Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Flytande biopsi (LB) är ett koncept som snabbt vinner popularitet inom det biomedicinska området. Konceptet bygger huvudsakligen på detektion av fragment av cirkulerande extracellulärt DNA (ccfDNA), vilka huvudsakligen frigörs som små fragment efter celldöd i olika vävnader. En liten andel av dessa fragment härrör från främmande vävnader eller organismer. I nuvarande arbete har vi tillämpat detta koncept på musslor, en vaktpostart känd för sin höga filtreringskapacitet för havsvatten. Vi använder musslornas förmåga att fungera som naturliga filter för att fånga upp miljö-DNA-fragment från en mängd olika källor för att ge information om den biologiska mångfalden i marina kustekosystem. Våra resultat visar att musslornas hemolymf innehåller DNA-fragment som varierar kraftigt i storlek, från 1 till 5 kb. Hagelgevärssekvensering visade att ett stort antal DNA-fragment är av främmande mikrobiellt ursprung. Bland dem fann vi DNA-fragment från bakterier, arkéer och virus, inklusive virus som är kända för att infektera en mängd olika värdorganismer som vanligtvis finns i kustnära marina ekosystem. Sammanfattningsvis visar vår studie att konceptet LB tillämpat på musslor representerar en rik men ännu outforskad kunskapskälla om mikrobiell mångfald i marina kustekosystem.
Klimatförändringarnas inverkan på den biologiska mångfalden i marina ekosystem är ett snabbt växande forskningsområde. Global uppvärmning orsakar inte bara betydande fysiologiska stressfaktorer, utan tänjer också på de evolutionära gränserna för den termiska stabiliteten hos marina organismer, vilket påverkar livsmiljön för ett antal arter och får dem att söka efter mer gynnsamma förhållanden [1, 2]. Förutom att påverka den biologiska mångfalden hos metazoer stör klimatförändringarna den känsliga balansen mellan värd-mikrobiella interaktioner. Denna mikrobiella dysbakterios utgör ett allvarligt hot mot marina ekosystem eftersom den gör marina organismer mer mottagliga för infektiösa patogener [3, 4]. Man tror att SS spelar en viktig roll i massdöd, vilket är ett allvarligt problem för förvaltningen av globala marina ekosystem [5, 6]. Detta är en viktig fråga med tanke på de ekonomiska, ekologiska och näringsmässiga effekterna av många marina arter. Detta gäller särskilt för musslor som lever i polarområdena, där effekterna av klimatförändringar är mer omedelbara och allvarliga [6, 7]. Faktum är att musslor som Mytilus spp. används i stor utsträckning för att övervaka effekterna av klimatförändringar på marina ekosystem. Inte överraskande har ett relativt stort antal biomarkörer utvecklats för att övervaka deras hälsa, ofta med hjälp av en tvåstegsmetod som involverar funktionella biomarkörer baserade på enzymatisk aktivitet eller cellulära funktioner såsom cellviabilitet och fagocytisk aktivitet [8]. Dessa metoder inkluderar också mätning av koncentrationen av specifika tryckindikatorer som ackumuleras i mjukvävnader efter absorption av stora mängder havsvatten. Den höga filtreringskapaciteten och det halvöppna cirkulationssystem som finns hos musslor ger dock en möjlighet att utveckla nya hemolymfbiomarkörer med hjälp av konceptet flytande biopsi (LB), en enkel och minimalt invasiv metod för patienthantering i blodprover [9, 10]. Även om flera typer av cirkulerande molekyler kan hittas i humana LB, är detta koncept främst baserat på DNA-sekvenseringsanalys av cirkulerande extracellulära DNA-fragment (ccfDNA) i plasma. Faktum är att förekomsten av cirkulerande DNA i mänsklig plasma har varit känd sedan mitten av 1900-talet [11], men det är först på senare år som tillkomsten av högkapacitetssekvenseringsmetoder har lett till klinisk diagnos baserad på ccfDNA. Närvaron av dessa cirkulerande DNA-fragment beror delvis på den passiva frisättningen av genomiskt DNA (kärn- och mitokondriellt) efter celldöd. Hos friska individer är koncentrationen av ccfDNA normalt låg (<10 ng/ml) men kan ökas 5–10 gånger hos patienter som lider av olika patologier eller utsätts för stress, vilket resulterar i vävnadsskador. Hos friska individer är koncentrationen av ccfDNA normalt låg (<10 ng/ml) men kan ökas 5–10 gånger hos patienter som lider av olika patologier eller utsätts för stress, vilket resulterar i vävnadsskador. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 сразычно патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos friska personer är koncentrationen av cccDNA normalt låg (<10 ng/ml), men den kan öka 5–10 gånger hos patienter med olika patologier eller under stress som leder till vävnadsskada.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导燴㻄在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 旅理 刖 扊理 刖 扊中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 расично патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentrationerna är vanligtvis låga (<10 ng/ml) hos friska individer, men kan öka 5–10 gånger hos patienter med olika patologier eller stress, vilket resulterar i vävnadsskada.Storleken på ccfDNA-fragment varierar kraftigt, men varierar vanligtvis från 150 till 200 bp. [12]. Analys av självderiverat ccfDNA, dvs. ccfDNA från normala eller transformerade värdceller, kan användas för att detektera genetiska och epigenetiska förändringar i det nukleära och/eller mitokondriella genomet, vilket hjälper kliniker att välja specifika molekylärt riktade terapier [13]. CcfDNA kan dock erhållas från främmande källor, såsom ccfDNA från fosterceller under graviditet eller från transplanterade organ [14,15,16,17]. ccfDNA är också en viktig informationskälla för att detektera närvaron av nukleinsyror från ett infektiöst agens (främmande), vilket möjliggör icke-invasiv detektion av utbredda infektioner som inte identifieras av blododlingar, vilket undviker invasiv biopsi av infekterad vävnad [18]. Nyligen genomförda studier har verkligen visat att mänskligt blod innehåller en rik informationskälla som kan användas för att identifiera virala och bakteriella patogener, och att cirka 1 % av ccfDNA som finns i mänsklig plasma är av främmande ursprung [19]. Dessa studier visar att den biologiska mångfalden i en organisms cirkulerande mikrobiom kan bedömas med hjälp av ccfDNA-analys. Fram tills nyligen användes dock detta koncept uteslutande hos människor och, i mindre utsträckning, hos andra ryggradsdjur [20, 21].
I denna artikel använder vi LB-potentialen för att analysera ccfDNA hos Aulacomya atra, en sydlig art som vanligtvis finns på de subantarktiska Kerguelenöarna, en ögrupp ovanpå en stor platå som bildades för 35 miljoner år sedan. Med hjälp av ett in vitro-experimentellt system fann vi att DNA-fragment i havsvatten snabbt tas upp av musslor och kommer in i hemolymfkomponenten. Hagelgevärssekvensering har visat att musslors hemolymf-ccfDNA innehåller DNA-fragment av eget och icke-självursprung, inklusive symbiotiska bakterier och DNA-fragment från biom typiska för kalla vulkaniska marina kustekosystem. Hemolymf-ccfDNA innehåller också virussekvenser härledda från virus med olika värdområden. Vi fann också DNA-fragment från flercelliga djur som benfisk, havsanemoner, alger och insekter. Sammanfattningsvis visar vår studie att LB-konceptet framgångsrikt kan tillämpas på marina ryggradslösa djur för att generera en rik genomisk repertoar i marina ekosystem.
Vuxna (55–70 mm långa) Mytilus platensis (M. platensis) och Aulacomya atra (A. atra) samlades in från de klippiga stränderna mellan tidvattenområdena i Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E). Kerguelenöarna i december 2018. Andra vuxna blåmusslor (Mytilus spp.) erhölls från en kommersiell leverantör (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) och placerades i en temperaturkontrollerad (4 °C) luftad tank innehållande 10–20 liter 32‰ artificiell saltlake (artificiellt havssalt, Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). För varje experiment mättes längden och vikten på de enskilda skalen.
Ett gratis protokoll med öppen åtkomst för detta program finns tillgängligt online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kortfattat samlades LB-hemolymfa in från abduktormuskler enligt beskrivningen [22]. Hemolymfen klargjordes genom centrifugering vid 1200 × g i 3 minuter, supernatanten frystes (-20 °C) tills den skulle användas. För isolering och rening av cfDNA tinades prover (1,5-2,0 ml) och bearbetades med NucleoSnap cfDNA-kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) enligt tillverkarens instruktioner. ccfDNA förvarades vid -80 °C tills vidare analys. I vissa experiment isolerades och renades ccfDNA med QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Renat DNA kvantifierades med hjälp av en standard PicoGreen-analys. Fragmentfördelningen av det isolerade ccfDNA:t analyserades med kapillärelektrofores med användning av en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) med ett High Sensitivity DNA Kit. Analysen utfördes med 1 µl av ccfDNA-provet enligt tillverkarens instruktioner.
För sekvensering av hemolymf-ccfDNA-fragment framställde Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) shotgun-bibliotek med hjälp av Illumina DNA Mix-kitet från Illumina MiSeq PE75-kitet. En standardadapter (BioO) användes. Rådatafiler finns tillgängliga från NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 och SRR8924809). Grundläggande avläsningskvalitet bedömdes med FastQC [23]. Trimmomatic [24] har använts för klippadaptrar och avläsningar av dålig kvalitet. Shotgun-avläsningar med parade ändar FLASH-sammanfogades till längre enskilda avläsningar med en minsta överlappning på 20 bp för att undvika missmatchningar [25]. Sammanslagna avläsningar annoterades med BLASTN med hjälp av en NCBI-taxonomidatabas för musslor (e-värde < 1e−3 och 90 % homologi), och maskering av lågkomplexa sekvenser utfördes med DUST [26]. Sammanslagna avläsningar annoterades med BLASTN med hjälp av en NCBI-taxonomidatabas för musslor (e-värde < 1e−3 och 90 % homologi), och maskering av lågkomplexa sekvenser utfördes med DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии BINCOVE BINCOVER (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельном с ис. Poolade avläsningar annoterades med BLASTN med hjälp av NCBI:s databas för musslor (e-värde < 1e-3 och 90 % homologi), och sekvensmaskering med låg komplexitet utfördes med DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的輯幕，2]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輽濹 2 ，进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двусков (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнель с исп6] с. Poolade avläsningar annoterades med BLASTN med hjälp av NCBI:s taxonomiska databas för musslor (e-värde <1e-3 och 90 % homologi), och sekvensmaskering med låg komplexitet utfördes med DUST [26].Avläsningarna delades in i två grupper: relaterade till musslornas sekvenser (här kallade självläsningar) och orelaterade (icke-självläsningar). Två grupper sattes ihop separat med hjälp av MEGAHIT för att generera contigs [27]. Samtidigt klassificerades den taxonomiska fördelningen av avläsningar av främmande mikrobiom med hjälp av Kraken2 [28] och representerades grafiskt med ett Krona-cirkeldiagram på Galaxy [29, 30]. De optimala kmererna bestämdes till att vara kmer-59 från våra preliminära experiment. Självkontiger identifierades sedan genom anpassning med BLASTN (tvåskaliga NCBI-databas, e-värde < 1e−10 och 60 % homologi) för en slutlig annotering. Självkontiger identifierades sedan genom anpassning med BLASTN (tvåskaliga NCBI-databas, e-värde < 1e−10 och 60 % homologi) för en slutlig annotering. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатлых, скечен мовече <1e-10 och гомология 60%) för окончательной аннотации. Självkontiger identifierades sedan genom matchning mot BLASTN (NCBI:s databas för musslor, e-värde <1e-10 och 60 % homologi) för slutlig annotering.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги för окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (бназыдания с BLASTN) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 och гомология 60%). Självkontiger identifierades sedan för slutlig annotering genom matchning mot BLASTN (NCBI:s databas för musslor, e-värde <1e-10 och 60 % homologi). Parallellt annoterades icke-självgruppscontigs med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde < 1e−10 och 60 % homologi). Parallellt annoterades icke-självgruppscontigs med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde < 1e−10 och 60 % homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (för dagen NCBI, den 1 januari 10 januari 60 %). Parallellt annoterades främmande gruppcontigs med BLASTN (NT NCBI-databas, e-värde <1e-10 och 60 % homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重倠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重倠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныNC) <1e-10 och гомология 60 %). Parallellt annoterades icke-självgruppscontigs med BLASTN (nt NCBI-databas, e-värde <1e-10 och 60 % homologi). BLASTX utfördes även på icke-självkontiger med hjälp av nr- och RefSeq-protein-NCBI-databaserna (e-värde < 1e−10 och 60 % homologi). BLASTX utfördes även på icke-självkontiger med hjälp av nr- och RefSeq-protein-NCBI-databaserna (e-värde < 1e−10 och 60 % homologi). BLASTX är tillgängligt för несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr och RefSeq NCBI (egna <1e-0 e. гомология 60 %). BLASTX utfördes även på icke-självkontiger med hjälp av proteindatabaserna nr och RefSeq NCBI (e-värde < 1e-10 och 60 % homologi).nrnr BLASTX tакже выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr och RefSeq NCBI (sedan <1e-1 гомология 60 %). BLASTX utfördes även på icke-självkontiger med hjälp av proteindatabaserna nr och RefSeq NCBI (e-värde <1e-10 och 60 % homologi).BLASTN- och BLASTX-poolerna av icke-självkontiger representerar de slutliga kontigerna (se kompletterande fil).
Primers som användes för PCR listas i tabell S1. Taq DNA-polymeras (Bio Basic Canada, Markham, ON) användes för att amplifiera ccfDNA-målgenerna. Följande reaktionsbetingelser användes: denaturering vid 95 °C i 3 minuter, 95 °C i 1 minut, inställd annealingtemperatur i 1 minut, förlängning vid 72 °C i 1 minut, 35 cykler och slutligen 72 °C inom 10 minuter. PCR-produkterna separerades genom elektrofores i agarosgeler (1,5 %) innehållande SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) vid 95 V.
Musslor (Mytilus spp.) acklimatiserades i 500 ml syresatt havsvatten (32 PSU) i 24 timmar vid 4°C. Plasmid-DNA innehållande en insats som kodar för den humana galectin-7 cDNA-sekvensen (NCBI-accessionsnummer L07769) tillsattes till ampullen vid en slutlig koncentration av 190 μg/μl. Musslor inkuberade under samma förhållanden utan DNA-tillsats utgjorde kontrollen. Den tredje kontrolltanken innehöll DNA utan musslor. För att övervaka DNA-kvaliteten i havsvatten togs havsvattenprover (20 μl; tre repetitioner) från varje tank vid den angivna tiden. För spårbarhet av plasmid-DNA skördades LB-musslor vid de angivna tidpunkterna och analyserades med qPCR och ddPCR. På grund av havsvattnets höga salthalt späddes alikvoter i vatten av PCR-kvalitet (1:10) före alla PCR-analyser.
Digital dropp-PCR (ddPCR) utfördes med BioRad QX200-protokollet (Mississauga, Ontario, Kanada). Använd temperaturprofilen för att bestämma den optimala temperaturen (tabell S1). Dropparna genererades med en QX200 droppgenerator (BioRad). ddPCR utfördes enligt följande: 95 °C i 5 minuter, 50 cykler vid 95 °C i 30 sekunder och en given glödgningstemperatur i 1 minut och 72 °C i 30 sekunder, 4 °C i 5 minuter och 90 °C inom 5 minuter. Antalet droppar och positiva reaktioner (antal kopior/µl) mättes med en QX200 droppläsare (BioRad). Prover med färre än 10 000 droppar kasserades. Mönsterkontroll utfördes inte varje gång ddPCR kördes.
qPCR utfördes med Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) och LGALS7-specifika primers. Alla kvantitativa PCR:er utfördes i 20 µl med QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR startades med 15 minuters inkubation vid 95 °C följt av 40 cykler vid 95 °C i 10 sekunder och vid 60 °C i 60 sekunder med en datainsamling. Smältkurvor genererades med successiva mätningar vid 95 °C i 5 sekunder, 65 °C i 60 sekunder och 97 °C i slutet av qPCR:n. Varje qPCR utfördes i triplikat, förutom för kontrollproverna.
Eftersom musslor är kända för sin höga filtreringshastighet undersökte vi först om de kunde filtrera och behålla DNA-fragment som finns i havsvatten. Vi var också intresserade av om dessa fragment ackumuleras i deras halvöppna lymfsystem. Vi löste detta problem experimentellt genom att spåra ödet för lösliga DNA-fragment som tillsattes till blåmussladekar. För att underlätta spårning av DNA-fragment använde vi främmande (inte själv-) plasmid-DNA innehållande den humana galectin-7-genen. ddPCR spårar plasmid-DNA-fragment i havsvatten och musslor. Våra resultat visar att om mängden DNA-fragment i havsvatten förblev relativt konstant över tid (upp till 7 dagar) i frånvaro av musslor, så försvann denna nivå nästan helt inom 8 timmar i närvaro av musslor (Fig. 1a, b). Fragment av exogent DNA detekterades lätt inom 15 minuter i intravalvulär vätska och hemolymfa (Fig. 1c). Dessa fragment kunde fortfarande detekteras upp till 4 timmar efter exponering. Denna filtreringsaktivitet med avseende på DNA-fragment är jämförbar med filtreringsaktiviteten hos bakterier och alger [31]. Dessa resultat tyder på att musslor kan filtrera och ackumulera främmande DNA i sina vätskekompartments.
Relativa koncentrationer av plasmid-DNA i havsvatten i närvaro (A) eller frånvaro (B) av musslor, mätt med ddPCR. I A uttrycks resultaten som procentandelar, där rutornas kanter representerar 75:e och 25:e percentilen. Den anpassade logaritmiska kurvan visas i rött, och det gråskuggade området representerar 95 % konfidensintervallet. I B representerar den röda linjen medelvärdet och den blå linjen representerar 95 % konfidensintervallet för koncentrationen. C Ackumulering av plasmid-DNA i hemolymfen och klaffvätskan hos musslor vid olika tidpunkter efter tillsats av plasmid-DNA. Resultaten presenteras som absoluta kopior detekterade/ml (±SE).
Därefter undersökte vi ursprunget till ccfDNA i musslor insamlade från musselbankar på Kerguelenöarna, en avlägsen ögrupp med begränsad antropogen påverkan. För detta ändamål isolerades och renades cccDNA från musslors hemolymfer med metoder som vanligtvis används för att rena mänskligt cccDNA [32, 33]. Vi fann att genomsnittliga koncentrationer av hemolymf-ccfDNA i musslor ligger i det låga intervallet av mikrogram per ml hemolymf (se tabell S2, kompletterande information). Detta koncentrationsintervall är mycket större än hos friska personer (låga nanogram per milliliter), men i sällsynta fall, hos cancerpatienter, kan nivån av ccfDNA nå flera mikrogram per milliliter [34, 35]. En analys av storleksfördelningen av hemolymf-ccfDNA visade att dessa fragment varierar kraftigt i storlek, från 1000 bp till 1000 bp upp till 5000 bp (fig. 2). Liknande resultat erhölls med hjälp av det kiseldioxidbaserade QIAamp Investigator Kit, en metod som vanligtvis används inom forensisk vetenskap för att snabbt isolera och rena genomiskt DNA från DNA-prover med låg koncentration, inklusive ccfDNA [36].
Representativt ccfDNA-elektroforegram av musslors hemolymf. Extraherat med NucleoSnap Plasma Kit (överst) och QIAamp DNA Investigator Kit. B Fioldiagram som visar fördelningen av hemolymf-ccfDNA-koncentrationer (±SE) i musslor. De svarta och röda linjerna representerar medianen respektive den första och tredje kvartilen.
Ungefär 1 % av ccfDNA hos människor och primater har en främmande källa [21, 37]. Med tanke på det halvöppna cirkulationssystem som finns hos musslor, mikrobiellt rikt havsvatten och storleksfördelningen hos musslors ccfDNA, antog vi att musslors hemolymf-ccfDNA kan innehålla en rik och varierad pool av mikrobiellt DNA. För att testa denna hypotes sekvenserade vi hemolymf-ccfDNA från Aulacomya atra-prover insamlade från Kerguelenöarna, vilket gav över 10 miljoner avläsningar, varav 97,6 % klarade kvalitetskontrollen. Avläsningarna klassificerades sedan enligt egna och icke-självkällor med hjälp av BLASTN- och NCBI-databaserna för musslor (Fig. S1, kompletterande information).
Hos människor kan både kärn- och mitokondriellt DNA frigöras i blodomloppet [38]. I den aktuella studien var det dock inte möjligt att i detalj beskriva musslornas kärngenomiska DNA, eftersom A. atra-genomet inte har sekvenserats eller beskrivits. Vi kunde dock identifiera ett antal ccfDNA-fragment av vårt eget ursprung med hjälp av musslebiblioteket (Fig. S2, kompletterande information). Vi bekräftade också närvaron av DNA-fragment av vårt eget ursprung genom riktad PCR-amplifiering av de A. atra-gener som sekvenserades (Fig. 3). På liknande sätt, med tanke på att A. atras mitokondriella genom är tillgängligt i offentliga databaser, kan man hitta bevis för närvaron av mitokondriella ccfDNA-fragment i hemolymfen hos A. atra. Närvaron av mitokondriella DNA-fragment bekräftades genom PCR-amplifiering (Fig. 3).
Olika mitokondriella gener fanns i hemolymfan hos A. atra (röda prickar – lagernummer: SRX5705969) och M. platensis (blå prickar – lagernummer: SRX5705968) amplifierade med PCR. Figur anpassad från Breton et al., 2011 B Amplifiering av hemolymfsupernatant från A. atra Förvaras på FTA-papper. Använd en 3 mm stans för att tillsätta direkt till PCR-röret som innehåller PCR-blandningen.
Med tanke på det rikliga mikrobiella innehållet i havsvatten fokuserade vi initialt på karakterisering av mikrobiella DNA-sekvenser i hemolymfa. För att göra detta använder vi två olika strategier. Den första strategin använde Kraken2, ett algoritmbaserat sekvensklassificeringsprogram som kan identifiera mikrobiella sekvenser med en noggrannhet jämförbar med BLAST och andra verktyg [28]. Mer än 6719 avläsningar fastställdes vara av bakteriellt ursprung, medan 124 och 64 kom från arkéer respektive virus (Fig. 4). De vanligaste bakteriella DNA-fragmenten var Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) och Bacteroidetes (17 %) (Fig. 4a). Denna fördelning överensstämmer med tidigare studier av den marina blåmusslans mikrobiom [39, 40]. Gammaproteobakterier var huvudklassen av Proteobacteria (44 %), inklusive många Vibrionales (Fig. 4b). ddPCR-metoden bekräftade närvaron av Vibrio-DNA-fragment i ccfDNA hos A. atra-hemolymfen (Fig. 4c) [41]. För att få mer information om ccfDNA:ts bakteriella ursprung användes en ytterligare metod (Fig. S2, kompletterande information). I detta fall sammanställdes avläsningar som överlappade varandra som parade avläsningar och klassificerades som av själv- (musslor) eller icke-själv-ursprung med hjälp av BLASTN och ett e-värde på 1e−3 och en gränsvärde med >90 % homologi. I detta fall sammanställdes avläsningar som överlappade varandra som parade avläsningar och klassificerades som av själv- (musslor) eller icke-själv-ursprung med hjälp av BLASTN och ett e-värde på 1e−3 och en gränsvärde med >90 % homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были класиксиов (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения > 0%. I detta fall samlades överlappande avläsningar in som parade avläsningar och klassificerades som nativa (musslor) eller icke-ursprungliga med hjälp av BLASTN och e-värde på 1e-3 och gränsvärde med >90 % homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和和叠3 皒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使焚 使焚 的 焚 的 皌值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN och 1e-3 и погог 0%. I detta fall samlades överlappande avläsningar in som parade avläsningar och klassificerades som egna (musslor) eller icke-ursprungliga med hjälp av e-BLASTN- och 1e-3-värden och en homologitröskel >90 %.Eftersom A. atra-genomet ännu inte har sekvenserats, använde vi de novo-assembleringsstrategin från MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assemblern. Totalt 147 188 contigs har identifierats som beroende (musslor) av ursprung. Dessa contigs sekvenserades sedan med e-värden på 1e-10 med hjälp av BLASTN och BLASTX. Denna strategi gjorde det möjligt för oss att identifiera 482 icke-musslor som finns i A. atra ccfDNA. Mer än hälften (57 %) av dessa DNA-fragment erhölls från bakterier, huvudsakligen från gälsymbionter, inklusive sulfotrofa symbionter, och från gälsymbionterna Solemya velum (Fig. 5).
Relativ förekomst på typnivå. B Mikrobiell mångfald hos två huvudliga fyla (Firmicutes och Proteobacteria). Representativ amplifiering av ddPCR C Vibrio spp. A. Fragment av 16S rRNA-genen (blå) i tre atrahemolymfer.
Totalt 482 insamlade contigs analyserades. Allmän profil av den taxonomiska fördelningen av metagenomiska contig-annoteringar (prokaryoter och eukaryoter). B Detaljerad distribution av bakteriella DNA-fragment identifierade med BLASTN och BLASTX.
Kraken2-analys visade också att musslornas ccfDNA innehöll arkeologiska DNA-fragment, inklusive DNA-fragment från Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) och Thaurmarcheota (11 %) (Fig. 6a). Förekomsten av DNA-fragment härledda från Euryarchaeota och Crenarchaeota, som tidigare hittats i det mikrobiella samhället av kaliforniska musslor, borde inte komma som någon överraskning [42]. Även om Euryarchaeota ofta förknippas med extrema förhållanden, är det nu erkänt att både Euryarchaeota och Crenarcheota är bland de vanligaste prokaryoterna i den marina kryogena miljön [43, 44]. Förekomsten av metanogena mikroorganismer i musslor är inte förvånande, med tanke på de senaste rapporterna om omfattande metanläckor från bottenläckor på Kerguelenplatån [45] och möjlig mikrobiell metanproduktion observerad utanför Kerguelenöarnas kust [46].
Vår uppmärksamhet riktades sedan mot avläsningar från DNA-virus. Så vitt vi vet är detta den första studien utanför målgruppen av virusinnehållet i musslor. Som förväntat fann vi DNA-fragment från bakteriofager (Caudovirales) (Fig. 6b). Det vanligaste virala DNA:t kommer dock från en stam av nukleocytovirus, även känt som det nukleära cytoplasmatiska stora DNA-viruset (NCLDV), som har det största genomet av alla virus. Inom denna stam tillhör de flesta DNA-sekvenserna familjerna Mimimidoviridae (58 %) och Poxviridae (21 %), vars naturliga värdar inkluderar ryggradsdjur och leddjur, medan en liten andel av dessa DNA-sekvenser tillhör kända virologiska alger. Infekterar marina eukaryota alger. Sekvenserna erhölls också från Pandora-viruset, det jättevirus med den största genomstorleken av alla kända virussläkten. Intressant nog var utbudet av värdar som är kända för att vara infekterade med viruset, bestämt genom hemolymf-ccfDNA-sekvensering, relativt stort (Figur S3, kompletterande information). Det inkluderar virus som infekterar insekter som Baculoviridae och Iridoviridae, såväl som virus som infekterar amöbor, alger och ryggradsdjur. Vi hittade också sekvenser som matchar Pithovirus sibericum-genomet. Pitovirus (även kända som "zombievirus") isolerades först från 30 000 år gammal permafrost i Sibirien [47]. Således överensstämmer våra resultat med tidigare rapporter som visar att inte alla moderna arter av dessa virus är utdöda [48] och att dessa virus kan finnas i avlägsna subarktiska marina ekosystem.
Slutligen testade vi om vi kunde hitta DNA-fragment från andra flercelliga djur. Totalt 482 främmande contigs identifierades av BLASTN och BLASTX med nt-, nr- och RefSeq-bibliotek (genomiska och proteiniska). Våra resultat visar att bland de främmande fragmenten av ccfDNA från flercelliga djur dominerar DNA från beniga ben (Fig. 5). DNA-fragment från insekter och andra arter har också hittats. En relativt stor del av DNA-fragmenten har inte identifierats, möjligen på grund av underrepresentationen av ett stort antal marina arter i genomiska databaser jämfört med landlevande arter [49].
I denna artikel tillämpar vi LB-konceptet på musslor och argumenterar för att ccfDNA-sekvensering av hemolymfen kan ge insikt i sammansättningen av marina kustekosystem. I synnerhet fann vi att 1) ​​musslors hemolymfa innehåller relativt höga koncentrationer (mikrogramnivåer) av relativt stora (~1-5 kb) cirkulerande DNA-fragment; 2) dessa DNA-fragment är både oberoende och icke-oberoende; 3) Bland de främmande källorna till dessa DNA-fragment fann vi bakteriellt, arkealt och viralt DNA, såväl som DNA från andra flercelliga djur; 4) Ackumuleringen av dessa främmande ccfDNA-fragment i hemolymfen sker snabbt och bidrar till musslornas interna filtreringsaktivitet. Sammanfattningsvis visar vår studie att LB-konceptet, som hittills huvudsakligen har tillämpats inom biomedicin, kodar för en rik men outforskad kunskapskälla som kan användas för att bättre förstå interaktionen mellan sentinelarter och deras omgivning.
Förutom primater har ccfDNA-isolering rapporterats hos däggdjur, inklusive möss, hundar, katter och hästar [50, 51, 52]. Men såvitt vi vet är vår studie den första som rapporterar detektion och sekvensering av ccfDNA hos marina arter med ett öppet cirkulationssystem. Denna anatomiska egenskap och filtreringsförmåga hos musslor kan, åtminstone delvis, förklara de olika storleksegenskaperna hos cirkulerande DNA-fragment jämfört med andra arter. Hos människor är de flesta DNA-fragment som cirkulerar i blodet små fragment som varierar i storlek från 150 till 200 bp, med en maximal topp på 167 bp [34, 53]. En liten men betydande del av DNA-fragmenten är mellan 300 och 500 bp stora, och cirka 5 % är längre än 900 bp [54]. Anledningen till denna storleksfördelning är att den huvudsakliga källan till ccfDNA i plasma sker som ett resultat av celldöd, antingen på grund av celldöd eller på grund av nekros av cirkulerande hematopoetiska celler hos friska individer eller på grund av apoptos av tumörceller hos cancerpatienter (känt som cirkulerande tumör-DNA, ctDNA). Storleksfördelningen av hemolymf-ccfDNA som vi fann i musslor varierade från 1000 till 5000 bp, vilket tyder på att musslors ccfDNA har ett annat ursprung. Detta är en logisk hypotes, eftersom musslor har ett halvöppet kärlsystem och lever i marina vattenmiljöer som innehåller höga koncentrationer av mikrobiellt genomiskt DNA. Faktum är att våra laboratorieexperiment med exogent DNA har visat att musslor ackumulerar DNA-fragment i havsvatten, åtminstone efter några timmar bryts de ner efter cellulärt upptag och/eller frigörs och/eller lagras i olika organisationer. Med tanke på cellernas sällsynthet (både prokaryota och eukaryota) kommer användningen av intravalvulära kompartment att minska mängden ccfDNA från egna källor såväl som från främmande källor. Med tanke på vikten av medfödd immunitet hos musslor och det stora antalet cirkulerande fagocyter, antog vi vidare att även främmande ccfDNA är anrikat med cirkulerande fagocyter som ackumulerar främmande DNA vid intag av mikroorganismer och/eller cellulära skräp. Sammantaget visar våra resultat att ccfDNA från hemolymfen hos musslor är ett unikt arkiv för molekylär information och förstärker deras status som en sentinelart.
Våra data indikerar att sekvensering och analys av bakteriellt härledda hemolymf-ccfDNA-fragment kan ge viktig information om värdens bakterieflora och de bakterier som finns i det omgivande marina ekosystemet. Shot-sekvenseringstekniker har avslöjat sekvenser av den kommensala bakterien A. atra gill som skulle ha missats om konventionella 16S rRNA-identifieringsmetoder hade använts, delvis på grund av en referensbiblioteksbias. Faktum är att vår användning av LB-data insamlade från M. platensis i samma mussellager vid Kerguelen visade att sammansättningen av gälassocierade bakteriella symbionter var densamma för båda musslorterna (Fig. S4, kompletterande information). Denna likhet mellan två genetiskt olika musslor kan återspegla sammansättningen av bakteriesamhällen i de kalla, svavelhaltiga och vulkaniska avlagringarna i Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Högre nivåer av svavelreducerande mikroorganismer har beskrivits väl vid skörd av musslor från bioturberade kustområden [59], såsom kusten i Port-au-France. En annan möjlighet är att musslornas flora kan påverkas av horisontell smittspridning [60, 61]. Mer forskning behövs för att fastställa sambandet mellan den marina miljön, havsbottenytan och sammansättningen av symbiotiska bakterier i musslor. Dessa studier pågår för närvarande.
Längden och koncentrationen av hemolymf-ccfDNA, dess enkla rening och höga kvalitet för att möjliggöra snabb shotgun-sekvensering är några av de många fördelarna med att använda musslors ccfDNA för att bedöma biologisk mångfald i marina kustekosystem. Denna metod är särskilt effektiv för att karakterisera virussamhällen (viromer) i ett givet ekosystem [62, 63]. Till skillnad från bakterier, arkéer och eukaryoter innehåller virusgenom inte fylogenetiskt konserverade gener såsom 16S-sekvenser. Våra resultat indikerar att flytande biopsier från indikatorarter som musslor kan användas för att identifiera relativt stora antal ccfDNA-virusfragment som är kända för att infektera värddjur som vanligtvis bebor kustnära marina ekosystem. Detta inkluderar virus som är kända för att infektera protozoer, leddjur, insekter, växter och bakterievirus (t.ex. bakteriofager). En liknande fördelning hittades när vi undersökte hemolymf-ccfDNA-viromet hos blåmusslor (M. platensis) insamlade i samma musslelager vid Kerguelen (tabell S2, kompletterande information). Hagelgevärssekvensering av ccfDNA är verkligen en ny metod som vinner fart i studiet av viromet hos människor eller andra arter [21, 37, 64]. Denna metod är särskilt användbar för att studera dubbelsträngade DNA-virus, eftersom ingen enskild gen är bevarad bland alla dubbelsträngade DNA-virus, vilket representerar den mest mångsidiga och breda klassen av virus i Baltimore [65]. Även om de flesta av dessa virus förblir oklassificerade och kan inkludera virus från en helt okänd del av virusvärlden [66], fann vi att viromen och värdområdena för musslorna A. atra och M. platensis faller mellan de två arterna på liknande sätt (se figur S3, ytterligare information). Denna likhet är inte förvånande, eftersom den kan återspegla en bristande selektivitet i upptaget av DNA som finns i miljön. Framtida studier med renat RNA behövs för att karakterisera RNA-viromet.
I vår studie använde vi en mycket rigorös pipeline anpassad från Kowarski och kollegors [37] arbete, som använde en tvåstegsdeletion av poolade avläsningar och contigs före och efter sammansättning av nativt ccfDNA, vilket resulterade i en hög andel omappade avläsningar. Därför kan vi inte utesluta att vissa av dessa omappade avläsningar fortfarande kan ha sitt eget ursprung, främst för att vi inte har ett referensgenom för denna musslart. Vi använde också denna pipeline eftersom vi var oroade över chimärerna mellan själv- och icke-självläsningar och de avläsningslängder som genereras av Illumina MiSeq PE75. En annan anledning till majoriteten av okarterade avläsningar är att många av de marina mikroberna, särskilt i avlägsna områden som Kerguelen, inte har annoterats. Vi använde Illumina MiSeq PE75, under antagandet att ccfDNA-fragmentlängder liknar mänskligt ccfDNA. För framtida studier, med tanke på våra resultat som visar att hemolymf-ccfDNA har längre avläsningar än människors och/eller däggdjurs, rekommenderar vi att man använder en sekvenseringsplattform som är mer lämpad för längre ccfDNA-fragment. Denna metod kommer att göra det mycket enklare att identifiera fler indikationer för djupare analys. Att erhålla den för närvarande otillgängliga kompletta A. atra-kärngenomsekvensen skulle också avsevärt underlätta åtskillnaden av ccfDNA från egna och icke-självkällor. Med tanke på att vår forskning har fokuserat på möjligheten att tillämpa konceptet flytande biopsi på musslor, hoppas vi att när detta koncept används i framtida forskning, kommer nya verktyg och pipelines att utvecklas för att öka potentialen för denna metod för att studera den mikrobiella mångfalden hos musslor i det marina ekosystemet.
Som en icke-invasiv klinisk biomarkör är förhöjda nivåer av ccfDNA i mänsklig plasma associerade med olika sjukdomar, vävnadsskador och stressförhållanden [67,68,69]. Denna ökning är förknippad med frisättning av DNA-fragment av eget ursprung efter vävnadsskada. Vi undersökte detta problem med hjälp av akut värmestress, där musslor kortvarigt exponerades för en temperatur på 30 °C. Vi utförde denna analys på tre olika typer av musslor i tre oberoende experiment. Vi fann dock ingen förändring i ccfDNA-nivåer efter akut värmestress (se figur S5, ytterligare information). Denna upptäckt kan åtminstone delvis förklara det faktum att musslor har ett halvöppet cirkulationssystem och ackumulerar stora mängder främmande DNA på grund av sin höga filtreringsaktivitet. Å andra sidan kan musslor, liksom många ryggradslösa djur, vara mer resistenta mot stressinducerad vävnadsskada, vilket begränsar frisättningen av ccfDNA i deras hemolymf [70, 71].
Hittills har DNA-analys av biologisk mångfald i akvatiska ekosystem huvudsakligen fokuserat på metastreckkodning av miljö-DNA (eDNA). Denna metod är dock vanligtvis begränsad vid analys av biologisk mångfald när primers används. Användningen av shotgun-sekvensering kringgår begränsningarna hos PCR och det snedvridna urvalet av primeruppsättningar. Således ligger vår metod på sätt och vis närmare den nyligen använda högkapacitetsmetoden eDNA Shotgun-sekvensering, som kan direkt sekvensera fragmenterat DNA och analysera nästan alla organismer [72, 73]. Det finns dock ett antal grundläggande problem som skiljer LB från vanliga eDNA-metoder. Naturligtvis är den största skillnaden mellan eDNA och LB användningen av naturliga filtervärdar. Användningen av marina arter som svampar och musslor (Dresseina spp.) som ett naturligt filter för att studera eDNA har rapporterats [74, 75]. Dreissenas studie använde dock vävnadsbiopsier från vilka DNA extraherades. Analys av ccfDNA från LB kräver inte vävnadsbiopsi, specialiserad och ibland dyr utrustning och logistik i samband med eDNA eller vävnadsbiopsi. Vi rapporterade faktiskt nyligen att ccfDNA från LB kan lagras och analyseras med FTA-stöd utan att upprätthålla en kylkedja, vilket är en stor utmaning för forskning i avlägsna områden [76]. Extraktionen av ccfDNA från flytande biopsier är också enkel och ger högkvalitativt DNA för shotgun-sekvensering och PCR-analys. Detta är en stor fördel med tanke på några av de tekniska begränsningarna som är förknippade med eDNA-analys [77]. Enkelheten och den låga kostnaden för provtagningsmetoden är också särskilt lämplig för långsiktiga övervakningsprogram. Förutom deras höga filtreringsförmåga är en annan välkänd egenskap hos musslor den kemiska mukopolysackaridsammansättningen i deras slem, vilket främjar absorptionen av virus [78, 79]. Detta gör musslor till ett idealiskt naturligt filter för att karakterisera biologisk mångfald och effekterna av klimatförändringar i ett givet akvatisk ekosystem. Även om förekomsten av värd-härledda DNA-fragment kan ses som en begränsning av metoden jämfört med eDNA, är kostnaden för att ha ett sådant nativt ccfDNA jämfört med eDNA samtidigt förståelig med tanke på den stora mängd information som finns tillgänglig för hälsostudier som kompenserar värd. Detta inkluderar närvaron av virala sekvenser integrerade i värdens genom. Detta är särskilt viktigt för musslor, med tanke på förekomsten av horisontellt överförda leukemiska retrovirus hos musslor [80, 81]. En annan fördel med LB jämfört med eDNA är att det utnyttjar den fagocytiska aktiviteten hos cirkulerande blodkroppar i hemolymfen, som uppslukar mikroorganismer (och deras genom). Fagocytos är blodkropparnas huvudfunktion hos musslor [82]. Slutligen utnyttjar metoden musslornas höga filtreringskapacitet (i genomsnitt 1,5 l/h havsvatten) och tvådagarscirkulationen, vilket ökar blandningen av olika lager av havsvatten, vilket möjliggör infångning av heterologt eDNA. [83, 84]. Således är ccfDNA-analys av musslor en intressant väg med tanke på musslornas näringsmässiga, ekonomiska och miljömässiga effekter. I likhet med analysen av LB insamlat från människor öppnar denna metod också upp möjligheten att mäta genetiska och epigenetiska förändringar i värd-DNA som svar på exogena ämnen. Till exempel kan tredje generationens sekvenseringstekniker tänkas utföra genomomfattande metyleringsanalys i nativt ccfDNA med hjälp av nanoporsekvensering. Denna process bör underlättas av det faktum att längden på musslornas ccfDNA-fragment är idealiskt kompatibel med Long-read-sekvenseringsplattformar som möjliggör genomomfattande DNA-metyleringsanalys från en enda sekvenseringskörning utan behov av kemiska transformationer.85,86] Detta är en intressant möjlighet, eftersom det har visats att DNA-metyleringsmönster återspeglar ett svar på miljöstress och kvarstår över många generationer. Därför kan det ge värdefull insikt i de underliggande mekanismerna som styr svaret efter exponering för klimatförändringar eller föroreningar [87]. Användningen av LB är dock inte utan begränsningar. Naturligtvis kräver detta närvaron av indikatorarter i ekosystemet. Som nämnts ovan kräver användning av LB för att bedöma den biologiska mångfalden i ett givet ekosystem också en rigorös bioinformatisk pipeline som tar hänsyn till närvaron av DNA-fragment från källan. Ett annat stort problem är tillgången på referensgenom för marina arter. Det är förhoppningsfullt att initiativ som Marine Mammal Genomes Project och det nyligen etablerade Fish10k-projektet [88] kommer att underlätta sådan analys i framtiden. Tillämpningen av LB-konceptet på marina filterätande organismer är också kompatibel med de senaste framstegen inom sekvenseringsteknik, vilket gör det väl lämpat för utveckling av multi-ohm biomarkörer för att ge viktig information om hälsan hos marina livsmiljöer som svar på miljöstress.
Data från genomsekvensering har deponerats i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimatförändringarnas inverkan på marint liv och ekosystem. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Överväg de kombinerade effekterna av klimatförändringar och andra lokala stressfaktorer på den marina miljön. allmän vetenskaplig miljö. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Vetenskap av den första mars. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Minskad värmetolerans under upprepade värmestressförhållanden förklarar den höga sommardödligheten hos blåmusslor. Vetenskaplig rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Nyligen genomförda förändringar i frekvensen, orsakerna och omfattningen av djurdödsfall. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Flera icke-artsspecifika patogener kan ha orsakat massdödlighet hos Pinna nobilis. Liv. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potentiell påverkan av klimatförändringar på zoonotiska sjukdomar i Arktis. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blåmusslor (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer vid övervakning av kustföroreningar: en översikt. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrering av flytande biopsi i cancerbehandling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Mognad av flytande biopsi: Tillåter tumör-DNA att cirkulera. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyror i human plasma. Mötesprotokoll för Soc Biols dotterbolag. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny roll för cellfritt DNA som en molekylär markör för cancerbehandling. Kvantifiering av biomolär analys. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flytande biopsi kommer in i kliniken – implementeringsproblem och framtida utmaningar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW m.fl. Foster-DNA finns i moderns plasma och serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie av graviditetsförloppet och dess komplikationer med hjälp av cirkulerande extracellulärt RNA i blodet hos kvinnor under graviditet. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Flytande biopsi: donatorcellfritt DNA används för att detektera allogena lesioner i ett njurtransplantat. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovationer inom prenatal diagnostik: genomsekvensering av maternell plasmagenom. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Snabb patogendetektering med nästa generations metagenomiska sekvensering av infekterade kroppsvätskor. Nat Medicine. 2021;27:115-24.