Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Biopsi cecair (LB) merupakan satu konsep yang semakin popular dalam bidang bioperubatan. Konsep ini terutamanya berdasarkan pengesanan serpihan DNA ekstraselular yang beredar (ccfDNA), yang kebanyakannya dilepaskan sebagai serpihan kecil selepas kematian sel dalam pelbagai tisu. Sebahagian kecil daripada serpihan ini berasal daripada tisu atau organisma asing (asing). Dalam kajian semasa, kami telah mengaplikasikan konsep ini kepada kupang, spesies pengawal yang dikenali dengan kapasiti penapisan air lautnya yang tinggi. Kami menggunakan keupayaan kupang untuk bertindak sebagai penapis semula jadi bagi menangkap serpihan DNA persekitaran daripada pelbagai sumber untuk memberikan maklumat tentang biodiversiti ekosistem pantai marin. Keputusan kami menunjukkan bahawa hemolimfa kupang mengandungi serpihan DNA yang sangat berbeza saiznya, dari 1 hingga 5 kb. Penjujukan senapang patah menunjukkan bahawa sebilangan besar serpihan DNA berasal dari mikrob asing. Antaranya, kami menemui serpihan DNA daripada bakteria, arkea dan virus, termasuk virus yang diketahui menjangkiti pelbagai perumah yang biasa ditemui dalam ekosistem laut pantai. Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB yang digunakan pada kupang mewakili sumber pengetahuan yang kaya tetapi masih belum diterokai tentang kepelbagaian mikrob dalam ekosistem pantai marin.
Kesan perubahan iklim (CC) terhadap biodiversiti ekosistem marin merupakan bidang penyelidikan yang berkembang pesat. Pemanasan global bukan sahaja menyebabkan tekanan fisiologi yang penting, tetapi juga mendorong had evolusi kestabilan terma organisma marin, yang menjejaskan habitat beberapa spesies, mendorong mereka untuk mencari keadaan yang lebih baik [1, 2]. Selain menjejaskan biodiversiti metazoa, CC mengganggu keseimbangan halus interaksi perumah-mikrob. Disbakteriosis mikrob ini menimbulkan ancaman serius kepada ekosistem marin kerana ia menjadikan organisma marin lebih mudah terdedah kepada patogen berjangkit [3, 4]. Adalah dipercayai bahawa SS memainkan peranan penting dalam kematian besar-besaran, yang merupakan masalah serius bagi pengurusan ekosistem marin global [5, 6]. Ini adalah isu penting memandangkan kesan ekonomi, ekologi dan pemakanan banyak spesies marin. Ini terutamanya benar untuk bivalvia yang hidup di kawasan kutub, di mana kesan CK lebih serta-merta dan teruk [6, 7]. Malah, bivalvia seperti Mytilus spp. digunakan secara meluas untuk memantau kesan CC terhadap ekosistem marin. Tidak menghairankan, sejumlah besar biomarker telah dibangunkan untuk memantau kesihatan mereka, selalunya menggunakan pendekatan dua peringkat yang melibatkan biomarker berfungsi berdasarkan aktiviti enzimatik atau fungsi selular seperti daya tahan sel dan aktiviti fagositik [8]. Kaedah ini juga termasuk pengukuran kepekatan penunjuk tekanan tertentu yang terkumpul dalam tisu lembut selepas penyerapan sejumlah besar air laut. Walau bagaimanapun, kapasiti penapisan yang tinggi dan sistem peredaran darah separa terbuka bivalvia memberikan peluang untuk membangunkan biomarker hemolimf baharu menggunakan konsep biopsi cecair (LB), pendekatan mudah dan invasif minimum untuk pengurusan pesakit. [9, 10]. Walaupun beberapa jenis molekul yang beredar boleh didapati dalam LB manusia, konsep ini terutamanya berdasarkan analisis penjujukan DNA serpihan DNA ekstraselular (ccfDNA) yang beredar dalam plasma. Malah, kehadiran DNA yang beredar dalam plasma manusia telah diketahui sejak pertengahan abad ke-20 [11], tetapi hanya dalam beberapa tahun kebelakangan ini kemunculan kaedah penjujukan daya pemprosesan tinggi telah membawa kepada diagnosis klinikal berdasarkan ccfDNA. Kehadiran serpihan DNA yang beredar ini sebahagiannya disebabkan oleh pembebasan pasif DNA genomik (nuklear dan mitokondria) selepas kematian sel. Dalam individu yang sihat, kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi boleh ditingkatkan sebanyak 5–10 kali ganda pada pesakit yang menghidap pelbagai patologi atau mengalami tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu. Dalam individu yang sihat, kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi boleh ditingkatkan sebanyak 5–10 kali ganda pada pesakit yang menghidap pelbagai patologi atau mengalami tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухлиной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Dalam kalangan orang yang sihat, kepekatan cccDNA biasanya rendah (<10 ng/mL), tetapi ia boleh meningkat sebanyak 5–10 kali ganda pada pesakit dengan pelbagai patologi atau di bawah tekanan yang membawa kepada kerosakan tisu.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承受可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у плица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Kepekatan ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/ml) pada individu yang sihat, tetapi boleh ditingkatkan 5-10 kali ganda pada pesakit dengan pelbagai patologi atau tekanan, mengakibatkan kerosakan tisu.Saiz serpihan ccfDNA sangat berbeza, tetapi biasanya antara 150 hingga 200 bp. [12]. Analisis ccfDNA yang diperoleh sendiri, iaitu ccfDNA daripada sel perumah normal atau yang diubah, boleh digunakan untuk mengesan perubahan genetik dan epigenetik yang terdapat dalam genom nuklear dan/atau mitokondria, sekali gus membantu doktor memilih terapi sasaran molekul tertentu [13]. Walau bagaimanapun, ccfDNA boleh diperolehi daripada sumber asing seperti ccfDNA daripada sel janin semasa kehamilan atau daripada organ yang dipindahkan [14,15,16,17]. ccfDNA juga merupakan sumber maklumat penting untuk mengesan kehadiran asid nukleik agen berjangkit (asing), yang membolehkan pengesanan jangkitan meluas yang tidak dikenal pasti melalui kultur darah, mengelakkan biopsi invasif tisu yang dijangkiti [18]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa darah manusia mengandungi sumber maklumat yang kaya yang boleh digunakan untuk mengenal pasti patogen virus dan bakteria, dan kira-kira 1% daripada ccfDNA yang terdapat dalam plasma manusia berasal dari luar negara [19]. Kajian-kajian ini menunjukkan bahawa biodiversiti mikrobiom yang beredar dalam organisma boleh dinilai menggunakan analisis ccfDNA. Walau bagaimanapun, sehingga baru-baru ini, konsep ini digunakan secara eksklusif pada manusia dan, pada tahap yang lebih rendah, pada vertebrata lain [20, 21].
Dalam kertas kerja ini, kami menggunakan potensi LB untuk menganalisis ccfDNA Aulacomya atra, spesies selatan yang biasa ditemui di Kepulauan Kerguelen subantartika, sekumpulan pulau di atas dataran tinggi besar yang terbentuk 35 juta tahun yang lalu. letusan gunung berapi. Menggunakan sistem eksperimen in vitro, kami mendapati bahawa serpihan DNA dalam air laut cepat diambil oleh kupang dan memasuki petak hemolimfa. Penjujukan senapang patah telah menunjukkan bahawa hemolimfa ccfDNA kupang mengandungi serpihan DNA yang berasal dari asalnya sendiri dan bukan dari diri sendiri, termasuk bakteria simbiotik dan serpihan DNA daripada biom yang tipikal dalam ekosistem pantai marin gunung berapi sejuk. Hemolimfa ccfDNA juga mengandungi jujukan virus yang berasal daripada virus dengan julat perumah yang berbeza. Kami juga menemui serpihan DNA daripada haiwan multiselular seperti ikan bertulang, anemon laut, alga dan serangga. Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB boleh digunakan dengan jayanya pada invertebrata marin untuk menghasilkan repertoir genomik yang kaya dalam ekosistem marin.
Ikan dewasa (55-70 mm panjang) Mytilus platensis (M. platensis) dan Aulacomya atra (A. atra) telah dikumpulkan dari pantai berbatu intertidal Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Kepulauan Kerguelen pada Disember 2018. Kupang biru dewasa yang lain (Mytilus spp.) telah diperoleh daripada pembekal komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dan diletakkan di dalam tangki berudara suhu terkawal (4°C) yang mengandungi 10–20 L air garam tiruan 32‰ (garam laut tiruan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, Amerika Syarikat). Bagi setiap eksperimen, panjang dan berat cangkerang individu telah diukur.
Protokol akses terbuka percuma untuk program ini boleh didapati dalam talian (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Secara ringkas, hemolimf LB dikumpulkan daripada otot abduktor seperti yang diterangkan [22]. Hemolimf dijernihkan melalui sentrifugasi pada 1200×g selama 3 minit, supernatan dibekukan (-20°C) sehingga digunakan. Untuk pengasingan dan penulenan cfDNA, sampel (1.5-2.0 ml) dicairkan dan diproses menggunakan kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) mengikut arahan pengilang. ccfDNA disimpan pada suhu -80°C sehingga analisis lanjut. Dalam beberapa eksperimen, ccfDNA diasingkan dan ditulenkan menggunakan Kit Penyiasat DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA yang ditulenkan diukur menggunakan ujian PicoGreen standard. Taburan serpihan ccfDNA yang diasingkan telah dianalisis melalui elektroforesis kapilari menggunakan bioanalisis Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) menggunakan Kit DNA Kepekaan Tinggi. Pengujian telah dijalankan menggunakan 1 µl sampel ccfDNA mengikut arahan pengilang.
Untuk penjujukan serpihan hemolimfa ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) menyediakan pustaka senapang patah menggunakan kit Campuran DNA Illumina bagi kit Illumina MiSeq PE75. Penyesuai standard (BioO) telah digunakan. Fail data mentah boleh didapati daripada Arkib Bacaan Jujukan NCBI (SRR8924808 dan SRR8924809). Kualiti bacaan asas dinilai menggunakan FastQC [23]. Trimmomatic [24] telah digunakan untuk kliping penyesuai dan bacaan berkualiti rendah. Bacaan senapang patah dengan hujung berpasangan telah digabungkan dengan FLASH menjadi bacaan tunggal yang lebih panjang dengan pertindihan minimum 20 bp untuk mengelakkan ketidakpadanan [25]. Bacaan yang digabungkan telah dianotasi dengan BLASTN menggunakan pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e < 1e−3 dan homologi 90%), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah telah dilakukan menggunakan DUST [26]. Bacaan yang digabungkan telah dianotasi dengan BLASTN menggunakan pangkalan data Taksonomi NCBI bivalve (nilai e < 1e−3 dan homologi 90%), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah telah dilakukan menggunakan DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчозлылючих < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [DUS]. Bacaan terkumpul telah dianotasi dengan BLASTN menggunakan pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e < 1e-3 dan homologi 90%), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah telah dilakukan menggunakan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，年数，2年进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 6用 debu进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствослючат (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с исполнено с исполнено с исполнено с испольмьзоUST]. Bacaan terkumpul telah dianotasi dengan BLASTN menggunakan pangkalan data taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 dan homologi 90%), dan penyamaran jujukan kerumitan rendah telah dilakukan menggunakan DUST [26].Bacaan dibahagikan kepada dua kumpulan: berkaitan dengan jujukan bivalvia (di sini dipanggil bacaan kendiri) dan tidak berkaitan (bukan bacaan kendiri). Dua kumpulan dikumpulkan secara berasingan menggunakan MEGAHIT untuk menjana kontinjen [27]. Sementara itu, taburan taksonomi bacaan mikrobiom asing dikelaskan menggunakan Kraken2 [28] dan diwakili secara grafik oleh carta pai Krona pada Galaxy [29, 30]. Kmer optimum ditentukan sebagai kmer-59 daripada eksperimen awal kami. Kontinjen kendiri kemudiannya dikenal pasti melalui penjajaran dengan BLASTN (pangkalan data NCBI bivalve, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir. Kontinjen kendiri kemudiannya dikenal pasti melalui penjajaran dengan BLASTN (pangkalan data NCBI bivalve, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллючиск, 1 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Kontinjen kendiri kemudiannya dikenal pasti dengan memadankan dengan BLASTN (pangkalan data bivalve NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%) untuk anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал NCBIн двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 dan гомология 60%). Kontinjen kendiri kemudiannya dikenal pasti untuk anotasi akhir dengan memadankan dengan BLASTN (pangkalan data bivalve NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). Secara selari, kontinjen kumpulan bukan diri telah dianotasi dengan BLASTN (pangkalan data NCBI nt, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). Secara selari, kontinjen kumpulan bukan diri telah dianotasi dengan BLASTN (pangkalan data NCBI nt, nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 % Secara selari, kontinjen kumpulan asing telah dianotasi dengan BLASTN (pangkalan data NT NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt nt 1 гомология 60%). Secara selari, kontinjen kumpulan bukan kendiri telah dianotasi dengan BLASTN (pangkalan data NCBI nt, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). BLASTX juga dijalankan ke atas kontinjen bukan diri menggunakan pangkalan data NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). BLASTX juga dijalankan ke atas kontinjen bukan diri menggunakan pangkalan data NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e < 1e−10 dan homologi 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значоский использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значовие 10%) BLASTX juga dilakukan pada kontinjen bukan kendiri menggunakan pangkalan data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e < 1e-10 dan homologi 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和）% 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和）% 同 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 % BLASTX juga dilakukan pada kontinjen bukan kendiri menggunakan pangkalan data protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan homologi 60%).Kolam BLASTN dan BLASTX bagi kontij bukan kendiri mewakili kontij akhir (lihat fail Tambahan).
Primer yang digunakan untuk PCR disenaraikan dalam Jadual S1. Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) telah digunakan untuk menguatkan gen sasaran ccfDNA. Keadaan tindak balas berikut telah digunakan: denaturasi pada 95°C selama 3 minit, 95°C selama 1 minit, menetapkan suhu penyepuhlindapan selama 1 minit, pemanjangan pada 72°C selama 1 minit, 35 kitaran, dan akhirnya 72°C dalam masa 10 minit. . Produk PCR telah diasingkan melalui elektroforesis dalam gel agarosa (1.5%) yang mengandungi SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) pada 95 V.
Kupang (Mytilus spp.) telah diaklimatisasi dalam 500 ml air laut beroksigen (32 PSU) selama 24 jam pada suhu 4°C. DNA plasmid yang mengandungi sisipan yang mengekod jujukan cDNA galectin-7 manusia (nombor aksesi NCBI L07769) telah ditambah ke dalam vial pada kepekatan akhir 190 μg/μl. Kupang yang diinkubasi di bawah keadaan yang sama tanpa penambahan DNA adalah kawalan. Tangki kawalan ketiga mengandungi DNA tanpa kupang. Untuk memantau kualiti DNA dalam air laut, sampel air laut (20 μl; tiga ulangan) diambil dari setiap tangki pada masa yang ditunjukkan. Untuk kebolehkesanan DNA plasmid, kupang LB dituai pada masa yang ditunjukkan dan dianalisis dengan qPCR dan ddPCR. Disebabkan kandungan garam air laut yang tinggi, alikuot telah dicairkan dalam air berkualiti PCR (1:10) sebelum semua ujian PCR.
PCR titisan digital (ddPCR) telah dijalankan menggunakan protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Gunakan profil suhu untuk menentukan suhu optimum (Jadual S1). Titisan telah dijana menggunakan penjana titisan QX200 (BioRad). ddPCR telah dijalankan seperti berikut: 95°C selama 5 minit, 50 kitaran 95°C selama 30 saat dan suhu penyepuhlindapan yang diberikan selama 1 minit dan 72°C selama 30 saat, 4°C selama 5 minit dan 90°C dalam masa 5 minit. Bilangan titisan dan tindak balas positif (bilangan salinan/µl) telah diukur menggunakan pembaca titisan QX200 (BioRad). Sampel dengan kurang daripada 10,000 titisan telah ditolak. Kawalan corak tidak dilakukan setiap kali ddPCR dijalankan.
qPCR telah dijalankan menggunakan Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) dan primer khusus LGALS7. Semua PCR kuantitatif telah dijalankan dalam 20 µl menggunakan Kit PCR Hijau QuantiFast SYBR (QIAGEN). qPCR telah dimulakan dengan pengeraman selama 15 minit pada suhu 95°C diikuti dengan 40 kitaran pada suhu 95°C selama 10 saat dan pada suhu 60°C selama 60 saat dengan satu pengumpulan data. Lengkung lebur telah dijana menggunakan pengukuran berturut-turut pada suhu 95°C selama 5 saat, 65°C selama 60 saat, dan 97°C pada akhir qPCR. Setiap qPCR telah dijalankan dalam tiga kali ganda, kecuali untuk sampel kawalan.
Oleh kerana kupang dikenali dengan kadar penapisan yang tinggi, kami mula-mula menyiasat sama ada ia boleh menapis dan mengekalkan serpihan DNA yang terdapat dalam air laut. Kami juga berminat sama ada serpihan ini terkumpul dalam sistem limfa separa terbuka mereka. Kami menyelesaikan masalah ini secara eksperimen dengan mengesan nasib serpihan DNA larut yang ditambahkan ke dalam tangki kupang biru. Untuk memudahkan pengesanan serpihan DNA, kami menggunakan DNA plasmid asing (bukan diri) yang mengandungi gen galectin-7 manusia. ddPCR mengesan serpihan DNA plasmid dalam air laut dan kupang. Keputusan kami menunjukkan bahawa jika jumlah serpihan DNA dalam air laut kekal agak malar dari semasa ke semasa (sehingga 7 hari) tanpa kehadiran kupang, maka dengan kehadiran kupang, tahap ini hampir hilang sepenuhnya dalam masa 8 jam (Rajah 1a,b). Serpihan DNA eksogen mudah dikesan dalam masa 15 minit dalam cecair intravalvular dan hemolimfa (Rajah 1c). Serpihan ini masih boleh dikesan sehingga 4 jam selepas pendedahan. Aktiviti penapisan ini berkenaan dengan serpihan DNA adalah setanding dengan aktiviti penapisan bakteria dan alga [31]. Keputusan ini menunjukkan bahawa kupang boleh menapis dan mengumpul DNA asing dalam petak bendalirnya.
Kepekatan relatif DNA plasmid dalam air laut dengan kehadiran (A) atau ketiadaan (B) kupang, diukur dengan ddPCR. Dalam A, keputusan dinyatakan sebagai peratusan, dengan sempadan kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25. Lengkung logaritma yang dipadankan ditunjukkan dalam warna merah, dan kawasan yang dilorek dengan kelabu mewakili selang keyakinan 95%. Dalam B, garis merah mewakili min dan garis biru mewakili selang keyakinan 95% untuk kepekatan. C Pengumpulan DNA plasmid dalam hemolimf dan cecair injap kupang pada masa yang berbeza selepas penambahan DNA plasmid. Keputusan dibentangkan sebagai salinan mutlak yang dikesan/mL (±SE).
Seterusnya, kami mengkaji asal usul ccfDNA dalam kupang yang dikumpulkan dari dasar kupang di Kepulauan Kerguelen, sekumpulan pulau terpencil dengan pengaruh antropogenik yang terhad. Untuk tujuan ini, cccDNA daripada hemolimfa kupang telah diasingkan dan ditulenkan melalui kaedah yang biasa digunakan untuk menulenkan cccDNA manusia [32, 33]. Kami mendapati bahawa purata kepekatan ccfDNA hemolimfa dalam kupang berada dalam julat mikrogram per ml hemolimfa yang rendah (lihat Jadual S2, Maklumat Tambahan). Julat kepekatan ini jauh lebih besar daripada orang yang sihat (nanogram per mililiter rendah), tetapi dalam kes yang jarang berlaku, pada pesakit kanser, tahap ccfDNA boleh mencapai beberapa mikrogram per mililiter [34, 35]. Analisis taburan saiz hemolimfa ccfDNA menunjukkan bahawa serpihan ini sangat berbeza dari segi saiz, antara 1000 bp hingga 1000 bp. sehingga 5000 bp (Rajah 2). Keputusan yang serupa diperoleh menggunakan Kit Penyiasat QIAamp berasaskan silika, satu kaedah yang biasa digunakan dalam sains forensik untuk mengasingkan dan menulenkan DNA genomik dengan cepat daripada sampel DNA berkepekatan rendah, termasuk ccfDNA [36].
Elektroforegram ccfDNA perwakilan hemolimfa kupang. Diekstrak dengan Kit Plasma NucleoSnap (atas) dan Kit Penyiasat DNA QIAamp. Plot Biola B menunjukkan taburan kepekatan hemolimfa ccfDNA (±SE) dalam kupang. Garis hitam dan merah masing-masing mewakili median dan kuartil pertama dan ketiga.
Kira-kira 1% ccfDNA dalam manusia dan primata mempunyai sumber asing [21, 37]. Memandangkan sistem peredaran darah separa terbuka bivalvia, air laut yang kaya dengan mikrob, dan taburan saiz ccfDNA kupang, kami membuat hipotesis bahawa hemolimf ccfDNA kupang mungkin mengandungi himpunan DNA mikrob yang kaya dan pelbagai. Untuk menguji hipotesis ini, kami menjujukan hemolimf ccfDNA daripada sampel Aulacomya atra yang dikumpulkan dari Kepulauan Kerguelen, menghasilkan lebih 10 juta bacaan, 97.6% daripadanya lulus kawalan kualiti. Bacaan kemudiannya dikelaskan mengikut sumber kendiri dan bukan kendiri menggunakan pangkalan data bivalv BLASTN dan NCBI (Rajah S1, Maklumat Tambahan).
Dalam manusia, kedua-dua DNA nuklear dan mitokondria boleh dilepaskan ke dalam aliran darah [38]. Walau bagaimanapun, dalam kajian ini, adalah tidak mungkin untuk menerangkan secara terperinci DNA genomik nuklear kupang, memandangkan genom A. atra belum dijujukan atau diterangkan. Walau bagaimanapun, kami dapat mengenal pasti beberapa serpihan ccfDNA asal kita sendiri menggunakan perpustakaan bivalvia (Rajah S2, Maklumat Tambahan). Kami juga mengesahkan kehadiran serpihan DNA asal kita sendiri melalui amplifikasi PCR terarah bagi gen A. atra yang dijujukan (Rajah 3). Begitu juga, memandangkan genom mitokondria A. atra tersedia dalam pangkalan data awam, seseorang boleh menemui bukti kehadiran serpihan ccfDNA mitokondria dalam hemolimfa A. atra. Kehadiran serpihan DNA mitokondria telah disahkan oleh amplifikasi PCR (Rajah 3).
Pelbagai gen mitokondria terdapat dalam hemolimf A. atra (titik merah – nombor stok: SRX5705969) dan M. platensis (titik biru – nombor stok: SRX5705968) yang dikuatkan dengan PCR. Rajah diadaptasi daripada Breton et al., 2011 B Penguatan supernatan hemolimf daripada A. atra Disimpan pada kertas FTA. Gunakan penebuk 3 mm untuk menambah terus ke dalam tiub PCR yang mengandungi campuran PCR.
Memandangkan kandungan mikrob yang banyak dalam air laut, pada mulanya kami menumpukan pada pencirian jujukan DNA mikrob dalam hemolimfa. Untuk melakukan ini, kami menggunakan dua strategi yang berbeza. Strategi pertama menggunakan Kraken2, program pengelasan jujukan berasaskan algoritma yang dapat mengenal pasti jujukan mikrob dengan ketepatan yang setanding dengan BLAST dan alat lain [28]. Lebih daripada 6719 bacaan ditentukan berasal dari bakteria, manakala 124 dan 64 masing-masing berasal dari arkea dan virus (Rajah 4). Serpihan DNA bakteria yang paling banyak ialah Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), dan Bacteroidetes (17%) (Rajah 4a). Taburan ini selaras dengan kajian terdahulu tentang mikrobiom kupang biru marin [39, 40]. Gammaproteobacteria adalah kelas utama Proteobacteria (44%), termasuk banyak Vibrionales (Rajah 4b). Kaedah ddPCR mengesahkan kehadiran serpihan DNA Vibrio dalam ccfDNA hemolimfa A. atra (Rajah 4c) [41]. Untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang asal usul bakteria ccfDNA, pendekatan tambahan telah diambil (Rajah S2, Maklumat Tambahan). Dalam kes ini, bacaan yang bertindih telah dikumpulkan sebagai bacaan hujung berpasangan dan dikelaskan sebagai asal usul diri (bivalvia) atau bukan asal usul diri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan potongan dengan homologi >90%. Dalam kes ini, bacaan yang bertindih telah dikumpulkan sebagai bacaan hujung berpasangan dan dikelaskan sebagai asal usul diri (bivalvia) atau bukan asal usul diri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan potongan dengan homologi >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы какдвирскиство моллюски) atau чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 dan отсечения с гомологией> 90%. Dalam kes ini, bacaan bertindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan dikelaskan sebagai asli (bivalvia) atau bukan asli menggunakan BLASTN dan nilai e 1e-3 dan potongan dengan homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 和 和 和 3n 的3 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствоствены моллюски) atau несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Dalam kes ini, bacaan bertindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan dikelaskan sebagai sendiri (bivalvia) atau bukan asli menggunakan nilai e BLASTN dan 1e-3 serta ambang homologi >90%.Oleh kerana genom A. atra belum dijujukan, kami menggunakan strategi pemasangan de novo bagi penghimpun MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Sebanyak 147,188 kontij telah dikenal pasti sebagai bersandar (bivalvia) asal. Kontij ini kemudiannya diletupkan dengan nilai-e 1e-10 menggunakan BLASTN dan BLASTX. Strategi ini membolehkan kami mengenal pasti 482 serpihan bukan bivalvia yang terdapat dalam ccfDNA A. atra. Lebih separuh (57%) daripada serpihan DNA ini diperoleh daripada bakteria, terutamanya daripada simbion insang, termasuk simbion sulfotropik, dan daripada simbion insang Solemya velum (Rajah 5).
Kelimpahan relatif pada peringkat jenis. B Kepelbagaian mikrob bagi dua filum utama (Firmicutes dan Proteobacteria). Amplifikasi perwakilan ddPCR C Vibrio spp. A. Serpihan gen rRNA 16S (biru) dalam tiga hemolimfa atra.
Sebanyak 482 kontij yang dikumpul telah dianalisis. Profil umum taburan taksonomi anotasi kontij metagenomik (prokariot dan eukariot). B Taburan terperinci serpihan DNA bakteria yang dikenal pasti oleh BLASTN dan BLASTX.
Analisis Kraken2 juga menunjukkan bahawa ccfDNA kupang mengandungi serpihan DNA arkeologi, termasuk serpihan DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), dan Thaurmarcheota (11%) (Rajah 6a). Kehadiran serpihan DNA yang berasal dari Euryarchaeota dan Crenarchaeota, yang sebelum ini ditemui dalam komuniti mikrob kupang California, tidaklah mengejutkan [42]. Walaupun Euryarchaeota sering dikaitkan dengan keadaan yang melampau, kini diakui bahawa kedua-dua Euryarchaeota dan Crenarcheota adalah antara prokariot yang paling biasa dalam persekitaran kriogenik marin [43, 44]. Kehadiran mikroorganisma metanogenik dalam kupang tidak mengejutkan, memandangkan laporan terbaru tentang kebocoran metana yang meluas dari kebocoran dasar di Dataran Tinggi Kerguelen [45] dan kemungkinan pengeluaran metana mikrob yang diperhatikan di luar pantai Kepulauan Kerguelen [46].
Perhatian kami kemudian beralih kepada bacaan daripada virus DNA. Setahu kami, ini merupakan kajian luar sasaran pertama tentang kandungan virus kupang. Seperti yang dijangkakan, kami menemui serpihan DNA bakteriofaj (Caudovirales) (Rajah 6b). Walau bagaimanapun, DNA virus yang paling biasa berasal daripada filum nukleositovirus, juga dikenali sebagai virus DNA besar sitoplasma nuklear (NCLDV), yang mempunyai genom terbesar berbanding mana-mana virus. Dalam filum ini, kebanyakan jujukan DNA tergolong dalam keluarga Mimimidoviridae (58%) dan Poxviridae (21%), yang hos semula jadinya termasuk vertebrata dan artropod, manakala sebahagian kecil daripada jujukan DNA ini tergolong dalam alga virologi yang diketahui. Menjangkiti alga eukariotik marin. Jujukan tersebut juga diperoleh daripada virus Pandora, virus gergasi dengan saiz genom terbesar berbanding mana-mana genera virus yang diketahui. Menariknya, julat hos yang diketahui dijangkiti virus, seperti yang ditentukan oleh penjujukan hemolimfa ccfDNA, adalah agak besar (Rajah S3, Maklumat Tambahan). Ia termasuk virus yang menjangkiti serangga seperti Baculoviridae dan Iridoviridae, serta virus yang menjangkiti amuba, alga dan vertebrata. Kami juga menemui urutan yang sepadan dengan genom Pithovirus sibericum. Pitovirus (juga dikenali sebagai "virus zombi") mula-mula diasingkan daripada permafrost berusia 30,000 tahun di Siberia [47]. Oleh itu, keputusan kami selaras dengan laporan terdahulu yang menunjukkan bahawa tidak semua spesies moden virus ini telah pupus [48] dan virus ini mungkin terdapat dalam ekosistem marin subarctic yang terpencil.
Akhir sekali, kami menguji untuk melihat sama ada kami boleh menemui serpihan DNA daripada haiwan multiselular lain. Sebanyak 482 kontinjen asing telah dikenal pasti oleh BLASTN dan BLASTX dengan pustaka nt, nr dan RefSeq (genomik dan protein). Keputusan kami menunjukkan bahawa antara serpihan asing ccfDNA haiwan multiselular, DNA tulang bertulang mendominasi (Rajah 5). Serpihan DNA daripada serangga dan spesies lain juga telah ditemui. Sebahagian besar serpihan DNA belum dikenal pasti, mungkin disebabkan oleh kurangnya perwakilan sebilangan besar spesies marin dalam pangkalan data genomik berbanding spesies daratan [49].
Dalam kertas kerja ini, kami mengaplikasikan konsep LB kepada kupang, dengan alasan bahawa penjujukan tembakan hemolimf ccfDNA dapat memberikan gambaran tentang komposisi ekosistem pantai marin. Khususnya, kami mendapati bahawa 1) hemolimf kupang mengandungi kepekatan yang agak tinggi (tahap mikrogram) serpihan DNA yang beredar yang agak besar (~1-5 kb); 2) serpihan DNA ini adalah bebas dan tidak bebas 3) Antara sumber asing serpihan DNA ini, kami menemui DNA bakteria, arkeologi dan virus, serta DNA haiwan multiselular lain; 4) Pengumpulan serpihan ccfDNA asing ini dalam hemolimf berlaku dengan cepat dan menyumbang kepada aktiviti penapisan dalaman kupang. Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa konsep LB, yang setakat ini telah digunakan terutamanya dalam bidang bioperubatan, mengekod sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum diterokai yang boleh digunakan untuk lebih memahami interaksi antara spesies sentinel dan persekitarannya.
Selain primata, pengasingan ccfDNA telah dilaporkan dalam mamalia, termasuk tikus, anjing, kucing, dan kuda [50, 51, 52]. Walau bagaimanapun, setahu kami, kajian kami adalah yang pertama melaporkan pengesanan dan penjujukan ccfDNA dalam spesies marin dengan sistem peredaran terbuka. Ciri anatomi dan keupayaan penapisan kupang ini, sekurang-kurangnya sebahagiannya, mungkin menjelaskan ciri-ciri saiz serpihan DNA yang beredar berbanding spesies lain. Pada manusia, kebanyakan serpihan DNA yang beredar dalam darah adalah serpihan kecil yang bersaiz antara 150 hingga 200 bp dengan puncak maksimum 167 bp [34, 53]. Sebahagian kecil tetapi ketara daripada serpihan DNA adalah antara 300 dan 500 bp, dan kira-kira 5% lebih panjang daripada 900 bp [54]. Sebab bagi taburan saiz ini adalah kerana sumber utama ccfDNA dalam plasma berlaku akibat kematian sel, sama ada disebabkan oleh kematian sel atau disebabkan oleh nekrosis sel hematopoietik yang beredar dalam individu yang sihat atau disebabkan oleh apoptosis sel tumor dalam pesakit kanser (dikenali sebagai DNA tumor yang beredar). , ctDNA). Taburan saiz hemolimf ccfDNA yang kami temui dalam kupang adalah antara 1000 hingga 5000 bp, menunjukkan bahawa ccfDNA kupang mempunyai asal usul yang berbeza. Ini adalah hipotesis logik, kerana kupang mempunyai sistem vaskular separa terbuka dan hidup dalam persekitaran akuatik marin yang mengandungi kepekatan DNA genomik mikrob yang tinggi. Malah, eksperimen makmal kami menggunakan DNA eksogen telah menunjukkan bahawa kupang mengumpul serpihan DNA dalam air laut, sekurang-kurangnya selepas beberapa jam ia terdegradasi selepas pengambilan selular dan/atau dilepaskan dan/atau disimpan dalam pelbagai organisasi. Memandangkan kelangkaan sel (kedua-dua prokariotik dan eukariotik), penggunaan petak intravalvular akan mengurangkan jumlah ccfDNA daripada sumber sendiri serta daripada sumber asing. Memandangkan kepentingan imuniti semula jadi bivalvia dan bilangan fagosit yang beredar, kami selanjutnya membuat hipotesis bahawa ccfDNA asing juga diperkaya dalam fagosit yang beredar yang mengumpul DNA asing apabila mikroorganisma dan/atau serpihan selular dimakan. Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan bahawa hemolimfa ccfDNA bivalvia merupakan tempat penyimpanan maklumat molekul yang unik dan mengukuhkan statusnya sebagai spesies pengawal.
Data kami menunjukkan bahawa penjujukan dan analisis serpihan hemolimfa ccfDNA yang berasal dari bakteria dapat memberikan maklumat penting tentang flora bakteria perumah dan bakteria yang terdapat dalam ekosistem marin di sekitarnya. Teknik penjujukan tembakan telah mendedahkan urutan bakteria komensal A. atra insang yang mungkin terlepas pandang jika kaedah pengenalpastian rRNA 16S konvensional telah digunakan, sebahagiannya disebabkan oleh bias perpustakaan rujukan. Malah, penggunaan data LB yang kami kumpulkan daripada M. platensis dalam lapisan kupang yang sama di Kerguelen menunjukkan bahawa komposisi simbion bakteria yang berkaitan dengan insang adalah sama untuk kedua-dua spesies kupang (Rajah S4, Maklumat Tambahan). Persamaan dua kupang yang berbeza secara genetik ini mungkin mencerminkan komposisi komuniti bakteria dalam mendapan sejuk, sulfur, dan gunung berapi Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tahap mikroorganisma pengurangan sulfur yang lebih tinggi telah dijelaskan dengan baik semasa menuai kupang dari kawasan pantai yang dibioturbasi [59], seperti pantai Port-au-France. Satu lagi kemungkinan ialah flora kupang komensal mungkin terjejas oleh penghantaran mendatar [60, 61]. Lebih banyak kajian diperlukan untuk menentukan korelasi antara persekitaran marin, permukaan dasar laut dan komposisi bakteria simbiotik dalam kupang. Kajian-kajian ini sedang dijalankan.
Panjang dan kepekatan hemolimf ccfDNA, kemudahan penulenannya, dan kualiti tinggi untuk membolehkan penjujukan shotgun yang pantas adalah antara banyak kelebihan menggunakan ccfDNA kupang untuk menilai biodiversiti dalam ekosistem pantai marin. Pendekatan ini amat berkesan untuk mencirikan komuniti virus (virom) dalam ekosistem tertentu [62, 63]. Tidak seperti bakteria, arkea, dan eukariot, genom virus tidak mengandungi gen yang dipelihara secara filogenetik seperti jujukan 16S. Keputusan kami menunjukkan bahawa biopsi cecair daripada spesies penunjuk seperti kupang boleh digunakan untuk mengenal pasti bilangan serpihan virus ccfDNA yang agak besar yang diketahui menjangkiti perumah yang biasanya mendiami ekosistem laut pantai. Ini termasuk virus yang diketahui menjangkiti protozoa, artropod, serangga, tumbuhan, dan virus bakteria (contohnya, bakteriofaj). Taburan yang serupa ditemui apabila kami memeriksa virom hemolimf ccfDNA kupang biru (M. platensis) yang dikumpulkan dalam lapisan kupang yang sama di Kerguelen (Jadual S2, Maklumat Tambahan). Penjujukan ccfDNA secara senapang patah sememangnya merupakan pendekatan baharu yang mendapat momentum dalam kajian virom manusia atau spesies lain [21, 37, 64]. Pendekatan ini amat berguna untuk mengkaji virus DNA untai dua, kerana tiada gen tunggal yang dipelihara di antara semua virus DNA untai dua, yang mewakili kelas virus yang paling pelbagai dan luas di Baltimore [65]. Walaupun kebanyakan virus ini masih tidak dikelaskan dan mungkin termasuk virus dari bahagian dunia virus yang tidak diketahui sepenuhnya [66], kami mendapati bahawa virom dan julat perumah kupang A. atra dan M. platensis berada di antara kedua-dua spesies. sama seperti (lihat rajah S3, maklumat tambahan). Persamaan ini tidak mengejutkan, kerana ia mungkin mencerminkan kekurangan selektiviti dalam pengambilan DNA yang terdapat dalam persekitaran. Kajian masa depan menggunakan RNA yang telah ditulenkan kini diperlukan untuk mencirikan virom RNA.
Dalam kajian kami, kami menggunakan saluran paip yang sangat teliti yang diadaptasi daripada karya Kowarski dan rakan sekerja [37], yang menggunakan penghapusan dua langkah bacaan terkumpul dan kontigen sebelum dan selepas pemasangan ccfDNA asli, menghasilkan kadar bacaan yang tidak dipetakan yang tinggi. Oleh itu, kami tidak dapat menolak bahawa sebahagian daripada bacaan yang tidak dipetakan ini mungkin masih mempunyai asal usulnya sendiri, terutamanya kerana kami tidak mempunyai genom rujukan untuk spesies kupang ini. Kami juga menggunakan saluran paip ini kerana kami bimbang tentang kimera antara bacaan kendiri dan bukan kendiri dan panjang bacaan yang dihasilkan oleh Illumina MiSeq PE75. Satu lagi sebab untuk kebanyakan bacaan yang tidak dipetakan adalah kerana kebanyakan mikrob marin, terutamanya di kawasan terpencil seperti Kerguelen, belum dianotasi. Kami menggunakan Illumina MiSeq PE75, dengan mengandaikan panjang serpihan ccfDNA serupa dengan ccfDNA manusia. Untuk kajian masa depan, memandangkan keputusan kami menunjukkan bahawa hemolimfa ccfDNA mempunyai bacaan yang lebih panjang daripada manusia dan/atau mamalia, kami mengesyorkan menggunakan platform penjujukan yang lebih sesuai untuk serpihan ccfDNA yang lebih panjang. Amalan ini akan memudahkan untuk mengenal pasti lebih banyak petunjuk untuk analisis yang lebih mendalam. Memperoleh jujukan genom nuklear A. atra lengkap yang tidak tersedia pada masa ini juga akan memudahkan diskriminasi ccfDNA daripada sumber kendiri dan bukan kendiri. Memandangkan penyelidikan kami telah memberi tumpuan kepada kemungkinan mengaplikasikan konsep biopsi cecair kepada kupang, kami berharap apabila konsep ini digunakan dalam penyelidikan masa hadapan, alat dan saluran paip baharu akan dibangunkan untuk meningkatkan potensi kaedah ini bagi mengkaji kepelbagaian mikrob kupang. ekosistem marin.
Sebagai penanda bio klinikal bukan invasif, tahap ccfDNA plasma manusia yang tinggi dikaitkan dengan pelbagai penyakit, kerosakan tisu, dan keadaan tekanan [67,68,69]. Peningkatan ini dikaitkan dengan pembebasan serpihan DNA asalnya sendiri selepas kerosakan tisu. Kami menangani isu ini menggunakan tekanan haba akut, di mana kupang didedahkan sebentar pada suhu 30 °C. Kami menjalankan analisis ini pada tiga jenis kupang yang berbeza dalam tiga eksperimen bebas. Walau bagaimanapun, kami tidak menemui sebarang perubahan dalam tahap ccfDNA selepas tekanan haba akut (lihat Rajah S5, maklumat tambahan). Penemuan ini mungkin menjelaskan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, fakta bahawa kupang mempunyai sistem peredaran darah separa terbuka dan mengumpul sejumlah besar DNA asing disebabkan oleh aktiviti penapisan yang tinggi. Sebaliknya, kupang, seperti kebanyakan invertebrata, mungkin lebih tahan terhadap kerosakan tisu yang disebabkan oleh tekanan, sekali gus mengehadkan pembebasan ccfDNA dalam hemolimfa mereka [70, 71].
Sehingga kini, analisis DNA biodiversiti dalam ekosistem akuatik tertumpu terutamanya pada pengekodan metabar DNA persekitaran (eDNA). Walau bagaimanapun, kaedah ini biasanya terhad dalam analisis biodiversiti apabila primer digunakan. Penggunaan penjujukan shotgun mengelakkan batasan PCR dan pemilihan set primer yang berat sebelah. Oleh itu, dalam erti kata lain, kaedah kami lebih dekat dengan kaedah penjujukan Shotgun eDNA daya pemprosesan tinggi yang baru digunakan, yang mampu menjujukan DNA berpecah secara langsung dan menganalisis hampir semua organisma [72, 73]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa isu asas yang membezakan LB daripada kaedah eDNA standard. Sudah tentu, perbezaan utama antara eDNA dan LB ialah penggunaan perumah penapis semula jadi. Penggunaan spesies marin seperti span dan bivalvia (Dresseina spp.) sebagai penapis semula jadi untuk mengkaji eDNA telah dilaporkan [74, 75]. Walau bagaimanapun, kajian Dreissena menggunakan biopsi tisu dari mana DNA diekstrak. Analisis ccfDNA daripada LB tidak memerlukan biopsi tisu, peralatan dan logistik khusus dan kadangkala mahal yang berkaitan dengan eDNA atau biopsi tisu. Malah, kami baru-baru ini melaporkan bahawa ccfDNA daripada LB boleh disimpan dan dianalisis dengan sokongan FTA tanpa mengekalkan rantaian sejuk, yang merupakan cabaran utama untuk penyelidikan di kawasan terpencil [76]. Pengekstrakan ccfDNA daripada biopsi cecair juga mudah dan menyediakan DNA berkualiti tinggi untuk penjujukan shotgun dan analisis PCR. Ini merupakan kelebihan yang besar memandangkan beberapa batasan teknikal yang berkaitan dengan analisis eDNA [77]. Kesederhanaan dan kos rendah kaedah persampelan juga amat sesuai untuk program pemantauan jangka panjang. Selain keupayaan penapisan yang tinggi, satu lagi ciri bivalvia yang terkenal ialah komposisi mukopolisakarida kimia mukusnya, yang menggalakkan penyerapan virus [78, 79]. Ini menjadikan bivalvia penapis semula jadi yang ideal untuk mencirikan biodiversiti dan kesan perubahan iklim dalam ekosistem akuatik tertentu. Walaupun kehadiran serpihan DNA yang berasal dari perumah boleh dilihat sebagai batasan kaedah berbanding eDNA, kos yang berkaitan dengan mempunyai ccfDNA asli sedemikian berbanding eDNA pada masa yang sama difahami untuk sejumlah besar maklumat yang tersedia untuk kajian kesihatan. Ini termasuk kehadiran jujukan virus yang disepadukan ke dalam genom perumah. Ini amat penting untuk kupang, memandangkan kehadiran retrovirus leukemia yang dihantar secara mendatar dalam bivalvia [80, 81]. Satu lagi kelebihan LB berbanding eDNA ialah ia mengeksploitasi aktiviti fagositik sel darah yang beredar dalam hemolimfa, yang menelan mikroorganisma (dan genomnya). Fagositosis adalah fungsi utama sel darah dalam bivalvia [82]. Akhir sekali, kaedah ini memanfaatkan kapasiti penapisan kupang yang tinggi (purata 1.5 l/j air laut) dan peredaran dua hari, yang meningkatkan pencampuran lapisan air laut yang berbeza, membolehkan penangkapan eDNA heterolog. [83, 84]. Oleh itu, analisis ccfDNA kupang adalah saluran yang menarik memandangkan kesan pemakanan, ekonomi dan alam sekitar kupang. Sama seperti analisis LB yang dikumpulkan daripada manusia, kaedah ini juga membuka kemungkinan untuk mengukur perubahan genetik dan epigenetik dalam DNA perumah sebagai tindak balas kepada bahan eksogen. Sebagai contoh, teknologi penjujukan generasi ketiga boleh dibayangkan untuk melaksanakan analisis metilasi seluruh genom dalam ccfDNA asli menggunakan penjujukan nanopore. Proses ini harus difasilitasi oleh fakta bahawa panjang serpihan ccfDNA kupang adalah idealnya serasi dengan platform penjujukan bacaan panjang yang membolehkan analisis metilasi DNA seluruh genom daripada satu penjujukan tunggal dijalankan tanpa memerlukan transformasi kimia.85,86] Ini adalah kemungkinan yang menarik, kerana telah ditunjukkan bahawa corak metilasi DNA mencerminkan tindak balas terhadap tekanan persekitaran dan berterusan selama beberapa generasi. Oleh itu, ia dapat memberikan pandangan berharga tentang mekanisme asas yang mengawal tindak balas selepas terdedah kepada perubahan iklim atau bahan pencemar [87]. Walau bagaimanapun, penggunaan LB bukan tanpa batasan. Tidak perlu dikatakan, ini memerlukan kehadiran spesies penunjuk dalam ekosistem. Seperti yang dinyatakan di atas, penggunaan LB untuk menilai biodiversiti ekosistem tertentu juga memerlukan saluran paip bioinformatik yang ketat yang mengambil kira kehadiran serpihan DNA dari sumbernya. Satu lagi masalah utama ialah ketersediaan genom rujukan untuk spesies marin. Adalah diharapkan bahawa inisiatif seperti Projek Genom Mamalia Marin dan projek Fish10k yang baru ditubuhkan [88] akan memudahkan analisis sedemikian pada masa hadapan. Aplikasi konsep LB kepada organisma pemakan penapis marin juga serasi dengan kemajuan terkini dalam teknologi penjujukan, menjadikannya sangat sesuai untuk pembangunan penanda bio berbilang ohm bagi memberikan maklumat penting tentang kesihatan habitat marin sebagai tindak balas kepada tekanan persekitaran.
Data penjujukan genom telah disimpan dalam Arkib Bacaan Jujukan NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bawah Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Kesan perubahan iklim terhadap hidupan marin dan ekosistem. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, dsb. Pertimbangkan impak gabungan perubahan iklim dan tekanan tempatan lain terhadap persekitaran marin. persekitaran saintifik umum. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Sains pertama bulan Mac. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleransi haba yang berkurangan di bawah keadaan tekanan haba berulang menjelaskan kematian kupang biru yang tinggi pada musim panas. Laporan saintifik 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, dsb. Perubahan terkini dalam kekerapan, punca dan tahap kematian haiwan. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Berbilang patogen bukan spesies khusus mungkin telah menyebabkan kematian besar-besaran Pinna nobilis. kehidupan. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potensi kesan perubahan iklim terhadap penyakit zoonotik Artik. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. dkk. Kupang biru (Mytilus edulis spp.) sebagai organisma isyarat dalam pemantauan pencemaran pantai: satu ulasan. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cecair dalam rawatan kanser. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, dsb. Kematangan biopsi cecair: Membolehkan DNA tumor beredar. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asid nukleik dalam plasma manusia. Minit mesyuarat anak syarikat Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peranan baharu untuk DNA bebas sel sebagai penanda molekul untuk rawatan kanser. Kuantifikasi analisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cecair memasuki klinik – isu pelaksanaan dan cabaran masa depan. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dan lain-lain. DNA janin terdapat dalam plasma dan serum ibu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Kajian tentang perjalanan kehamilan dan komplikasinya menggunakan RNA ekstraselular yang beredar dalam darah wanita semasa kehamilan. Dopediatrik. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, dsb. Biopsi cecair: DNA bebas sel penderma digunakan untuk mengesan lesi alogenik dalam cantuman buah pinggang. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dalam diagnostik pranatal: penjujukan genom plasma ibu. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, dsb. Pengesanan patogen pantas dengan penjujukan metagenomik generasi seterusnya bagi cecair badan yang dijangkiti. Nat Medicine. 2021;27:115-24.