Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Рідинна біопсія (РБ) – це концепція, яка швидко набирає популярності в біомедичній галузі. Концепція головним чином базується на виявленні фрагментів циркулюючої позаклітинної ДНК (ccfDNA), які переважно вивільняються у вигляді невеликих фрагментів після загибелі клітин у різних тканинах. Невелика частина цих фрагментів походить із чужорідних (іноземних) тканин або організмів. У поточній роботі ми застосували цю концепцію до мідій, сторожового виду, відомого своєю високою фільтраційною здатністю морської води. Ми використовуємо здатність мідій діяти як природні фільтри для захоплення фрагментів ДНК навколишнього середовища з різних джерел, щоб надати інформацію про біорізноманіття морських прибережних екосистем. Наші результати показують, що гемолімфа мідій містить фрагменти ДНК, які сильно варіюються за розміром, від 1 до 5 кб. Секвенування дробовика показало, що велика кількість фрагментів ДНК має чужорідне мікробне походження. Серед них ми виявили фрагменти ДНК бактерій, архей та вірусів, включаючи віруси, які, як відомо, інфікують різноманітних господарів, що зазвичай зустрічаються в прибережних морських екосистемах. На завершення, наше дослідження демонструє, що концепція LB, застосована до мідій, являє собою багате, але ще не досліджене джерело знань про мікробне різноманіття в морських прибережних екосистемах.
Вплив зміни клімату (ЗК) на біорізноманіття морських екосистем є швидкозростаючою галуззю досліджень. Глобальне потепління не тільки викликає важливі фізіологічні стреси, але й розширює еволюційні межі термічної стабільності морських організмів, впливаючи на середовище існування низки видів, спонукаючи їх шукати більш сприятливі умови [1, 2]. Окрім впливу на біорізноманіття багатоклітинних, ЗК порушує делікатний баланс взаємодії між господарем і мікробами. Цей мікробний дисбактеріоз становить серйозну загрозу для морських екосистем, оскільки робить морські організми більш сприйнятливими до інфекційних патогенів [3, 4]. Вважається, що двостулкові молюски відіграють важливу роль у масовій загибелі, що є серйозною проблемою для управління глобальними морськими екосистемами [5, 6]. Це важливе питання, враховуючи економічний, екологічний та харчовий вплив багатьох морських видів. Це особливо стосується двостулкових молюсків, що мешкають у полярних регіонах, де наслідки ЗК є більш негайними та серйозними [6, 7]. Фактично, двостулкові молюски, такі як Mytilus spp., широко використовуються для моніторингу впливу ЗК на морські екосистеми. Не дивно, що для моніторингу їхнього здоров'я було розроблено відносно велику кількість біомаркерів, часто з використанням дворівневого підходу, що включає функціональні біомаркери, засновані на ферментативній активності або клітинних функціях, таких як життєздатність клітин та фагоцитарна активність [8]. Ці методи також включають вимірювання концентрації специфічних показників тиску, що накопичуються в м'яких тканинах після поглинання великої кількості морської води. Однак висока фільтраційна здатність та напіввідкрита кровоносна система двостулкових молюсків надають можливість розробляти нові біомаркери гемолімфи, використовуючи концепцію рідкої біопсії (РБ) – простого та мінімально інвазивного підходу до ведення пацієнтів у зразках крові [9, 10]. Хоча в РБ людини можна знайти кілька типів циркулюючих молекул, ця концепція в першу чергу базується на аналізі секвенування ДНК циркулюючих фрагментів позаклітинної ДНК (ccfDNA) у плазмі. Фактично, наявність циркулюючої ДНК у плазмі людини відома з середини 20 століття [11], але лише в останні роки поява високопродуктивних методів секвенування призвела до клінічної діагностики на основі ccfDNA. Наявність цих циркулюючих фрагментів ДНК частково зумовлена ​​пасивним вивільненням геномної ДНК (ядерної та мітохондріальної) після загибелі клітини. У здорових людей концентрація ccfDNA зазвичай низька (<10 нг/мл), але може бути підвищена у 5–10 разів у пацієнтів, які страждають на різні патології або зазнають стресу, що призводить до пошкодження тканин. У здорових людей концентрація ccfDNA зазвичай низька (<10 нг/мл), але може бути підвищена у 5–10 разів у пацієнтів, які страждають на різні патології або зазнають стресу, що призводить до пошкодження тканин. У здорових людей концентрація вккДНК в нормі низька (<10 нг/мл), але може підвищуватися в 5-10 разів у хворих з різною патологією або піддаються стресу, що призводить до пошкодження тканин. У здорових людей концентрація cccДНК зазвичай низька (<10 нг/мл), але вона може зростати у 5–10 разів у пацієнтів з різними патологіями або в умовах стресу, що призводить до пошкодження тканин.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 нг/мл），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрації ccfDNA зазвичай низькі (<10 нг/мл) у здорових людей, але можуть бути збільшені в 5-10 разів у пацієнтів з різними патологіями або стресом, що призводить до пошкодження тканин. Концентрації ccfDNA зазвичай низькі (<10 нг/мл) у здорових людей, але можуть бути підвищені у 5-10 разів у пацієнтів з різними патологіями або стресом, що призводить до пошкодження тканин.Розмір фрагментів ccfDNA широко варіюється, але зазвичай коливається від 150 до 200 пар основ. [12]. Аналіз власної ccfDNA, тобто ccfDNA з нормальних або трансформованих клітин хазяїна, може бути використаний для виявлення генетичних та епігенетичних змін, присутніх у ядерному та/або мітохондріальному геномі, тим самим допомагаючи клініцистам вибирати специфічні молекулярно-таргетні методи терапії [13]. Однак ccfDNA може бути отримана з іноземних джерел, таких як ccfDNA з клітин плода під час вагітності або з трансплантованих органів [14,15,16,17]. ccfDNA також є важливим джерелом інформації для виявлення наявності нуклеїнових кислот інфекційного агента (чужорідного), що дозволяє неінвазивно виявляти поширені інфекції, не ідентифіковані за допомогою посівів крові, уникаючи інвазивної біопсії інфікованої тканини [18]. Недавні дослідження дійсно показали, що кров людини містить багате джерело інформації, яке може бути використане для ідентифікації вірусних та бактеріальних патогенів, і що близько 1% ccfDNA, виявленої в плазмі людини, має іноземне походження [19]. Ці дослідження демонструють, що біорізноманіття циркулюючого мікробіому організму можна оцінити за допомогою аналізу ccfDNA. Однак донедавна ця концепція використовувалася виключно у людей і, меншою мірою, у інших хребетних [20, 21].
У цій статті ми використовуємо потенціал LB для аналізу ccfDNA Aulacomya atra, південного виду, який зазвичай зустрічається на субантарктичних островах Кергелен, групі островів на вершині великого плато, що утворилося 35 мільйонів років тому внаслідок виверження вулкана. Використовуючи експериментальну систему in vitro, ми виявили, що фрагменти ДНК у морській воді швидко поглинаються мідіями та потрапляють у гемолімфу. Секвенування дробовиком показало, що ccfDNA гемолімфи мідій містить фрагменти ДНК власного та чужого походження, включаючи симбіотичні бактерії та фрагменти ДНК з біомів, типових для холодних вулканічних морських прибережних екосистем. ccfDNA гемолімфи також містить вірусні послідовності, отримані від вірусів з різними діапазонами господарів. Ми також знайшли фрагменти ДНК багатоклітинних тварин, таких як кісткові риби, актинії, водорості та комахи. На завершення, наше дослідження демонструє, що концепція LB може бути успішно застосована до морських безхребетних для створення багатого геномного репертуару в морських екосистемах.
Дорослі особини (55-70 мм завдовжки) Mytilus platensis (M. platensis) та Aulacomya atra (A. atra) були зібрані з припливно-скелястих берегів Порт-о-Франс (049°21.235 пд.ш., 070°13.490 сх.д.) островів Кергелен у грудні 2018 року. Інші дорослі блакитні мідії (Mytilus spp.) були отримані від комерційного постачальника (PEI Mussel King Inc., Острів Принца Едуарда, Канада) та поміщені в аерований резервуар з контрольованою температурою (4°C), що містив 10–20 л штучного розсолу 32‰ (штучна морська сіль Reef Crystal, Instant Ocean, Вірджинія, США). Для кожного експерименту вимірювали довжину та вагу окремих мушель.
Безкоштовний протокол відкритого доступу для цієї програми доступний онлайн (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Коротко кажучи, гемолімфу LB збирали з м'язів-відвідників, як описано [22]. Гемолімфу освітлювали центрифугуванням при 1200×g протягом 3 хвилин, супернатант заморожували (-20°C) до використання. Для виділення та очищення cfDNA зразки (1,5-2,0 мл) розморожували та обробляли за допомогою набору NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) згідно з інструкціями виробника. ccfDNA зберігали при -80°C до подальшого аналізу. У деяких експериментах ccfDNA виділяли та очищали за допомогою набору QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Торонто, Онтаріо, Канада). Очищену ДНК кількісно визначали за допомогою стандартного аналізу PicoGreen. Розподіл фрагментів ізольованої ccfДНК аналізували за допомогою капілярного електрофорезу з використанням біоаналізатора Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Каліфорнія) з використанням набору High Sensitivity DNA Kit. Аналіз проводили з використанням 1 мкл зразка ccfДНК згідно з інструкціями виробника.
Для секвенування фрагментів ДНК гемолімфи, Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) підготували бібліотеки дробовиків, використовуючи набір Illumina DNA Mix з набору Illumina MiSeq PE75. Був використаний стандартний адаптер (BioO). Файли необроблених даних доступні в архіві зчитування послідовностей NCBI (SRR8924808 та SRR8924809). Базову якість зчитування оцінювали за допомогою FastQC [23]. Trimmomatic [24] використовували для кліппінгу адаптерів та зчитувань низької якості. Зчитування дробовиків з парними кінцями об'єднували за допомогою FLASH у довші окремі зчитування з мінімальним перекриттям 20 пар основ, щоб уникнути невідповідностей [25]. Об'єднані зчитування були анотовані за допомогою BLASTN з використанням бази даних таксономії NCBI для двостулкових молюсків (значення e < 1e−3 та 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26]. Об'єднані зчитування були анотовані за допомогою BLASTN з використанням бази даних таксономії NCBI для двостулкових молюсків (значення e < 1e−3 та 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26]. Об'єднані чтення були анотовані за допомогою BLASTN з використанням бази даних таксономії двостворених молюсків NCBI (значення e < 1e-3 і 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26]. Об'єднані дані були анотовані за допомогою BLASTN з використанням бази даних таксономії двостулкових молюсків NCBI (значення e < 1e-3 та 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（(<1e-3 和 90% 同源）) 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 пил [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Об'єднані чтення були анотовані за допомогою BLASTN з використанням таксономічної бази даних двостворених молюсків NCBI (значення e <1e-3 і 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26]. Об'єднані дані були анотовані за допомогою BLASTN з використанням таксономічної бази даних двостулкових молюсків NCBI (значення e <1e-3 та 90% гомології), а маскування послідовностей низької складності було виконано за допомогою DUST [26].Зчитування було розділено на дві групи: пов'язані з послідовностями двостулкових молюсків (тут їх називають самозчитуваннями) та непов'язані (не самозчитування). Дві групи були окремо зібрані за допомогою MEGAHIT для створення контигів [27]. Тим часом таксономічний розподіл зчитувань чужорідного мікробіому був класифікований за допомогою Kraken2 [28] та графічно представлений круговою діаграмою Krona на Galaxy [29, 30]. Оптимальними кмерами було визначено kmers-59 за результатами наших попередніх експериментів. Потім власні контиги були ідентифіковані шляхом вирівнювання з BLASTN (база даних двостулкових NCBI, значення e < 1e−10 та 60% гомологія) для остаточної анотації. Потім власні контиги були ідентифіковані шляхом вирівнювання з BLASTN (база даних двостулкових NCBI, значення e < 1e−10 та 60% гомологія) для остаточної анотації. Потім власні контиги були ідентифіковані шляхом складання з BLASTN (база даних двостворених молюсків NCBI, значення e <1e-10 і гомологія 60%) для остаточної анотації. Потім самоконтиги були ідентифіковані шляхом зіставлення з BLASTN (база даних двостулкових молюсків NCBI, значення e <1e-10 та 60% гомологія) для остаточної анотації.然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。.然后通过与BLASTN，双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Потім були ідентифіковані власні контигі для остаточної анотації шляхом складання з BLASTN (база даних NCBI для двостворених молюсків, значення e <1e-10 і гомологія 60%). Потім самоконтиги були ідентифіковані для остаточної анотації шляхом зіставлення з BLASTN (база даних двостулкових молюсків NCBI, значення e <1e-10 та 60% гомологія). Паралельно, контиги невласних груп були анотовані за допомогою BLASTN (база даних nt NCBI, значення e < 1e−10 та 60% гомологія). Паралельно, контиги невласних груп були анотовані за допомогою BLASTN (база даних nt NCBI, значення e < 1e−10 та 60% гомологія). Паралельно чужеродні групові контиги були анотовані за допомогою BLASTN (база даних nt NCBI, значення e <1e-10 і гомологія 60%). Паралельно, контиги іноземних груп були анотовані за допомогою BLASTN (база даних NT NCBI, значення e <1e-10 та 60% гомологія).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Паралельно контиги, не відносні до власної групи, були анотовані за допомогою BLASTN (база даних nt NCBI, значення e <1e-10 і гомологія 60%). Паралельно, контиги невласних груп були анотовані за допомогою BLASTN (база даних nt NCBI, значення e <1e-10 та 60% гомологія). BLASTX також проводили на невласних контигах з використанням баз даних NCBI для білків nr та RefSeq (значення e < 1e−10 та 60% гомології). BLASTX також проводили на невласних контигах з використанням баз даних NCBI для білків nr та RefSeq (значення e < 1e−10 та 60% гомології). BLASTX також був проведений на несамостійних контигах з використанням бази даних білка nr і RefSeq NCBI (значення e <1e-10 і гомологія 60%). BLASTX також проводили на невласних контигах з використанням баз даних білків nr та RefSeq NCBI (значення e < 1e-10 та 60% гомології).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX також виконується на несамостояльних контигах з використанням бази даних білка nr і RefSeq NCBI (значення e <1e-10 і гомологія 60%). BLASTX також проводили на невласних контигах з використанням баз даних білків nr та RefSeq NCBI (значення e <1e-10 та 60% гомології).Пули BLASTN та BLASTX несамостійних контигів представляють собою кінцеві контиги (див. Додатковий файл).
Праймери, що використовувалися для ПЛР, наведено в таблиці S1. Для ампліфікації цільових генів ccfДНК використовували Taq ДНК-полімеразу (Bio Basic Canada, Маркем, Онтаріо). Були використані такі умови реакції: денатурація при 95°C протягом 3 хвилин, 95°C протягом 1 хвилини, встановлена ​​температура відпалу протягом 1 хвилини, елонгація при 72°C протягом 1 хвилини, 35 циклів і, нарешті, 72°C протягом 10 хвилин. Продукти ПЛР розділяли електрофорезом в агарозних гелях (1,5%), що містять SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Берлінгтон, Онтаріо, Канада) при 95 В.
Мідії (Mytilus spp.) акліматизували у 500 мл насиченої киснем морської води (32 PSU) протягом 24 годин при температурі 4°C. Плазмідну ДНК, що містить вставку, що кодує послідовність кДНК людського галектину-7 (номер доступу NCBI L07769), додавали до флакона у кінцевій концентрації 190 мкг/мкл. Мідії, інкубовані за тих самих умов без додавання ДНК, служили контролем. Третій контрольний резервуар містив ДНК без мідій. Для контролю якості ДНК у морській воді зразки морської води (20 мкл; три повторення) брали з кожного резервуара у зазначений час. Для простежуваності плазмідної ДНК мідії LB збирали у зазначений час та аналізували за допомогою кПЛР та ддПЛР. Через високий вміст солі у морській воді аліквоти розводили у воді якості ПЛР (1:10) перед усіма ПЛР-аналізами.
Цифрову крапельну ПЛР (ддПЛР) проводили за протоколом BioRad QX200 (Міссіссога, Онтаріо, Канада). Використовуйте температурний профіль для визначення оптимальної температури (Таблиця S1). Краплі генерували за допомогою генератора крапель QX200 (BioRad). ддПЛР проводили наступним чином: 95°C протягом 5 хв, 50 циклів по 95°C протягом 30 с та заданій температурі відпалу протягом 1 хв та 72°C протягом 30 с, 4°C протягом 5 хв та 90°C протягом 5 хвилин. Кількість крапель та позитивних реакцій (кількість копій/мкл) вимірювали за допомогою зчитувача крапель QX200 (BioRad). Зразки з кількістю крапель менше 10 000 були відхилені. Контроль за шаблоном не проводився щоразу, коли проводилася ддПЛР.
ПЛР проводили з використанням Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сідней, Австралія) та специфічних праймерів LGALS7. Всі кількісні ПЛР проводили в 20 мкл з використанням набору QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). ПЛР розпочинали з 15-хвилинної інкубації при 95°C, а потім 40 циклів при 95°C протягом 10 секунд та при 60°C протягом 60 секунд з одним збором даних. Криві плавлення будували за допомогою послідовних вимірювань при 95°C протягом 5 секунд, 65°C протягом 60 секунд та 97°C в кінці ПЛР. Кожну ПЛР проводили у трьох повторностях, за винятком контрольних зразків.
Оскільки мідії відомі своєю високою швидкістю фільтрації, ми спочатку дослідили, чи можуть вони фільтрувати та утримувати фрагменти ДНК, присутні в морській воді. Нас також цікавило, чи накопичуються ці фрагменти в їхній напіввідкритій лімфатичній системі. Ми вирішили це питання експериментально, відстежуючи долю розчинних фрагментів ДНК, доданих до резервуарів з блакитними мідіями. Для полегшення відстеження фрагментів ДНК ми використовували чужорідну (не власну) плазмідну ДНК, що містить ген людського галектину-7. ddPCR відстежує фрагменти плазмідної ДНК у морській воді та мідіях. Наші результати показують, що якщо кількість фрагментів ДНК у морській воді залишалася відносно постійною протягом часу (до 7 днів) за відсутності мідій, то за наявності мідій цей рівень майже повністю зникав протягом 8 годин (рис. 1a,b). Фрагменти екзогенної ДНК легко виявлялися протягом 15 хвилин у внутрішньоклапанній рідині та гемолімфі (рис. 1c). Ці фрагменти все ще можна було виявляти до 4 годин після впливу. Ця фільтруюча активність щодо фрагментів ДНК порівнянна з фільтруючою активністю бактерій та водоростей [31]. Ці результати свідчать про те, що мідії можуть фільтрувати та накопичувати чужорідну ДНК у своїх рідких компартментах.
Відносні концентрації плазмідної ДНК у морській воді за наявності (A) або відсутності (B) мідій, виміряні за допомогою ddPCR. На малюнку A результати виражені у відсотках, причому межі прямокутників представляють 75-й та 25-й процентилі. Підібрана логарифмічна крива показана червоним кольором, а площа, затінена сірим кольором, представляє 95% довірчий інтервал. На малюнку B червона лінія представляє середнє значення, а синя лінія – 95% довірчий інтервал для концентрації. C Накопичення плазмідної ДНК у гемолімфі та клапанній рідині мідій у різний час після додавання плазмідної ДНК. Результати представлені у вигляді абсолютних виявлених копій/мл (±SE).
Далі ми досліджували походження ccfDNA у мідіях, зібраних з мідійних відкладень на островах Кергелен, віддаленій групі островів з обмеженим антропогенним впливом. Для цього cccDNA з гемолімф мідій була виділена та очищена методами, що зазвичай використовуються для очищення cccDNA людини [32, 33]. Ми виявили, що середні концентрації ccfDNA гемолімфи в мідіях знаходяться в діапазоні низьких мікрограмів на мл гемолімфи (див. Таблицю S2, Додаткова інформація). Цей діапазон концентрацій набагато більший, ніж у здорових людей (низькі нанограми на мілілітр), але в рідкісних випадках, у онкологічних хворих, рівень ccfDNA може досягати кількох мікрограмів на мілілітр [34, 35]. Аналіз розподілу розмірів ccfDNA гемолімфи показав, що ці фрагменти сильно відрізняються за розміром, коливаючись від 1000 п.н. до 5000 п.н. (рис. 2). Подібні результати були отримані за допомогою набору QIAamp Investigator Kit на основі діоксиду кремнію, методу, який зазвичай використовується в криміналістиці для швидкого виділення та очищення геномної ДНК із зразків ДНК низької концентрації, включаючи ccfDNA [36].
Репрезентативна електрофореграма ccfDNA гемолімфи мідій. Екстрагована за допомогою набору NucleoSnap Plasma Kit (угорі) та набору QIAamp DNA Investigator Kit. B Скрипкова діаграма, що показує розподіл концентрацій ccfDNA гемолімфи (±SE) у мідіях. Чорна та червона лінії представляють медіану та перший і третій квартилі відповідно.
Приблизно 1% ccfDNA у людей та приматів має чужорідне джерело [21, 37]. Враховуючи напіввідкриту кровоносну систему двостулкових молюсків, багату на мікроби морську воду та розподіл розмірів ccfDNA мідій, ми висунули гіпотезу, що ccfDNA гемолімфи мідій може містити багатий та різноманітний пул мікробної ДНК. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми секвенували ccfDNA гемолімфи зі зразків Aulacomya atra, зібраних на островах Кергелен, що дало понад 10 мільйонів зчитувань, 97,6% з яких пройшли контроль якості. Потім зчитування були класифіковані за власними та чужими джерелами за допомогою баз даних двостулкових молюсків BLASTN та NCBI (рис. S1, Додаткова інформація).
У людини як ядерна, так і мітохондріальна ДНК можуть потрапляти в кровотік [38]. Однак у цьому дослідженні не було можливості детально описати ядерну геномну ДНК мідій, враховуючи, що геном A. atra не був секвенований або описаний. Однак, нам вдалося ідентифікувати низку фрагментів ccfDNA нашого власного походження, використовуючи бібліотеку двостулкових молюсків (рис. S2, Додаткова інформація). Ми також підтвердили наявність фрагментів ДНК нашого власного походження шляхом спрямованої ПЛР-ампліфікації тих генів A. atra, які були секвеновані (рис. 3). Аналогічно, враховуючи, що мітохондріальний геном A. atra доступний у публічних базах даних, можна знайти докази наявності фрагментів мітохондріальної ccfDNA в гемолімфі A. atra. Наявність фрагментів мітохондріальної ДНК була підтверджена за допомогою ПЛР-ампліфікації (рис. 3).
Різні мітохондріальні гени були присутні в гемолімфі A. atra (червоні крапки – номер запасу: SRX5705969) та M. platensis (сині крапки – номер запасу: SRX5705968), ампліфікованій за допомогою ПЛР. Рисунок адаптований з Breton et al., 2011 B Ампліфікація супернатанту гемолімфи з A. atra. Зберігається на папері FTA. Використовуйте 3-міліметровий пробійник для додавання безпосередньо до ПЛР-пробірки, що містить ПЛР-суміш.
Враховуючи значний вміст мікробів у морській воді, ми спочатку зосередилися на характеристиці послідовностей мікробної ДНК у гемолімфі. Для цього ми використовуємо дві різні стратегії. Перша стратегія використовувала Kraken2, програму класифікації послідовностей на основі алгоритмів, яка може ідентифікувати мікробні послідовності з точністю, порівнянною з BLAST та іншими інструментами [28]. Було визначено, що понад 6719 зчитувань мають бактеріальне походження, тоді як 124 та 64 були від архей та вірусів відповідно (рис. 4). Найбільш поширеними фрагментами бактеріальної ДНК були Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) та Bacteroidetes (17%) (рис. 4a). Цей розподіл узгоджується з попередніми дослідженнями мікробіому морської блакитної мідії [39, 40]. Гаммапротеобактерії були основним класом Proteobacteria (44%), включаючи багато Vibrionales (рис. 4b). Метод ddPCR підтвердив наявність фрагментів ДНК Vibrio у ccfDNA гемолімфи A. atra (рис. 4c) [41]. Щоб отримати більше інформації про бактеріальне походження ccfDNA, було використано додатковий підхід (рис. S2, Додаткова інформація). У цьому випадку зчитування, що перекривалися, були зібрані як зчитування парних кінців і класифіковані як власного (двостулкові молюски) або невласного походження за допомогою BLASTN та значення e 1e−3, а також порогового значення з гомологією >90%. У цьому випадку зчитування, що перекривалися, були зібрані як зчитування парних кінців і класифіковані як власного (двостулкові молюски) або невласного походження за допомогою BLASTN та значення e 1e−3, а також порогового значення з гомологією >90%. В цьому випадку перекриваючі чтення були зібрані як чтення з парними кінцями і були класифіковані як власні (двотворчаті моллюски) або чужі за походженням з використанням BLASTN і значення e 1e-3 і відсіку з гомологією> 90%. У цьому випадку перекриваючі зчитування були зібрані як парні зчитування та класифіковані як нативні (двостулкові) або неоригінальні за допомогою BLASTN та значення e 1e-3 та порогового значення з гомологією >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В цьому випадку перекриваючі чтення були зібрані як чтення з парними кінцями та класифіковані як власні (двотворчаті моллюски) або невласні за походженням з використанням значення e BLASTN і 1e-3 і породи гомології> 90%. У цьому випадку перекриваючі зчитування були зібрані як парні зчитування та класифіковані як власні (двостулкові молюски) або неоригінальні з використанням значень e BLASTN та 1e-3 ​​і порогу гомології >90%.Оскільки геном A. atra ще не секвеновано, ми використали стратегію de novo складання асемблера MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Загалом 147 188 контигів було ідентифіковано як залежні (двостулкові) за походженням. Потім ці контиги були розбиті з e-значеннями 1e-10 за допомогою BLASTN та BLASTX. Ця стратегія дозволила нам ідентифікувати 482 недвостулкових фрагменти, присутні в ccfDNA A. atra. Більше половини (57%) цих фрагментів ДНК було отримано з бактерій, переважно із зябрових симбіонтів, включаючи сульфотрофні симбіонти, та із зябрових симбіонтів Solemya velum (рис. 5).
Відносна чисельність на рівні типу. B Мікробне різноманіття двох основних типів (Firmicutes та Proteobacteria). Типова ампліфікація ddPCR C Vibrio spp. A. Фрагменти гена 16S рРНК (синій) у трьох атрагемолімфах.
Загалом було проаналізовано 482 зібрані контиги. Загальний профіль таксономічного розподілу анотацій метагеномних контигів (прокаріоти та еукаріоти). B Детальний розподіл фрагментів бактеріальної ДНК, ідентифікованих за допомогою BLASTN та BLASTX.
Аналіз Kraken2 також показав, що ДНК мідій з ccf містить фрагменти ДНК архей, включаючи фрагменти ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) та Thaurmarcheota (11%) (рис. 6a). Присутність фрагментів ДНК, отриманих від Euryarchaeota та Crenarchaeota, які раніше були виявлені в мікробному співтоваристві каліфорнійських мідій, не повинна дивувати [42]. Хоча Euryarchaeota часто асоціюється з екстремальними умовами, зараз визнано, що як Euryarchaeota, так і Crenarcheota є одними з найпоширеніших прокаріотів у морському кріогенному середовищі [43, 44]. Присутність метаногенних мікроорганізмів у мідіях не є дивною, враховуючи нещодавні повідомлення про значні витоки метану з донних витоків на плато Кергелен [45] та можливе мікробне виробництво метану, що спостерігається біля узбережжя островів Кергелен [46].
Потім наша увага переключилася на показники ДНК-вірусів. Наскільки нам відомо, це перше позацільове дослідження вмісту вірусів у мідіях. Як і очікувалося, ми виявили фрагменти ДНК бактеріофагів (Caudovirales) (рис. 6b). Однак найпоширеніша вірусна ДНК походить з типу нуклеоцитовірусів, також відомого як ядерно-цитоплазматичний великий ДНК-вірус (NCLDV), який має найбільший геном серед усіх вірусів. У цьому типі більшість послідовностей ДНК належать до родин Mimimidoviridae (58%) та Poxviridae (21%), природними господарями яких є хребетні та членистоногі, тоді як невелика частина цих послідовностей ДНК належить до відомих вірусологічних водоростей. Інфікує морські еукаріотичні водорості. Послідовності також були отримані з вірусу Пандора, гігантського вірусу з найбільшим розміром геному серед усіх відомих вірусних родів. Цікаво, що діапазон господарів, інфікованих вірусом, визначений за допомогою секвенування ccfDNA гемолімфи, був відносно великим (рис. S3, Додаткова інформація). Він включає віруси, що інфікують комах, таких як Baculoviridae та Iridoviridae, а також віруси, що інфікують амеб, водорості та хребетних. Ми також знайшли послідовності, що відповідають геному Pithovirus sibericum. Пітовіруси (також відомі як «зомбі-віруси») були вперше виділені з 30 000-річної вічної мерзлоти в Сибіру [47]. Таким чином, наші результати узгоджуються з попередніми звітами, які показують, що не всі сучасні види цих вірусів вимерли [48] і що ці віруси можуть бути присутніми у віддалених субарктичних морських екосистемах.
Зрештою, ми перевірили, чи можемо знайти фрагменти ДНК інших багатоклітинних тварин. Загалом 482 сторонні контиги було ідентифіковано за допомогою BLASTN та BLASTX з бібліотеками nt, nr та RefSeq (геномними та білковими). ​​Наші результати показують, що серед сторонніх фрагментів ccfDNA багатоклітинних тварин переважає ДНК кісток (рис. 5). Також були знайдені фрагменти ДНК комах та інших видів. Відносно велика частина фрагментів ДНК не була ідентифікована, можливо, через недостатню представленість великої кількості морських видів у геномних базах даних порівняно з наземними видами [49].
У цій статті ми застосовуємо концепцію LB до мідій, стверджуючи, що секвенування ccfDNA гемолімфи може дати уявлення про склад морських прибережних екосистем. Зокрема, ми виявили, що 1) гемолімфа мідій містить відносно високі концентрації (мікрограмові рівні) відносно великих (~1-5 кб) циркулюючих фрагментів ДНК; 2) ці фрагменти ДНК є як незалежними, так і не незалежними; 3) Серед чужорідних джерел цих фрагментів ДНК ми виявили бактеріальну, архейну та вірусну ДНК, а також ДНК інших багатоклітинних тварин; 4) Накопичення цих чужорідних фрагментів ccfDNA в гемолімфі відбувається швидко та сприяє внутрішній фільтрувальній активності мідій. На завершення, наше дослідження демонструє, що концепція LB, яка досі застосовувалася переважно в галузі біомедицини, кодує багате, але невивчене джерело знань, яке можна використовувати для кращого розуміння взаємодії між сторожовими видами та їхнім середовищем.
Окрім приматів, виділення ccfДНК було зареєстровано у ссавців, включаючи мишей, собак, котів та коней [50, 51, 52]. Однак, наскільки нам відомо, наше дослідження є першим, у якому повідомляється про виявлення та секвенування ccfДНК у морських видів з відкритою системою кровообігу. Ця анатомічна особливість та фільтруюча здатність мідій можуть, принаймні частково, пояснити різні розмірні характеристики циркулюючих фрагментів ДНК порівняно з іншими видами. У людини більшість фрагментів ДНК, що циркулюють у крові, є малими фрагментами розміром від 150 до 200 п.н. з максимальним піком 167 п.н. [34, 53]. Невелика, але значна частина фрагментів ДНК має розмір від 300 до 500 п.н., а близько 5% мають довжину понад 900 п.н. [54]. Причина такого розподілу розмірів полягає в тому, що основне джерело ccfDNA у плазмі відбувається в результаті загибелі клітин, або через загибель клітин, або через некроз циркулюючих гемопоетичних клітин у здорових людей, або через апоптоз пухлинних клітин у хворих на рак (відомий як циркулююча пухлинна ДНК). , ctDNA). Розподіл розмірів ccfDNA гемолімфи, який ми виявили в мідіях, коливався від 1000 до 5000 п.н., що свідчить про інше походження ccfDNA мідій. Це логічна гіпотеза, оскільки мідії мають напіввідкриту судинну систему та живуть у морському водному середовищі, що містить високі концентрації мікробної геномної ДНК. Фактично, наші лабораторні експерименти з використанням екзогенної ДНК показали, що мідії накопичують фрагменти ДНК у морській воді, принаймні через кілька годин вони деградують після поглинання клітинами та/або вивільняються та/або зберігаються в різних організаціях. Враховуючи рідкість клітин (як прокаріотичних, так і еукаріотичних), використання внутрішньоклапанних компартментів зменшить кількість ccfDNA з власних, а також із чужорідних джерел. Враховуючи важливість вродженого імунітету двостулкових молюсків та велику кількість циркулюючих фагоцитів, ми також висунули гіпотезу, що навіть чужорідна ccfDNA збагачується циркулюючими фагоцитами, які накопичують чужорідну ДНК після поглинання мікроорганізмів та/або клітинних залишків. У сукупності наші результати показують, що ccfDNA гемолімфи двостулкових молюсків є унікальним сховищем молекулярної інформації та підкріплює їхній статус як сторожового виду.
Наші дані вказують на те, що секвенування та аналіз фрагментів ДНК гемолімфи, отриманої з бактерій, може надати ключову інформацію про бактеріальну флору хазяїна та бактерії, присутні в навколишній морській екосистемі. Методи секвенування пострілом виявили послідовності зябрової флори коменсальної бактерії A. atra, які були б пропущені, якби використовувалися звичайні методи ідентифікації 16S рРНК, частково через упередженість бібліотеки довідників. Фактично, наше використання даних LB, зібраних з M. platensis в тому ж шарі мідій у Кергелені, показало, що склад бактеріальних симбіонтів, пов'язаних із зябрами, був однаковим для обох видів мідій (рис. S4, Додаткова інформація). Ця подібність двох генетично різних мідій може відображати склад бактеріальних спільнот у холодних, сірчистих та вулканічних відкладеннях Кергелена [55, 56, 57, 58]. Вищі рівні мікроорганізмів, що відновлюють сірку, були добре описані під час збору мідій з біотурбованих прибережних районів [59], таких як узбережжя Порт-о-Франс. Інша можливість полягає в тому, що флора коменсальних мідій може бути уражена горизонтальною передачею [60, 61]. Потрібні додаткові дослідження, щоб визначити кореляцію між морським середовищем, поверхнею морського дна та складом симбіотичних бактерій у мідіях. Ці дослідження наразі тривають.
Довжина та концентрація ccfDNA гемолімфи, легкість її очищення та висока якість, що дозволяє швидке секвенування методом дробовика, є деякими з багатьох переваг використання ccfDNA мідій для оцінки біорізноманіття в морських прибережних екосистемах. Цей підхід особливо ефективний для характеристики вірусних спільнот (віромів) у певній екосистемі [62, 63]. На відміну від бактерій, архей та еукаріотів, вірусні геноми не містять філогенетично консервативних генів, таких як послідовності 16S. Наші результати показують, що рідкі біопсії з видів-індикаторів, таких як мідії, можуть бути використані для ідентифікації відносно великої кількості фрагментів вірусу ccfDNA, які, як відомо, інфікують господарів, що зазвичай населяють прибережні морські екосистеми. Це включає віруси, які, як відомо, інфікують найпростіших, членистоногих, комах, рослини та бактеріальні віруси (наприклад, бактеріофаги). Подібний розподіл був виявлений, коли ми досліджували віром ccfDNA гемолімфи блакитних мідій (M. platensis), зібраних у тому ж шарі мідій у Кергелені (Таблиця S2, Додаткова інформація). Дробовикове секвенування ccfDNA справді є новим підходом, що набирає обертів у вивченні вірому людини чи інших видів [21, 37, 64]. Цей підхід особливо корисний для вивчення дволанцюгових ДНК-вірусів, оскільки серед усіх дволанцюгових ДНК-вірусів не зберігається жодного гена, що представляє найрізноманітніший та найширший клас вірусів у Балтиморі [65]. Хоча більшість цих вірусів залишаються некласифікованими та можуть включати віруси з абсолютно невідомої частини вірусного світу [66], ми виявили, що віроми та діапазони хазяїв мідій A. atra та M. platensis знаходяться між цими двома видами подібним чином (див. рисунок S3, додаткова інформація). Ця подібність не дивує, оскільки вона може відображати відсутність селективності в поглинанні ДНК, присутньої в навколишньому середовищі. Наразі необхідні майбутні дослідження з використанням очищеної РНК для характеристики РНК-вірому.
У нашому дослідженні ми використовували дуже суворий конвеєр, адаптований з роботи Коварського та його колег [37], які використовували двоетапне видалення об'єднаних зчитувань та контигів до та після складання нативної ccfDNA, що призвело до високої частки некартованих зчитувань. Тому ми не можемо виключати, що деякі з цих некартованих зчитувань можуть мати власне походження, головним чином тому, що у нас немає референсного геному для цього виду мідій. Ми також використовували цей конвеєр, оскільки нас турбували химери між власними та невласними зчитуваннями та довжини зчитувань, згенеровані Illumina MiSeq PE75. Ще однією причиною більшості некартованих зчитувань є те, що значна частина морських мікробів, особливо у віддалених районах, таких як Кергелен, не була анотована. Ми використовували Illumina MiSeq PE75, припускаючи, що довжина фрагментів ccfDNA подібна до людської ccfDNA. Для майбутніх досліджень, враховуючи наші результати, які показують, що ccfDNA гемолімфи має довші зчитування, ніж людські та/або ссавці, ми рекомендуємо використовувати платформу секвенування, яка більше підходить для довших фрагментів ccfDNA. Така практика значно полегшить виявлення більшої кількості показань для глибшого аналізу. Отримання недоступної наразі повної послідовності ядерного геному A. atra також значно полегшить розрізнення ccfDNA від власних та чужих джерел. Враховуючи, що наші дослідження зосереджені на можливості застосування концепції рідкої біопсії до мідій, ми сподіваємося, що оскільки ця концепція буде використана в майбутніх дослідженнях, будуть розроблені нові інструменти та методи для збільшення потенціалу цього методу для вивчення мікробного різноманіття мідій. морська екосистема.
Як неінвазивний клінічний біомаркер, підвищений рівень ccfDNA у плазмі крові людини пов'язаний з різними захворюваннями, пошкодженням тканин та стресовими станами [67,68,69]. Це підвищення пов'язане з вивільненням фрагментів ДНК власного походження після пошкодження тканин. Ми розглянули це питання за допомогою гострого теплового стресу, при якому мідії короткочасно піддавали дії температури 30 °C. Ми провели цей аналіз на трьох різних типах мідій у трьох незалежних експериментах. Однак ми не виявили жодних змін у рівнях ccfDNA після гострого теплового стресу (див. Рисунок S5, додаткова інформація). Це відкриття може пояснити, принаймні частково, той факт, що мідії мають напіввідкриту кровоносну систему та накопичують велику кількість чужорідної ДНК через свою високу фільтруючу активність. З іншого боку, мідії, як і багато безхребетних, можуть бути більш стійкими до пошкодження тканин, викликаного стресом, тим самим обмежуючи вивільнення ccfDNA в їхній гемолімфі [70, 71].
На сьогоднішній день аналіз ДНК біорізноманіття у водних екосистемах в основному зосереджувався на метабаркодуванні екологічної ДНК (еДНК). Однак цей метод зазвичай обмежений в аналізі біорізноманіття, коли використовуються праймери. Використання дробового секвенування обходить обмеження ПЛР та упереджений вибір наборів праймерів. Таким чином, у певному сенсі наш метод ближчий до нещодавно використаного високопродуктивного методу дробового секвенування еДНК, який здатний безпосередньо секвенувати фрагментовану ДНК та аналізувати майже всі організми [72, 73]. Однак існує ряд фундаментальних проблем, які відрізняють LB від стандартних методів еДНК. Звичайно, основна відмінність між еДНК та LB полягає у використанні природних фільтруючих господарів. Повідомлялося про використання морських видів, таких як губки та двостулкові молюски (Dresseina spp.), як природного фільтра для вивчення еДНК [74, 75]. Однак у дослідженні Дрейссени використовувалися біопсії тканин, з яких була екстрагована ДНК. Аналіз ccfДНК з LB не вимагає біопсії тканин, спеціалізованого та іноді дорогого обладнання та логістики, пов'язаної з еДНК або біопсією тканин. Фактично, нещодавно ми повідомили, що ccfDNA з LB можна зберігати та аналізувати за допомогою FTA-підтримки без підтримки холодового ланцюга, що є серйозною проблемою для досліджень у віддалених районах [76]. Екстракція ccfDNA з рідких біоптатів також є простою та забезпечує високоякісну ДНК для дробового секвенування та ПЛР-аналізу. Це велика перевага, враховуючи деякі технічні обмеження, пов'язані з аналізом eDNA [77]. Простота та низька вартість методу відбору проб також особливо підходять для довгострокових програм моніторингу. Окрім їхньої високої фільтруючої здатності, ще однією відомою особливістю двостулкових молюсків є хімічний мукополісахаридний склад їхнього слизу, який сприяє поглинанню вірусів [78, 79]. Це робить двостулкових молюсків ідеальним природним фільтром для характеристики біорізноманіття та впливу зміни клімату в даній водній екосистемі. Хоча наявність фрагментів ДНК, отриманих від господаря, можна розглядати як обмеження методу порівняно з eDNA, вартість, пов'язана з наявністю такої нативної ccfDNA порівняно з eDNA, одночасно зрозуміла через величезну кількість інформації, доступної для досліджень здоров'я. компенсувати господаря. Це включає наявність вірусних послідовностей, інтегрованих у геном хазяїна. Це особливо важливо для мідій, враховуючи наявність горизонтально передаваних лейкемічних ретровірусів у двостулкових молюсках [80, 81]. Ще однією перевагою LB над eDNA є те, що він використовує фагоцитарну активність циркулюючих клітин крові в гемолімфі, яка поглинає мікроорганізми (та їхні геноми). Фагоцитоз є основною функцією клітин крові у двостулкових молюсках [82]. Нарешті, метод використовує високу фільтрувальну здатність мідій (в середньому 1,5 л/год морської води) та дводенну циркуляцію, що збільшує змішування різних шарів морської води, дозволяючи захоплювати гетерологічну eDNA. [83, 84]. Таким чином, аналіз ccfDNA мідій є цікавим напрямком, враховуючи вплив мідій на харчування, економіку та навколишнє середовище. Подібно до аналізу LB, зібраного у людей, цей метод також відкриває можливість вимірювання генетичних та епігенетичних змін у ДНК хазяїна у відповідь на екзогенні речовини. Наприклад, можна передбачити технології секвенування третього покоління для проведення аналізу метилювання всього геному в нативній ccfDNA з використанням нанопорного секвенування. Цей процес має бути полегшений тим фактом, що довжина фрагментів ccfDNA мідій ідеально сумісна з платформами секвенування з довгим зчитуванням, які дозволяють проводити аналіз метилювання ДНК всього геному з одного запуску секвенування без необхідності хімічних трансформацій.85,86] Це цікава можливість, оскільки було показано, що патерни метилювання ДНК відображають реакцію на стрес навколишнього середовища та зберігаються протягом багатьох поколінь. Таким чином, це може дати цінне розуміння основних механізмів, що регулюють реакцію після впливу зміни клімату або забруднюючих речовин [87]. Однак використання LB не без обмежень. Само собою зрозуміло, що це вимагає наявності видів-індикаторів в екосистемі. Як згадувалося вище, використання LB для оцінки біорізноманіття даної екосистеми також вимагає ретельного біоінформаційного конвеєра, який враховує наявність фрагментів ДНК з джерела. Ще однією важливою проблемою є наявність референтних геномів для морських видів. Є надія, що такі ініціативи, як Проект геномів морських ссавців та нещодавно створений проект Fish10k [88], сприятимуть такому аналізу в майбутньому. Застосування концепції LB до морських організмів, що фільтрують воду, також сумісне з останніми досягненнями в технології секвенування, що робить її добре придатною для розробки багатоомних біомаркерів для надання важливої ​​інформації про здоров'я морських середовищ існування у відповідь на екологічний стрес.
Дані секвенування геному були депоновані в Архіві читання послідовностей NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 у розділі Bioprojects SRR8924808.
Брайєрлі А.С., Кінгсфорд М.Дж. Вплив зміни клімату на морське життя та екосистеми. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Гіссі Е., Манеа Е., Мазаріс А.Д., Фрашетті С., Альманіду В., Бевілаква С. та ін. Розгляньте сукупний вплив зміни клімату та інших локальних стресових факторів на морське середовище. Загальне наукове середовище. 2021;755:142564.
Карелла Ф., Антуофермо Е., Фаріна С., Салаті Ф., Мандас Д., Прадо П. та ін. ). Наука першого березня. 2020; 7:48.
Серонт Л., Нікастро К.Р., Зарді Г.І., Гобервіль Е. Знижена термостійкість за умов повторюваного теплового стресу пояснює високу літню смертність блакитних мідій. Науковий звіт 2019; 9:17498.
Фей С.Б., Сепельський А.М., Нусле С., Сервантес-Йошіда К., Хван Дж.Л., Хубер Е.Р. та ін. Нещодавні зміни в частоті, причинах та масштабах смертності тварин. Праці Національної академії наук США. 2015;112:1083-8.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена І., Мугетті Д., Черруті Ф., Хоссейні С. та ін. Численні неспецифічні патогени могли спричинити масову загибель Pinna nobilis. життя. 2020; 10: 238.
Бредлі М., Коуттс С. Дж., Дженкінс Е., О'Хара Т. М. Потенційний вплив зміни клімату на арктичні зоонозні захворювання. Міжнародний журнал охорони здоров'я Циркумполярного регіону. 2005; 64:468–77.
Бейєр Дж., Грін Н.В., Брукс С., Аллан І.Дж., Руус А., Гомес Т. та ін. Блакитні мідії (Mytilus edulis spp.) як сигнальні організми в моніторингу забруднення прибережних зон: огляд. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Сіравенья Г., Марсоні С., Сієна С., Барделлі А. Інтеграція рідкої біопсії в лікування раку. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Ван Дж. К. М., Массі К., Гарсія-Корбачо Дж., Мульєр Ф., Брентон Дж. Д., Кальдас К. та ін. Дозрівання рідкої біопсії: дозволяє циркулювати пухлинній ДНК. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Мандель П., Метейс П. Нуклеїнові кислоти в плазмі людини. Протоколи засідань дочірніх компаній Товариства біології. 1948; 142:241-3.
Бронкхорст А. Дж., Унгерер В., Холденрідер С. Нова роль безклітинної ДНК як молекулярного маркера для лікування раку. Кількісна оцінка біомолярного аналізу. 2019;17:100087.
Ігнатіадіс М., Следж Г.В., Джеффрі С.С. Рідинна біопсія входить у клініку – проблеми впровадження та майбутні виклики. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент І.Л., Редман К.В. та ін. Фетальна ДНК присутня в материнській плазмі та сироватці крові. Lancet. 1997; 350:485-7.
Муфаррей М.Н., Вонг Р.Дж., Шоу Г.М., Стівенсон Д.К., Квейк С.Р. Вивчення перебігу вагітності та її ускладнень з використанням циркулюючої позаклітинної РНК у крові жінок під час вагітності. Допедіатрія. 2020;8:605219.
Оллеріх М., Шервуд К., Кіоун П., Шютц Е., Бек Дж., Штегбауер Дж. та ін. Рідинна біопсія: безклітинна ДНК донора використовується для виявлення алогенних уражень у трансплантованій нирці. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Хуан Ф.К., Ло Ю.М. Інновації в пренатальній діагностиці: секвенування геному материнської плазми. Анна, доктор медичних наук. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D та ін. Швидке виявлення патогенів за допомогою метагеномного секвенування інфікованих рідин організму наступного покоління. Nat Medicine. 2021;27:115-24.