Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Suyuq biopsiya (LB) - bu biotibbiyot sohasida tez mashhurlik kasb etayotgan tushuncha. Kontseptsiya asosan aylanib yuruvchi hujayradan tashqari DNK (ccfDNK) parchalarini aniqlashga asoslangan bo'lib, ular asosan turli to'qimalarda hujayra o'lganidan keyin kichik bo'laklar sifatida chiqariladi. Ushbu bo'laklarning kichik bir qismi begona (begona) to'qimalar yoki organizmlardan kelib chiqadi. Joriy ishda biz ushbu tushunchani dengiz suvini yuqori filtrlash qobiliyati bilan mashhur bo'lgan midiya turlariga qo'lladik. Biz dengiz qirg'oqlari ekotizimlarining biologik xilma-xilligi haqida ma'lumot berish uchun turli manbalardan atrof-muhit DNK qismlarini olish uchun midiyalarning tabiiy filtr sifatida harakat qilish qobiliyatidan foydalanamiz. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya gemolimfasida kattaligi 1 dan 5 kb gacha bo'lgan DNK bo'laklari mavjud. O'q otish qurollari ketma-ketligi shuni ko'rsatdiki, ko'p sonli DNK bo'laklari begona mikroblardan kelib chiqqan. Ular orasida biz bakteriyalar, arxeya va viruslardan DNK parchalarini topdik, shu jumladan qirg'oq dengiz ekotizimlarida keng tarqalgan turli xostlarni yuqtirishi ma'lum bo'lgan viruslar. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz midiyalarga nisbatan qo'llaniladigan LB kontseptsiyasi dengiz qirg'oq ekotizimlarida mikrobial xilma-xillik to'g'risida boy, ammo hali o'rganilmagan bilim manbai ekanligini ko'rsatadi.
Iqlim o'zgarishining (CC) dengiz ekotizimlarining biologik xilma-xilligiga ta'siri tez o'sib borayotgan tadqiqot sohasidir. Global isish nafaqat muhim fiziologik stresslarni keltirib chiqarmoqda, balki dengiz organizmlarining termal barqarorligining evolyutsion chegaralarini oshirib, bir qator turlarning yashash muhitiga ta'sir qiladi va ularni yanada qulayroq sharoitlarni izlashga undaydi [1, 2]. Metazoanlarning biologik xilma-xilligiga ta'sir qilishdan tashqari, CC mezbon-mikrobial o'zaro ta'sirlarning nozik muvozanatini buzadi. Ushbu mikrobial disbakterioz dengiz ekotizimlari uchun jiddiy xavf tug'diradi, chunki u dengiz organizmlarini yuqumli patogenlarga ko'proq moyil qiladi [3, 4]. SS global dengiz ekotizimlarini boshqarish uchun jiddiy muammo bo'lgan ommaviy o'limda muhim rol o'ynaydi, deb ishoniladi [5, 6]. Bu ko'plab dengiz turlarining iqtisodiy, ekologik va ozuqaviy ta'sirini hisobga olgan holda muhim masala. Bu, ayniqsa, qutbli hududlarda yashovchi ikki pallalilar uchun to'g'ri keladi, bu erda CK ta'siri tezroq va kuchliroqdir [6, 7]. Aslida, Mytilus spp kabi ikki pallali. CC ning dengiz ekotizimlariga ta'sirini kuzatish uchun keng qo'llaniladi. Ajablanarli emaski, ularning sog'lig'ini kuzatish uchun nisbatan ko'p sonli biomarkerlar ishlab chiqilgan bo'lib, ular ko'pincha fermentativ faollik yoki hujayra hayotiyligi va fagotsitar faollik kabi hujayra funktsiyalariga asoslangan funktsional biomarkerlarni o'z ichiga olgan ikki bosqichli yondashuvdan foydalanadilar [8]. Ushbu usullar, shuningdek, ko'p miqdorda dengiz suvi so'rilganidan keyin yumshoq to'qimalarda to'plangan maxsus bosim ko'rsatkichlarining kontsentratsiyasini o'lchashni o'z ichiga oladi. Shu bilan birga, ikki pallalilarning yuqori filtrlash qobiliyati va yarim ochiq qon aylanish tizimi bemorlarni boshqarishda oddiy va minimal invaziv yondashuv bo'lgan suyuq biopsiya (LB) kontseptsiyasidan foydalangan holda yangi gemolimfa biomarkerlarini ishlab chiqish imkoniyatini beradi. qon namunalari [9, 10]. Inson LBda aylanma molekulalarning bir nechta turlarini topish mumkin bo'lsa-da, bu kontseptsiya birinchi navbatda plazmadagi aylanma hujayradan tashqari DNK (ccfDNA) bo'laklarining DNK ketma-ketligini tahlil qilishga asoslangan. Darhaqiqat, inson plazmasida aylanib yuruvchi DNK mavjudligi 20-asrning oʻrtalaridan beri maʼlum boʻlgan [11], lekin faqat keyingi yillarda yuqori oʻtkazuvchanlik sekvensiyasi usullarining paydo boʻlishi ccfDNK asosida klinik tashxis qoʻyishga olib keldi. Ushbu aylanma DNK fragmentlarining mavjudligi qisman hujayra o'limidan so'ng genomik DNKning (yadro va mitoxondrial) passiv chiqishi bilan bog'liq. Sog'lom odamlarda ccfDNK kontsentratsiyasi odatda past bo'ladi (<10 ng/ml), lekin turli patologiyalardan aziyat chekadigan yoki stressga duchor bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi. Sog'lom odamlarda ccfDNK kontsentratsiyasi odatda past bo'ladi (<10 ng/ml), lekin turli patologiyalardan aziyat chekadigan yoki stressga duchor bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi. U zdorovyx ludey joylashuvi vkDNK v norme nizkaya (<10 ng/ml), lekin mumkin povyshaya v 5-10 razlichnoy patologik yoki podvergayuschyhsya stressu, privodyaschemu k povrejdenyu tkaney. Sog'lom odamlarda cccDNA kontsentratsiyasi odatda past (<10 ng / ml), ammo turli patologiyalari bo'lgan yoki to'qimalarning shikastlanishiga olib keladigan stressli bemorlarda u 5-10 baravar oshishi mumkin.ccfDNA língíngíngíngíngjínjínjínjínjín (<10) ng/mL），mīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngčichàngāng yāngī, ccfdna yāngāng yīng yī (<10 ng/ml）) 5-10 shn, mēngčičičičičičičičičić mínKonsentratsii ccfDNA obychno nizkie (<10 ng/ml) u zdorovyx lumey, lekin 5-10 razryadli bemorlarning turli xil kasalliklari yoki stressi, chto privodit k povrejdenyu tkaney mumkin. Sog'lom odamlarda ccfDNA kontsentratsiyasi odatda past (<10 ng / ml), lekin turli patologiyalar yoki stressli bemorlarda 5-10 barobar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi.ccfDNK fragmentlarining o'lchami juda katta farq qiladi, lekin odatda 150 dan 200 bp gacha. [12]. O'z-o'zidan olingan ccfDNK tahlili, ya'ni normal yoki o'zgartirilgan xost hujayralaridan ccfDNK, yadro va/yoki mitoxondriyal genomda mavjud bo'lgan genetik va epigenetik o'zgarishlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin va shu bilan klinisyenlarga maxsus molekulyar maqsadli terapiyani tanlashda yordam beradi [13]. Biroq, ccfDNKni homiladorlik paytida homila hujayralaridan yoki transplantatsiya qilingan organlardan ccfDNK kabi xorijiy manbalardan olish mumkin [14,15,16,17]. ccfDNK, shuningdek, infektsion agentning (chet el) nuklein kislotalari mavjudligini aniqlash uchun muhim ma'lumot manbai bo'lib, bu qon madaniyati bilan aniqlanmagan keng tarqalgan infektsiyalarni invaziv bo'lmagan holda aniqlashga, infektsiyalangan to'qimalarning invaziv biopsiyasidan qochishga imkon beradi [18]. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, inson qoni virusli va bakterial patogenlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan boy ma'lumot manbasini o'z ichiga oladi va inson plazmasida topilgan ccfDNK ning taxminan 1% begona kelib chiqishi [19]. Ushbu tadqiqotlar organizmning aylanma mikrobiomasining biologik xilma-xilligini ccfDNK tahlili yordamida baholash mumkinligini ko'rsatadi. Biroq, yaqin vaqtgacha bu tushuncha faqat odamlarda va kamroq darajada boshqa umurtqali hayvonlarda qo'llanilgan [20, 21].
Ushbu maqolada biz LB potentsialidan 35 million yil oldin shakllangan katta plato tepaligidagi orollar guruhi bo'lgan, subantarktikadagi Kerguelen orollarida keng tarqalgan janubiy turdagi Aulakomya atraning ccfDNKsini tahlil qilish uchun foydalanamiz. vulqon otilishi. In vitro eksperimental tizimdan foydalanib, biz dengiz suvidagi DNK parchalari midiya tomonidan tezda olib ketilishi va gemolimfa bo'linmasiga kirishini aniqladik. O'q otish quroli ketma-ketligi midiya gemolimfa ccfDNK ning o'ziga xos va o'ziga xos bo'lmagan DNK bo'laklarini, jumladan, simbiotik bakteriyalarni va sovuq vulqon dengiz qirg'oq ekotizimlariga xos bo'lgan biomlarning DNK qismlarini o'z ichiga olishini ko'rsatdi. Gemolimfa ccfDNK shuningdek, turli xost diapazoniga ega bo'lgan viruslardan olingan virusli ketma-ketlikni o'z ichiga oladi. Biz, shuningdek, suyakli baliqlar, dengiz anemonlari, suv o'tlari va hasharotlar kabi ko'p hujayrali hayvonlarning DNK qismlarini topdik. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, LB kontseptsiyasi dengiz ekotizimlarida boy genomik repertuar yaratish uchun dengiz umurtqasizlariga muvaffaqiyatli qo'llanilishi mumkin.
Kattalar (uzunligi 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) va Aulacomya atra (A. atra) Port-o-Fransiyaning (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.) gelgitlararo qoyali qirg'oqlaridan to'plangan. 2018 yil dekabr oyida Kerguelen orollari. Boshqa katta yoshli ko'k midiya (Mytilus spp.) tijorat yetkazib beruvchidan (PEI Mussel King Inc., Prince Edvard oroli, Kanada) olingan va 10-20 L 32‰ sun'iy sho'r suvi bo'lgan haroratni nazorat qiluvchi (4 ° C) gazlangan idishga joylashtirilgan. (sun'iy dengiz tuzi Reef Crystal, Instant Ocean, Virjiniya, AQSh). Har bir tajriba uchun alohida qobiqlarning uzunligi va og'irligi o'lchandi.
Ushbu dastur uchun bepul ochiq kirish protokoli onlaynda mavjud (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Qisqacha aytganda, LB gemolimfa ta'riflanganidek o'g'irlab ketuvchi mushaklardan yig'ilgan [22]. Gemolimfa 1200 × g 3 daqiqa davomida santrifüjlash orqali aniqlandi, supernatant ishlatilgunga qadar muzlatilgan (-20 ° C). CfDNKni izolyatsiya qilish va tozalash uchun namunalar (1,5-2,0 ml) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq NucleoSnap cfDNA to'plami (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) yordamida eritildi va qayta ishlandi. ccfDNA keyingi tahlilga qadar -80 ° C da saqlanadi. Ba'zi tajribalarda ccfDNK QIAamp DNK tadqiqotchisi to'plami (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) yordamida ajratilgan va tozalangan. Tozalangan DNK standart PicoGreen tahlili yordamida miqdori aniqlandi. Izolyatsiya qilingan ccfDNKning fragmentlar taqsimoti kapillyar elektroforez orqali Agilent 2100 bioanalizatori (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) yordamida yuqori sezuvchanlik DNK to'plami yordamida tahlil qilindi. Tahlil ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq ccfDNK namunasining 1 µl yordamida amalga oshirildi.
Gemolimfa ccfDNK fragmentlarini ketma-ketlashtirish uchun Génome Québec (Monreal, Kvebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 to'plamining Illumina DNK Mix to'plamidan foydalangan holda ov miltig'i kutubxonalarini tayyorladi. Standart adapter (BioO) ishlatilgan. Raw ma'lumotlar fayllari NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 va SRR8924809) dan mavjud. Asosiy o'qish sifati FastQC [23] yordamida baholandi. Trimmomatic [24] adapterlarni kesish va sifatsiz o'qish uchun ishlatilgan. Uchlari juftlangan o‘q otish moslamalari FLASH mos kelmaslik uchun kamida 20 bp bo‘lgan uzunroq bitta o‘qishga birlashtirildi [25]. Birlashtirilgan o'qishlar ikki pallali NCBI Taxonomy ma'lumotlar bazasidan (e qiymati <1e−3 va 90% homologiya) foydalangan holda BLASTN bilan izohlangan va past murakkablikdagi ketma-ketliklarni maskalash DUST [26] yordamida amalga oshirilgan. Birlashtirilgan o'qishlar ikki pallali NCBI Taxonomy ma'lumotlar bazasidan (e qiymati <1e−3 va 90% homologiya) foydalangan holda BLASTN bilan izohlangan va past murakkablikdagi ketma-ketliklarni maskalash DUST [26] yordamida amalga oshirilgan. Ob'edindennye chteniya byli annotirovany s pomoshchyu BLASTN s ispolzovanie bazy dannyx taksonomii dvustvorchatyx mollyuskov NCBI (znachenie e < 1e-3 va 90% gomologii), a maskirovanie posledovatelnostey nizkoy slojnosti bylo slojnosty. [26]. Birlashtirilgan o'qishlar NCBI ikki pallali taksonomiya ma'lumotlar bazasi (e qiymati < 1e-3 va 90% homologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va DUST [26] yordamida past murakkablikdagi ketma-ketlikni maskalash amalga oshirildi.nēngčiči NCBI nėngčičiči（e mí< 1e-3 90% BLASTN língíngínín BLASTN díngínīlín 2 ST 2. língíngíngíngíngíníngínínínbčičiči ncbi lín （（（<1e-3 tn 90% lēngči） lēngčičičičičičičičičičijī 6 dīngjīng 6 lílílílílílílílílílílíííííííííííííííí líííííííOb'edindennye chteniya byli annotirovani s pomoshchyu BLASTN s ispolzovanem taksonomicheskoy bazy dannyx dvustvortatyh mollyuskov NCBI (znachenie e <1e-3 va 90% gomologii), a maskirovanie posledovatelnostey byly slojplovenie byly slojnosty. [26]. Birlashtirilgan o'qishlar NCBI ikki pallali taksonomik ma'lumotlar bazasi (e qiymati <1e-3 va 90% homologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va DUST [26] yordamida past murakkablikdagi ketma-ketlikni maskalash amalga oshirildi.O'qishlar ikki guruhga bo'lingan: ikki pallali ketma-ketliklar bilan bog'liq (bu erda o'z-o'zidan o'qiladi) va aloqasiz (o'z-o'zidan o'qilmagan). Kontiglarni yaratish uchun MEGAHIT yordamida ikkita guruh alohida yig'ildi [27]. Shu bilan birga, begona mikrobioma o'qishlarining taksonomik taqsimoti Kraken2 [28] yordamida tasniflangan va Galaxy [29, 30] da Krona doiraviy diagrammasi bilan grafik tarzda ifodalangan. Bizning dastlabki tajribalarimiz natijasida optimal kmerlar kmer-59 ekanligi aniqlandi. Keyinchalik yakuniy izoh uchun BLASTN (ikki pallali NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan moslashish orqali o'z-o'zidan kontiglar aniqlandi. Keyinchalik yakuniy izoh uchun BLASTN (ikki pallali NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan moslashish orqali o'z-o'zidan kontiglar aniqlandi. Zatem sobstvennye konti byli identifikatoran putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx dvustvorchatyx mollyuskov NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%) uchun okonchatelnoy annotatsii. Keyinchalik yakuniy izoh uchun BLASTN (NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) bilan taqqoslash orqali o'z-o'zini tutashuvlar aniqlandi.BLASTN（yēngjīnīn NCBI lìnìnẓ，e yēngči，e qēng< 1e-10 60% 同源性) 对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.BLASTN（yēngjīnīn NCBI lìnìnẓ，e yēngči，e qēng< 1e-10 60% Zatem byli identifisirovani sobstvennye kontiqi uchun okonchatelnoy annotatsii putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx NCBI dlya dvustvorchatyh mollyuskov, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Keyinchalik BLASTN (NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) ga mos kelish orqali yakuniy izoh uchun o'z-o'zini tutashuvlar aniqlandi. Bunga parallel ravishda, BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan o'z-o'zidan bo'lmagan guruh kontiglari izohlangan. Bunga parallel ravishda, BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan o'z-o'zidan bo'lmagan guruh kontiglari izohlangan. Parallelno chujorodnye grupovye kontiqi byli annotrovany s pomoshchyu BLASTN (baza dannyx nt NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Bunga parallel ravishda, xorijiy guruh kontiglari BLASTN (NT NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) bilan izohlangan.BLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīngBLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīng Parallelno kontiqi, ne otnosyashchiesya k sobstvennoy gruppe, byli annotrovany s pomoshchyu BLASTN (baza dannyx nt NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Bunga parallel ravishda, o'z-o'zidan bo'lmagan guruh kontiglari BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) bilan izohlangan. BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq protein NCBI ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglar ustida o'tkazildi. BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq protein NCBI ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglar ustida o'tkazildi. BLASTX ham nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovaniem baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq NCBI protein ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda ham amalga oshirildi.nr nr nr refSeq nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr n ncbi ng ng ng n ng ng ng bl bl BLASTXnr nr nr refSeq nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr n ncbi ng ng ng n ng ng ng bl bl BLASTX BLASTX shuningdek vypolnyali na nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovanie baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq NCBI protein ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda amalga oshirildi.BLASTN va BLASTX o'z-o'zidan kontig'lar bo'lmagan hovuzlar yakuniy kontiglarni ifodalaydi (Qo'shimcha faylga qarang).
PCR uchun ishlatiladigan primerlar S1-jadvalda keltirilgan. Taq DNK polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA maqsadli genlarini kuchaytirish uchun ishlatilgan. Quyidagi reaktsiya shartlari qo'llanildi: 95 ° C da 3 daqiqa davomida denatürasyon, 1 daqiqa davomida 95 ° C, 1 daqiqa davomida o'rnatilgan tavlanish harorati, 72 ° C da 1 daqiqa davomida cho'zish, 35 tsikl va nihoyat 10 daqiqa ichida 72 ° C. . PCR mahsulotlari 95 V da SYBRTM Safe DNK Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) o'z ichiga olgan agaroz jellarida (1,5%) elektroforez bilan ajratildi.
Midiya (Mytilus spp.) 500 ml kislorodli dengiz suvida (32 PSU) 24 soat davomida 4 ° C da iqlimlashtirildi. Inson galektin-7 cDNK ketma-ketligini (NCBI kirish raqami L07769) kodlovchi qo'shimchani o'z ichiga olgan plazmid DNK flakonga yakuniy 190 mkg/mkl konsentratsiyasida qo'shildi. DNK qo'shilmagan holda bir xil sharoitda inkubatsiya qilingan midiya nazorati edi. Uchinchi nazorat tankida midiyasiz DNK mavjud edi. Dengiz suvidagi DNK sifatini kuzatish uchun ko'rsatilgan vaqtda har bir tankdan dengiz suvi namunalari (20 mkl; uchta takroriy) olindi. Plazmid DNKning kuzatilishi uchun LB midiyasi ko'rsatilgan vaqtlarda yig'ib olindi va qPCR va ddPCR tomonidan tahlil qilindi. Dengiz suvining yuqori tuz miqdori tufayli alikvotlar barcha PCR tahlillaridan oldin PCR sifatli suvda (1:10) suyultirildi.
Raqamli tomchi PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokoli (Missisauga, Ontario, Kanada) yordamida amalga oshirildi. Optimal haroratni aniqlash uchun harorat rejimidan foydalaning (jadval S1). Tomchilar QX200 tomchi generatori (BioRad) yordamida yaratilgan. ddPCR quyidagicha amalga oshirildi: 5 daqiqa davomida 95 ° C, 30 s uchun 95 ° C 50 tsikl va ma'lum tavlanish harorati 1 daqiqa va 72 ° C 30 s, 5 daqiqa davomida 4 ° C va 90 ° C 5 daqiqa ichida. Tomchilar soni va ijobiy reaktsiyalar (nusxalar soni/ml) QX200 tomchi o'quvchi (BioRad) yordamida o'lchandi. 10 000 tomchidan kam bo'lgan namunalar rad etildi. Har safar ddPCR ishga tushirilganda naqsh nazorati bajarilmadi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avstraliya) va LGALS7 maxsus primerlari yordamida amalga oshirildi. Barcha miqdoriy PCRlar QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) yordamida 20 mklda bajarildi. qPCR 95 ° C da 15 daqiqalik inkubatsiyadan so'ng 95 ° C da 10 soniya va 60 ° C da 60 soniya davomida bitta ma'lumot to'plami bilan 40 tsikldan boshlandi. Erish egri chiziqlari qPCR oxirida 95 ° C da 5 s, 65 ° C 60 s va 97 ° C da ketma-ket o'lchovlar yordamida yaratilgan. Har bir qPCR uch nusxada amalga oshirildi, nazorat namunalari bundan mustasno.
Midiya yuqori filtrlash tezligi bilan mashhur bo'lganligi sababli, biz birinchi navbatda ular dengiz suvida mavjud bo'lgan DNK bo'laklarini filtrlash va saqlab qolish mumkinligini tekshirdik. Shuningdek, biz bu parchalar yarim ochiq limfa tizimida to'planishi bilan qiziqdik. Biz bu muammoni ko'k midiya tanklariga qo'shilgan eruvchan DNK bo'laklarining taqdirini kuzatish orqali eksperimental ravishda hal qildik. DNK parchalarini kuzatishni osonlashtirish uchun biz inson galektin-7 genini o'z ichiga olgan xorijiy (o'z-o'zidan emas) plazmid DNKdan foydalandik. ddPCR dengiz suvi va midiyadagi plazmid DNK parchalarini izlaydi. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, agar dengiz suvida DNK bo'laklarining miqdori vaqt o'tishi bilan (7 kungacha) nisbatan o'zgarmas bo'lsa, midiya borligida bu daraja 8 soat ichida deyarli butunlay yo'qoladi (1a,b-rasm). Ekzogen DNKning bo'laklari 15 daqiqa ichida intravalvular suyuqlik va gemolimfada osongina aniqlandi (1c-rasm). Ushbu parchalar ta'sir qilishdan keyin 4 soatgacha aniqlanishi mumkin. DNK bo'laklariga nisbatan bu filtrlash faolligi bakteriyalar va suv o'tlarining filtrlash faolligi bilan taqqoslanadi [31]. Ushbu natijalar midiyalarning suyuqlik bo'linmalarida begona DNKni filtrlashi va to'plashi mumkinligini ko'rsatadi.
ddPCR bilan o'lchangan midiya borligida (A) yoki yo'qligida (B) dengiz suvida plazmid DNKning nisbiy konsentratsiyasi. A da natijalar foizlarda ifodalanadi, qutilar chegaralari 75 va 25 foizlarni ifodalaydi. O'rnatilgan logarifmik egri qizil rangda ko'rsatilgan va kul rang bilan qoplangan maydon 95% ishonch oralig'ini bildiradi. Bda qizil chiziq o'rtacha, ko'k chiziq esa konsentratsiya uchun 95% ishonch oralig'ini ifodalaydi. C plazmid DNK qo'shilgandan keyin turli vaqtlarda midiya gemolimfa va qopqoq suyuqligida plazmid DNKning to'planishi. Natijalar aniqlangan mutlaq nusxalar/ml (±SE) sifatida taqdim etiladi.
Keyinchalik, biz cheklangan antropogen ta'sirga ega bo'lgan uzoq orollar guruhi bo'lgan Kerguelen orollaridagi midiya to'shaklaridan yig'ilgan midiyalarda ccfDNKning kelib chiqishini o'rganib chiqdik. Shu maqsadda midiya gemolimfalaridan cccDNK ajratilgan va inson cccDNKsini tozalash uchun keng tarqalgan usullar bilan tozalangan [32, 33]. Midiyadagi o'rtacha gemolimfa ccfDNK kontsentratsiyasi ml gemolimfa diapazonida past mikrogramlarda ekanligini aniqladik (S2-jadval, Qo'shimcha ma'lumotga qarang). Ushbu kontsentratsiyalar diapazoni sog'lom odamlarga qaraganda ancha katta (mililitr uchun past nanogramlar), ammo kamdan-kam hollarda saraton kasalligida ccfDNK darajasi millilitr uchun bir necha mikrogramga etishi mumkin [34, 35]. Gemolimfa ccfDNK hajmining taqsimlanishi tahlili shuni ko'rsatdiki, bu bo'laklar 1000 bp dan 1000 bp gacha bo'lgan o'lchamlari bo'yicha juda farq qiladi. 5000 bp gacha (2-rasm). Shunga o'xshash natijalar kremniy dioksidiga asoslangan QIAamp Investigator Kit yordamida olindi, bu usul sud-tibbiyot fanida keng tarqalgan bo'lib past konsentratsiyali DNK namunalaridan, shu jumladan ccfDNA dan genomik DNKni tezda ajratib olish va tozalash uchun ishlatiladi [36].
Midiya gemolimfasining vakili ccfDNK elektroforegrammasi. NucleoSnap plazma to'plami (yuqorida) va QIAamp DNK tadqiqotchisi to'plami bilan chiqariladi. B Midiyadagi gemolimfa ccfDNK kontsentratsiyasining (±SE) tarqalishini ko'rsatadigan skripka syujeti. Qora va qizil chiziqlar mos ravishda medianani va birinchi va uchinchi kvartillarni ifodalaydi.
Odamlar va primatlardagi ccfDNK ning taxminan 1% chet el manbasiga ega [21, 37]. Ikki pallalilarning yarim ochiq qon aylanish tizimini, mikroblarga boy dengiz suvini va midiya ccfDNK ning o'lchamlarini hisobga olgan holda, biz midiya gemolimfa ccfDNK mikrobial DNKning boy va xilma-xil hovuzini o'z ichiga olishi mumkinligini taxmin qildik. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz Kerguelen orollaridan to'plangan Aulakomiya atra namunalaridan gemolimfa ccfDNKni ketma-ketlashtirdik, bu 10 milliondan ortiq o'qish natijasini berdi, ularning 97,6 foizi sifat nazoratidan o'tdi. Keyin o'qishlar BLASTN va NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalarga ko'ra tasniflandi (S1-rasm, Qo'shimcha ma'lumot).
Odamlarda ham yadro, ham mitoxondrial DNK qon oqimiga chiqarilishi mumkin [38]. Biroq, ushbu tadqiqotda, A. atra genomining ketma-ketligi yoki tavsiflanmaganligini hisobga olsak, midiyaning yadro genomik DNKsini batafsil tavsiflash mumkin emas edi. Biroq, biz ikki pallali kutubxonadan foydalanib, o'zimizdan kelib chiqqan bir qator ccfDNA parchalarini aniqlay oldik (S2-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Shuningdek, biz o'zimizdan kelib chiqqan DNK bo'laklari mavjudligini o'sha A. atra genlarini yo'naltirilgan PCR kuchaytirilishi orqali tasdiqladik (3-rasm). Xuddi shunday, A. atraning mitoxondrial genomi umumiy maʼlumotlar bazalarida mavjudligini hisobga olsak, A. atra gemolimfasida mitoxondrial ccfDNK boʻlaklari borligi haqida dalillarni topish mumkin. Mitoxondriyal DNK fragmentlarining mavjudligi PCR kuchaytirilishi bilan tasdiqlangan (3-rasm).
PCR bilan kuchaytirilgan A. atra (qizil nuqta - stok raqami: SRX5705969) va M. platensis (ko'k nuqta - stok raqami: SRX5705968) gemolimfasida turli mitoxondriyal genlar mavjud edi. Rasm Breton va boshqalardan moslangan, 2011 B A. atra dan gemolimfa supernatantini kuchaytirish FTA qog'ozida saqlangan. PCR aralashmasini o'z ichiga olgan PCR trubasiga to'g'ridan-to'g'ri qo'shish uchun 3 mm zarbdan foydalaning.
Dengiz suvida ko'p miqdorda mikrobial tarkibni hisobga olgan holda, biz dastlab gemolimfadagi mikrobial DNK ketma-ketligini tavsiflashga e'tibor qaratdik. Buning uchun biz ikki xil strategiyadan foydalanamiz. Birinchi strategiyada BLAST va boshqa vositalar bilan taqqoslanadigan aniqlik bilan mikrobial ketma-ketliklarni aniqlay oladigan algoritmga asoslangan ketma-ketlikni tasniflash dasturi Kraken2 ishlatilgan [28]. 6719 dan ortiq o'qish bakterial kelib chiqishi aniqlandi, 124 va 64 mos ravishda archaea va viruslar (4-rasm). Eng ko'p bakterial DNK bo'laklari Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) va Bacteoides (17%) edi (4a-rasm). Ushbu taqsimot dengiz ko'k midiya mikrobiomasining oldingi tadqiqotlariga mos keladi [39, 40]. Gammaproteobakteriyalar Proteobakteriyalarning asosiy sinfi (44%), shu jumladan ko'plab Vibrionales (4b-rasm). ddPCR usuli A. atra gemolimfning ccfDNKsida Vibrio DNK fragmentlari mavjudligini tasdiqladi (4c-rasm) [41]. ccfDNK ning bakterial kelib chiqishi haqida ko'proq ma'lumot olish uchun qo'shimcha yondashuv qo'llanildi (S2-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Bu holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va e qiymati 1e−3 va >90% homologiyaga ega bo'lgan kesimdan foydalangan holda o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqishi sifatida tasniflandi. Bu holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va e qiymati 1e−3 va >90% homologiyaga ega bo'lgan kesimdan foydalangan holda o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqishi sifatida tasniflandi. V etom sluchae perekryvayushchiesya chteniya byi sobrany kak chteniya s parnymi kontsami va byli klassisitsirovany kak sobstvennye (dvustvorchatye mollyuski) yoki chujie po proisxojdeniyu s ispolzovanyem BLASTN va znacheniya gomi e 190% oteychen>. Bunday holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juftlangan o'qishlar sifatida to'plangan va BLASTN va e qiymati 1e-3 va >90% homologiya bilan kesishgan holda mahalliy (ikkivaliv) yoki asl bo'lmagan deb tasniflangan.língíngíngíníníníníngínííníngíngíngíngíngíngíngíngínííníngíníngíníngíngíngínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínín BLASTN 1e-3 dín>90% língíngíngíngíngíngíngíngíngínjínjínjínjínjínjínjínjíngíngíníchài yàng yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yínzhi línííníí, yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín qài > 90% líííííí íííííí ííííí （lííníí） língìíči V etom sluchae perekryvayushchiesya chteniya byli sobrany kak chteniya s parnymi kontsami va klassisitsirovany kak sobstvennye (dvustvorchatye mollyuski) yoki nesobstvennye po proisxojdeniyu s ispolzovaniem znacheniy e BLASTN gomiga i 19%. Bunday holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juftlashtirilgan o'qishlar sifatida to'plangan va e BLASTN va 1e-3 qiymatlari va homologiya chegarasi > 90% dan foydalangan holda o'z (ikkivaliv) yoki asl bo'lmagan deb tasniflangan.A. atra genomi hali ketma-ketlashtirilmaganligi sababli biz MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assemblerining de novo yig'ish strategiyasidan foydalandik. Hammasi bo'lib 147 188 kontigs kelib chiqishiga bog'liq (ikki pallali) sifatida aniqlangan. Keyinchalik bu kontiglar BLASTN va BLASTX yordamida 1e-10 elektron qiymatlari bilan portlatilgan. Bu strategiya bizga A. atra ccfDNAda mavjud bo'lgan 482 ta ikki pallali bo'lmagan fragmentlarni aniqlash imkonini berdi. Bu DNK fragmentlarining yarmidan koʻpi (57%) bakteriyalardan, asosan, sulfotrofik simbiontlardan, shu jumladan, gill simbiontlaridan va Solemya velum gill simbiontlaridan olingan (5-rasm).
Tur darajasida nisbiy ko'plik. B ikkita asosiy filaning mikrobial xilma-xilligi (Firmicutes va Proteobacteria). ddPCR C Vibrio spp ning reprezentativ kuchaytirilishi. A. 16S rRNK genining fragmentlari (ko'k) uchta atra gemolimfada.
Jami 482 ta to'plangan kontig tahlil qilindi. Metagenomik kontig annotatsiyalarining taksonomik taqsimotining umumiy profili (prokaryotlar va eukaryotlar). B BLASTN va BLASTX tomonidan aniqlangan bakterial DNK fragmentlarining batafsil taqsimlanishi.
Kraken2 tahlili shuni ko'rsatdiki, midiya ccfDNA arxeal DNK bo'laklarini, jumladan Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) va Thaurmarcheota (11%) DNK qismlarini o'z ichiga oladi (6a-rasm). Euryarchaeota va Crenarchaeota dan olingan DNK bo'laklarining mavjudligi, avvalroq Kaliforniya midiyasining mikroblar jamoasida topilganligi ajablanarli emas [42]. Euryarchaeota ko'pincha ekstremal sharoitlar bilan bog'liq bo'lsa-da, endi Euryarchaeota ham, Crenarcheota ham dengiz kriyojenik muhitida eng keng tarqalgan prokaryotlar qatoriga kirishi tan olingan [43, 44]. Kerguelen platosida [45] pastki oqmalardan keng ko'lamli metan sizib chiqishi va Kerguelen orollari [46] qirg'oqlarida kuzatilgan ehtimoliy mikrob metan ishlab chiqarilishi haqidagi so'nggi xabarlarni hisobga olsak, midiya tarkibida metanogen mikroorganizmlarning mavjudligi ajablanarli emas.
Keyin e'tiborimiz DNK viruslarini o'qishga qaratildi. Bizning ma'lumotlarga ko'ra, bu midiya tarkibidagi viruslar bo'yicha birinchi maqsaddan tashqari tadqiqotdir. Kutilganidek, biz bakteriofaglarning (Caudovirales) DNK qismlarini topdik (6b-rasm). Biroq, eng keng tarqalgan virusli DNK nukleotsitoviruslar filumidan kelib chiqadi, shuningdek, yadro sitoplazmatik yirik DNK virusi (NCLDV) deb ham ataladi, u har qanday virusning eng katta genomiga ega. Ushbu filumda ko'pchilik DNK ketma-ketligi Mimimidoviridae (58%) va Poxviridae (21%) oilalariga tegishli bo'lib, ularning tabiiy xostlari umurtqali hayvonlar va artropodlarni o'z ichiga oladi, bu DNK ketma-ketliklarining kichik qismi esa ma'lum virusologik yosunlarga tegishli. Dengiz eukaryotik suvo'tlarini yuqtiradi. Ketma-ketliklar, shuningdek, ma'lum bo'lgan virusli avlodlar orasida eng katta genom hajmiga ega bo'lgan ulkan virus Pandora virusidan olingan. Qizig'i shundaki, gemolimfa ccfDNK ketma-ketligi bilan aniqlangan virus bilan kasallanganligi ma'lum bo'lgan xostlar diapazoni nisbatan katta edi (S3-rasm, qo'shimcha ma'lumot). Unga Baculoviridae va Iridoviridae kabi hasharotlarni yuqtiruvchi viruslar, shuningdek, amyoba, suv o'tlari va umurtqali hayvonlarni yuqtiruvchi viruslar kiradi. Shuningdek, biz Pithovirus sibericum genomiga mos keladigan ketma-ketliklarni topdik. Pitoviruslar ("zombi viruslari" deb ham ataladi) birinchi marta Sibirdagi 30 000 yillik abadiy muzlikdan ajratilgan [47]. Shunday qilib, bizning natijalarimiz avvalgi hisobotlarga mos keladi, bu viruslarning barcha zamonaviy turlari yo'q bo'lib ketmagan [48] va bu viruslar uzoq subarktik dengiz ekotizimlarida mavjud bo'lishi mumkin.
Va nihoyat, biz boshqa ko'p hujayrali hayvonlarning DNK qismlarini topishimiz mumkinligini tekshirish uchun sinovdan o'tkazdik. NT, nr va RefSeq kutubxonalari (genomik va oqsil) bilan BLASTN va BLASTX tomonidan jami 482 ta xorijiy kontig aniqlandi. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, ko'p hujayrali hayvonlarning ccfDNK ning begona qismlari orasida suyak suyaklari DNKsi ustunlik qiladi (5-rasm). Hasharotlar va boshqa turlardan DNK parchalari ham topilgan. DNK fragmentlarining nisbatan katta qismi aniqlanmagan, bu ehtimol quruqlikdagi turlarga nisbatan genomik ma'lumotlar bazalarida ko'p sonli dengiz turlarining kam ifodalanganligi tufayli [49].
Ushbu maqolada biz LB kontseptsiyasini midiya uchun qo'llaymiz va gemolimfa ccfDNK tortishish ketma-ketligi dengiz qirg'oq ekotizimlari tarkibini tushunishga yordam beradi. Xususan, biz 1) midiya gemolimfasida nisbatan katta (~ 1-5 kb) aylanma DNK fragmentlarining nisbatan yuqori konsentratsiyasi (mikrogramma darajalari) mavjudligini aniqladik; 2) bu DNK fragmentlari ham mustaqil, ham mustaqil bo'lmagan 3) Bu DNK bo'laklarining xorijiy manbalari orasida biz bakterial, archaeal va virusli DNKni, shuningdek, boshqa ko'p hujayrali hayvonlarning DNKsini topdik; 4) Bu begona ccfDNK fragmentlarining gemolimfada to'planishi tez sodir bo'ladi va midiyaning ichki filtrlash faolligiga yordam beradi. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, hozirgacha asosan biotibbiyot sohasida qo'llanilgan LB kontseptsiyasi sentinel turlari va ularning atrof-muhit o'rtasidagi o'zaro ta'sirini yaxshiroq tushunish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan boy, ammo o'rganilmagan bilim manbasini kodlaydi.
Primatlardan tashqari sutemizuvchilar, jumladan sichqonlar, itlar, mushuklar va otlarda ccfDNK izolyatsiyasi qayd etilgan [50, 51, 52]. Biroq, bizning ma'lumotimizga ko'ra, bizning tadqiqotimiz ochiq aylanish tizimiga ega bo'lgan dengiz turlarida ccfDNK ning aniqlanishi va ketma-ketligi haqida birinchi bo'lib xabar beradi. Midiyalarning bu anatomik xususiyati va filtrlash qobiliyati, hech bo'lmaganda, boshqa turlarga nisbatan aylanma DNK bo'laklarining turli o'lchamdagi xususiyatlarini tushuntirishi mumkin. Odamlarda qonda aylanib yuradigan ko'pchilik DNK fragmentlari 150 dan 200 bp gacha bo'lgan o'lchamdagi kichik bo'laklardir. maksimal cho'qqisi 167 bp [34, 53] bilan. DNK fragmentlarining kichik, ammo muhim qismi 300 dan 500 bp gacha, taxminan 5% esa 900 bp dan uzunroqdir. [54]. Ushbu o'lchamdagi taqsimotning sababi shundaki, plazmadagi ccfDNK ning asosiy manbai hujayra o'limi natijasida yoki sog'lom odamlarda aylanma gematopoetik hujayralar nekrozi yoki saraton kasalligida o'simta hujayralari apoptozi tufayli yuzaga keladi (aylanib yuruvchi o'simta DNKsi deb nomlanadi). , ctDNK). Biz midiyalarda topilgan gemolimfa ccfDNK ning o'lchamdagi taqsimoti 1000 dan 5000 bp gacha bo'lgan, bu midiya ccfDNK ning kelib chiqishi boshqacha ekanligini ko'rsatadi. Bu mantiqiy farazdir, chunki midiya yarim ochiq qon tomir tizimiga ega va mikrobial genomik DNKning yuqori konsentratsiyasini o'z ichiga olgan dengiz suv muhitida yashaydi. Haqiqatan ham, ekzogen DNK yordamida olib borilgan laboratoriya tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, midiya dengiz suvida DNK bo'laklarini to'playdi, hech bo'lmaganda bir necha soatdan so'ng ular hujayralarni qabul qilgandan keyin parchalanadi va / yoki chiqariladi va / yoki turli tashkilotlarda saqlanadi. Hujayralarning (prokaryotik va eukaryotik) noyobligini hisobga olgan holda, intravalvulyar bo'limlardan foydalanish o'z-o'zidan manbalardan ham, xorijiy manbalardan ham ccfDNK miqdorini kamaytiradi. Ikki pallali tug'ma immunitetning ahamiyatini va aylanma fagotsitlarning ko'pligini hisobga olib, biz hatto begona ccfDNK ham mikroorganizmlar va / yoki hujayra qoldiqlari yutilganda begona DNKni to'playdigan aylanma fagotsitlar bilan boyitilganligini taxmin qildik. Birgalikda olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, ikki pallali gemolimfa ccfDNK molekulyar ma'lumotlarning noyob ombori bo'lib, ularning qo'riqchi tur sifatidagi maqomini mustahkamlaydi.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bakterial kelib chiqadigan gemolimfa ccfDNK bo'laklarining ketma-ketligi va tahlili mezbon bakterial flora va atrofdagi dengiz ekotizimida mavjud bo'lgan bakteriyalar haqida asosiy ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin. Otishmalarni ketma-ketlashtirish texnikasi kommensal bakteriyalar A. atra gill ketma-ketligini aniqladi, agar an'anaviy 16S rRNK identifikatsiyalash usullari qo'llanilganda, qisman ma'lumotnoma kutubxonasi noto'g'riligi sababli o'tkazib yuborilgan bo'lar edi. Aslida, Kerguelendagi bir xil midiya qatlamida M. platensisdan to'plangan LB ma'lumotlaridan foydalanishimiz gill bilan bog'langan bakterial simbiontlarning tarkibi ikkala midiya turi uchun bir xil ekanligini ko'rsatdi (S4-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Ikki genetik jihatdan bir-biridan farq qiladigan midiyaning bu o'xshashligi Kerguelenning sovuq, oltingugurtli va vulqon konlaridagi bakterial jamoalarning tarkibini aks ettirishi mumkin [55, 56, 57, 58]. Oltingugurtni kamaytiruvchi mikroorganizmlarning yuqori darajalari Port-o-Frans qirg'oqlari kabi bioturbatsiyalangan qirg'oq hududlarida [59] midiya yig'ishda yaxshi tasvirlangan. Yana bir imkoniyat shundaki, kommensal midiya florasi gorizontal uzatilishi bilan ta'sir qilishi mumkin [60, 61]. Dengiz muhiti, dengiz tubi yuzasi va midiyadagi simbiotik bakteriyalar tarkibi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi. Hozirda bu tadqiqotlar davom etmoqda.
Gemolimfa ccfDNK ning uzunligi va kontsentratsiyasi, uni tozalash qulayligi va otishmalarni tez ketma-ketlashtirishga imkon beradigan yuqori sifati dengiz qirg'oqlari ekotizimlarida bioxilma-xillikni baholash uchun midiya ccfDNK dan foydalanishning ko'plab afzalliklaridan biridir. Ushbu yondashuv, ayniqsa, ma'lum bir ekotizimdagi virusli jamoalarni (viromlarni) tavsiflash uchun samaralidir [62, 63]. Bakteriyalar, arxeya va eukariotlardan farqli o'laroq, virus genomlarida 16S sekanslari kabi filogenetik jihatdan saqlanib qolgan genlar mavjud emas. Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya kabi indikator turlaridan suyuq biopsiya odatda qirg'oq dengiz ekotizimlarida yashaydigan xostlarni yuqtirishi ma'lum bo'lgan nisbatan ko'p miqdordagi ccfDNA virus fragmentlarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Bunga protozoa, artropodlar, hasharotlar, o'simliklar va bakterial viruslarni (masalan, bakteriofaglar) yuqtirishi ma'lum bo'lgan viruslar kiradi. Xuddi shunday taqsimot biz Kerguelenda bir xil midiya qatlamida to'plangan ko'k midiya (M. platensis) gemolimfa ccfDNK viromini tekshirganimizda topildi (jadval S2, qo'shimcha ma'lumot). ccfDNK ning otishma sekvensiyasi haqiqatan ham odamlar yoki boshqa turlar virusini o'rganishda jadallashib borayotgan yangi yondashuvdir [21, 37, 64]. Ushbu yondashuv, ayniqsa, ikki zanjirli DNK viruslarini o'rganish uchun foydalidir, chunki Baltimordagi eng xilma-xil va keng viruslar sinfini ifodalovchi barcha ikki zanjirli DNK viruslari orasida bitta gen saqlanib qolmaydi [65]. Garchi bu viruslarning aksariyati tasniflanmagan boʻlib qolsa va virus dunyosining mutlaqo nomaʼlum qismidagi viruslarni oʻz ichiga olishi mumkin [66], biz A. atra va M. platensis midiyasining viromlari va xost diapazonlari ikki tur oʻrtasida joylashganligini aniqladik. xuddi shunday (S3 rasmga qarang, qo'shimcha ma'lumot). Bu o'xshashlik ajablanarli emas, chunki u atrof-muhitda mavjud bo'lgan DNKni qabul qilishda selektivlikning etishmasligini aks ettirishi mumkin. Hozirgi vaqtda RNK viromini tavsiflash uchun tozalangan RNK yordamida kelajakdagi tadqiqotlar zarur.
Bizning tadqiqotimizda biz Kovarski va uning hamkasblari [37] ishlariga moslashtirilgan juda qattiq quvur liniyasidan foydalandik, ular mahalliy ccfDNK yig'ilishidan oldin va keyin yig'ilgan o'qish va kontiglarni ikki bosqichli o'chirishdan foydalangan, natijada xaritalanmagan o'qishlarning yuqori ulushi paydo bo'ldi. Shuning uchun, biz ushbu xaritalanmagan o'qishlarning ba'zilari hali ham o'zlarining kelib chiqishiga ega bo'lishi mumkinligini istisno qila olmaymiz, birinchi navbatda, bizda bu midiya turi uchun mos yozuvlar genomi yo'q. Biz ushbu quvur liniyasidan ham foydalandik, chunki biz o'z-o'zidan va o'z-o'zidan o'qishlar o'rtasidagi ximeralar va Illumina MiSeq PE75 tomonidan yaratilgan o'qish uzunliklari haqida tashvishlanardik. Ko'pgina aniqlanmagan o'qishlarning yana bir sababi shundaki, dengiz mikroblarining ko'pchiligi, ayniqsa Kerguelen kabi chekka hududlarda izoh berilmagan. Biz Illumina MiSeq PE75 dan foydalandik, ccfDNA fragment uzunligi inson ccfDNKsiga o'xshash. Kelajakdagi tadqiqotlar uchun, gemolimfa ccfDNK odamlar va/yoki sutemizuvchilarga qaraganda ko'proq o'qishga ega ekanligini ko'rsatadigan natijalarimizni hisobga olgan holda, uzunroq ccfDNK fragmentlari uchun ko'proq mos keladigan sekvensiya platformasidan foydalanishni tavsiya etamiz. Ushbu amaliyot chuqurroq tahlil qilish uchun ko'proq ko'rsatkichlarni aniqlashni ancha osonlashtiradi. Hozirda mavjud bo'lmagan to'liq A. atra yadro genom ketma-ketligini olish, shuningdek, ccfDNKni o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalardan ajratishni sezilarli darajada osonlashtiradi. Tadqiqotlarimiz suyuq biopsiya kontseptsiyasini midiyalarga tatbiq etish imkoniyatlariga qaratilganligini inobatga olib, ushbu kontseptsiya kelajakdagi tadqiqotlarda qo'llanilganligi sababli midiyalarning mikrobial xilma-xilligini o'rganish uchun ushbu usulning imkoniyatlarini oshirish uchun yangi vositalar va quvurlar ishlab chiqilishiga umid qilamiz. dengiz ekotizimlari.
Invaziv bo'lmagan klinik biomarker sifatida inson plazmasidagi ccfDNKning yuqori darajasi turli kasalliklar, to'qimalarning shikastlanishi va stress sharoitlari bilan bog'liq [67,68,69]. Bu o'sish to'qimalarning shikastlanishidan keyin o'z kelib chiqishi bo'lgan DNK parchalarini chiqarish bilan bog'liq. Biz bu muammoni o'tkir issiqlik stressidan foydalangan holda ko'rib chiqdik, unda midiya 30 ° C haroratga qisqa vaqt ta'sir qildi. Biz ushbu tahlilni uchta mustaqil eksperimentda uch xil turdagi midiya ustida o'tkazdik. Biroq, biz o'tkir issiqlik stressidan keyin ccfDNA darajasida hech qanday o'zgarish topmadik (qarang: S5-rasm, qo'shimcha ma'lumot). Ushbu kashfiyot qisman bo'lsa ham, midiyalarning yarim ochiq qon aylanish tizimiga ega ekanligini va yuqori filtrlash faolligi tufayli ko'p miqdorda begona DNKni to'plashini tushuntirishi mumkin. Boshqa tomondan, midiya, ko'plab umurtqasiz hayvonlar kabi, stressdan kelib chiqqan to'qimalarning shikastlanishiga ko'proq chidamli bo'lishi mumkin va shu bilan ularning gemolimfasida ccfDNKning chiqarilishini cheklaydi [70, 71].
Bugungi kunga kelib, suv ekotizimlarida bioxilma-xillikning DNK tahlili asosan atrof-muhit DNK (eDNK) metabarkodlashiga qaratilgan. Biroq, bu usul odatda primerlardan foydalanilganda bioxilma-xillikni tahlil qilishda cheklangan. O'q otishni o'rganish ketma-ketligini qo'llash PCR cheklovlarini va primer to'plamlarini noto'g'ri tanlashni chetlab o'tadi. Shunday qilib, qaysidir ma'noda bizning usulimiz yaqinda qo'llanilgan, parchalangan DNKni to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlashtirishga va deyarli barcha organizmlarni tahlil qilishga qodir bo'lgan yuqori samarali eDNK Shotgun sekvensiyasi usuliga yaqinroqdir [72, 73]. Biroq, LBni standart eDNA usullaridan ajratib turadigan bir qator fundamental muammolar mavjud. Albatta, eDNA va LB o'rtasidagi asosiy farq tabiiy filtr xostlaridan foydalanishdir. eDNKni o'rganish uchun tabiiy filtr sifatida gubkalar va ikki pallalilar (Dresseina spp.) kabi dengiz turlaridan foydalanish haqida xabar berilgan [74, 75]. Biroq, Dreissena tadqiqotida DNK olingan to'qimalar biopsiyalaridan foydalanilgan. LB dan ccfDNA tahlili to'qima biopsiyasi, maxsus va ba'zan qimmat uskunalar va eDNK yoki to'qimalar biopsiyasi bilan bog'liq logistika talab qilmaydi. Darhaqiqat, biz yaqinda LB dan olingan ccfDNKni sovuq zanjirni saqlamasdan FTA yordami bilan saqlanishi va tahlil qilinishi mumkinligini xabar qildik, bu uzoq hududlarda tadqiqot uchun katta muammo hisoblanadi [76]. Suyuq biopsiyalardan ccfDNKni olish ham oddiy va ov miltig'i ketma-ketligi va PCR tahlili uchun yuqori sifatli DNKni ta'minlaydi. Bu eDNK tahlili bilan bog'liq ba'zi texnik cheklovlarni hisobga olgan holda katta afzallikdir [77]. Namuna olish usulining soddaligi va arzonligi, ayniqsa, uzoq muddatli monitoring dasturlari uchun juda mos keladi. Yuqori filtrlash qobiliyatiga qo'shimcha ravishda, ikki pallalilarning yana bir taniqli xususiyati - ularning shilimshiq tarkibidagi kimyoviy mukopolisaxaridlar, bu viruslarning so'rilishiga yordam beradi [78, 79]. Bu bivalvesni biologik xilma-xillikni va ma'lum bir suv ekotizimidagi iqlim o'zgarishi ta'sirini tavsiflash uchun ideal tabiiy filtrga aylantiradi. Xostdan olingan DNK fragmentlarining mavjudligi eDNA bilan solishtirganda usulning cheklanishi sifatida qaralishi mumkin bo'lsa-da, eDNA bilan solishtirganda bunday mahalliy ccfDNKga ega bo'lish bilan bog'liq xarajatlar sog'liqni saqlash tadqiqotlari uchun mavjud bo'lgan juda ko'p ma'lumotlar uchun bir vaqtning o'zida tushunarli. ofset xost. Bunga xost egasining genomiga integratsiyalangan virusli ketma-ketliklarning mavjudligi kiradi. Bu, ayniqsa, midiya uchun juda muhim, chunki gorizontal ravishda uzatiladigan leykemiya retroviruslari ikki pallalilarda [80, 81]. LB ning eDNKga nisbatan yana bir afzalligi shundaki, u mikroorganizmlarni (va ularning genomlarini) yutib yuboradigan gemolimfada aylanib yuruvchi qon hujayralarining fagotsitar faolligidan foydalanadi. Fagotsitoz ikki pallali qon hujayralarining asosiy vazifasidir [82]. Nihoyat, usul midiyaning yuqori filtrlash qobiliyatidan (o'rtacha 1,5 l / soat dengiz suvi) va ikki kunlik sirkulyatsiyadan foydalanadi, bu dengiz suvining turli qatlamlarini aralashtirishni oshiradi, bu esa heterolog eDNKni qo'lga kiritish imkonini beradi. [83, 84]. Shunday qilib, midiya ccfDNK tahlili midiyalarning ozuqaviy, iqtisodiy va atrof-muhitga ta'sirini hisobga olgan holda qiziqarli yo'ldir. Odamlardan to'plangan LB tahliliga o'xshab, bu usul ham ekzogen moddalarga javoban xost DNKidagi genetik va epigenetik o'zgarishlarni o'lchash imkoniyatini ochadi. Misol uchun, uchinchi avlod sekvensiya texnologiyalari nanopore sekvensiyasi yordamida mahalliy ccfDNKda genom bo'ylab metillanish tahlilini o'tkazish uchun ko'zda tutilishi mumkin. Bu jarayonga midiya ccfDNK fragmentlarining uzunligi uzoq vaqt davomida o'qiladigan sekvensiya platformalari bilan ideal tarzda mos kelishi yordam berishi kerak, bu esa kimyoviy o'zgarishlarga muhtoj bo'lmasdan, genom bo'ylab DNK metilatsiyasini tahlil qilish imkonini beradi.85,86]. Shu sababli, u iqlim o'zgarishi yoki ifloslantiruvchi moddalar ta'siridan keyin javobni boshqaradigan asosiy mexanizmlar haqida qimmatli tushuncha berishi mumkin [87]. Biroq, LB dan foydalanish cheklovlarsiz emas. Aytish kerakki, bu ekotizimda indikator turlarining mavjudligini talab qiladi. Yuqorida aytib o'tilganidek, ma'lum bir ekotizimning biologik xilma-xilligini baholash uchun LB dan foydalanish, shuningdek, manbadan DNK bo'laklari mavjudligini hisobga oladigan qat'iy bioinformatika quvurini talab qiladi. Yana bir muhim muammo - dengiz turlari uchun mos yozuvlar genomlarining mavjudligi. Dengiz sutemizuvchilari genomlari loyihasi va yaqinda tashkil etilgan Fish10k loyihasi [88] kabi tashabbuslar kelajakda bunday tahlillarni osonlashtirishiga umid qilinadi. LB kontseptsiyasini dengiz filtri bilan oziqlanadigan organizmlarga tatbiq qilish, shuningdek, ketma-ketlik texnologiyasining so'nggi yutuqlari bilan mos keladi, bu esa atrof-muhitning stressiga javoban dengiz yashash joylarining salomatligi haqida muhim ma'lumotlarni taqdim etish uchun ko'p ohmli biomarkerlarni ishlab chiqish uchun juda mos keladi.
Genom ketma-ketligi ma'lumotlari NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 ostida saqlangan.
Brierley AS, Kingsford MJ Iqlim o'zgarishining dengiz hayoti va ekotizimlariga ta'siri. Koul biologiyasi. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S va boshqalar. Iqlim o'zgarishi va boshqa mahalliy stress omillarining dengiz muhitiga birgalikda ta'sirini ko'rib chiqing. umumiy ilmiy muhit. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P va boshqalar. ). Birinchi mart fani. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Takroriy issiqlik stressi sharoitida issiqlik bardoshliligining pasayishi ko'k midiyalarning yozgi o'limini tushuntiradi. Ilmiy hisobot 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Servantes-Yoshida K, Xvan JL, Huber ER va boshqalar. Hayvonlarning o'limining chastotasi, sabablari va darajasidagi so'nggi o'zgarishlar. Proc Natl Acad Sci AQSh. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S va boshqalar. Bir nechta turga xos bo'lmagan patogenlar Pinna nobilisning ommaviy o'limiga sabab bo'lishi mumkin. Hayot. 2020;10:238.
Bredli M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Iqlim o'zgarishining Arktika zoonoz kasalliklariga potentsial ta'siri. Int J Sirkumpolyar salomatlik. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. va boshqalar. Ko'k midiya (Mytilus edulis spp.) qirg'oq ifloslanishini monitoring qilishda signal organizmlari sifatida: sharh. Mart Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Saratonni davolashda suyuq biopsiyaning integratsiyasi. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C va boshqalar. Suyuq biopsiyaning pishishi: o'simta DNKsining aylanishiga imkon beradi. Nat Rev Saraton. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Inson plazmasidagi nuklein kislotalar. Soc Biol sho''ba korxonalarining yig'ilish bayonnomalari. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Saratonni davolash uchun molekulyar marker sifatida hujayrasiz DNKning yangi roli. Biomolyar tahlilni miqdoriy aniqlash. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Suyuq biopsiya klinikaga kiradi - amalga oshirish muammolari va kelajakdagi muammolar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW va boshqalar. Xomilalik DNK onaning plazmasi va zardobida mavjud. Lanset. 1997 yil; 350:485-7.
Mufarray MN, Vong RJ, Shou GM, Stivenson DK, Quake SR Homiladorlik davrida ayollar qonida aylanib yuruvchi hujayradan tashqari RNK yordamida homiladorlik va uning asoratlarini o'rganish. Dopediatriya. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J va boshqalar. Suyuq biopsiya: donor hujayrasiz DNK buyrak greftidagi allogen lezyonlarni aniqlash uchun ishlatiladi. Nat Rev Nefrol. 2021; 17:591–603.
Xuan FC, Lo YM Prenatal diagnostikadagi innovatsiyalar: ona plazmasi genomini ketma-ketlashtirish. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu V, Deng X, Li M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D va boshqalar. Infektsiyalangan tana suyuqliklarining keyingi avlod metagenomik ketma-ketligi bilan patogenni tezda aniqlash. Nat tibbiyoti. 2021;27:115-24.