Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngarender situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Biopsi cair (LB) nyaéta konsép anu gancang populer di widang biomédis. Konsép ieu utamina dumasar kana deteksi fragmen DNA ékstrasélular anu ngider (ccfDNA), anu utamina dileupaskeun salaku fragmen leutik saatos maotna sél dina rupa-rupa jaringan. Sabagian leutik tina fragmen ieu asalna tina jaringan atanapi organisme asing (asing). Dina panilitian ayeuna, kami parantos nerapkeun konsép ieu kana remis, spésiés sentinel anu dikenal ku kapasitas filtrasi cai laut anu luhur. Kami nganggo kamampuan remis pikeun bertindak salaku filter alami pikeun néwak fragmen DNA lingkungan tina rupa-rupa sumber pikeun nyayogikeun inpormasi ngeunaan kaanekaragaman hayati ékosistem basisir laut. Hasil panilitian kami nunjukkeun yén hemolimf remis ngandung fragmen DNA anu ukuranana béda-béda, ti 1 dugi ka 5 kb. Sekuensing shotgun nunjukkeun yén sajumlah ageung fragmen DNA asalna tina mikroba asing. Di antarana, kami mendakan fragmen DNA tina baktéri, archaea, sareng virus, kalebet virus anu dipikanyaho ngainféksi rupa-rupa host anu umumna aya dina ékosistem laut basisir. Dina kacindekanana, panilitian kami nunjukkeun yén konsép LB anu diterapkeun kana remis ngagambarkeun sumber pangaweruh anu beunghar tapi tacan ditalungtik ngeunaan karagaman mikroba dina ékosistem basisir laut.
Dampak parobahan iklim (CC) kana kaanekaragaman hayati ékosistem laut mangrupikeun widang panalungtikan anu gancang berkembang. Pemanasan global henteu ngan ukur nyababkeun setrés fisiologis anu penting, tapi ogé ngadorong wates évolusionér stabilitas termal organisme laut, mangaruhan habitat sababaraha spésiés, ngadorong aranjeunna milarian kaayaan anu langkung nguntungkeun [1, 2]. Salian ti mangaruhan kaanekaragaman hayati metazoa, CC ngaganggu kasaimbangan anu hipu tina interaksi host-mikroba. Disbakteriosis mikroba ieu mangrupikeun ancaman serius pikeun ékosistem laut sabab ngajantenkeun organisme laut langkung rentan ka patogén inféksi [3, 4]. Dipercaya yén SS maénkeun peran penting dina maotna massal, anu mangrupikeun masalah serius pikeun manajemen ékosistem laut global [5, 6]. Ieu mangrupikeun masalah penting kumargi dampak ékonomi, ékologis sareng nutrisi tina seueur spésiés laut. Ieu khususna leres pikeun bivalvia anu hirup di daérah kutub, dimana pangaruh CK langkung langsung sareng parah [6, 7]. Nyatana, bivalvia sapertos Mytilus spp. seueur dianggo pikeun ngawas pangaruh CC kana ékosistem laut. Teu anéh, sajumlah biomarker anu kawilang loba geus dimekarkeun pikeun ngawas kaséhatanana, mindeng ngagunakeun pendekatan dua tingkat anu ngalibetkeun biomarker fungsional dumasar kana aktivitas énzimatik atawa fungsi sélular saperti viabilitas sél jeung aktivitas fagositik [8]. Métode ieu ogé ngawengku pangukuran konsentrasi indikator tekanan spésifik anu akumulasi dina jaringan lemes sanggeus nyerep cai laut dina jumlah anu loba. Sanajan kitu, kapasitas filtrasi anu luhur jeung sistem sirkulasi semi-kabuka bivalvia nyadiakeun kasempetan pikeun ngembangkeun biomarker hemolimf anyar ngagunakeun konsép biopsi cair (LB), pendekatan anu basajan jeung minimal invasif pikeun manajemen pasien. sampel getih [9, 10]. Sanajan sababaraha jenis molekul sirkulasi bisa kapanggih dina LB manusa, konsép ieu utamana dumasar kana analisis sekuensing DNA tina fragmen DNA ekstrasélular sirkulasi (ccfDNA) dina plasma. Kanyataanna, ayana DNA sirkulasi dina plasma manusa geus dipikanyaho ti saprak pertengahan abad ka-20 [11], tapi ngan dina taun-taun ayeuna datangna métode sekuensing throughput tinggi geus ngarah kana diagnosis klinis dumasar kana ccfDNA. Ayana fragmen DNA anu ngider ieu sabagian disababkeun ku pelepasan pasif DNA genomik (nuklir sareng mitokondria) saatos maotna sél. Dina jalma anu séhat, konsentrasi ccfDNA biasana rendah (<10 ng/mL) tapi tiasa ningkat 5-10 kali lipat dina pasien anu kaserang rupa-rupa patologi atanapi kakeunaan setrés, anu nyababkeun karusakan jaringan. Dina jalma anu séhat, konsentrasi ccfDNA biasana rendah (<10 ng/mL) tapi tiasa ningkat 5-10 kali lipat dina pasien anu kaserang rupa-rupa patologi atanapi kakeunaan setrés, anu nyababkeun karusakan jaringan. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухльно патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Dina jalma anu séhat, konsentrasi cccDNA biasana rendah (<10 ng/mL), tapi tiasa ningkat 5-10 kali lipat dina pasien anu ngagaduhan rupa-rupa patologi atanapi dina kaayaan setrés anu nyababkeun karusakan jaringan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损会。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承受可 增加 5-10 ， 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз умлица патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Konsentrasi ccfDNA biasana rendah (<10 ng/ml) dina jalma anu séhat, tapi tiasa ningkat 5-10 kali lipat dina pasien anu ngagaduhan rupa-rupa patologi atanapi setrés, anu nyababkeun karusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA rupa-rupa pisan, tapi biasana antara 150 nepi ka 200 bp. [12]. Analisis ccfDNA anu diturunkeun sorangan, nyaéta ccfDNA tina sél inang normal atanapi anu dirobih, tiasa dianggo pikeun ngadeteksi parobahan genetik sareng epigenetik anu aya dina génom nuklir sareng/atanapi mitokondria, ku kituna ngabantosan dokter milih terapi anu ditujukeun sacara molekuler [13]. Nanging, ccfDNA tiasa diala tina sumber asing sapertos ccfDNA tina sél fétal nalika kakandungan atanapi tina organ anu dicangkokkeun [14,15,16,17]. ccfDNA ogé mangrupikeun sumber inpormasi anu penting pikeun ngadeteksi ayana asam nukléat tina agén inféksi (asing), anu ngamungkinkeun deteksi non-invasif tina inféksi anu nyebar anu henteu diidentipikasi ku kultur getih, nyingkahan biopsi invasif jaringan anu kainféksi [18]. Panilitian anyar parantos nunjukkeun yén getih manusa ngandung sumber inpormasi anu beunghar anu tiasa dianggo pikeun ngaidentipikasi patogén virus sareng baktéri, sareng sakitar 1% tina ccfDNA anu aya dina plasma manusa asalna ti luar negeri [19]. Panilitian ieu nunjukkeun yén kaanekaragaman hayati mikrobioma anu aya dina sirkulasi organisme tiasa dipeunteun nganggo analisis ccfDNA. Nanging, dugi ka ayeuna, konsép ieu dianggo sacara éksklusif dina manusa sareng, dina tingkat anu langkung alit, dina vertebrata sanésna [20, 21].
Dina tulisan ieu, urang nganggo poténsi LB pikeun nganalisis ccfDNA Aulacomya atra, spésiés kidul anu umumna kapanggih di Kapuloan Kerguelen subantartika, sakumpulan pulo di luhur dataran luhur anu kabentuk 35 juta taun ka tukang. letusan gunungapi. Ngagunakeun sistem ékspériméntal in vitro, urang mendakan yén fragmen DNA dina cai laut gancang dicandak ku remis sareng lebet kana kompartemen hemolimfa. Sekuensing shotgun parantos nunjukkeun yén hemolimfa remis ccfDNA ngandung fragmen DNA anu asalna sorangan sareng henteu mandiri, kalebet baktéri simbiotik sareng fragmen DNA tina bioma anu khas ékosistem basisir laut vulkanik tiis. Hemolimfa ccfDNA ogé ngandung sekuen virus anu diturunkeun tina virus kalayan rentang host anu béda. Urang ogé mendakan fragmen DNA tina sato multisélular sapertos lauk bertulang, anemon laut, ganggang sareng serangga. Dina kacindekanana, panilitian urang nunjukkeun yén konsép LB tiasa diterapkeun sacara suksés kana invertebrata laut pikeun ngahasilkeun repertoar génomik anu beunghar dina ékosistem laut.
Kerang dewasa (panjangna 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) sareng Aulacomya atra (A. atra) dikumpulkeun ti basisir batu intertidal Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .). Kapuloan Kerguelen dina bulan Désémber 2018. Kerang biru dewasa anu sanés (Mytilus spp.) diala ti supplier komérsial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) sareng disimpen dina tangki aerasi anu dikontrol suhu (4°C) anu ngandung 10–20 L cai uyah jieunan 32‰. (uyah laut jieunan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, AS). Pikeun unggal ékspérimén, panjang sareng beurat cangkang individu diukur.
Protokol aksés kabuka gratis pikeun program ieu sayogi online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Sacara singget, hemolimf LB dikumpulkeun tina otot abduktor sapertos anu dijelaskeun [22]. Hemolimf diklarifikasi ku cara sentrifugasi dina 1200 × g salami 3 menit, supernatan dibekukeun (-20 °C) dugi ka dianggo. Pikeun isolasi sareng purifikasi cfDNA, sampel (1,5-2,0 ml) dicairkeun sareng diprosés nganggo kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) numutkeun pitunjuk produsén. ccfDNA disimpen dina suhu -80 °C dugi ka dianalisis salajengna. Dina sababaraha ékspérimén, ccfDNA diisolasi sareng dimurnikeun nganggo Kit Investigator DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). DNA anu dimurnikeun diukur nganggo uji PicoGreen standar. Sebaran fragmen tina ccfDNA anu diisolasi dianalisis ku éléktroforésis kapiler nganggo bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) nganggo Kit DNA Sensitivity Tinggi. Uji ieu dilaksanakeun nganggo 1 µl sampel ccfDNA numutkeun pitunjuk produsén.
Pikeun ngurutkeun fragmen hemolimf ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) nyiapkeun pustaka shotgun nganggo kit Illumina DNA Mix tina kit Illumina MiSeq PE75. Adaptor standar (BioO) dianggo. File data atah sayogi tina Arsip Baca Sekuen NCBI (SRR8924808 sareng SRR8924809). Kualitas bacaan dasar ditaksir nganggo FastQC [23]. Trimmomatic [24] parantos dianggo pikeun motong adaptor sareng bacaan kualitas goréng. Bacaan shotgun kalayan tungtung anu dipasangkeun di FLASH digabungkeun kana bacaan tunggal anu langkung panjang kalayan tumpang tindih minimum 20 bp pikeun nyingkahan ketidakcocokan [25]. Bacaan anu digabungkeun dibéré anotasi ku BLASTN nganggo database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 sareng homologi 90%), sareng masking tina runtuyan kompléksitas rendah dilakukeun nganggo DUST [26]. Bacaan anu digabungkeun dibéré anotasi ku BLASTN nganggo database Taksonomi NCBI bivalvia (nilai e < 1e−3 sareng homologi 90%), sareng masking tina runtuyan kompléksitas rendah dilakukeun nganggo DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчозолзналюмих < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST []. Bacaan gabungan dianotasi ku BLASTN nganggo database taksonomi bivalvia NCBI (nilai e < 1e-3 sareng homologi 90%), sareng masking runtuyan kompleksitas rendah dilakukeun nganggo DUST [26].使用双壳类 NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，用数，年年进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 2 幨 ， 2进行 复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустволскмча (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с исполнено с использовий с [использовий]. Bacaan gabungan dianotasi ku BLASTN nganggo database taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e-3 sareng homologi 90%), sareng masking runtuyan kompleksitas rendah dilakukeun nganggo DUST [26].Bacaan dibagi kana dua kelompok: anu aya patalina jeung runtuyan bivalvia (di dieu disebut maca mandiri) jeung anu teu aya patalina (maca mandiri). Dua kelompok disusun sacara misah ngagunakeun MEGAHIT pikeun ngahasilkeun kontinyu [27]. Samentawis éta, distribusi taksonomi bacaan mikrobioma alien diklasifikasikeun ngagunakeun Kraken2 [28] jeung digambarkeun sacara grafis ku bagan pai Krona dina Galaxy [29, 30]. Kmer optimal ditangtukeun nyaéta kmer-59 tina ékspérimén awal urang. Kontinyu mandiri teras diidéntifikasi ku cara disejajarkeun sareng BLASTN (database NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%) pikeun anotasi akhir. Kontinyu mandiri teras diidéntifikasi ku cara disejajarkeun sareng BLASTN (database NCBI bivalvia, nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%) pikeun anotasi akhir. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1-0 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Kontigén mandiri teras diidéntifikasi ku cara cocogkeun sareng BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 sareng homologi 60%) pikeun anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал да NCBIн двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Kontigén mandiri teras diidéntifikasi pikeun anotasi ahir ku cara cocogkeun sareng BLASTN (database bivalvia NCBI, nilai e <1e-10 sareng homologi 60%). Sacara paralel, kontéks grup nonself dibéré anotasi ku BLASTN (database nt NCBI, nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%). Sacara paralel, kontéks grup nonself dibéré anotasi ku BLASTN (database nt NCBI, nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 м. Sacara paralel, kontinjén grup asing dibéré anotasi ku BLASTN (database NT NCBI, nilai e <1e-10 sareng homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных nt nt 1 гомология 60%). Sacara paralel, kontigén grup non-mandiri dibéré anotasi ku BLASTN (database nt NCBI, nilai e <1e-10 sareng homologi 60%). BLASTX ogé dilakukeun dina nonself contigs nganggo database nr sareng RefSeq protéin NCBI (nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%). BLASTX ogé dilakukeun dina nonself contigs nganggo database nr sareng RefSeq protéin NCBI (nilai e < 1e−10 sareng homologi 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значовие лиолет 6%)-10 e <1e. BLASTX ogé dilakukeun dina non-self contigs nganggo database protéin nr sareng RefSeq NCBI (nilai e < 1e-10 sareng homologi 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 怌 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 % BLASTX ogé dilakukeun dina non-self contigs nganggo database protéin nr sareng RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 sareng homologi 60%).Kumpulan BLASTN sareng BLASTX tina non-self-contigs ngagambarkeun contigs ahir (tingali file Tambahan).
Primer anu dianggo pikeun PCR didaptarkeun dina Tabel S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) dianggo pikeun ngamplipikasi gén target ccfDNA. Kaayaan réaksi ieu dianggo: denaturasi dina 95°C salami 3 menit, 95°C salami 1 menit, nyetel suhu annealing salami 1 menit, elongasi dina 72°C salami 1 menit, 35 siklus, sareng pamungkas 72°C dina 10 menit. . Produk PCR dipisahkeun ku éléktroforésis dina gél agarosa (1,5%) anu ngandung SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) dina 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi dina 500 ml cai laut anu dioksigénasi (32 PSU) salami 24 jam dina suhu 4°C. DNA plasmid anu ngandung sisipan anu ngodekeun runtuyan cDNA galectin-7 manusa (nomer aksési NCBI L07769) ditambahkeun kana vial dina konsentrasi ahir 190 μg/μl. Kerang anu diinkubasi dina kaayaan anu sami tanpa tambahan DNA mangrupikeun kontrol. Tangki kontrol katilu ngandung DNA tanpa kerang. Pikeun ngawas kualitas DNA dina cai laut, sampel cai laut (20 μl; tilu pangulangan) dicandak tina unggal tangki dina waktos anu dituduhkeun. Pikeun katerlacakan DNA plasmid, kerang LB dipanén dina waktos anu dituduhkeun sareng dianalisis ku qPCR sareng ddPCR. Kusabab kandungan uyah anu luhur dina cai laut, alikuot diéncérkeun dina cai kualitas PCR (1:10) sateuacan sadaya uji PCR.
PCR tetesan digital (ddPCR) dilaksanakeun nganggo protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Anggo profil suhu pikeun nangtukeun suhu optimal (Tabel S1). Tetesan dihasilkeun nganggo generator tetesan QX200 (BioRad). ddPCR dilaksanakeun sapertos kieu: 95°C salami 5 menit, 50 siklus 95°C salami 30 detik sareng suhu annealing anu ditangtukeun salami 1 menit sareng 72°C salami 30 detik, 4°C salami 5 menit sareng 90°C dina 5 menit. Jumlah tetesan sareng réaksi positip (jumlah salinan/µl) diukur nganggo pamaca tetesan QX200 (BioRad). Sampel anu kirang ti 10.000 tetesan ditolak. Kontrol pola henteu dilaksanakeun unggal ddPCR dijalankeun.
qPCR dilaksanakeun nganggo Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) sareng primer spésifik LGALS7. Sadaya PCR kuantitatif dilaksanakeun dina 20 µl nganggo QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR dimimitian ku inkubasi 15 menit dina suhu 95°C dituturkeun ku 40 siklus dina suhu 95°C salami 10 detik sareng dina suhu 60°C salami 60 detik kalayan hiji pangumpulan data. Kurva lebur dihasilkeun nganggo pangukuran berturut-turut dina suhu 95°C salami 5 detik, 65°C salami 60 detik, sareng 97°C dina ahir qPCR. Unggal qPCR dilaksanakeun dina rangkap tilu, kecuali sampel kontrol.
Kusabab remis dikenal ku laju filtrasi anu luhur, mimitina kami nalungtik naha aranjeunna tiasa nyaring sareng nahan fragmen DNA anu aya dina cai laut. Kami ogé resep kana naha fragmen ieu akumulasi dina sistem limfatik semi-kabuka. Kami ngarengsekeun masalah ieu sacara ékspériméntal ku cara ngalacak nasib fragmen DNA leyur anu ditambihkeun kana tangki remis biru. Pikeun ngagampangkeun ngalacak fragmen DNA, kami nganggo DNA plasmid asing (sanés mandiri) anu ngandung gén galectin-7 manusa. ddPCR ngalacak fragmen DNA plasmid dina cai laut sareng remis. Hasil kami nunjukkeun yén upami jumlah fragmen DNA dina cai laut tetep relatif konstan salami waktos (dugi ka 7 dinten) tanpa remis, maka dina ayana remis tingkat ieu ampir ngaleungit dina 8 jam (Gambar 1a, b). Fragmen DNA éksogén gampang dideteksi dina 15 menit dina cairan intravalvular sareng hemolimf (Gambar 1c). Fragmen ieu masih tiasa dideteksi dugi ka 4 jam saatos paparan. Aktivitas panyaringan ieu anu aya hubunganana sareng fragmen DNA tiasa dibandingkeun sareng aktivitas panyaringan baktéri sareng ganggang [31]. Hasil ieu nunjukkeun yén remis tiasa nyaring sareng ngumpulkeun DNA asing dina kompartemen cairanana.
Konsentrasi relatif DNA plasmid dina cai laut nalika aya (A) atanapi henteuna (B) remis, diukur ku ddPCR. Dina A, hasilna dikedalkeun salaku persentase, kalayan wates kotak ngawakilan persentil ka-75 sareng ka-25. Kurva logaritmik anu pas dipidangkeun dina warna beureum, sareng daérah anu diarsir ku kulawu ngawakilan interval kapercayaan 95%. Dina B, garis beureum ngawakilan rata-rata sareng garis biru ngawakilan interval kapercayaan 95% pikeun konsentrasi. C Akumulasi DNA plasmid dina hemolimf sareng cairan katup remis dina waktos anu béda saatos panambahan DNA plasmid. Hasilna dipidangkeun salaku salinan absolut anu dideteksi/mL (±SE).
Salajengna, urang nalungtik asal-usul ccfDNA dina remis anu dikumpulkeun tina ranjang remis di Kapuloan Kerguelen, sakelompok pulo terpencil anu gaduh pangaruh antropogenik anu terbatas. Pikeun tujuan ieu, cccDNA tina hemolimf remis diisolasi sareng dimurnikeun ku metode anu umum dianggo pikeun ngamurnikeun cccDNA manusa [32, 33]. Kami mendakan yén konsentrasi ccfDNA hemolimf rata-rata dina remis aya dina kisaran mikrogram per ml hemolimf anu handap (tingali Tabel S2, Inpormasi Tambahan). Kisaran konsentrasi ieu jauh langkung ageung tibatan dina jalma anu séhat (nanogram rendah per mililiter), tapi dina kasus anu jarang, dina pasien kanker, tingkat ccfDNA tiasa ngahontal sababaraha mikrogram per mililiter [34, 35]. Analisis distribusi ukuran hemolimf ccfDNA nunjukkeun yén fragmen ieu rupa-rupa pisan ukuranana, mimitian ti 1000 bp dugi ka 1000 bp. dugi ka 5000 bp (Gambar 2). Hasil anu sami diala nganggo QIAamp Investigator Kit berbasis silika, metode anu umum dianggo dina élmu forensik pikeun gancang ngasingkeun sareng ngamurnikeun DNA genomik tina sampel DNA konsentrasi rendah, kalebet ccfDNA [36].
Éléktroforegram ccfDNA répréséntatif tina hémolimf kerang. Diékstrak nganggo Kit Plasma NucleoSnap (luhur) sareng Kit Investigator DNA QIAamp. Plot Biola B nunjukkeun distribusi konsentrasi hémolimf ccfDNA (±SE) dina kerang. Garis hideung sareng beureum ngagambarkeun median sareng kuartil kahiji sareng katilu, masing-masing.
Kira-kira 1% ccfDNA dina manusa sareng primata gaduh sumber asing [21, 37]. Kusabab sistem sirkulasi semi-kabuka bivalvia, cai laut anu beunghar mikroba, sareng distribusi ukuran ccfDNA kerang, kami ngahipotesiskeun yén hemolimf ccfDNA kerang tiasa ngandung kumpulan DNA mikroba anu beunghar sareng beragam. Pikeun nguji hipotesis ieu, kami ngurutkeun hemolimf ccfDNA tina sampel Aulacomya atra anu dikumpulkeun ti Kapuloan Kerguelen, ngahasilkeun langkung ti 10 juta bacaan, 97,6% diantarana lulus kontrol kualitas. Bacaan teras diklasifikasikeun numutkeun sumber mandiri sareng non-mandiri nganggo database bivalvia BLASTN sareng NCBI (Gambar S1, Inpormasi Tambahan).
Dina manusa, DNA inti sareng mitokondria tiasa dileupaskeun kana aliran getih [38]. Nanging, dina panilitian ieu, teu mungkin pikeun ngajelaskeun sacara rinci DNA genomik inti remis, kumargi génom A. atra teu acan diurutkeun atanapi didadarkeun. Nanging, urang tiasa ngaidentipikasi sababaraha fragmen ccfDNA asal urang sorangan nganggo perpustakaan bivalvia (Gambar S2, Inpormasi Tambahan). Kami ogé mastikeun ayana fragmen DNA asal urang sorangan ku amplifikasi PCR anu diarahkeun tina gén A. atra anu diurutkeun (Gambar 3). Sarua, kumargi génom mitokondria A. atra sayogi dina database umum, urang tiasa mendakan bukti ayana fragmen ccfDNA mitokondria dina hemolimf A. atra. Ayana fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi ku amplifikasi PCR (Gambar 3).
Rupa-rupa gén mitokondria aya dina hemolimf A. atra (titik beureum – nomer stok: SRX5705969) sareng M. platensis (titik biru – nomer stok: SRX5705968) anu diamplifikasi ku PCR. Gambar diadaptasi tina Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolimf tina A. atra Disimpen dina kertas FTA. Anggo punch 3 mm pikeun ditambahkeun langsung kana tabung PCR anu ngandung campuran PCR.
Kusabab seueurna eusi mikroba dina cai laut, mimitina urang fokus kana karakterisasi runtuyan DNA mikroba dina hemolimfa. Pikeun ngalakukeun ieu, urang nganggo dua strategi anu béda. Strategi anu munggaran nganggo Kraken2, program klasifikasi runtuyan dumasar algoritma anu tiasa ngaidentipikasi runtuyan mikroba kalayan akurasi anu sami sareng BLAST sareng alat-alat sanésna [28]. Langkung ti 6719 bacaan ditangtukeun asalna tina baktéri, sedengkeun 124 sareng 64 masing-masing asalna tina archaea sareng virus (Gambar 4). Fragmen DNA baktéri anu paling seueur nyaéta Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), sareng Bacteroidetes (17%) (Gambar 4a). Distribusi ieu saluyu sareng panilitian sateuacana ngeunaan mikrobioma kerang biru laut [39, 40]. Gammaproteobacteria mangrupikeun kelas utama Proteobacteria (44%), kalebet seueur Vibrionales (Gambar 4b). Métode ddPCR mastikeun ayana fragmen DNA Vibrio dina ccfDNA hemolimf A. atra (Gambar 4c) [41]. Pikeun kéngingkeun langkung seueur inpormasi ngeunaan asal baktéri tina ccfDNA, pendekatan tambahan dilaksanakeun (Gambar S2, Inpormasi Tambahan). Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan tungtung-pasangan sareng diklasifikasikeun salaku asal-usul mandiri (bivalvia) atanapi sanés asal-usul mandiri nganggo BLASTN sareng nilai e 1e−3 sareng cutoff kalayan homologi >90%. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan tungtung-pasangan sareng diklasifikasikeun salaku asal-usul mandiri (bivalvia) atanapi sanés asal-usul mandiri nganggo BLASTN sareng nilai e 1e−3 sareng cutoff kalayan homologi >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы какдрусныество моллюски) atanapi чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan anu dipasangkeun sareng diklasifikasikeun salaku asli (bivalvia) atanapi non-asli nganggo BLASTN sareng nilai e 1e-3 sareng cutoff kalayan homologi >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 和 和 和 3n 的3 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственный моллюски) atanapi несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Dina hal ieu, bacaan anu tumpang tindih dikumpulkeun salaku bacaan anu dipasangkeun sareng diklasifikasikeun salaku sorangan (bivalvia) atanapi henteu asli nganggo nilai e BLASTN sareng 1e-3 sareng ambang homologi >90%.Kusabab génom A. atra tacan diurutkeun, kami nganggo strategi perakitan de novo tina assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Total 147.188 kontigen parantos diidéntifikasi salaku gumantung (bivalvia) asal. Kontigen ieu teras di-explode kalayan nilai-e 1e-10 nganggo BLASTN sareng BLASTX. Strategi ieu ngamungkinkeun kami pikeun ngaidentipikasi 482 fragmen non-bivalvia anu aya dina ccfDNA A. atra. Langkung ti satengah (57%) tina fragmen DNA ieu diala tina baktéri, utamina tina simbion insang, kalebet simbion sulfotropik, sareng tina simbion insang Solemya velum (Gambar 5).
Kaayaan relatif dina tingkat tipe. B Karagaman mikroba tina dua filum utama (Firmicutes sareng Proteobacteria). Amplifikasi representatif ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmen gén 16S rRNA (biru) dina tilu hemolimf atra.
Sajumlah 482 kontigén anu dikumpulkeun dianalisis. Profil umum distribusi taksonomi anotasi kontigén métagenomik (prokariota sareng eukariota). B Distribusi lengkep fragmen DNA baktéri anu diidentipikasi ku BLASTN sareng BLASTX.
Analisis Kraken2 ogé nunjukkeun yén ccfDNA kerang ngandung fragmen DNA archaeal, kalebet fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), sareng Thaurmarcheota (11%) (Gambar 6a). Ayana fragmen DNA anu diturunkeun tina Euryarchaeota sareng Crenarchaeota, anu sateuacanna kapanggih dina komunitas mikroba kerang California, henteu kedah janten kejutan [42]. Sanaos Euryarchaeota sering dikaitkeun sareng kaayaan ekstrim, ayeuna diakui yén Euryarchaeota sareng Crenarcheota kalebet prokariota anu paling umum dina lingkungan kriogenik laut [43, 44]. Ayana mikroorganisme metanogenik dina kerang henteu anéh, kumargi laporan anyar ngeunaan bocor metana anu éksténsif tina bocor handap di Dataran Tinggi Kerguelen [45] sareng kamungkinan produksi metana mikroba anu dititénan di basisir Kapuloan Kerguelen [46].
Perhatosan urang teras ngalih kana bacaan tina virus DNA. Numutkeun pangaweruh urang, ieu mangrupikeun panilitian anu munggaran di luar target ngeunaan eusi virus remis. Sapertos anu dipiharep, urang mendakan fragmen DNA tina bakteriofag (Caudovirales) (Gambar 6b). Nanging, DNA virus anu paling umum asalna tina filum nukleositovirus, ogé katelah virus DNA ageung sitoplasmik nuklir (NCLDV), anu gaduh génom panggedéna tibatan virus naon waé. Dina filum ieu, kaseueuran runtuyan DNA kagolong kana kulawarga Mimimidoviridae (58%) sareng Poxviridae (21%), anu inang alami kalebet vertebrata sareng artropoda, sedengkeun sabagian alit tina runtuyan DNA ieu kagolong kana ganggang virologis anu dipikanyaho. Nginféksi ganggang eukariotik laut. Urutan éta ogé diala tina virus Pandora, virus raksasa kalayan ukuran génom panggedéna tibatan genera virus anu dipikanyaho. Anu pikaresepeun, rentang inang anu dipikanyaho kainféksi virus, sakumaha ditangtukeun ku sekuensing hemolimf ccfDNA, relatif ageung (Gambar S3, Inpormasi Tambahan). Ieu kalebet virus anu ngainféksi serangga sapertos Baculoviridae sareng Iridoviridae, ogé virus anu ngainféksi amuba, ganggang sareng vertebrata. Kami ogé mendakan runtuyan anu cocog sareng génom Pithovirus sibericum. Pitovirus (ogé katelah "virus zombie") mimitina diisolasi tina permafrost umur 30.000 taun di Siberia [47]. Ku kituna, hasil kami saluyu sareng laporan sateuacana anu nunjukkeun yén henteu sadaya spésiés modéren tina virus ieu punah [48] sareng yén virus ieu tiasa aya di ékosistem laut subarctic anu terpencil.
Pamungkas, urang nguji pikeun ningali naha urang tiasa mendakan fragmen DNA tina sato multiseluler anu sanés. Sajumlah 482 kontinjén asing diidentipikasi ku BLASTN sareng BLASTX nganggo perpustakaan nt, nr sareng RefSeq (génomik sareng protéin). Hasil panilitian urang nunjukkeun yén di antara fragmen asing ccfDNA sato multiseluler, DNA tulang tulang dominan (Gambar 5). Fragmen DNA tina serangga sareng spésiés sanésna ogé parantos kapendak. Sabagian ageung fragmen DNA teu acan diidentipikasi, kamungkinan kusabab kurangna perwakilan sajumlah ageung spésiés laut dina database génomik dibandingkeun sareng spésiés darat [49].
Dina tulisan ieu, urang nerapkeun konsép LB kana remis, kalayan alesan yén sekuensing tembakan hemolimf ccfDNA tiasa masihan wawasan ngeunaan komposisi ékosistem basisir laut. Khususna, urang mendakan yén 1) hemolimf remis ngandung konsentrasi anu relatif luhur (tingkat mikrogram) tina fragmen DNA anu sirkulasi anu relatif ageung (~1-5 kb); 2) fragmen DNA ieu mandiri sareng henteu mandiri 3) Di antara sumber asing tina fragmen DNA ieu, urang mendakan DNA baktéri, arkéal sareng virus, ogé DNA sato multisélulér sanésna; 4) Akumulasi fragmen ccfDNA asing ieu dina hemolimf lumangsung gancang sareng nyumbang kana aktivitas panyaringan internal remis. Dina kacindekanana, panilitian urang nunjukkeun yén konsép LB, anu dugi ka ayeuna parantos diterapkeun utamina dina widang biomédis, ngodekeun sumber pangaweruh anu beunghar tapi teu acan dijelajah anu tiasa dianggo pikeun langkung ngartos interaksi antara spésiés sentinel sareng lingkunganana.
Salian ti primata, isolasi ccfDNA parantos dilaporkeun dina mamalia, kalebet beurit, anjing, ucing, sareng kuda [50, 51, 52]. Nanging, numutkeun pangaweruh kami, panilitian kami mangrupikeun anu munggaran ngalaporkeun deteksi sareng sekuensing ccfDNA dina spésiés laut kalayan sistem sirkulasi terbuka. Fitur anatomis sareng kamampuan nyaring remis ieu, sahenteuna sabagian, tiasa ngajelaskeun karakteristik ukuran anu béda tina fragmen DNA anu bersirkulasi dibandingkeun sareng spésiés sanés. Dina manusa, kaseueuran fragmen DNA anu bersirkulasi dina getih mangrupikeun fragmen alit anu ukuranana ti 150 dugi ka 200 bp. kalayan puncak maksimum 167 bp [34, 53]. Bagian alit tapi signifikan tina fragmen DNA ukuranana antara 300 sareng 500 bp, sareng sakitar 5% langkung panjang tibatan 900 bp. [54]. Alesan pikeun distribusi ukuran ieu nyaéta sumber utama ccfDNA dina plasma lumangsung salaku akibat tina maot sél, boh kusabab maot sél atanapi kusabab nekrosis sél hematopoietik anu sirkulasi dina jalma anu séhat atanapi kusabab apoptosis sél tumor dina pasien kanker (anu katelah DNA tumor anu sirkulasi). , ctDNA). Distribusi ukuran hemolimf ccfDNA anu kami mendakan dina remis mimitian ti 1000 dugi ka 5000 bp, nunjukkeun yén ccfDNA remis ngagaduhan asal anu béda. Ieu mangrupikeun hipotesis logis, kumargi remis ngagaduhan sistem vaskular semi-kabuka sareng hirup dina lingkungan akuatik laut anu ngandung konsentrasi DNA génomik mikroba anu luhur. Nyatana, ékspérimén laboratorium kami anu nganggo DNA éksogén parantos nunjukkeun yén remis ngumpulkeun fragmen DNA dina cai laut, sahenteuna saatos sababaraha jam aranjeunna didegradasi saatos panyerepan sél sareng / atanapi dileupaskeun sareng / atanapi disimpen dina sababaraha organisasi. Kusabab langkana sél (boh prokariotik sareng eukariotik), panggunaan kompartemen intravalvular bakal ngirangan jumlah ccfDNA tina sumber mandiri ogé tina sumber asing. Nginget pentingna imunitas bawaan bivalvia sareng seueurna fagosit anu ngider, kami salajengna ngahipotesiskeun yén bahkan ccfDNA asing ogé diperkaya ku fagosit anu ngider anu ngumpulkeun DNA asing nalika ngonsumsi mikroorganisme sareng/atanapi runtah sél. Sacara gembleng, hasil kami nunjukkeun yén hemolimf ccfDNA bivalvia mangrupikeun gudang inpormasi molekuler anu unik sareng nguatkeun statusna salaku spésiés sentinel.
Data kami nunjukkeun yén sekuensing sareng analisis fragmen hemolimf ccfDNA anu diturunkeun tina baktéri tiasa nyayogikeun inpormasi konci ngeunaan flora baktéri inang sareng baktéri anu aya dina ékosistem laut di sakurilingna. Téhnik sekuensing shot parantos ngungkabkeun sekuen baktéri komensal A. atra insang anu bakal sono upami metode idéntifikasi 16S rRNA konvensional parantos dianggo, sabagian kusabab bias perpustakaan rujukan. Nyatana, panggunaan data LB anu dikumpulkeun ti M. platensis dina lapisan kerang anu sami di Kerguelen nunjukkeun yén komposisi simbion baktéri anu aya hubunganana sareng insang sami pikeun duanana spésiés kerang (Gambar S4, Inpormasi Tambahan). Kamiripan dua kerang anu béda sacara genetik ieu tiasa ngagambarkeun komposisi komunitas baktéri dina deposit tiis, walirang, sareng vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Tingkat mikroorganisme pangurangan walirang anu langkung luhur parantos dijelaskeun kalayan saé nalika panén kerang ti daérah basisir bioturbasi [59], sapertos basisir Port-au-France. Kamungkinan séjénna nyaéta flora kerang komensal bisa kapangaruhan ku transmisi horizontal [60, 61]. Panalungtikan leuwih lanjut diperyogikeun pikeun nangtukeun korélasi antara lingkungan laut, permukaan dasar laut, sareng komposisi baktéri simbiotik dina kerang. Panilitian ieu ayeuna keur lumangsung.
Panjang sareng konsentrasi hemolimf ccfDNA, gampangna dimurnikeun, sareng kualitas anu luhur pikeun ngamungkinkeun sekuensing shotgun gancang mangrupikeun sababaraha tina seueur kaunggulan ngagunakeun ccfDNA kerang pikeun meunteun kaanekaragaman hayati dina ékosistem basisir laut. Pendekatan ieu khususna efektif pikeun ngacirikeun komunitas virus (virom) dina ékosistem anu dipasihkeun [62, 63]. Teu sapertos baktéri, archaea, sareng eukariota, génom virus henteu ngandung gén anu dilestarikan sacara filogenetik sapertos sekuen 16S. Hasil kami nunjukkeun yén biopsi cair tina spésiés indikator sapertos kerang tiasa dianggo pikeun ngaidentipikasi jumlah anu relatif ageung tina fragmen virus ccfDNA anu dipikanyaho pikeun ngainféksi host anu biasana cicing di ékosistem laut basisir. Ieu kalebet virus anu dipikanyaho pikeun ngainféksi protozoa, artropoda, serangga, pepelakan, sareng virus baktéri (contona, bakteriofag). Sebaran anu sami kapanggih nalika kami nalungtik virom hemolimf ccfDNA kerang biru (M. platensis) anu dikumpulkeun dina lapisan kerang anu sami di Kerguelen (Tabel S2, Inpormasi Tambahan). Sekuensing ccfDNA nganggo shotgun memang mangrupikeun pendekatan énggal anu kéngingkeun moméntum dina panilitian virome manusa atanapi spésiés sanés [21, 37, 64]. Pendekatan ieu khususna kapaké pikeun nalungtik virus DNA untaian ganda, sabab teu aya gén tunggal anu dilestarikan di antara sadaya virus DNA untaian ganda, anu ngawakilan kelas virus anu paling beragam sareng lega di Baltimore [65]. Sanaos kalolobaan virus ieu tetep teu diklasifikasikeun sareng tiasa kalebet virus ti bagian anu teu dipikanyaho pisan tina dunya virus [66], kami mendakan yén virome sareng rentang host tina remis A. atra sareng M. platensis aya di antara dua spésiés. sami (tingali gambar S3, inpormasi tambahan). Kamiripan ieu henteu anéh, sabab tiasa ngagambarkeun kurangna selektivitas dina panyerepan DNA anu aya di lingkungan. Panilitian ka hareup anu nganggo RNA anu dimurnikeun ayeuna diperyogikeun pikeun ngacirikeun virome RNA.
Dina panilitian kami, kami nganggo pipa anu ketat pisan anu diadaptasi tina karya Kowarski sareng kolega [37], anu nganggo ngahapus dua léngkah tina bacaan sareng kontinyu anu dikumpulkeun sateuacan sareng saatos perakitan ccfDNA asli, anu ngahasilkeun proporsi bacaan anu teu dipetakan anu luhur. Ku alatan éta, kami teu tiasa ngaluarkeun yén sababaraha bacaan anu teu dipetakan ieu masih kénéh gaduh asal-usulna nyalira, utamina kusabab kami henteu gaduh génom rujukan pikeun spésiés kerang ieu. Kami ogé nganggo pipa ieu sabab kami prihatin ngeunaan kimera antara bacaan mandiri sareng non-mandiri sareng panjang bacaan anu dihasilkeun ku Illumina MiSeq PE75. Alesan sanés pikeun mayoritas bacaan anu teu dipetakan nyaéta seueur mikroba laut, khususna di daérah terpencil sapertos Kerguelen, teu acan dianotasi. Kami nganggo Illumina MiSeq PE75, kalayan nganggap panjang fragmen ccfDNA sami sareng ccfDNA manusa. Pikeun panilitian ka hareup, kumargi hasil kami nunjukkeun yén hemolimf ccfDNA gaduh bacaan anu langkung panjang tibatan manusa sareng / atanapi mamalia, kami nyarankeun nganggo platform sekuensing anu langkung cocog pikeun fragmen ccfDNA anu langkung panjang. Prakték ieu bakal ngagampangkeun pikeun ngaidentipikasi langkung seueur indikasi pikeun analisis anu langkung jero. Kéngingkeun runtuyan génom nuklir A. atra lengkep anu ayeuna teu sayogi ogé bakal ngagampangkeun pisan diskriminasi ccfDNA tina sumber mandiri sareng non-mandiri. Kusabab panalungtikan kami parantos fokus kana kamungkinan nerapkeun konsép biopsi cair kana remis, kami ngarepkeun yén nalika konsép ieu dianggo dina panalungtikan ka hareup, alat sareng pipa énggal bakal dikembangkeun pikeun ningkatkeun poténsi metode ieu pikeun nalungtik karagaman mikroba remis. ékosistem laut.
Salaku biomarker klinis non-invasif, tingkat ccfDNA plasma manusa anu luhur aya hubunganana sareng rupa-rupa panyakit, karusakan jaringan, sareng kaayaan setrés [67,68,69]. Kanaékan ieu aya hubunganana sareng pelepasan fragmen DNA asalna sorangan saatos karusakan jaringan. Kami ngabahas masalah ieu nganggo setrés panas akut, dimana remis kakeunaan suhu 30 °C sakedap. Kami ngalaksanakeun analisis ieu dina tilu jinis remis anu béda dina tilu ékspérimén mandiri. Nanging, kami henteu mendakan parobahan dina tingkat ccfDNA saatos setrés panas akut (tingali Gambar S5, inpormasi tambahan). Kapanggihna ieu tiasa ngajelaskeun, sahenteuna sabagian, kanyataan yén remis gaduh sistem sirkulasi semi-kabuka sareng ngumpulkeun seueur DNA asing kusabab aktivitas panyaringan anu luhur. Di sisi anu sanés, remis, sapertos seueur invertebrata, tiasa langkung tahan kana karusakan jaringan anu diinduksi setrés, sahingga ngawatesan pelepasan ccfDNA dina hemolimfa na [70, 71].
Nepi ka ayeuna, analisis DNA ngeunaan kaanekaragaman hayati dina ékosistem akuatik utamina museur kana metabarcoding DNA lingkungan (eDNA). Nanging, metode ieu biasana diwatesan dina analisis kaanekaragaman hayati nalika primer dianggo. Panggunaan sekuensing shotgun ngungkulan watesan PCR sareng pilihan sét primer anu bias. Ku kituna, dina hiji segi, metode urang langkung caket kana metode sekuensing eDNA Shotgun throughput tinggi anu nembe dianggo, anu tiasa langsung ngurut DNA anu terfragmentasi sareng nganalisis ampir sadaya organisme [72, 73]. Nanging, aya sababaraha masalah dasar anu ngabédakeun LB tina metode eDNA standar. Tangtosna, bédana utama antara eDNA sareng LB nyaéta panggunaan host filter alami. Panggunaan spésiés laut sapertos spons sareng bivalvia (Dresseina spp.) salaku filter alami pikeun nalungtik eDNA parantos dilaporkeun [74, 75]. Nanging, panilitian Dreissena nganggo biopsi jaringan tina mana DNA diekstrak. Analisis ccfDNA tina LB henteu meryogikeun biopsi jaringan, peralatan khusus sareng kadang mahal sareng logistik anu aya hubunganana sareng eDNA atanapi biopsi jaringan. Kanyataanna, kami nembe ngalaporkeun yén ccfDNA tina LB tiasa disimpen sareng dianalisis nganggo dukungan FTA tanpa ngajaga ranté tiis, anu mangrupikeun tantangan utama pikeun panalungtikan di daérah terpencil [76]. Ékstraksi ccfDNA tina biopsi cair ogé saderhana sareng nyayogikeun DNA kualitas luhur pikeun sekuensing shotgun sareng analisis PCR. Ieu mangrupikeun kaunggulan anu ageung kumargi sababaraha watesan téknis anu aya hubunganana sareng analisis eDNA [77]. Kesederhanaan sareng biaya anu murah tina metode sampling ogé cocog pisan pikeun program pemantauan jangka panjang. Salian ti kamampuan panyaring anu luhur, fitur bivalvia anu terkenal nyaéta komposisi mukopolisakarida kimiawi tina lendirna, anu ngamajukeun panyerepan virus [78, 79]. Ieu ngajantenkeun bivalvia janten filter alami anu idéal pikeun ngacirikeun kaanekaragaman hayati sareng dampak parobahan iklim dina ékosistem akuatik anu dipasihkeun. Sanaos ayana fragmen DNA anu diturunkeun tina host tiasa ditingali salaku watesan metode dibandingkeun sareng eDNA, biaya anu aya hubunganana sareng gaduh ccfDNA asli sapertos kitu dibandingkeun sareng eDNA sakaligus kahartos pikeun jumlah inpormasi anu sayogi pikeun studi kaséhatan. offset host. Ieu kalebet ayana runtuyan virus anu diintegrasikeun kana génom host host. Ieu penting pisan pikeun remis, kumargi ayana rétrovirus leukemia anu ditularkeun sacara horizontal dina bivalvia [80, 81]. Kaunggulan séjén tina LB tibatan eDNA nyaéta ngamangpaatkeun aktivitas fagositik sél getih anu ngiderkeun dina hemolimfa, anu ngalegleg mikroorganisme (sareng génomna). Fagositosis mangrupikeun fungsi utama sél getih dina bivalvia [82]. Pamungkas, metode ieu ngamangpaatkeun kapasitas panyaringan remis anu luhur (rata-rata 1,5 l / jam cai laut) sareng sirkulasi dua dinten, anu ningkatkeun campuran lapisan cai laut anu béda, ngamungkinkeun néwak eDNA hétérolog. [83, 84]. Ku kituna, analisis ccfDNA remis mangrupikeun jalan anu pikaresepeun kumargi dampak nutrisi, ékonomi, sareng lingkungan remis. Sarupa sareng analisis LB anu dikumpulkeun ti manusa, metode ieu ogé muka kamungkinan pikeun ngukur parobahan genetik sareng épigenetik dina DNA host salaku réspon kana zat éksogén. Contona, téknologi sekuensing generasi katilu tiasa dibayangkeun pikeun ngalaksanakeun analisis metilasi sakumna génom dina ccfDNA asli nganggo sekuensing nanopore. Prosés ieu kedah difasilitasi ku kanyataan yén panjang fragmen ccfDNA kerang idéalna cocog sareng platform sekuensing anu dibaca panjang anu ngamungkinkeun analisis metilasi DNA sakumna génom tina hiji sekuensing tunggal tanpa kedah transformasi kimia.85,86] Ieu mangrupikeun kamungkinan anu pikaresepeun, sabab parantos dipidangkeun yén pola metilasi DNA ngagambarkeun réspon kana setrés lingkungan sareng tetep salami sababaraha generasi. Ku alatan éta, éta tiasa masihan wawasan anu berharga kana mékanisme anu mendasari anu ngatur réspon saatos paparan parobahan iklim atanapi polutan [87]. Nanging, panggunaan LB sanés tanpa watesan. Tangtosna, ieu meryogikeun ayana spésiés indikator dina ékosistem. Sakumaha anu parantos disebatkeun di luhur, nganggo LB pikeun meunteun kaanekaragaman hayati ékosistem anu dipasihkeun ogé meryogikeun pipa bioinformatika anu ketat anu merhatoskeun ayana fragmen DNA tina sumberna. Masalah utama anu sanés nyaéta kasadiaan génom rujukan pikeun spésiés laut. Dipiharep yén inisiatif sapertos Proyék Génom Mamalia Laut sareng proyék Fish10k anu nembé diadegkeun [88] bakal ngagampangkeun analisis sapertos kitu di hareup. Aplikasi konsép LB pikeun organisme anu nyaring saringan laut ogé cocog sareng kamajuan panganyarna dina téknologi sekuensing, janten cocog pikeun pamekaran biomarker multi-ohm pikeun nyayogikeun inpormasi penting ngeunaan kaséhatan habitat laut dina réspon kana setrés lingkungan.
Data sekuensing génom parantos disimpen dina Arsip Baca Sekuen NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 dina Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak parobahan iklim kana kahirupan laut sareng ékosistem. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Pertimbangkeun dampak gabungan tina parobahan iklim sareng setrés lokal sanésna kana lingkungan laut. lingkungan ilmiah umum. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Élmu mimiti Maret. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ngurangan toleransi panas dina kaayaan setrés panas anu diulang-ulang ngajelaskeun mortalitas remis biru anu luhur dina usum panas. Laporan ilmiah 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Parobahan anyar dina frékuénsi, panyabab sareng tingkat maotna sato. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Sababaraha patogén non-spésifik-spésifik mungkin geus ngabalukarkeun mortality massa Pinna nobilis. Hirup. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Poténsi dampak parobahan iklim kana panyakit zoonotik Arktik. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Remis biru (Mytilus edulis spp.) salaku organisme sinyal dina pangawasan polusi basisir: hiji ulasan. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair dina pangobatan kanker. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Pematangan biopsi cair: Ngamungkinkeun DNA tumor ngiderkeun. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukléat dina plasma manusa. Risalah rapat anak perusahaan Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran anyar pikeun DNA bébas sél salaku pananda molekuler pikeun pangobatan kanker. Kuantifikasi analisis biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cair lebet ka klinik – masalah palaksanaan sareng tantangan ka hareup. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW sareng anu sanésna. DNA fétal aya dina plasma sareng sérum maternal. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Ulikan ngeunaan jalanna kakandungan sareng komplikasina nganggo RNA ékstrasélulér anu sirkulasi dina getih awéwé nalika kakandungan. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biopsi cair: DNA bébas sél donor dianggo pikeun ngadeteksi lési alogenik dina cangkok ginjal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dina diagnostik prenatal: sekuensing génom plasma maternal. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Deteksi patogén gancang kalayan sekuensing metagenomik generasi salajengna tina cairan awak anu kainféksi. Nat Medicine. 2021;27:115-24.