نيوڪليو سنيپ پلازما ڪِٽ (مٿي) ۽ QIAamp ڊي اين اي جاچ ڪندڙ ڪِٽ سان ڪڍيو ويو. بي وائلن پلاٽ مُسل ۾ هيموليمف ccfDNA ڪنسنٽريشن (±SE) جي ورڇ ڏيکاري ٿو. ڪارا ۽ ڳاڙهي لڪيرون ترتيب وار وچين ۽ پهرين ۽ ٽئين چوٿين جي نمائندگي ڪن ٿيون.
انسانن ۽ پرائيميٽس ۾ تقريبن 1٪ ccfDNA جو هڪ پرڏيهي ذريعو آهي [21، 37]. بائيوالز جي نيم کليل گردش سسٽم، مائڪروبيل سان مالا مال سامونڊي پاڻي، ۽ مسل ccfDNA جي سائيز جي ورڇ کي ڏنو ويو، اسان اهو فرض ڪيو ته مسل هيموليمف ccfDNA ۾ مائڪروبيل ڊي اين اي جو هڪ امير ۽ متنوع پول شامل ٿي سگهي ٿو. هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ، اسان ڪيرگولين ٻيٽن مان گڏ ڪيل آلاڪوميا ايٽرا نمونن مان هيموليمف ccfDNA کي ترتيب ڏنو، جنهن ۾ 10 ملين کان وڌيڪ پڙهڻا مليا، جن مان 97.6٪ معيار جي ڪنٽرول مان گذريا. پوءِ پڙهڻ کي BLASTN ۽ NCBI بائيوالز ڊيٽابيس استعمال ڪندي خود ۽ غير خود ذريعن جي مطابق درجه بندي ڪيو ويو (شڪل S1، ضمني معلومات).
انسانن ۾، نيوڪليئر ۽ مائيٽوڪونڊريل ڊي اين اي ٻئي رت جي وهڪري ۾ آزاد ٿي سگهن ٿا [38]. بهرحال، موجوده مطالعي ۾، مسلز جي نيوڪليئر جينومڪ ڊي اين اي کي تفصيل سان بيان ڪرڻ ممڪن نه هو، ڇاڪاڻ ته A. atra جينوم کي ترتيب يا بيان نه ڪيو ويو آهي. تنهن هوندي، اسان بائيوالو لائبريري استعمال ڪندي اسان جي پنهنجي اصل جي ڪيترن ئي ccfDNA ٽڪرن کي سڃاڻڻ جي قابل هئاسين (شڪل S2، ضمني معلومات). اسان انهن A. atra جين جي هدايت ڪيل PCR امپليفڪيشن ذريعي اسان جي پنهنجي اصل جي DNA ٽڪرن جي موجودگي جي تصديق پڻ ڪئي جيڪي ترتيب ڏنل هئا (شڪل 3). ساڳئي طرح، ڏنو ويو ته A. atra جو mitochondrial جينوم عوامي ڊيٽابيس ۾ موجود آهي، ڪو به A. atra جي هيموليمف ۾ mitochondrial ccfDNA ٽڪرن جي موجودگي لاءِ ثبوت ڳولي سگهي ٿو. mitochondrial DNA ٽڪرن جي موجودگي PCR امپليفڪيشن ذريعي تصديق ڪئي وئي (شڪل 3).
A. atra (ڳاڙهو نقطو - اسٽاڪ نمبر: SRX5705969) ۽ M. platensis (نيرو نقطو - اسٽاڪ نمبر: SRX5705968) جي هيموليمف ۾ مختلف مائيٽوڪونڊريل جين موجود هئا جيڪي PCR پاران وڌايل هئا. Breton et al.، 2011 B مان ترتيب ڏنل شڪل A. atra مان هيموليمف سپرنيٽينٽ جي واڌ FTA پيپر تي محفوظ ڪئي وئي. PCR مکس تي مشتمل PCR ٽيوب ۾ سڌو سنئون شامل ڪرڻ لاءِ 3 ملي ميٽر پنچ استعمال ڪريو.
سمنڊ جي پاڻيءَ ۾ وافر مقدار ۾ مائڪروبيل مواد کي ڏنو ويو، اسان شروعاتي طور تي هيموليمف ۾ مائڪروبيل ڊي اين اي جي ترتيبن جي خاصيت تي ڌيان ڏنو. اهو ڪرڻ لاءِ، اسان ٻه مختلف حڪمت عمليون استعمال ڪندا آهيون. پهرين حڪمت عملي ۾ ڪرڪين 2 استعمال ڪيو ويو، هڪ الگورتھم تي ٻڌل ترتيب جي درجه بندي پروگرام جيڪو مائڪروبيل ترتيبن کي BLAST ۽ ٻين اوزارن جي مقابلي ۾ درستگي سان سڃاڻي سگهي ٿو [28]. 6719 کان وڌيڪ پڙهڻ بيڪٽيريا جي اصليت جا طئي ڪيا ويا، جڏهن ته 124 ۽ 64 ترتيب وار آرڪيا ۽ وائرس مان هئا (شڪل 4). سڀ کان وڌيڪ گهڻائي بيڪٽيريا ڊي اين اي جا ٽڪرا فرمڪيوٽس (46٪)، پروٽيوبيڪٽيريا (27٪)، ۽ بيڪٽيروائيڊيٽس (17٪) (شڪل 4a) هئا. هي تقسيم سامونڊي نيري مسل مائڪروبيوم [39، 40] جي پوئين مطالعي سان مطابقت رکي ٿي. گاما پروٽوبيڪٽيريا پرٽيوبيڪٽيريا (44٪) جو مکيه طبقو هو، جنهن ۾ ڪيترائي وائبريونلز (شڪل 4b) شامل آهن. ڊي ڊي پي سي آر طريقي سان اي. ايٽرا هيموليمف (شڪل 4 سي) [41] جي سي سي ايف ڊي اين اي ۾ ويبريو ڊي اين اي ٽڪرن جي موجودگي جي تصديق ڪئي وئي. سي سي ايف ڊي اين اي جي بيڪٽيريا جي اصليت بابت وڌيڪ معلومات حاصل ڪرڻ لاءِ، هڪ اضافي طريقو اختيار ڪيو ويو (شڪل ايس 2، اضافي معلومات). هن صورت ۾، اوورليپ ٿيل ريڊز کي پيئرڊ-اينڊ ريڊز جي طور تي گڏ ڪيو ويو ۽ BLASTN استعمال ڪندي خود (بائيوالز) يا غير خود اصليت جي طور تي درجه بندي ڪيو ويو ۽ 1e−3 جي e قدر ۽ 90٪ هومولوجي سان ڪٽ آف. هن صورت ۾، اوورليپ ٿيل ريڊز کي پيئرڊ-اينڊ ريڊز جي طور تي گڏ ڪيو ويو ۽ BLASTN استعمال ڪندي خود (بائيوالز) يا غير خود اصليت جي طور تي درجه بندي ڪيو ويو ۽ 1e−3 جي e قدر ۽ 90٪ هومولوجي سان ڪٽ آف. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как чтения моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90٪. هن صورت ۾، اوورليپنگ ريڊز کي پيئرڊ-اينڊڊ ريڊز جي طور تي گڏ ڪيو ويو ۽ BLASTN ۽ 1e-3 جي e ويليو ۽ 90٪ کان وڌيڪ هومولوجي سان ڪٽ آف استعمال ڪندي اصلي (بائيوال) يا غير اصلي طور تي درجه بندي ڪيو ويو.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用 的使用使用 blastn 和1> 90% 同源性的分类自身（双壳类）非自身... В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственчевыстированы моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90٪. هن صورت ۾، اوورليپنگ ريڊز کي پيئرڊ-اينڊڊ ريڊز جي طور تي گڏ ڪيو ويو ۽ e BLASTN ۽ 1e-3 قدرن ۽ هڪ هومولوجي حد >90٪ استعمال ڪندي پنهنجي (بائيوالز) يا غير اصلي طور تي درجه بندي ڪيو ويو.جيئن ته A. atra جينوم کي اڃا تائين ترتيب نه ڏني وئي آهي، اسان MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) اسمبلر جي ڊي نوو اسيمبلي حڪمت عملي استعمال ڪئي. ڪل 147,188 ڪانٽيگ کي اصل جي منحصر (بائيوالز) طور سڃاتو ويو آهي. انهن ڪانٽيگ کي پوءِ BLASTN ۽ BLASTX استعمال ڪندي 1e-10 جي اي-ويليوز سان ڌماڪو ڪيو ويو. هن حڪمت عملي اسان کي A. atra ccfDNA ۾ موجود 482 غير بائيوالز ٽڪرن جي سڃاڻپ ڪرڻ جي اجازت ڏني. انهن ڊي اين اي ٽڪرن مان اڌ کان وڌيڪ (57٪) بيڪٽيريا مان حاصل ڪيا ويا، خاص طور تي گل سمبيونٽس مان، جن ۾ سلفوٽروفڪ سمبيونٽس شامل آهن، ۽ گل سمبيونٽس Solemya velum (شڪل 5) مان.
قسم جي سطح تي نسبتي ڪثرت. B ٻن مکيه فائلا (فرميڪيوٽس ۽ پروٽو بيڪٽيريا) جي مائڪروبيل تنوع. ddPCR C Vibrio spp جي نمائندگي ڪندڙ واڌ. A. ٽن ايٽرا هيموليف ۾ 16S rRNA جين (نيرو) جا ٽڪرا.
ڪُل 482 گڏ ڪيل ڪانٽيگ جو تجزيو ڪيو ويو. ميٽاجينومڪ ڪانٽيگ تشريحن (پروڪاريوٽس ۽ يوڪاريوٽس) جي ٽيڪسونومڪ ورڇ جو عام پروفائل. B BLASTN ۽ BLASTX پاران سڃاڻپ ڪيل بيڪٽيريا ڊي اين اي ٽڪرن جي تفصيلي ورڇ.
ڪرڪين 2 جي تجزيي مان اهو به ظاهر ٿيو ته مسلز ccfDNA ۾ آرڪيئل ڊي اين اي جا ٽڪرا شامل آهن، جن ۾ يوري آرچيوٽا (65٪)، ڪرينارچيوٽا (24٪)، ۽ ٿورمارچيوٽا (11٪) جا ڊي اين اي ٽڪرا شامل آهن (شڪل 6a). يوري آرچيوٽا ۽ ڪرينارچيوٽا مان نڪتل ڊي اين اي ٽڪرن جي موجودگي، جيڪي اڳ ۾ ڪيليفورنيا جي مسلز جي مائڪروبيل برادري ۾ مليا هئا، حيران ڪندڙ نه هجڻ گهرجي [42]. جيتوڻيڪ يوري آرچيوٽا اڪثر ڪري انتهائي حالتن سان لاڳاپيل هوندو آهي، هاڻي اهو تسليم ڪيو ويو آهي ته يوري آرچيوٽا ۽ ڪرينارچيوٽا ٻئي سامونڊي ڪرائيوجينڪ ماحول ۾ سڀ کان عام پروڪاريوٽس مان آهن [43، 44]. مسلز ۾ ميٿانوجينڪ مائڪروجنزمن جي موجودگي حيران ڪندڙ نه آهي، ڪرگيولن پليٽيو [45] تي هيٺئين لڪيج مان وسيع ميٿين جي ليڪ ۽ ڪرگيولن ٻيٽن جي ساحل تي ممڪن مائڪروبيل ميٿين جي پيداوار جي تازي رپورٽن کي ڏنو ويو آهي [46].
پوءِ اسان جو ڌيان ڊي اين اي وائرس مان پڙهڻ ڏانهن منتقل ٿيو. اسان جي بهترين ڄاڻ موجب، هي مسلز جي وائرس جي مواد جو پهريون آف-ٽارگيٽ مطالعو آهي. جيئن توقع ڪئي وئي هئي، اسان کي بيڪٽيريوفيجز (ڪائوڊوائرلز) جا ڊي اين اي ٽڪرا مليا (شڪل 6b). بهرحال، سڀ کان عام وائرل ڊي اين اي نيوڪليو سائٽوپلاسمڪ لارج ڊي اين اي وائرس (NCLDV) جي هڪ فائلم مان ايندو آهي، جنهن کي نيوڪليئر سائيٽوپلاسمڪ لارج ڊي اين اي وائرس (NCLDV) پڻ چيو ويندو آهي، جنهن ۾ ڪنهن به وائرس جو سڀ کان وڏو جينوم هوندو آهي. هن فائلم اندر، گهڻا ڊي اين اي سيڪوئنس ميميميڊوويرڊي (58٪) ۽ پوڪسويرڊي (21٪) خاندانن سان تعلق رکن ٿا، جن جي قدرتي ميزبانن ۾ ريڙها ۽ آرٿروپوڊ شامل آهن، جڏهن ته انهن ڊي اين اي سيڪوئنس جو هڪ ننڍڙو حصو سڃاتل وائرولوجيڪل الگا سان تعلق رکي ٿو. سامونڊي يوڪريوٽڪ الگا کي متاثر ڪري ٿو. تسلسل پڻ پنڊورا وائرس مان حاصل ڪيا ويا، ڪنهن به سڃاتل وائرل نسل جي سڀ کان وڏي جينوم سائيز سان وڏو وائرس. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، وائرس سان متاثر ٿيل ميزبانن جي حد، جيئن هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي سيڪوئنسنگ ذريعي طئي ڪئي وئي آهي، نسبتا وڏي هئي (شڪل S3، اضافي معلومات). ان ۾ اهي وائرس شامل آهن جيڪي بيڪولوويرڊي ۽ ايريڊويرڊي جهڙن حشرات کي متاثر ڪن ٿا، انهي سان گڏ اهي وائرس جيڪي اموبا، الجي ۽ ڪرنگهي وارن جانورن کي متاثر ڪن ٿا. اسان کي پيٿووير سائبيرڪم جينوم سان ملندڙ تسلسل پڻ مليا. پيٽوويرسس (جنهن کي "زومبي وائرس" پڻ چيو ويندو آهي) پهريون ڀيرو سائبيريا ۾ 30,000 سال پراڻي پرما فراسٽ کان الڳ ڪيا ويا هئا [47]. ان ڪري، اسان جا نتيجا پوئين رپورٽن سان مطابقت رکن ٿا جيڪي ڏيکارين ٿا ته انهن وائرسن جون سڀئي جديد جنسون ختم نه ٿيون آهن [48] ۽ اهي وائرس دور دراز سب آرڪٽڪ سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ موجود ٿي سگهن ٿا.
آخرڪار، اسان جانچ ڪئي ته ڇا اسان ٻين گھڻ-سيلولر جانورن مان ڊي اين اي جا ٽڪرا ڳولي سگهون ٿا. BLASTN ۽ BLASTX پاران nt، nr ۽ RefSeq لائبريرين (جينومڪ ۽ پروٽين) سان ڪل 482 غير ملڪي ڪانٽيگ جي سڃاڻپ ڪئي وئي. اسان جا نتيجا ڏيکارين ٿا ته گھڻ-سيلولر جانورن جي ccfDNA جي غير ملڪي ٽڪرن ۾ هڏن جي هڏن جو DNA غالب آهي (شڪل 5). حشرات ۽ ٻين نسلن مان DNA جا ٽڪرا پڻ مليا آهن. DNA جي ٽڪرن جو هڪ نسبتا وڏو حصو سڃاڻپ نه ڪيو ويو آهي، ممڪن طور تي زميني نسلن جي مقابلي ۾ جينومڪ ڊيٽابيس ۾ وڏي تعداد ۾ سامونڊي نسلن جي گهٽ نمائندگي جي ڪري [49].
موجوده مقالي ۾، اسان LB تصور کي mussels تي لاڳو ڪريون ٿا، دليل ڏيون ٿا ته hemolymph ccfDNA شاٽ sequence سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام جي جوڙجڪ ۾ بصيرت فراهم ڪري سگهي ٿي. خاص طور تي، اسان ڏٺو ته 1) mussels hemolymph ۾ نسبتا وڏي (~1-5 kb) گردش ڪندڙ DNA ٽڪرن جي نسبتاً وڌيڪ ڪنسنٽريشن (مائڪروگرام ليول) شامل آهن؛ 2) اهي DNA ٽڪرا آزاد ۽ غير آزاد ٻئي آهن 3) انهن DNA ٽڪرن جي پرڏيهي ذريعن مان، اسان کي بيڪٽيريا، آرڪيئل ۽ وائرل DNA، انهي سان گڏ ٻين ملٽي سيلولر جانورن جو DNA مليو؛ 4) hemolymph ۾ انهن پرڏيهي ccfDNA ٽڪرن جو جمع تيزيءَ سان ٿئي ٿو ۽ mussels جي اندروني فلٽرنگ سرگرمي ۾ حصو وٺندو آهي. نتيجي ۾، اسان جو مطالعو اهو ظاهر ڪري ٿو ته LB جو تصور، جيڪو اڃا تائين بنيادي طور تي بايو ميڊيسن جي ميدان ۾ لاڳو ڪيو ويو آهي، علم جي هڪ امير پر غير دريافت ٿيل ذريعن کي انڪوڊ ڪري ٿو جيڪو سينٽينل نسلن ۽ انهن جي ماحول جي وچ ۾ رابطي کي بهتر سمجهڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو.
پرائيميٽس کان علاوه، ٿڻائتن جانورن ۾ ccfDNA جي الڳ ٿيڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي، جن ۾ چوٿون، ڪتا، ٻليون ۽ گھوڙا شامل آهن [50، 51، 52]. تاهم، اسان جي ڄاڻ موجب، اسان جو مطالعو پهريون آهي جيڪو کليل گردش نظام سان سامونڊي نسلن ۾ ccfDNA جي ڳولا ۽ ترتيب جي رپورٽ ڪري ٿو. هي جسماني خاصيت ۽ مسلز جي فلٽرنگ جي صلاحيت، گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور تي، ٻين نسلن جي مقابلي ۾ گردش ڪندڙ DNA ٽڪرن جي مختلف سائيز جي خاصيتن جي وضاحت ڪري سگهي ٿي. انسانن ۾، رت ۾ گردش ڪندڙ گھڻا DNA ٽڪرا ننڍا ٽڪرا آهن جن جي سائيز 150 کان 200 bp تائين آهي. جن جي وڌ ۾ وڌ چوٽي 167 bp آهي [34، 53]. DNA ٽڪرن جو هڪ ننڍڙو پر اهم حصو سائيز ۾ 300 ۽ 500 bp جي وچ ۾ آهي، ۽ تقريبن 5٪ 900 bp کان وڌيڪ آهن. [54]. هن سائيز جي ورڇ جو سبب اهو آهي ته پلازما ۾ ccfDNA جو مکيه ذريعو سيل جي موت جي نتيجي ۾ ٿئي ٿو، يا ته سيل جي موت جي ڪري يا صحتمند ماڻهن ۾ گردش ڪندڙ هيماٽوپوئيٽڪ سيلز جي نڪروسس جي ڪري يا ڪينسر جي مريضن ۾ ٽيومر سيلز جي اپوپٽوسس جي ڪري (جيڪو گردش ڪندڙ ٽيومر ڊي اين اي جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو).، ctDNA). هيموليمف ccfDNA جي سائيز جي ورڇ جيڪا اسان کي مسلز ۾ ملي هئي 1000 کان 5000 bp تائين هئي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته مسلز ccfDNA جي هڪ مختلف اصليت آهي. هي هڪ منطقي مفروضو آهي، ڇاڪاڻ ته مسلز ۾ هڪ نيم کليل ويسڪولر سسٽم هوندو آهي ۽ اهي سامونڊي آبي ماحول ۾ رهندا آهن جن ۾ مائڪروبيل جينومڪ ڊي اين اي جي وڏي مقدار هوندي آهي. حقيقت ۾، اسان جي ليبارٽري تجربن مان ظاهر ٿيو آهي ته مسلز سمنڊ جي پاڻي ۾ ڊي اين اي جا ٽڪرا گڏ ڪندا آهن، گهٽ ۾ گهٽ ڪجهه ڪلاڪن کان پوءِ اهي سيلولر اپٽيڪ کان پوءِ خراب ٿي ويندا آهن ۽/يا آزاد ٿي ويندا آهن ۽/يا مختلف تنظيمن ۾ ذخيرو ٿي ويندا آهن. سيلز جي نايابيت کي ڏسندي (ٻئي پروڪريوٽڪ ۽ يوڪريوٽڪ)، انٽرا والوولر ڪمپارٽمينٽ جو استعمال خود ذريعن ۽ پرڏيهي ذريعن کان ccfDNA جي مقدار کي گهٽائي ڇڏيندو. بائيوالو پيدائشي قوت مدافعت جي اهميت ۽ گردش ڪندڙ فيگوسائٽس جي وڏي تعداد کي نظر ۾ رکندي، اسان وڌيڪ اهو تصور ڪيو ته غير ملڪي سي سي ايف ڊي اين اي گردش ڪندڙ فيگوسائٽس ۾ افزوده ٿئي ٿو جيڪي مائڪروجنزمن ۽/يا سيلولر ملبے جي استعمال تي غير ملڪي ڊي اين اي گڏ ڪن ٿا. گڏ ڪري، اسان جا نتيجا ڏيکارين ٿا ته بائيوالو هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي ماليڪيولر معلومات جو هڪ منفرد ذخيرو آهي ۽ هڪ سينٽينل نسل جي حيثيت سان انهن جي حيثيت کي مضبوط ڪري ٿو.
اسان جي ڊيٽا ظاهر ڪري ٿي ته بيڪٽيريا مان نڪتل هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي ٽڪرن جي ترتيب ۽ تجزيو ميزبان بيڪٽيريا فلورا ۽ آس پاس جي سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ موجود بيڪٽيريا بابت اهم معلومات فراهم ڪري سگهي ٿو. شاٽ سيڪوئنسنگ ٽيڪنڪ ڪمنسل بيڪٽيريا اي. ايٽرا گل جي ترتيب کي ظاهر ڪيو آهي جيڪي جيڪڏهن روايتي 16S آر آر اين اي سڃاڻپ جا طريقا استعمال ڪيا وڃن ها ته ياد نه ٿين ها، جزوي طور تي هڪ ريفرنس لائبريري تعصب جي ڪري. حقيقت ۾، ڪرگولين ۾ ساڳئي مسل پرت ۾ ايم. پليٽنسس مان گڏ ڪيل ايل بي ڊيٽا جو اسان جو استعمال ڏيکاري ٿو ته گل سان لاڳاپيل بيڪٽيريا سمبيونٽس جي جوڙجڪ ٻنهي مسل نسلن لاءِ ساڳي هئي (شڪل S4، اضافي معلومات). ٻن جينياتي طور تي مختلف مسل جي هي مماثلت ڪرگولين جي ٿڌي، سلفرس، ۽ آتش فشاني ذخيرن ۾ بيڪٽيريا برادرين جي جوڙجڪ کي ظاهر ڪري سگهي ٿي [55، 56، 57، 58]. بايوٽربٽيڊ ساحلي علائقن [59]، جهڙوڪ پورٽ-او-فرانس جي ساحل مان مسل حاصل ڪرڻ وقت سلفر گهٽائڻ وارا مائڪروجنزم جي اعليٰ سطحن کي چڱي طرح بيان ڪيو ويو آهي. هڪ ٻيو امڪان اهو آهي ته ڪمنسل مُسل فلورا افقي منتقلي کان متاثر ٿي سگهي ٿو [60، 61]. سامونڊي ماحول، سمنڊ جي فرش جي مٿاڇري، ۽ مُسل ۾ سمبيوٽڪ بيڪٽيريا جي جوڙجڪ جي وچ ۾ لاڳاپي کي طئي ڪرڻ لاءِ وڌيڪ تحقيق جي ضرورت آهي. اهي مطالعي هن وقت جاري آهن.
هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي جي ڊيگهه ۽ ڪنسنٽريشن، ان جي صفائي جي آساني، ۽ تيز شاٽگن سيڪوئنسنگ جي اجازت ڏيڻ لاءِ اعليٰ معيار، سامونڊي ساحلي ماحولياتي نظام ۾ حياتياتي تنوع جو جائزو وٺڻ لاءِ مسل سي سي ايف ڊي اين اي استعمال ڪرڻ جا ڪيترائي فائدا آهن. هي طريقو خاص طور تي ڏنل ماحولياتي نظام ۾ وائرل برادرين (وائرومز) جي خاصيت لاءِ اثرائتو آهي [62، 63]. بيڪٽيريا، آرڪيا، ۽ يوڪريوٽس جي برعڪس، وائرل جينومز ۾ 16S تسلسل جهڙا فائيلوجينياتي طور تي محفوظ ٿيل جين شامل نه آهن. اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته مسل جهڙين اشاري نسلن مان مائع بايوپسي استعمال ڪري سگهجن ٿيون ته جيئن نسبتا وڏي تعداد ۾ سي سي ايف ڊي اين اي وائرس جي ٽڪرن کي سڃاڻي سگهجي جيڪي ميزبانن کي متاثر ڪن ٿا جيڪي عام طور تي ساحلي سامونڊي ماحولياتي نظام ۾ رهن ٿا. ان ۾ وائرس شامل آهن جيڪي پروٽوزوا، آرٿروپوڊس، حشرات، ٻوٽا، ۽ بيڪٽيريا وائرس (مثال طور، بيڪٽيريوفيجز) کي متاثر ڪرڻ لاءِ سڃاتل آهن. جڏهن اسان ڪرگولين ۾ ساڳئي مسل پرت ۾ گڏ ڪيل نيري مسل (ايم. پليٽينس) جي هيموليمف سي سي ايف ڊي اين اي وائرس جو معائنو ڪيو ته ساڳي تقسيم ملي وئي (ٽيبل ايس 2، ضمني معلومات). ccfDNA جي شاٽگن سيڪوئنسنگ واقعي هڪ نئون طريقو آهي جيڪو انسانن يا ٻين نسلن جي وائرس جي مطالعي ۾ رفتار حاصل ڪري رهيو آهي [21، 37، 64]. هي طريقو خاص طور تي ڊبل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي وائرس جي مطالعي لاءِ ڪارآمد آهي، ڇاڪاڻ ته بالٽيمور ۾ وائرس جي سڀ کان وڌيڪ متنوع ۽ وسيع طبقي جي نمائندگي ڪندڙ سڀني ڊبل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي وائرس ۾ ڪو به هڪ جين محفوظ نه آهي [65]. جيتوڻيڪ انهن مان گھڻا وائرس غير درجه بندي ٿيل آهن ۽ وائرل دنيا جي مڪمل طور تي اڻڄاتل حصي مان وائرس شامل ٿي سگهن ٿا [66]، اسان ڏٺو ته مسلز A. atra ۽ M. platensis جا وائرس ۽ ميزبان رينج ٻن نسلن جي وچ ۾ اچن ٿا. ساڳئي طرح (شڪل S3، اضافي معلومات ڏسو). هي مماثلت حيران ڪندڙ نه آهي، ڇاڪاڻ ته اهو ماحول ۾ موجود ڊي اين اي جي اپٽيڪ ۾ چونڊ جي گهٽتائي کي ظاهر ڪري سگهي ٿو. آر اين اي وائرس جي خاصيت لاءِ پاڪ ٿيل آر اين اي استعمال ڪندي مستقبل جي مطالعي جي ضرورت آهي.
اسان جي مطالعي ۾، اسان ڪوارسڪي ۽ ساٿين [37] جي ڪم مان ٺهيل هڪ تمام سخت پائپ لائن استعمال ڪئي، جن مقامي ccfDNA جي اسيمبلي کان اڳ ۽ بعد ۾ پول ٿيل ريڊز ۽ ڪانٽيگس جي ٻن مرحلن واري حذف کي استعمال ڪيو، جنهن جي نتيجي ۾ غير ميپ ٿيل ريڊز جو وڏو تناسب پيدا ٿيو. تنهن ڪري، اسان ان ڳالهه کي رد نٿا ڪري سگهون ته انهن مان ڪجهه غير ميپ ٿيل ريڊز اڃا تائين پنهنجي اصليت رکي سگهن ٿا، بنيادي طور تي ڇاڪاڻ ته اسان وٽ هن مسل نسل لاءِ ريفرنس جينوم ناهي. اسان هن پائپ لائن کي پڻ استعمال ڪيو ڇاڪاڻ ته اسان خود ۽ غير خود ريڊز جي وچ ۾ چيميرا ۽ Illumina MiSeq PE75 پاران پيدا ٿيندڙ پڙهڻ جي ڊيگهه بابت پريشان هئاسين. اڻ چارٽ ٿيل ريڊنگ جي اڪثريت جو هڪ ٻيو سبب اهو آهي ته گهڻو ڪري سامونڊي مائڪروبس، خاص طور تي دور دراز علائقن جهڙوڪ Kerguelen ۾، تشريح نه ڪئي وئي آهي. اسان Illumina MiSeq PE75 استعمال ڪيو، فرض ڪيو ته ccfDNA جي ٽڪرن جي ڊيگهه انساني ccfDNA سان ملندڙ جلندڙ آهي. مستقبل جي مطالعي لاءِ، اسان جي نتيجن کي ڏنو ويو آهي ته هيموليمف ccfDNA انسانن ۽/يا ٿلهي جانورن جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ پڙهڻ ۾ مدد ڪري ٿو، اسان سفارش ڪريون ٿا ته هڪ ترتيب واري پليٽ فارم استعمال ڪريو جيڪو ڊگهي ccfDNA ٽڪرن لاءِ وڌيڪ مناسب هجي. هي عمل گہرے تجزيي لاءِ وڌيڪ اشارن جي سڃاڻپ ڪرڻ کي تمام آسان بڻائيندو. هن وقت دستياب مڪمل A. atra نيوڪليئر جينوم جي ترتيب حاصل ڪرڻ سان ccfDNA جي خود ۽ غير خود ذريعن کان امتياز کي تمام گهڻو آسان بڻائيندو. ڏنو ويو آهي ته اسان جي تحقيق مائع بايوپسي جي تصور کي مسلز تي لاڳو ڪرڻ جي امڪان تي ڌيان ڏنو آهي، اسان اميد ڪريون ٿا ته جيئن هي تصور مستقبل جي تحقيق ۾ استعمال ڪيو ويندو، نوان اوزار ۽ پائپ لائنون تيار ڪيون وينديون ته جيئن مسلز جي مائڪروبيل تنوع جو مطالعو ڪرڻ لاءِ هن طريقي جي صلاحيت کي وڌايو وڃي. سامونڊي ماحولياتي نظام.
هڪ غير ناگوار ڪلينڪل بايو مارڪر جي طور تي، ccfDNA جي بلند انساني پلازما سطح مختلف بيمارين، ٽشو نقصان، ۽ دٻاءُ جي حالتن سان لاڳاپيل آهن [67,68,69]. هي واڌارو ٽشو نقصان کان پوءِ پنهنجي اصل جي ڊي اين اي ٽڪرن جي ڇڏڻ سان لاڳاپيل آهي. اسان هن مسئلي کي تيز گرمي جي دٻاءُ استعمال ڪندي حل ڪيو، جنهن ۾ ٿلهن کي مختصر طور تي 30 °C جي گرمي پد تي ظاهر ڪيو ويو. اسان ٽن آزاد تجربن ۾ ٽن مختلف قسمن جي ٿلهن تي هي تجزيو ڪيو. جڏهن ته، اسان کي تيز گرمي جي دٻاءُ کان پوءِ ccfDNA جي سطحن ۾ ڪا به تبديلي نه ملي (شڪل S5، اضافي معلومات ڏسو). هي دريافت گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور تي، حقيقت جي وضاحت ڪري سگهي ٿي ته ٿلهن ۾ هڪ نيم کليل گردش نظام هوندو آهي ۽ انهن جي اعلي فلٽرنگ سرگرمي جي ڪري وڏي مقدار ۾ پرڏيهي ڊي اين اي گڏ ڪندا آهن. ٻئي طرف، ٿلها، ڪيترن ئي غير فقاري جانورن وانگر، دٻاءُ جي ڪري ٽشو نقصان جي خلاف وڌيڪ مزاحمتي ٿي سگهن ٿا، ان ڪري انهن جي هيموليمف ۾ ccfDNA جي ڇڏڻ کي محدود ڪري ٿو [70, 71].
اڄ تائين، آبي ماحولياتي نظامن ۾ حياتياتي تنوع جي ڊي اين اي تجزيي ۾ بنيادي طور تي ماحولياتي ڊي اين اي (eDNA) ميٽابارڪوڊنگ تي ڌيان ڏنو ويو آهي. بهرحال، هي طريقو عام طور تي حياتياتي تنوع جي تجزيي ۾ محدود هوندو آهي جڏهن پرائمر استعمال ڪيا ويندا آهن. شاٽگن سيڪوئنسنگ جو استعمال پي سي آر جي حدن ۽ پرائمر سيٽن جي جانبدار چونڊ کي ختم ڪري ٿو. تنهن ڪري، هڪ لحاظ کان، اسان جو طريقو تازو استعمال ٿيل هاءِ-ٿرو پُٽ اي ڊي اين اي شاٽگن سيڪوئنسنگ طريقي جي ويجهو آهي، جيڪو سڌو سنئون ٽڪرا ٿيل ڊي اين اي کي ترتيب ڏيڻ ۽ تقريبن سڀني جاندارن جو تجزيو ڪرڻ جي قابل آهي [72، 73]. بهرحال، ڪيترائي بنيادي مسئلا آهن جيڪي LB کي معياري اي ڊي اين اي طريقن کان ڌار ڪن ٿا. يقيناً، اي ڊي اين اي ۽ ايل بي جي وچ ۾ مکيه فرق قدرتي فلٽر هوسٽ جو استعمال آهي. اي ڊي اين اي جي مطالعي لاءِ قدرتي فلٽر طور سامونڊي نسلن جهڙوڪ اسپنج ۽ بائيوالوز (ڊريسينا ايس پي پي) جو استعمال رپورٽ ڪيو ويو آهي [74، 75]. بهرحال، ڊريسينا جي مطالعي ۾ ٽشو بايوپسي استعمال ڪئي وئي جنهن مان ڊي اين اي ڪڍيو ويو هو. ايل بي مان سي سي ايف ڊي اين اي جي تجزيي لاءِ ٽشو بايوپسي، خاص ۽ ڪڏهن ڪڏهن مهانگو سامان ۽ اي ڊي اين اي يا ٽشو بايوپسي سان لاڳاپيل رسد جي ضرورت ناهي. حقيقت ۾، اسان تازو ئي رپورٽ ڪئي آهي ته ايل بي مان سي سي ايف ڊي اين اي کي ڪولڊ چين برقرار رکڻ کان سواءِ ايف ٽي اي سپورٽ سان ذخيرو ۽ تجزيو ڪري سگهجي ٿو، جيڪو ڏورانهن علائقن ۾ تحقيق لاءِ هڪ وڏو چئلينج آهي [76]. مائع بايوپسي مان سي سي ايف ڊي اين اي ڪڍڻ پڻ سادو آهي ۽ شاٽگن سيڪوئنسنگ ۽ پي سي آر تجزيي لاءِ اعليٰ معيار جو ڊي اين اي فراهم ڪري ٿو. اي ڊي اين اي تجزيي سان لاڳاپيل ڪجهه ٽيڪنيڪل حدون ڏنل هڪ وڏو فائدو آهي [77]. نموني جي طريقي جي سادگي ۽ گهٽ قيمت پڻ ڊگهي مدت جي نگراني پروگرامن لاءِ خاص طور تي مناسب آهي. انهن جي اعليٰ فلٽرنگ جي صلاحيت کان علاوه، بائيوالوز جي هڪ ٻي مشهور خاصيت انهن جي بلغم جي ڪيميائي ميوڪوپوليسڪرائڊ ساخت آهي، جيڪا وائرس جي جذب کي فروغ ڏئي ٿي [78، 79]. اهو بائيوالوز کي هڪ مثالي قدرتي فلٽر بڻائي ٿو جيڪو هڪ ڏنل آبي ماحولياتي نظام ۾ حياتياتي تنوع ۽ موسمياتي تبديلي جي اثر کي بيان ڪري ٿو. جيتوڻيڪ ميزبان مان نڪتل ڊي اين اي ٽڪرن جي موجودگي کي eDNA جي مقابلي ۾ طريقي جي حد جي طور تي ڏسي سگهجي ٿو، eDNA جي مقابلي ۾ اهڙي اصلي ccfDNA هجڻ سان لاڳاپيل قيمت صحت جي مطالعي لاءِ موجود معلومات جي وڏي مقدار لاءِ هڪ ئي وقت سمجھڻ لائق آهي. آفسيٽ هوسٽ. ان ۾ ميزبان هوسٽ جي جينوم ۾ ضم ٿيل وائرل تسلسل جي موجودگي شامل آهي. اهو خاص طور تي مسلز لاءِ اهم آهي، بائيوالز ۾ افقي طور تي منتقل ٿيل ليوڪيمڪ ريٽرو وائرس جي موجودگي کي ڏنو ويو آهي [80، 81]. eDNA تي LB جو هڪ ٻيو فائدو اهو آهي ته اهو هيموليمف ۾ گردش ڪندڙ رت جي سيلن جي فگوسائيٽڪ سرگرمي جو استحصال ڪري ٿو، جيڪو مائڪروجنزمن (۽ انهن جي جينوم) کي گهيرو ڪري ٿو. بائيوالز ۾ رت جي سيلن جو مکيه ڪم فيگوسائيٽوسس آهي [82]. آخرڪار، طريقو مسلز جي اعلي فلٽرنگ صلاحيت (اوسط 1.5 l/h سامونڊي پاڻي) ۽ ٻن ڏينهن جي گردش جو فائدو وٺندو آهي، جيڪو سمنڊ جي پاڻي جي مختلف تہن جي ميلاپ کي وڌائيندو آهي، هيٽرولوگس اي ڊي اين اي کي پڪڙڻ جي اجازت ڏيندو آهي. [83، 84]. تنهن ڪري، مُسل ccfDNA تجزيو هڪ دلچسپ رستو آهي جيڪو مُسل جي غذائي، معاشي ۽ ماحولياتي اثرن کي ڏنو ويو آهي. انسانن مان گڏ ڪيل LB جي تجزيي وانگر، هي طريقو خارجي مادن جي جواب ۾ ميزبان ڊي اين اي ۾ جينياتي ۽ ايپي جينيٽڪ تبديلين کي ماپڻ جي امڪان کي به کوليندو آهي. مثال طور، ٽئين نسل جي ترتيب واري ٽيڪنالاجي کي تصور ڪري سگهجي ٿو ته جيئن نانوپور ترتيب استعمال ڪندي مقامي ccfDNA ۾ جينوم-وائڊ ميٿيليشن تجزيو ڪيو وڃي. هن عمل کي انهي حقيقت سان آسان بڻايو وڃي ته مُسل ccfDNA ٽڪرن جي ڊيگهه مثالي طور تي ڊگهي پڙهڻ واري ترتيب واري پليٽ فارمن سان مطابقت رکي ٿي جيڪي ڪيميائي تبديلين جي ضرورت کان سواءِ هڪ واحد ترتيب مان جينوم-وائڊ ڊي اين اي ميٿيليشن تجزيو هلائڻ جي اجازت ڏين ٿا.85,86] هي هڪ دلچسپ امڪان آهي، ڇاڪاڻ ته اهو ڏيکاريو ويو آهي ته ڊي اين اي ميٿيليشن نمونا ماحولياتي دٻاءُ جي ردعمل کي ظاهر ڪن ٿا ۽ ڪيترن ئي نسلن تائين برقرار رهن ٿا. تنهن ڪري، اهو موسمياتي تبديلي يا آلودگي جي نمائش کان پوءِ ردعمل کي سنڀاليندڙ بنيادي ميڪانيزم ۾ قيمتي بصيرت فراهم ڪري سگهي ٿو [87]. بهرحال، LB جو استعمال حدن کان سواءِ ناهي. چوڻ جي ضرورت ناهي، ان لاءِ ماحولياتي نظام ۾ اشاري جي نسلن جي موجودگي جي ضرورت آهي. جيئن مٿي ذڪر ڪيو ويو آهي، ڏنل ماحولياتي نظام جي حياتياتي تنوع جو جائزو وٺڻ لاءِ LB استعمال ڪرڻ لاءِ هڪ سخت بايو انفارميٽڪس پائپ لائن جي ضرورت آهي جيڪا ذريعن مان DNA ٽڪرن جي موجودگي کي مدنظر رکي ٿي. هڪ ٻيو وڏو مسئلو سامونڊي نسلن لاءِ ريفرنس جينومز جي دستيابي آهي. اميد آهي ته مئرين ميمل جينومز پروجيڪٽ ۽ تازو قائم ڪيل فش 10k پروجيڪٽ [88] جهڙا قدم مستقبل ۾ اهڙي تجزيي کي آسان بڻائيندا. مئرين فلٽر فيڊنگ آرگنزمز تي LB تصور جو اطلاق سيڪوئنسنگ ٽيڪنالاجي ۾ جديد ترقي سان پڻ مطابقت رکي ٿو، ان کي ماحولياتي دٻاءُ جي جواب ۾ سامونڊي رهائش جي صحت بابت اهم معلومات فراهم ڪرڻ لاءِ ملٽي اوهم بايو مارڪرز جي ترقي لاءِ مناسب بڻائي ٿو.
جينوم سيڪوئنسنگ ڊيٽا اين سي بي آءِ سيڪوئنس ريڊ آرڪائيو https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ۾ بايو پروجيڪٽس SRR8924808 تحت جمع ڪيو ويو آهي.
بريئرلي اي ايس، ڪنگس فورڊ ايم جي سامونڊي زندگي ۽ ماحولياتي نظام تي موسمياتي تبديلي جو اثر. ڪول بايولوجي. 2009؛ 19: پي 602–پي 614.
گيسي اي، مانيا اي، مزاريس اي ڊي، فريشيٽي ايس، المپانيڊو وي، بيويلاڪوا ايس، وغيره. سامونڊي ماحول تي موسمياتي تبديلي ۽ ٻين مقامي دٻاءُ جي گڏيل اثرن تي غور ڪريو. عام سائنسي ماحول. 2021;755:142564.
ڪاريلا ايف، اينٽوفرمو اي، فارينا ايس، سالاتي ايف، منڊاس ڊي، پراڊو پي، وغيره. ). پهرين مارچ جي سائنس. 2020؛ 7:48.
سيرونٽ ايل، نڪاسٽرو سي آر، زردي جي آءِ، گوبرويل اي. بار بار گرمي جي دٻاءُ واري حالتن ۾ گرمي برداشت ۾ گهٽتائي نيري مُسلن جي اونهاري جي موت جي شرح کي بيان ڪري ٿي. سائنسي رپورٽ 2019؛ 9:17498.
في ايس بي، سيپيلسڪي اي ايم، نسل ايس، سروينٽس-يوشيدا ڪي، هوان جي ايل، هوبر اي آر، وغيره. جانورن جي موت جي تعدد، سببن ۽ حد ۾ تازيون تبديليون. پروڪ نيٽل اڪيڊمي سائنس يو ايس اي. 2015؛ 112: 1083-8.
اسڪرپا ايف، سننا ڊي، ايزينا آء، ميگيٽي ڊي، سيروتي ايف، حسيني ايس، وغيره. گھڻن غير جنس-مخصوص پيٿوجنز شايد پينا نوبلس جي وڏي موت جو سبب بڻجن ٿيون. زندگي. 2020؛ 10:238.
بريڊلي ايم، ڪائوٽس ايس جي، جينڪنز اي، او هارا ٽي ايم. آرڪٽڪ زونوٽڪ بيمارين تي موسمياتي تبديلي جو امڪاني اثر. انٽ جي سرڪمپولر هيلٿ. 2005؛ 64:468-77.
بيئر جي.، گرين اين ڊبليو، بروڪس ايس.، ايلن آءِ جي، روئس اي.، گوميز ٽي. وغيره. ساحلي آلودگي جي نگراني ۾ سگنل آرگنزم جي طور تي نيرو مسلز (مائيٽيلس ايڊولس ايس پي پي): هڪ جائزو. مارچ اينوائرون ريس 2017؛ 130:338-65.
سيراويگنا جي، مارسوني ايس، سينا ​​ايس، بارڊيلي اي. ڪينسر جي علاج ۾ مائع بايوپسي جو انضمام. نيٽ ريو ڪلين آنڪول. 2017؛ 14:531-48.
وان جي سي ايم، ماسي سي، گارسيا-ڪورباچو جي، موليئر ايف، برينٽن جي ڊي، ڪالڊاس سي، وغيره. مائع بايوپسي پختگي: ٽيومر ڊي اين اي کي گردش ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي. نيٽ ريو ڪينسر. 2017؛ 17: 223-38.
منڊل پي.، ميٽائيس پي. انساني پلازما ۾ نيوڪليڪ ايسڊز. سوڪ بائيول جي ماتحت ادارن جي ميٽنگ منٽس. 1948؛ 142:241-3.
برونڪ هورسٽ اي جي، انگرر ڊبليو، هولڊنريڊر ايس. ڪينسر جي علاج لاءِ ماليڪيولر مارڪر جي طور تي سيل فري ڊي اين اي لاءِ هڪ نئون ڪردار. بايومولر تجزيي جي مقدار. 2019;17:100087.
اگنيٽيڊيس ايم.، سليج جي ڊبليو، جيفري ايس ايس لڪائيڊ بايوپسي ڪلينڪ ۾ داخل ٿئي ٿي - عملدرآمد جا مسئلا ۽ مستقبل جا چئلينج. نيٽ ريو ڪلين آنڪول. 2021؛ 18:297–312.
لو واءِ ايم، ڪوربيٽا اين، چيمبرلين پي ايف، راءِ ڊبليو، سارجنٽ آءِ ايل، ريڊمين سي ڊبليو ۽ ٻيا. جنين جو ڊي اين اي ماءُ جي پلازما ۽ سيرم ۾ موجود هوندو آهي. لينسيٽ. 1997؛ 350:485-7.
مفري ايم اين، وانگ آر جي، شا جي ايم، اسٽيونسن ڊي ڪي، ڪوئڪ ايس آر حمل دوران عورتن جي رت ۾ گردش ڪندڙ خارجي سيلولر آر اين اي استعمال ڪندي حمل جي دوران ۽ ان جي پيچيدگين جو مطالعو. ڊوپيڊياٽرڪس. 2020;8:605219.
اوليرچ ايم، شيروڊ ڪي، ڪيوون پي، شوٽز اي، بيڪ جي، اسٽيگباؤر جي، وغيره. مائع بايوپسي: ڊونر سيل فري ڊي اين اي گردن جي گرافٽ ۾ الوجينڪ زخمن کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. نيٽ ريو نيفرول. 2021؛ 17:591-603.
جوان ايف سي، لو وائي ايم پيدائش کان اڳ جي تشخيص ۾ جدت: ماءُ جي پلازما جينوم جي ترتيب. انا ايم ڊي. 2016; 67: 419-32.
گو ڊبليو، ڊينگ ايڪس، لي ايم، سوڪو وائي ڊي، اريوالو ايس، اسٽرائڪ ڊي، وغيره. متاثر ٿيل جسماني رطوبتن جي ايندڙ نسل جي ميٽاجينومڪ ترتيب سان تيز پيٿوجن جي سڃاڻپ. نيٽ ميڊيسن. 2021;27:115-24.