Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, uzluksiz qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz renderlaymiz.
Suyuq biopsiya (SB) biotibbiyot sohasida tez sur'atlar bilan mashhur bo'lib borayotgan konsepsiyadir. Ushbu konsepsiya asosan turli to'qimalarda hujayra o'limidan so'ng asosan kichik bo'laklar sifatida ajralib chiqadigan aylanib yuruvchi hujayradan tashqari DNK (ccfDNK) parchalarini aniqlashga asoslangan. Ushbu parchalarning kichik bir qismi begona (begona) to'qimalardan yoki organizmlardan kelib chiqadi. Hozirgi ishimizda biz ushbu konsepsiyani dengiz suvining yuqori filtrlash qobiliyati bilan mashhur bo'lgan qo'riqchi turi bo'lgan midiyalarga qo'lladik. Biz dengiz qirg'oqlari ekotizimlarining biologik xilma-xilligi haqida ma'lumot berish uchun turli manbalardan atrof-muhit DNK parchalarini olish uchun midiyalarning tabiiy filtrlar sifatida harakat qilish qobiliyatidan foydalanamiz. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya gemolimfasi hajmi jihatidan juda katta farq qiladigan, 1 dan 5 kb gacha bo'lgan DNK parchalarini o'z ichiga oladi. O'q otish ketma-ketligi shuni ko'rsatdiki, ko'p miqdordagi DNK parchalari begona mikrobial kelib chiqishiga ega. Ular orasida biz bakteriyalar, arxeyalar va viruslarning DNK parchalarini topdik, jumladan, qirg'oq dengiz ekotizimlarida keng tarqalgan turli xil xostlarni yuqtirishi ma'lum bo'lgan viruslar. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, midiyalarga qo'llaniladigan LB tushunchasi dengiz qirg'oqlari ekotizimlaridagi mikrobial xilma-xillik haqida boy, ammo hali o'rganilmagan bilim manbai hisoblanadi.
Iqlim o'zgarishining (IO) dengiz ekotizimlarining biologik xilma-xilligiga ta'siri tez rivojlanayotgan tadqiqot sohasidir. Global isish nafaqat muhim fiziologik stresslarni keltirib chiqaradi, balki dengiz organizmlarining issiqlik barqarorligining evolyutsion chegaralarini ham kengaytiradi, bir qator turlarning yashash muhitiga ta'sir qiladi va ularni yanada qulay sharoitlarni izlashga undaydi [1, 2]. Metazoalarning biologik xilma-xilligiga ta'sir qilishdan tashqari, IO xo'jayin-mikrobial o'zaro ta'sirlarning nozik muvozanatini buzadi. Bu mikrobial disbakterioz dengiz ekotizimlari uchun jiddiy xavf tug'diradi, chunki u dengiz organizmlarini yuqumli patogenlarga ko'proq moyil qiladi [3, 4]. SS ommaviy o'limlarda muhim rol o'ynaydi, deb ishoniladi, bu esa global dengiz ekotizimlarini boshqarish uchun jiddiy muammo hisoblanadi [5, 6]. Bu ko'plab dengiz turlarining iqtisodiy, ekologik va ozuqaviy ta'sirini hisobga olgan holda muhim masala. Bu, ayniqsa, IO ta'siri tezroq va jiddiyroq bo'lgan qutb mintaqalarida yashovchi ikki pallali mo'ylovlar uchun to'g'ri keladi [6, 7]. Darhaqiqat, Mytilus spp. kabi ikki pallali mo'ylovlar IO ning dengiz ekotizimlariga ta'sirini kuzatish uchun keng qo'llaniladi. Ajablanarli emaski, ularning sog'lig'ini kuzatish uchun nisbatan ko'p miqdordagi biomarkerlar ishlab chiqilgan bo'lib, ko'pincha fermentativ faollikka yoki hujayra hayotiyligi va fagotsitik faollik kabi hujayra funktsiyalariga asoslangan funktsional biomarkerlarni o'z ichiga olgan ikki bosqichli yondashuv qo'llaniladi [8]. Bu usullar shuningdek, ko'p miqdordagi dengiz suvi so'rilgandan keyin yumshoq to'qimalarda to'planadigan o'ziga xos bosim ko'rsatkichlari konsentratsiyasini o'lchashni ham o'z ichiga oladi. Biroq, ikki pallali mo'ylovlilarning yuqori filtrlash qobiliyati va yarim ochiq qon aylanish tizimi bemorlarni davolashning oddiy va minimal invaziv yondashuvi bo'lgan suyuq biopsiya (LB) kontseptsiyasidan foydalangan holda yangi gemolimfa biomarkerlarini ishlab chiqish imkoniyatini beradi. qon namunalari [9, 10]. Inson LBsida bir nechta turdagi aylanib yuruvchi molekulalarni topish mumkin bo'lsa-da, bu kontseptsiya asosan plazmadagi aylanib yuruvchi hujayradan tashqari DNK (ccfDNK) fragmentlarining DNK ketma-ketligini tahlil qilishga asoslangan. Aslida, inson plazmasida aylanib yuruvchi DNKning mavjudligi 20-asrning o'rtalaridan beri ma'lum bo'lgan [11], ammo faqat so'nggi yillarda yuqori o'tkazuvchanlikdagi ketma-ketlik usullarining paydo bo'lishi ccfDNKga asoslangan klinik tashxis qo'yishga olib keldi. Ushbu aylanib yuruvchi DNK fragmentlarining mavjudligi qisman hujayra o'limidan keyin genom DNKsining (yadroviy va mitoxondrial) passiv ravishda ajralib chiqishi bilan bog'liq. Sog'lom odamlarda ccfDNK konsentratsiyasi odatda past (<10 ng/ml), ammo turli patologiyalardan aziyat chekadigan yoki stressga duchor bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi. Sog'lom odamlarda ccfDNK konsentratsiyasi odatda past (<10 ng/ml), ammo turli patologiyalardan aziyat chekadigan yoki stressga duchor bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi. U zdorovyx ludey joylashuvi vkDNK v norme nizkaya (<10 ng/ml), lekin mumkin povyshaya v 5-10 razlichnoy patologik yoki podvergayuschyhsya stressu, privodyaschemu k povrejdenyu tkaney. Sog'lom odamlarda kccDNK konsentratsiyasi odatda past (<10 ng/ml), ammo u turli patologiyalari bo'lgan yoki to'qimalarning shikastlanishiga olib keladigan stress ostida bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar ko'payishi mumkin.ccfDNA língíngíngíngíngjínjínjínjínjín (<10) ng/mL），mīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngčichàngāng yāngī, ccfdna yāngāng yīng yī (<10 ng/ml）) 5-10 shn, mēngčičičičičičičičičić mínKonsentratsii ccfDNA obychno nizkie (<10 ng/ml) u zdorovyx lumey, lekin 5-10 razryadli bemorlarning turli xil kasalliklari yoki stressi, chto privodit k povrejdenyu tkaney mumkin. Sog'lom odamlarda ccfDNK konsentratsiyasi odatda past (<10 ng/ml), ammo turli patologiyalari yoki stressi bo'lgan bemorlarda 5-10 baravar oshishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi.ccfDNK fragmentlarining hajmi juda xilma-xil bo'ladi, lekin odatda 150 dan 200 bp gacha o'zgaradi. [12]. O'z-o'zidan olingan ccfDNK, ya'ni normal yoki transformatsiyalangan xost hujayralaridan olingan ccfDNK tahlili yadro va/yoki mitoxondrial genomda mavjud bo'lgan genetik va epigenetik o'zgarishlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin, shu bilan klinisyenlarga ma'lum molekulyar maqsadli terapiyalarni tanlashga yordam beradi [13]. Biroq, ccfDNKni homiladorlik paytida homila hujayralaridan yoki transplantatsiya qilingan organlardan olingan ccfDNK kabi xorijiy manbalardan olish mumkin [14,15,16,17]. ccfDNK shuningdek, yuqumli agentning (begona) nuklein kislotalari mavjudligini aniqlash uchun muhim ma'lumot manbai bo'lib, bu qon madaniyati bilan aniqlanmagan keng tarqalgan infektsiyalarni invaziv bo'lmagan holda aniqlash imkonini beradi va infektsiyalangan to'qimalarning invaziv biopsiyasidan qochadi [18]. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, inson qonida virusli va bakterial patogenlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan boy ma'lumot manbai mavjud va inson plazmasida topilgan ccfDNKning taxminan 1% xorijiy kelib chiqishi bor [19]. Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, organizmning aylanib yuruvchi mikrobiomining biologik xilma-xilligini ccfDNA tahlili yordamida baholash mumkin. Biroq, yaqin vaqtgacha bu tushuncha faqat odamlarda va kamroq darajada boshqa umurtqali hayvonlarda qo'llanilgan [20, 21].
Ushbu maqolada biz 35 million yil oldin shakllangan katta plato tepasida joylashgan orollar guruhi bo'lgan subantarktik Kerguelen orollarida keng tarqalgan janubiy tur bo'lgan Aulacomya atra ning ccfDNKsini tahlil qilish uchun LB potentsialidan foydalanamiz. vulqon otilishi. In vitro eksperimental tizimdan foydalanib, biz dengiz suvidagi DNK parchalari midiyalar tomonidan tezda egallab olinishini va gemolimfa bo'linmasiga kirishini aniqladik. O'q otish ketma-ketligi shuni ko'rsatdiki, midiya gemolimfa ccfDNK tarkibida o'ziga xos va o'z-o'zidan kelib chiqmagan DNK parchalari, jumladan, simbiotik bakteriyalar va sovuq vulqon dengiz qirg'oq ekotizimlariga xos bo'lgan biomlardan olingan DNK parchalari mavjud. Gemolimfa ccfDNK shuningdek, turli xil xost diapazonlariga ega viruslardan olingan virus ketma-ketliklarini ham o'z ichiga oladi. Shuningdek, biz suyakli baliqlar, dengiz anemonlari, suv o'tlari va hasharotlar kabi ko'p hujayrali hayvonlardan DNK parchalarini topdik. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz LB kontseptsiyasini dengiz umurtqasizlariga dengiz ekotizimlarida boy genom repertuarini yaratish uchun muvaffaqiyatli qo'llash mumkinligini ko'rsatadi.
Voyaga yetgan (55-70 mm uzunlikdagi) Mytilus platensis (M. platensis) va Aulacomya atra (A. atra) 2018-yil dekabr oyida Port-o-Fransning toshloq qirg'oqlaridan (049°21.235 S, 070°13.490 E.) yig'ib olindi. Kerguelen orollaridan boshqa voyaga yetgan ko'k midiyalar (Mytilus spp.) tijorat yetkazib beruvchisidan (PEI Mussel King Inc., Shahzoda Eduard oroli, Kanada) olindi va 10-20 litr 32‰ sun'iy sho'r suv (sun'iy dengiz tuzi Reef Crystal, Instant Ocean, Virjiniya, AQSh) solingan harorat nazorat qilinadigan (4°C) gazlangan idishga joylashtirildi. Har bir tajriba uchun alohida chig'anoqlarning uzunligi va og'irligi o'lchandi.
Ushbu dastur uchun bepul ochiq kirish protokoli onlayn mavjud (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Qisqacha aytganda, LB gemolimfa abduktor mushaklaridan [22] tasvirlanganidek yig'ilgan. Gemolimfa 1200 × g da 3 daqiqa davomida santrifugatsiya orqali aniqlandi, supernatant ishlatilgunga qadar muzlatildi (-20°C). cfDNKni ajratish va tozalash uchun namunalar (1,5-2,0 ml) eritildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq NucleoSnap cfDNA to'plami (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) yordamida qayta ishlandi. ccfDNK keyingi tahlilgacha -80°C da saqlandi. Ba'zi tajribalarda ccfDNK QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) yordamida ajratildi va tozalandi. Tozalangan DNK standart PicoGreen tahlili yordamida aniqlandi. Izolyatsiya qilingan ccfDNKning fragment taqsimoti yuqori sezuvchanlikdagi DNK to'plamidan foydalangan holda Agilent 2100 bioanalizatoridan (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) foydalanib kapillyar elektroforez yordamida tahlil qilindi. Tahlil ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq 1 µl ccfDNK namunasidan foydalanib amalga oshirildi.
Gemolimfa ccfDNK fragmentlarini ketma-ketlashtirish uchun Génome Québec (Monreal, Kvebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 to'plamining Illumina DNA Mix to'plamidan foydalanib, ov qurollari kutubxonalarini tayyorladi. Standart adapter (BioO) ishlatilgan. Xom ma'lumotlar fayllari NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 va SRR8924809) dan mavjud. Asosiy o'qish sifati FastQC [23] yordamida baholandi. Trimmomatic [24] adapterlarni kesish va sifatsiz o'qishlar uchun ishlatilgan. Juft uchlari bo'lgan ov qurollari mos kelmasliklarning oldini olish uchun FLASH kamida 20 bp ustma-ust tushish bilan uzunroq bitta o'qishlarga birlashtirildi [25]. Birlashtirilgan o'qishlar ikki pallali NCBI taksonomiya ma'lumotlar bazasi (e qiymati < 1e−3 va 90% gomologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va past murakkablikdagi ketma-ketliklarni niqoblash DUST [26] yordamida amalga oshirildi. Birlashtirilgan o'qishlar ikki pallali NCBI taksonomiya ma'lumotlar bazasi (e qiymati < 1e−3 va 90% gomologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va past murakkablikdagi ketma-ketliklarni niqoblash DUST [26] yordamida amalga oshirildi. Ob'edindennye chteniya byli annotirovany s pomoshchyu BLASTN s ispolzovanie bazy dannyx taksonomii dvustvorchatyx mollyuskov NCBI (znachenie e < 1e-3 va 90% gomologii), a maskirovanie posledovatelnostey nizkoy slojnosti bylo slojnosty. [26]. Birlashtirilgan o'qishlar NCBI ikki pallali taksonomiya ma'lumotlar bazasi (e qiymati < 1e-3 va 90% gomologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va past murakkablikdagi ketma-ketlikni niqoblash DUST [26] yordamida amalga oshirildi.nēngčiči NCBI nėngčičiči（e mí< 1e-3 90% BLASTN língíngínín BLASTN díngínīlín 2 ST 2. língíngíngíngíngíníngínínínbčičiči ncbi lín （（（<1e-3 tn 90% lēngči） lēngčičičičičičičičičičijī 6 dīngjīng 6 lílílílílílílílílílílíííííííííííííííí lílílílílíiOb'edindennye chteniya byli annotirovani s pomoshchyu BLASTN s ispolzovanem taksonomicheskoy bazy dannyx dvustvortatyh mollyuskov NCBI (znachenie e <1e-3 va 90% gomologii), a maskirovanie posledovatelnostey byly slojplovenie byly slojnosty. [26]. Birlashtirilgan o'qishlar NCBI ikki pallali taksonomik ma'lumotlar bazasi (e qiymati <1e-3 va 90% gomologiya) yordamida BLASTN bilan izohlandi va past murakkablikdagi ketma-ketlikni niqoblash DUST [26] yordamida amalga oshirildi.O'qishlar ikki guruhga bo'lindi: ikki pallali ketma-ketliklar bilan bog'liq (bu yerda o'z-o'zini o'qishlar deb ataladi) va bog'liq bo'lmagan (o'z-o'zini o'qishlar bo'lmagan). Ikki guruh MEGAHIT yordamida alohida yig'ilib, kontiglarni yaratdi [27]. Shu bilan birga, begona mikrobiom o'qishlarining taksonomik taqsimoti Kraken2 [28] yordamida tasniflandi va Galaxydagi Krona doira diagrammasi bilan grafik ravishda ifodalandi [29, 30]. Dastlabki tajribalarimizdan optimal kmerlar kmer-59 ekanligi aniqlandi. Keyin o'z-o'zidan bog'liqliklar yakuniy izoh uchun BLASTN (ikki pallali NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya) bilan moslashtirish orqali aniqlandi. Keyin o'z-o'zidan bog'liqliklar yakuniy izoh uchun BLASTN (ikki pallali NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya) bilan moslashtirish orqali aniqlandi. Zatem sobstvennye konti byli identifikatoran putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx dvustvorchatyx mollyuskov NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%) uchun okonchatelnoy annotatsii. Keyin o'z-o'zidan bog'liqliklar yakuniy izoh uchun BLASTN (NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% gomologiya) bilan taqqoslash orqali aniqlandi.BLASTN（yēngjīnīn NCBI lìnìnẓ，e yēngči，e qēng< 1e-10 60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。BLASTN（yēngjīnīn NCBI lìnìnẓ，e yēngči，e qēng< 1e-10 60% Zatem byli identifisirovani sobstvennye kontiqi uchun okonchatelnoy annotatsii putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx NCBI dlya dvustvorchatyh mollyuskov, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Keyin o'z-o'zidan bog'liqliklar BLASTN (NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% gomologiya) bilan taqqoslash orqali yakuniy izohlash uchun aniqlandi. Bunga parallel ravishda, o'z-o'zidan guruh bo'lmagan kontiglar BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya) bilan izohlandi. Bunga parallel ravishda, o'z-o'zidan guruh bo'lmagan kontiglar BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya) bilan izohlandi. Parallelno chujorodnye grupovye kontiqi byli annotrovany s pomoshchyu BLASTN (baza dannyx nt NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Bunga parallel ravishda, xorijiy guruh kontiglari BLASTN (NT NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% gomologiya) bilan izohlandi.BLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīngBLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīng Parallelno kontiqi, ne otnosyashchiesya k sobstvennoy gruppe, byli annotrovany s pomoshchyu BLASTN (baza dannyx nt NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Bunga parallel ravishda, o'z-o'zidan guruh bo'lmagan kontiglar BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% gomologiya) bilan izohlandi. BLASTX shuningdek, nr va RefSeq oqsili NCBI ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda ham o'tkazildi (e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya). BLASTX shuningdek, nr va RefSeq oqsili NCBI ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda ham o'tkazildi (e qiymati < 1e−10 va 60% gomologiya). BLASTX ham nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovaniem baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). BLASTX shuningdek, nr va RefSeq NCBI oqsil ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda ham amalga oshirildi (e qiymati < 1e-10 va 60% gomologiya).nr nr nr refSeq nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr n ncbi ng ng ng n ng ng ng bl bl BLASTXnr nr nr refSeq nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr n ncbi ng ng ng n ng ng ng bl bl BLASTX BLASTX shuningdek vypolnyali na nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovanie baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). BLASTX shuningdek, nr va RefSeq NCBI oqsil ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan bog'liq bo'lmagan kontiglarda ham amalga oshirildi (e qiymati <1e-10 va 60% gomologiya).O'z-o'zidan bog'liq bo'lmagan BLASTN va BLASTX pullari yakuniy bog'liqliklarni ifodalaydi (qo'shimcha faylga qarang).
PCR uchun ishlatiladigan primerlar S1 jadvalida keltirilgan. ccfDNK maqsadli genlarini kuchaytirish uchun Taq DNK polimerazasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) ishlatilgan. Quyidagi reaksiya shartlari qo'llanildi: 95°C da 3 daqiqa davomida denaturatsiya, 1 daqiqa davomida 95°C, 1 daqiqa davomida tavlash haroratini o'rnatish, 72°C da 1 daqiqa davomida cho'zish, 35 sikl va nihoyat 10 daqiqa ichida 72°C. . PCR mahsulotlari 95 V da SYBRTM xavfsiz DNK gel bo'yog'i (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) ni o'z ichiga olgan agaroza gellarida (1,5%) elektroforez yordamida ajratildi.
Midiyalar (Mytilus spp.) 500 ml kislorodli dengiz suvida (32 PSU) 4°C da 24 soat davomida iqlimlashtirildi. Inson galektini-7 kDNK ketma-ketligini kodlovchi qo'shimchani o'z ichiga olgan plazmid DNKsi (NCBI kirish raqami L07769) flakonga 190 mkg/mkl yakuniy konsentratsiyada qo'shildi. DNK qo'shilmasdan bir xil sharoitlarda inkubatsiya qilingan midiyalar nazorat edi. Uchinchi nazorat idishida midiyasiz DNK bor edi. Dengiz suvidagi DNK sifatini kuzatish uchun har bir idishdan ko'rsatilgan vaqtda dengiz suvi namunalari (20 mkl; uchta takrorlash) olindi. Plazmid DNKsini kuzatish uchun LB midiyalari ko'rsatilgan vaqtlarda yig'ib olindi va qPCR va ddPCR yordamida tahlil qilindi. Dengiz suvining yuqori tuz miqdori tufayli barcha PZR tahlillaridan oldin alikvotlar PZR sifatli suvda (1:10) suyultirildi.
Raqamli tomchi PZR (ddPCR) BioRad QX200 protokoli (Mississauga, Ontario, Kanada) yordamida amalga oshirildi. Optimal haroratni aniqlash uchun harorat profilidan foydalaning (S1-jadval). Tomchilar QX200 tomchi generatori (BioRad) yordamida hosil qilindi. ddPCR quyidagicha amalga oshirildi: 95°C da 5 daqiqa, 95°C da 30 soniya davomida 50 tsikl va berilgan tavlash harorati 1 daqiqa va 72°C da 30 soniya, 4°C da 5 daqiqa va 90°C da 5 daqiqa davomida. Tomchilar soni va musbat reaksiyalar (nusxalar soni/µl) QX200 tomchi o'quvchi (BioRad) yordamida o'lchandi. 10 000 dan kam tomchili namunalar rad etildi. Shaklni nazorat qilish har safar ddPCR ishga tushirilganda amalga oshirilmadi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avstraliya) va LGALS7 ga xos primerlar yordamida amalga oshirildi. Barcha miqdoriy PZRlar QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) yordamida 20 µl da amalga oshirildi. qPCR 95°C da 15 daqiqalik inkubatsiya bilan boshlandi, so'ngra 95°C da 10 soniya davomida va 60°C da 60 soniya davomida 40 sikl bitta ma'lumot to'plash bilan amalga oshirildi. Erish egri chiziqlari qPCR oxirida 95°C da 5 soniya, 65°C da 60 soniya va 97°C da ketma-ket o'lchovlar yordamida yaratildi. Har bir qPCR, nazorat namunalaridan tashqari, uch nusxada amalga oshirildi.
Midiyalar yuqori filtrlash tezligi bilan mashhur bo'lganligi sababli, biz avval dengiz suvida mavjud bo'lgan DNK parchalarini filtrlay oladimi va ushlab tura oladimi yoki yo'qligini tekshirdik. Shuningdek, biz bu parchalar ularning yarim ochiq limfa tizimida to'planadimi yoki yo'qmi, qiziqdik. Biz bu masalani ko'k midiya rezervuarlariga qo'shilgan eriydigan DNK parchalarining taqdirini kuzatish orqali eksperimental ravishda hal qildik. DNK parchalarini kuzatishni osonlashtirish uchun biz inson galektin-7 genini o'z ichiga olgan begona (o'zi emas) plazmid DNKsidan foydalandik. ddPCR dengiz suvi va midiyalardagi plazmid DNK parchalarini kuzatadi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, agar dengiz suvidagi DNK parchalari miqdori midiyalar yo'qligida vaqt o'tishi bilan (7 kungacha) nisbatan doimiy bo'lib qolsa, midiyalar borligida bu daraja 8 soat ichida deyarli butunlay yo'q bo'lib ketdi (1a, b-rasm). Ekzogen DNK parchalari klapan ichidagi suyuqlik va gemolimfada 15 daqiqa ichida osongina aniqlandi (1c-rasm). Bu parchalar ta'sir qilishdan keyin 4 soatgacha aniqlanishi mumkin edi. DNK fragmentlariga nisbatan bu filtrlash faolligi bakteriyalar va suv o'tlarining filtrlash faolligiga o'xshash [31]. Bu natijalar midiyalar o'zlarining suyuqlik bo'linmalarida begona DNKni filtrlashi va to'plashi mumkinligini ko'rsatadi.
Dengiz suvidagi plazmid DNKsining nisbiy konsentratsiyasi, midiyalar mavjudligida (A) yoki yo'qligida (B), ddPCR bilan o'lchanadi. A da natijalar foiz sifatida ifodalanadi, katakchalar chegaralari 75 va 25-persentillarni ifodalaydi. Moslashtirilgan logarifmik egri chiziq qizil rangda ko'rsatilgan va kulrang rang bilan belgilangan maydon 95% ishonch oralig'ini ifodalaydi. B da qizil chiziq o'rtacha qiymatni, ko'k chiziq esa konsentratsiya uchun 95% ishonch oralig'ini ifodalaydi. C Plazmid DNK qo'shilgandan keyin turli vaqtlarda midiyalarning gemolimfasi va klapan suyuqligida plazmid DNKning to'planishi. Natijalar aniqlangan mutlaq nusxalar/ml (±SE) sifatida taqdim etiladi.
Keyin, biz antropogen ta'siri cheklangan uzoq orollar guruhi bo'lgan Kerguelen orollaridagi midiya yotoqlaridan to'plangan midiyalarda ccfDNKning kelib chiqishini o'rganib chiqdik. Shu maqsadda, midiya gemolimfalaridan cccDNK ajratib olindi va inson cccDNKsini tozalash uchun keng qo'llaniladigan usullar bilan tozalandi [32, 33]. Biz midiyalardagi o'rtacha gemolimfa ccfDNK konsentratsiyasi ml gemolimfaning past mikrogramm oralig'ida ekanligini aniqladik (S2-jadvalga, Qo'shimcha ma'lumotga qarang). Bu konsentratsiya diapazoni sog'lom odamlarga qaraganda ancha katta (millilitrda past nanogramma), ammo kamdan-kam hollarda saraton kasalligiga chalingan bemorlarda ccfDNK darajasi millilitrda bir necha mikrogrammga yetishi mumkin [34, 35]. Gemolimfa ccfDNKning o'lcham taqsimotini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, bu parchalar hajmi jihatidan juda katta farq qiladi, 1000 bp dan 1000 bp gacha. dan 5000 bp gacha (2-rasm). Shunga o'xshash natijalar kremniy asosidagi QIAamp Investigator Kit yordamida olingan, bu usul sud tibbiyotida keng tarqalgan bo'lib, ccfDNKni o'z ichiga olgan past konsentratsiyali DNK namunalaridan genomik DNKni tezda ajratib olish va tozalash uchun ishlatiladi [36].
Midiya gemolimfasining vakillik ccfDNK elektroforegrammasi. NucleoSnap Plasma Kit (yuqorida) va QIAamp DNK tadqiqotchisi to'plami yordamida ekstraktsiya qilingan. Midiyalarda gemolimfa ccfDNK konsentratsiyasining (±SE) taqsimlanishini ko'rsatuvchi B Skripka diagrammasi. Qora va qizil chiziqlar mos ravishda medianani va birinchi va uchinchi kvartillarni bildiradi.
Odamlar va primatlardagi ccfDNKning taxminan 1% begona manbaga ega [21, 37]. Ikki pallali mo'ylovlilarning yarim ochiq qon aylanish tizimi, mikroblarga boy dengiz suvi va midiya ccfDNKning o'lchamlari taqsimotini hisobga olgan holda, biz midiya gemolimfasi ccfDNK tarkibida boy va xilma-xil mikrobial DNK havzasi bo'lishi mumkin degan gipotezani ilgari surdik. Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz Kerguelen orollaridan to'plangan Aulacomya atra namunalaridan gemolimfa ccfDNKni ketma-ketlashtirdik va 10 milliondan ortiq o'qishlarni oldik, ularning 97,6% sifat nazoratidan o'tdi. Keyin o'qishlar BLASTN va NCBI ikki pallali mo'ylovli ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalarga ko'ra tasniflandi (S1-rasm, Qo'shimcha ma'lumot).
Odamlarda ham yadroviy, ham mitoxondrial DNK qon oqimiga chiqarilishi mumkin [38]. Biroq, ushbu tadqiqotda A. atra genomi ketma-ketlashtirilmagan yoki tavsiflanmaganligi sababli, midiyalarning yadro genomik DNKsini batafsil tavsiflashning iloji bo'lmadi. Biroq, biz ikki pallali kutubxonadan foydalanib, o'zimiz kelib chiqqan bir qator ccfDNK fragmentlarini aniqlay oldik (S2-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Shuningdek, biz ketma-ketlashtirilgan A. atra genlarini yo'naltirilgan PZR amplifikatsiyasi orqali o'zimiz kelib chiqqan DNK fragmentlarining mavjudligini tasdiqladik (3-rasm). Xuddi shunday, A. atra mitoxondrial genomi ommaviy ma'lumotlar bazalarida mavjudligini hisobga olsak, A. atra gemolimfasida mitoxondrial ccfDNK fragmentlarining mavjudligiga dalillarni topish mumkin. Mitoxondrial DNK fragmentlarining mavjudligi PZR amplifikatsiyasi bilan tasdiqlandi (3-rasm).
A. atra (qizil nuqtalar - stok raqami: SRX5705969) va M. platensis (ko'k nuqtalar - stok raqami: SRX5705968) gemolimfasida PZR yordamida kuchaytirilgan turli xil mitoxondrial genlar mavjud edi. Rasm Breton va boshqalar, 2011 B dan moslashtirilgan. A. atra dan gemolimfa supernatantini kuchaytirish FTA qog'ozida saqlangan. PZR aralashmasini o'z ichiga olgan PZR naychasiga to'g'ridan-to'g'ri qo'shish uchun 3 mm shtampdan foydalaning.
Dengiz suvidagi mikrobial tarkibning ko'pligini hisobga olgan holda, biz dastlab gemolimfadagi mikrobial DNK ketma-ketliklarini tavsiflashga e'tibor qaratdik. Buning uchun biz ikki xil strategiyadan foydalanamiz. Birinchi strategiyada BLAST va boshqa vositalar bilan taqqoslanadigan aniqlik bilan mikrobial ketma-ketliklarni aniqlay oladigan algoritmga asoslangan ketma-ketlik tasniflash dasturi Kraken2 ishlatilgan [28]. 6719 dan ortiq o'qishlar bakterial kelib chiqishi aniqlangan, 124 va 64 tasi esa mos ravishda arxeya va viruslardan olingan (4-rasm). Eng ko'p uchraydigan bakterial DNK fragmentlari Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) va Bacteroidetes (17%) edi (4a-rasm). Bu taqsimot dengiz ko'k midiya mikrobiomining oldingi tadqiqotlariga mos keladi [39, 40]. Gammaproteobacteria ko'plab Vibrionalesni o'z ichiga olgan Proteobacterialarning asosiy sinfi (44%) edi (4b-rasm). ddPCR usuli A. atra gemolimfasining ccfDNKsida Vibrio DNK fragmentlari mavjudligini tasdiqladi (4c-rasm) [41]. ccfDNKning bakterial kelib chiqishi haqida ko'proq ma'lumot olish uchun qo'shimcha yondashuv qo'llanildi (S2-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Bu holda, ustma-ust tushgan o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va 1e−3 e qiymati hamda >90% gomologiyaga ega chegara yordamida o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqmagan deb tasniflandi. Bu holda, ustma-ust tushgan o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va 1e−3 e qiymati hamda >90% gomologiyaga ega chegara yordamida o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqmagan deb tasniflandi. V etom sluchae perekryvayushchiesya chteniya byi sobrany kak chteniya s parnymi kontsami va byli klassisitsirovany kak sobstvennye (dvustvorchatye mollyuski) yoki chujie po proisxojdeniyu s ispolzovanyem BLASTN va znacheniya gomi e 190% oteychen>. Bu holda, bir-birining ustiga chiqadigan o'qishlar juftlashgan o'qishlar sifatida to'plandi va BLASTN va 1e-3 ning e qiymati hamda >90% gomologiya bilan kesishish yordamida mahalliy (ikki pallali) yoki asl bo'lmagan deb tasniflandi.língíngíngíníníníníngínííníngíngíngíngíngíngíngíngínííníngíníngíníngíngíngínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínínín BLASTN 1e-3 dín>90% língíngíngíngíngíngíngíngíngínjínjínjínjínjínjínjínjíngíngíníchài yàng yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yínzhi línííníí, yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín yín qài > 90% líííííí íííííí ííííí （lííníí） língìíči V etom sluchae perekryvayushchiesya chteniya byli sobrany kak chteniya s parnymi kontsami va klassisitsirovany kak sobstvennye (dvustvorchatye mollyuski) yoki nesobstvennye po proisxojdeniyu s ispolzovaniem znacheniy e BLASTN gomiga i 19%. Bu holda, bir-birining ustiga chiqadigan o'qishlar juftlashgan o'qishlar sifatida to'plandi va e BLASTN va 1e-3 qiymatlari hamda >90% gomologiya chegarasi yordamida o'z (ikki pallali) yoki asl bo'lmagan deb tasniflandi.A. atra genomi hali ketma-ketlashtirilmaganligi sababli, biz MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assemblerining de novo yig'ish strategiyasidan foydalandik. Jami 147 188 ta kontig kelib chiqishiga bog'liq (ikki pallali) sifatida aniqlandi. Keyin bu kontiglar BLASTN va BLASTX yordamida 1e-10 e-qiymatlari bilan portlatildi. Ushbu strategiya bizga A. atra ccfDNKda mavjud bo'lgan 482 ta ikki pallali bo'lmagan fragmentlarni aniqlash imkonini berdi. Ushbu DNK fragmentlarining yarmidan ko'pi (57%) bakteriyalardan, asosan sulfotrofik simbiontlarni o'z ichiga olgan gill simbiontlaridan va Solemya velum gill simbiontlaridan olingan (5-rasm).
Tip darajasida nisbiy ko'plik. B Ikki asosiy filning (Firmicutes va Proteobacteria) mikrobial xilma-xilligi. ddPCR ning vakillik amplifikatsiyasi C Vibrio spp. A. Uchta atra gemolimfasida 16S rRNA genining (ko'k) qismlari.
Jami 482 ta to'plangan kontig tahlil qilindi. Metagenomik kontig annotatsiyalarining (prokaryotlar va eukaryotlar) taksonomik taqsimotining umumiy profili. B BLASTN va BLASTX tomonidan aniqlangan bakterial DNK fragmentlarining batafsil taqsimoti.
Kraken2 tahlili shuni ko'rsatdiki, midiya ccfDNKsida arxaik DNK fragmentlari, jumladan, Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) va Thaurmarcheota (11%) DNK fragmentlari mavjud (6a-rasm). Kaliforniya midiyalarining mikrobial hamjamiyatida ilgari topilgan Euryarchaeota va Crenarchaeotadan olingan DNK fragmentlarining mavjudligi ajablanarli emas [42]. Euryarchaeota ko'pincha ekstremal sharoitlar bilan bog'liq bo'lsa-da, endi Euryarchaeota ham, Crenarcheota ham dengiz kriogen muhitida eng keng tarqalgan prokaryotlar qatoriga kirishi tan olingan [43, 44]. Kerguelen platosidagi tub oqishlaridan keng ko'lamli metan oqishlari [45] va Kerguelen orollari qirg'oqlarida kuzatilgan mikrobial metan ishlab chiqarilishi mumkinligi haqidagi so'nggi xabarlarni hisobga olsak, midiyalarda metanogen mikroorganizmlarning mavjudligi ajablanarli emas [46].
Keyin bizning e'tiborimiz DNK viruslaridan olingan ma'lumotlarga qaratildi. Bizning bilishimcha, bu midiyalarning virus tarkibini o'rganish bo'yicha birinchi maqsaddan tashqari tadqiqot. Kutilganidek, biz bakteriofaglarning (Caudovirales) DNK parchalarini topdik (6b-rasm). Biroq, eng keng tarqalgan virusli DNK yadro sitoplazmatik katta DNK virusi (NCLDV) deb ham ataladigan nukleotsitoviruslar filumidan kelib chiqadi, bu har qanday virusning eng katta genomiga ega. Ushbu filum ichida DNK ketma-ketliklarining aksariyati Mimimidoviridae (58%) va Poxviridae (21%) oilalariga tegishli bo'lib, ularning tabiiy xo'jayinlari umurtqali hayvonlar va artropodlarni o'z ichiga oladi, bu DNK ketma-ketliklarining kichik bir qismi esa ma'lum virusologik suv o'tlariga tegishli. Dengiz eukaryotik suv o'tlarini yuqtiradi. Ketma-ketliklar, shuningdek, ma'lum virusli turkumlar orasida eng katta genom hajmiga ega bo'lgan ulkan virus bo'lgan Pandora virusidan olingan. Qizig'i shundaki, gemolimfa ccfDNK ketma-ketligi orqali aniqlangan virus bilan kasallangan deb ma'lum bo'lgan xostlar diapazoni nisbatan katta edi (S3-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). U Baculoviridae va Iridoviridae kabi hasharotlarni yuqtiradigan viruslarni, shuningdek, amyoba, suv o'tlari va umurtqali hayvonlarni yuqtiradigan viruslarni o'z ichiga oladi. Shuningdek, biz Pithovirus sibericum genomiga mos keladigan ketma-ketliklarni topdik. Pitoviruslar (shuningdek, "zombi viruslari" deb ham ataladi) birinchi marta Sibirdagi 30 000 yillik abadiy muzlikdan ajratilgan [47]. Shunday qilib, bizning natijalarimiz ushbu viruslarning barcha zamonaviy turlari yo'q bo'lib ketmaganligini ko'rsatuvchi oldingi hisobotlarga mos keladi [48] va bu viruslar uzoq subarktik dengiz ekotizimlarida mavjud bo'lishi mumkin.
Nihoyat, biz boshqa ko'p hujayrali hayvonlardan DNK parchalarini topa olishimizni tekshirish uchun sinov o'tkazdik. BLASTN va BLASTX yordamida nt, nr va RefSeq kutubxonalari (genom va oqsil) bilan jami 482 ta begona kontig aniqlandi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, ko'p hujayrali hayvonlarning ccfDNKsining begona parchalari orasida suyak suyaklarining DNKsi ustunlik qiladi (5-rasm). Hasharotlar va boshqa turlarning DNK parchalari ham topilgan. DNK parchalarining nisbatan katta qismi aniqlanmagan, ehtimol, quruqlikdagi turlarga nisbatan genomik ma'lumotlar bazalarida ko'p sonli dengiz turlarining kam vakilligi tufayli [49].
Ushbu maqolada biz LB konsepsiyasini midiyalarga qo'llaymiz va gemolimfa ccfDNK zarbalarini ketma-ketlashtirish dengiz qirg'oqlari ekotizimlarining tarkibi haqida tushuncha berishi mumkinligini ta'kidlaymiz. Xususan, biz 1) midiya gemolimfasida nisbatan katta (~1-5 kb) aylanib yuruvchi DNK fragmentlarining nisbatan yuqori konsentratsiyasi (mikrogram darajasi) mavjudligini aniqladik; 2) bu DNK fragmentlari ham mustaqil, ham mustaqil emas. 3) Ushbu DNK fragmentlarining begona manbalari orasida biz bakterial, arxaeal va virusli DNKni, shuningdek, boshqa ko'p hujayrali hayvonlarning DNKsini topdik; 4) Ushbu begona ccfDNK fragmentlarining gemolimfada to'planishi tez sodir bo'ladi va midiyalarning ichki filtrlash faolligiga hissa qo'shadi. Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, hozirgacha asosan biotibbiyot sohasida qo'llanilgan LB konsepsiyasi qo'riqchi turlari va ularning atrof-muhiti o'rtasidagi o'zaro ta'sirni yaxshiroq tushunish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan boy, ammo o'rganilmagan bilim manbasini kodlaydi.
Primatlardan tashqari, sichqonlar, itlar, mushuklar va otlar kabi sutemizuvchilarda ham ccfDNK izolyatsiyasi haqida xabar berilgan [50, 51, 52]. Biroq, bizning ma'lumotimizga ko'ra, bizning tadqiqotimiz ochiq qon aylanish tizimiga ega dengiz turlarida ccfDNKni aniqlash va ketma-ketligini aniqlash haqida xabar bergan birinchi tadqiqotdir. Midiyalarning bu anatomik xususiyati va filtrlash qobiliyati, hech bo'lmaganda qisman, boshqa turlarga nisbatan qon aylanishdagi DNK fragmentlarining turli o'lcham xususiyatlarini tushuntirishi mumkin. Odamlarda qonda aylanib yuradigan DNK fragmentlarining aksariyati 150 dan 200 bp gacha bo'lgan kichik fragmentlar bo'lib, maksimal cho'qqisi 167 bp ni tashkil qiladi [34, 53]. DNK fragmentlarining kichik, ammo sezilarli qismi 300 dan 500 bp gacha o'lchamda va taxminan 5% 900 bp dan uzunroqdir [54]. Bu o'lcham taqsimotining sababi shundaki, plazmadagi ccfDNKning asosiy manbai hujayra o'limi natijasida, sog'lom odamlarda hujayra o'limi yoki qon aylanish tizimidagi gematopoetik hujayralarning nekrozi yoki saraton bemorlarida o'sma hujayralarining apoptozi (qon aylanish tizimidagi o'sma DNKsi deb nomlanadi) natijasida yuzaga keladi. , ctDNK). Midiyalarda topgan gemolimfa ccfDNKning o'lcham taqsimoti 1000 dan 5000 bp gacha bo'lgan, bu midiya ccfDNKning boshqa kelib chiqishi borligini ko'rsatadi. Bu mantiqiy gipoteza, chunki midiyalar yarim ochiq qon tomir tizimiga ega va mikrobial genom DNKning yuqori konsentratsiyasini o'z ichiga olgan dengiz suv muhitida yashaydi. Aslida, ekzogen DNKdan foydalangan holda o'tkazilgan laboratoriya tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, midiyalar dengiz suvida DNK parchalarini to'playdi, hech bo'lmaganda bir necha soatdan keyin ular hujayralar tomonidan qabul qilingandan keyin parchalanadi va/yoki chiqariladi va/yoki turli tashkilotlarda saqlanadi. Hujayralarning (ham prokaryotik, ham eukaryotik) kamyobligini hisobga olgan holda, intravalvular bo'linmalardan foydalanish o'z-o'zidan, shuningdek, begona manbalardan keladigan ccfDNK miqdorini kamaytiradi. Ikki pallali tug'ma immunitetning ahamiyati va aylanib yuruvchi fagotsitlarning ko'pligini hisobga olgan holda, biz hatto begona ccfDNK ham mikroorganizmlar va/yoki hujayra qoldiqlarini yutish orqali begona DNKni to'playdigan aylanib yuruvchi fagotsitlarga boy degan gipotezani ilgari surdik. Umumiy holda, bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, ikki pallali gemolimfa ccfDNK molekulyar ma'lumotlarning noyob ombori bo'lib, ularning qo'riqchi tur sifatidagi maqomini mustahkamlaydi.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bakteriyalardan olingan gemolimfa ccfDNK fragmentlarini ketma-ketliklash va tahlil qilish mezbon bakterial flora va atrofdagi dengiz ekotizimida mavjud bo'lgan bakteriyalar haqida asosiy ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin. Shot ketma-ketliklash usullari an'anaviy 16S rRNK identifikatsiya usullari qo'llanilganda, qisman ma'lumotnoma kutubxonasi tarafkashligi tufayli o'tkazib yuborilishi mumkin bo'lgan A. atra gill kommensal bakteriyalarining ketma-ketliklarini aniqladi. Darhaqiqat, Kerguelendagi bir xil midiya qatlamida M. platensisdan to'plangan LB ma'lumotlaridan foydalanishimiz shuni ko'rsatdiki, gill bilan bog'liq bakterial simbiontlarning tarkibi ikkala midiya turi uchun ham bir xil edi (S4-rasm, Qo'shimcha ma'lumot). Ikki genetik jihatdan farq qiluvchi midiyaning bu o'xshashligi Kerguelenning sovuq, oltingugurtli va vulqon konlaridagi bakterial jamoalarning tarkibini aks ettirishi mumkin [55, 56, 57, 58]. Port-o-Frans qirg'oqlari kabi bioturbatlangan qirg'oqbo'yi hududlaridan midiyalarni yig'ishda oltingugurtni kamaytiruvchi mikroorganizmlarning yuqori darajasi yaxshi tasvirlangan [59]. Yana bir ehtimol shundaki, kommensal midiya florasi gorizontal uzatish ta'sirida bo'lishi mumkin [60, 61]. Dengiz muhiti, dengiz tubi yuzasi va midiyalardagi simbiotik bakteriyalar tarkibi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi. Ushbu tadqiqotlar hozirda davom etmoqda.
Gemolimfa ccfDNKsining uzunligi va konsentratsiyasi, uni tozalash osonligi va tez miltiq bilan ketma-ketlikni aniqlash imkonini beruvchi yuqori sifat dengiz qirg'oq ekotizimlarida biologik xilma-xillikni baholash uchun midiya ccfDNKsidan foydalanishning ko'plab afzalliklaridan biridir. Bu yondashuv, ayniqsa, ma'lum bir ekotizimdagi virusli jamoalarni (viromlarni) tavsiflash uchun samarali [62, 63]. Bakteriyalar, arxeyalar va eukaryotlardan farqli o'laroq, virusli genomlarda 16S ketma-ketliklari kabi filogenetik jihatdan saqlanib qolgan genlar mavjud emas. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya kabi indikator turlaridan olingan suyuq biopsiyalar odatda qirg'oq dengiz ekotizimlarida yashovchi xostlarni yuqtirishi ma'lum bo'lgan nisbatan ko'p miqdordagi ccfDNK virus parchalarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Bunga protozoa, artropodlar, hasharotlar, o'simliklar va bakterial viruslarni (masalan, bakteriofaglar) yuqtirishi ma'lum bo'lgan viruslar kiradi. Kerguelendagi xuddi shu midiya qatlamida to'plangan ko'k midiyalarning (M. platensis) gemolimfa ccfDNK viromini tekshirganimizda shunga o'xshash taqsimot aniqlandi (S2-jadval, Qo'shimcha ma'lumot). ccfDNK ni miltiq bilan ketma-ketlashtirish, haqiqatan ham, odamlar yoki boshqa turlarning viromini o'rganishda tobora kuchayib borayotgan yangi yondashuvdir [21, 37, 64]. Bu yondashuv, ayniqsa, ikki qatorli DNK viruslarini o'rganish uchun foydalidir, chunki Baltimordagi eng xilma-xil va keng viruslar sinfini ifodalovchi barcha ikki qatorli DNK viruslari orasida bitta ham gen saqlanmagan [65]. Garchi bu viruslarning aksariyati tasniflanmagan bo'lsa-da va viruslar dunyosining mutlaqo noma'lum qismidan viruslarni o'z ichiga olishi mumkin bo'lsa-da [66], biz A. atra va M. platensis midiyalarining viromlari va xost diapazonlari ikki tur orasida ekanligini aniqladik. shunga o'xshash (qo'shimcha ma'lumot uchun S3-rasmga qarang). Bu o'xshashlik ajablanarli emas, chunki u atrof-muhitda mavjud bo'lgan DNKni qabul qilishda selektivlikning yo'qligini aks ettirishi mumkin. Hozirda RNK viromini tavsiflash uchun tozalangan RNKdan foydalangan holda kelajakdagi tadqiqotlar zarur.
Tadqiqotimizda biz Kowarski va hamkasblarining ishlaridan moslashtirilgan juda qat'iy quvur liniyasidan foydalandik [37], ular mahalliy ccfDNKni yig'ishdan oldin va keyin birlashtirilgan o'qishlar va kontiglarni ikki bosqichli o'chirishdan foydalanganlar, natijada xaritalanmagan o'qishlarning yuqori ulushiga olib keldi. Shuning uchun, biz ushbu xaritalanmagan o'qishlarning ba'zilari hali ham o'z kelib chiqishiga ega bo'lishi mumkinligini istisno qila olmaymiz, asosan bizda bu midiya turi uchun mos yozuvlar genom yo'qligi sababli. Biz shuningdek, ushbu quvur liniyasidan foydalandik, chunki biz o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan o'qishlar o'rtasidagi ximeralar va Illumina MiSeq PE75 tomonidan yaratilgan o'qish uzunliklari haqida xavotirda edik. Xaritada ko'rsatilmagan o'qishlarning aksariyatining yana bir sababi shundaki, dengiz mikroblarining aksariyati, ayniqsa Kerguelen kabi chekka hududlarda, izohlanmagan. Biz ccfDNK fragmentlarining uzunligi inson ccfDNKsiga o'xshash deb taxmin qilib, Illumina MiSeq PE75 dan foydalandik. Kelajakdagi tadqiqotlar uchun, gemolimfa ccfDNKsi odamlar va/yoki sutemizuvchilarga qaraganda uzunroq o'qishga ega ekanligini ko'rsatadigan natijalarimizni hisobga olgan holda, biz uzunroq ccfDNK fragmentlari uchun mosroq sekvenlash platformasidan foydalanishni tavsiya qilamiz. Ushbu amaliyot chuqurroq tahlil qilish uchun ko'proq ko'rsatkichlarni aniqlashni ancha osonlashtiradi. Hozirda mavjud bo'lmagan to'liq A. atra yadro genom ketma-ketligini olish, shuningdek, ccfDNKni o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalardan ajratishni sezilarli darajada osonlashtiradi. Tadqiqotimiz suyuq biopsiya konsepsiyasini midiyalarga qo'llash imkoniyatiga qaratilganligini hisobga olsak, ushbu konsepsiya kelajakdagi tadqiqotlarda qo'llanilganligi sababli, midiyalarning mikrobial xilma-xilligini o'rganish uchun ushbu usulning salohiyatini oshirish uchun yangi vositalar va quvurlar ishlab chiqiladi deb umid qilamiz. dengiz ekotizimi.
Invaziv bo'lmagan klinik biomarker sifatida, inson plazmasidagi ccfDNK darajasining oshishi turli kasalliklar, to'qimalarning shikastlanishi va stress holatlari bilan bog'liq [67,68,69]. Bu o'sish to'qimalarning shikastlanishidan keyin o'z kelib chiqishiga ega DNK fragmentlarining ajralib chiqishi bilan bog'liq. Biz bu masalani o'tkir issiqlik stressidan foydalanib hal qildik, bunda midiyalar qisqa vaqt ichida 30 °C haroratga duchor qilindi. Biz ushbu tahlilni uchta mustaqil tajribada uch xil midiya turida o'tkazdik. Biroq, biz o'tkir issiqlik stressidan keyin ccfDNK darajasida hech qanday o'zgarish topmadik (qo'shimcha ma'lumot uchun S5-rasmga qarang). Bu kashfiyot, hech bo'lmaganda qisman, midiyalarning yarim ochiq qon aylanish tizimiga ega ekanligi va yuqori filtrlash faolligi tufayli ko'p miqdorda begona DNK to'planishini tushuntirishi mumkin. Boshqa tomondan, midiyalar, ko'plab umurtqasizlar singari, stress keltirib chiqaradigan to'qima shikastlanishiga ko'proq chidamli bo'lishi mumkin, shu bilan ularning gemolimfasida ccfDNKning ajralib chiqishini cheklaydi [70, 71].
Bugungi kunga qadar suv ekotizimlaridagi biologik xilma-xillikning DNK tahlili asosan atrof-muhit DNKsi (eDNK) metabarkodlashiga qaratilgan. Biroq, bu usul odatda primerlar ishlatilganda biologik xilma-xillik tahlilida cheklangan. O'q otish sekvensiyasidan foydalanish PCR cheklovlarini va primerlar to'plamini noto'g'ri tanlashni chetlab o'tadi. Shunday qilib, ma'lum ma'noda, bizning usulimiz yaqinda qo'llanilgan yuqori o'tkazuvchanlikdagi eDNK O'q otish sekvensiyasi usuliga yaqinroq bo'lib, u parchalangan DNKni to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlashtirish va deyarli barcha organizmlarni tahlil qilishga qodir [72, 73]. Biroq, LB ni standart eDNK usullaridan ajratib turadigan bir qator fundamental muammolar mavjud. Albatta, eDNK va LB o'rtasidagi asosiy farq tabiiy filtr xostlaridan foydalanishdir. eDNKni o'rganish uchun tabiiy filtr sifatida gubkalar va ikki pallali mo'ylovlilar (Dresseina spp.) kabi dengiz turlaridan foydalanish haqida xabar berilgan [74, 75]. Biroq, Dreissenaning tadqiqotida DNK olingan to'qima biopsiyalari ishlatilgan. LB dan ccfDNK tahlili to'qima biopsiyasi, eDNK yoki to'qima biopsiyasi bilan bog'liq ixtisoslashgan va ba'zan qimmat uskunalar va logistikani talab qilmaydi. Darhaqiqat, yaqinda biz LB dan ccfDNK sovuq zanjirni saqlamasdan FTA ko'magida saqlanishi va tahlil qilinishi mumkinligini xabar qildik, bu esa chekka hududlardagi tadqiqotlar uchun katta qiyinchilik tug'diradi [76]. Suyuq biopsiyalardan ccfDNKni ajratib olish ham oddiy va miltiq ketma-ketligi va PZR tahlili uchun yuqori sifatli DNKni ta'minlaydi. Bu eDNK tahlili bilan bog'liq ba'zi texnik cheklovlarni hisobga olgan holda katta afzallikdir [77]. Namuna olish usulining soddaligi va arzonligi, shuningdek, uzoq muddatli monitoring dasturlari uchun ham juda mos keladi. Yuqori filtrlash qobiliyatidan tashqari, ikki pallali mo'ylovlarning yana bir taniqli xususiyati ularning shilimshiq tarkibidagi kimyoviy mukopolisakkarid tarkibi bo'lib, u viruslarning so'rilishini rag'batlantiradi [78, 79]. Bu ikki pallali mo'ylovlarni ma'lum bir suv ekotizimida biologik xilma-xillikni va iqlim o'zgarishining ta'sirini tavsiflash uchun ideal tabiiy filtrga aylantiradi. Xostdan olingan DNK fragmentlarining mavjudligi usulning eDNK bilan solishtirganda cheklanishi sifatida qaralishi mumkin bo'lsa-da, eDNK bilan solishtirganda bunday mahalliy ccfDNKga ega bo'lish bilan bog'liq xarajatlar sog'liqni saqlash tadqiqotlari uchun mavjud bo'lgan juda ko'p ma'lumot uchun bir vaqtning o'zida tushunarli. ofset xost. Bunga xost xo'jayinining genomiga integratsiyalashgan virusli ketma-ketliklarning mavjudligi kiradi. Bu, ayniqsa, ikki pallali mo'ylovlilarda gorizontal ravishda uzatiladigan leykemik retroviruslar mavjudligini hisobga olgan holda, midiyalar uchun muhimdir [80, 81]. LB ning eDNKga nisbatan yana bir afzalligi shundaki, u gemolimfadagi qon hujayralarining fagotsitik faolligidan foydalanadi, bu esa mikroorganizmlarni (va ularning genomlarini) yutib yuboradi. Fagotsitoz ikki pallali mo'ylovli mo'ylovlilarda qon hujayralarining asosiy funktsiyasidir [82]. Va nihoyat, usul midiyalarning yuqori filtrlash qobiliyatidan (o'rtacha 1,5 l/soat dengiz suvi) va ikki kunlik qon aylanishidan foydalanadi, bu esa dengiz suvining turli qatlamlarining aralashishini oshiradi va heterologik eDNKni ushlashga imkon beradi. [83, 84]. Shunday qilib, midiya ccfDNK tahlili midiyalarning ozuqaviy, iqtisodiy va ekologik ta'sirini hisobga olgan holda qiziqarli yo'nalish hisoblanadi. Odamlardan to'plangan LB tahliliga o'xshash, bu usul ekzogen moddalarga javoban mezbon DNKdagi genetik va epigenetik o'zgarishlarni o'lchash imkoniyatini ham ochadi. Masalan, nanopora ketma-ketligi yordamida mahalliy ccfDNKda genom bo'ylab metillanish tahlilini o'tkazish uchun uchinchi avlod ketma-ketlik texnologiyalarini ko'zda tutish mumkin. Bu jarayon midiya ccfDNK fragmentlarining uzunligi kimyoviy transformatsiyalarga ehtiyoj sezmasdan bitta ketma-ketlik jarayonidan genom bo'ylab DNK metillanish tahlilini o'tkazish imkonini beruvchi uzoq o'qiladigan ketma-ketlik platformalari bilan ideal tarzda mos kelishi bilan osonlashtirilishi kerak.85,86] Bu qiziqarli imkoniyat, chunki DNK metillanish naqshlari atrof-muhit stressiga javobni aks ettirishi va ko'p avlodlar davomida saqlanib qolishi ko'rsatilgan. Shuning uchun, u iqlim o'zgarishi yoki ifloslantiruvchi moddalar ta'siridan keyin javobni boshqaruvchi asosiy mexanizmlar haqida qimmatli ma'lumot berishi mumkin [87]. Biroq, LB dan foydalanish cheklovlarsiz emas. Aytishga hojat yo'q, buning uchun ekotizimda indikator turlarining mavjudligi talab qilinadi. Yuqorida aytib o'tilganidek, ma'lum bir ekotizimning biologik xilma-xilligini baholash uchun LB dan foydalanish, shuningdek, manbadan olingan DNK fragmentlarining mavjudligini hisobga oladigan qat'iy bioinformatika quvurini talab qiladi. Yana bir muhim muammo dengiz turlari uchun mos yozuvlar genomlarining mavjudligidir. Dengiz sutemizuvchilari genomlari loyihasi va yaqinda tashkil etilgan Fish10k loyihasi [88] kabi tashabbuslar kelajakda bunday tahlilni osonlashtirishiga umid qilinmoqda. LB konsepsiyasini dengiz filtri bilan oziqlanadigan organizmlarga qo'llash, shuningdek, sekvenlash texnologiyasidagi eng so'nggi yutuqlar bilan mos keladi, bu esa uni ekologik stressga javoban dengiz yashash joylarining salomatligi haqida muhim ma'lumotlarni taqdim etish uchun ko'p ohmli biomarkerlarni ishlab chiqish uchun juda mos keladi.
Genom ketma-ketligi ma'lumotlari NCBI ketma-ketlik o'qish arxiviga https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 manzilida Bioprojects SRR8924808 bo'limida saqlandi.
Brierley AS, Kingsford MJ Iqlim o'zgarishining dengiz hayoti va ekotizimlariga ta'siri. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S va boshqalar. Iqlim o'zgarishi va boshqa mahalliy stress omillarining dengiz muhitiga ta'sirini ko'rib chiqing. umumiy ilmiy muhit. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P va boshqalar. ). Birinchi mart fani. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Takroriy issiqlik stressi sharoitida issiqlikka chidamlilikning pasayishi ko'k midiyalarning yozgi o'limining yuqori ekanligini tushuntiradi. Ilmiy hisobot 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER va boshqalar. Hayvonlar o'limining chastotasi, sabablari va darajasidagi so'nggi o'zgarishlar. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S va boshqalar. Bir nechta turga xos bo'lmagan patogenlar Pinna nobilisning ommaviy o'limiga sabab bo'lishi mumkin. Hayot. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Iqlim o'zgarishining Arktika zoonotik kasalliklariga potentsial ta'siri. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. va boshqalar. Moviy midiyalar (Mytilus edulis spp.) qirg'oqbo'yi ifloslanishini monitoring qilishda signal organizmlari sifatida: sharh. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Saraton kasalligini davolashda suyuq biopsiyaning integratsiyasi. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C va boshqalar. Suyuq biopsiyaning yetilishi: o'sma DNKsining aylanishiga imkon beradi. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Inson plazmasidagi nuklein kislotalar. Soc Biol sho''ba korxonalarining yig'ilish bayonnomalari. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Saraton kasalligini davolashda molekulyar marker sifatida hujayrasiz DNKning yangi roli. Biomolyar tahlilni miqdoriy aniqlash. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Suyuq biopsiya klinikaga kirib kelmoqda – amalga oshirish muammolari va kelajakdagi qiyinchiliklar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW va boshqalar. Xomila DNKsi onaning plazmasi va zardobida mavjud. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Homiladorlik davrida ayollar qonida aylanib yuruvchi hujayradan tashqari RNK yordamida homiladorlikning kechishi va uning asoratlarini o'rganish. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J va boshqalar. Suyuq biopsiya: donor hujayrasiz DNK buyrak transplantatidagi allogen lezyonlarni aniqlash uchun ishlatiladi. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Xuan FC, Lo YM Prenatal diagnostikada innovatsiyalar: ona plazmasi genomining ketma-ketligi. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D va boshqalar. Infektsiyalangan tana suyuqliklarini keyingi avlod metagenomik ketma-ketligi bilan tezkor patogenni aniqlash. Nat Medicine. 2021;27:115-24.