Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan render edəcəyik.
Maye biopsiyası (LB) biotibbi sahədə sürətlə populyarlıq qazanan bir anlayışdır. Konsepsiya əsasən dövran edən hüceyrədənkənar DNT-nin (ccfDNA) fraqmentlərinin aşkarlanmasına əsaslanır və onlar əsasən müxtəlif toxumalarda hüceyrə ölümündən sonra kiçik fraqmentlər şəklində buraxılır. Bu fraqmentlərin kiçik bir hissəsi yad (xarici) toxumalardan və ya orqanizmlərdən qaynaqlanır. Hazırkı işimizdə bu konsepsiyanı yüksək dəniz suyu filtrasiya qabiliyyəti ilə tanınan gözətçi növü olan midiyalara tətbiq etdik. Dəniz sahil ekosistemlərinin biomüxtəlifliyi haqqında məlumat vermək üçün müxtəlif mənbələrdən ətraf mühit DNT fraqmentlərini tutmaq üçün midiyaların təbii filtr kimi çıxış etmək qabiliyyətindən istifadə edirik. Nəticələrimiz göstərir ki, midiya hemolimfasında ölçüsü 1 ilə 5 kb arasında çox dəyişən DNT fraqmentləri var. Tüfəng ardıcıllığı göstərdi ki, çox sayda DNT fraqmenti yad mikrob mənşəlidir. Bunların arasında sahil dəniz ekosistemlərində tez-tez rast gəlinən müxtəlif sahibləri yoluxdurduğu bilinən viruslar da daxil olmaqla, bakteriyalardan, arxeyalardan və viruslardan DNT fraqmentləri tapdıq. Nəticə olaraq, tədqiqatımız göstərir ki, midiyalara tətbiq olunan LB anlayışı dəniz sahil ekosistemlərindəki mikrob müxtəlifliyi haqqında zəngin, lakin hələ araşdırılmamış bir bilik mənbəyidir.
İqlim dəyişikliyinin (İD) dəniz ekosistemlərinin biomüxtəlifliyinə təsiri sürətlə böyüyən tədqiqat sahəsidir. Qlobal istiləşmə təkcə mühüm fizioloji stresslərə səbəb olmur, həm də dəniz orqanizmlərinin istilik sabitliyinin təkamül hədlərini artırır, bir sıra növlərin yaşayış mühitinə təsir göstərir və onları daha əlverişli şərait axtarmağa sövq edir [1, 2]. Metazoaların biomüxtəlifliyinə təsir etməklə yanaşı, İD ev sahibi-mikrob qarşılıqlı təsirlərinin incə balansını pozur. Bu mikrobial disbakterioz dəniz orqanizmlərini yoluxucu patogenlərə daha həssas etdiyi üçün dəniz ekosistemləri üçün ciddi təhlükə yaradır [3, 4]. Qlobal dəniz ekosistemlərinin idarə olunması üçün ciddi problem olan kütləvi ölümlərdə İD-nin mühüm rol oynadığına inanılır [5, 6]. Bu, bir çox dəniz növünün iqtisadi, ekoloji və qidalanma təsirləri nəzərə alınmaqla vacib bir məsələdir. Bu, xüsusilə İD-nin təsirlərinin daha təcili və şiddətli olduğu qütb bölgələrində yaşayan ikitaylı molyusklar üçün doğrudur [6, 7]. Əslində, Mytilus spp. kimi ikitaylı molyusklar İD-nin dəniz ekosistemlərinə təsirini izləmək üçün geniş istifadə olunur. Təəccüblü deyil ki, onların sağlamlığını izləmək üçün nisbətən çox sayda biomarker hazırlanmışdır və tez-tez fermentativ aktivliyə və ya hüceyrənin canlılığı və faqositik aktivlik kimi hüceyrə funksiyalarına əsaslanan funksional biomarkerləri əhatə edən iki səviyyəli yanaşmadan istifadə olunur [8]. Bu metodlara həmçinin çoxlu miqdarda dəniz suyunun udulmasından sonra yumşaq toxumalarda toplanan spesifik təzyiq göstəricilərinin konsentrasiyasının ölçülməsi də daxildir. Lakin, ikitaylı molyuskların yüksək filtrasiya tutumu və yarı açıq qan dövranı sistemi xəstələrin idarə olunmasına sadə və minimal invaziv yanaşma olan maye biopsiyası (LB) konsepsiyasından istifadə edərək yeni hemolimfa biomarkerləri hazırlamaq imkanı verir. qan nümunələri [9, 10]. İnsan LB-də bir neçə növ dövran edən molekul tapıla bilsə də, bu konsepsiya əsasən plazmada dövran edən hüceyrədənkənar DNT (ccfDNA) fraqmentlərinin DNT ardıcıllıqla təhlilinə əsaslanır. Əslində, insan plazmasında dövran edən DNT-nin olması 20-ci əsrin ortalarından bəri məlumdur [11], lakin yalnız son illərdə yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllıqla müəyyənləşdirmə metodlarının meydana çıxması ccfDNA-ya əsaslanan klinik diaqnoza gətirib çıxarmışdır. Bu dövran edən DNT fraqmentlərinin mövcudluğu qismən hüceyrə ölümündən sonra genom DNT-sinin (nüvə və mitoxondrial) passiv şəkildə sərbəst buraxılması ilə əlaqədardır. Sağlam fərdlərdə ccfDNT-nin konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyalardan əziyyət çəkən və ya stressə məruz qalan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər ki, bu da toxuma zədələnməsinə səbəb olur. Sağlam fərdlərdə ccfDNT-nin konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyalardan əziyyət çəkən və ya stressə məruz qalan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər ki, bu da toxuma zədələnməsinə səbəb olur. U zdorovыh lädäy lövhäläri vccDNKK-da norme nizkaya (<10 нг/мл), lakin 5-10 räz märzində qädär çäkişdirə bilär. Sağlam insanlarda kkkDNK-nın konsentrasiyası normal olaraq aşağıdır (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyaları olan və ya toxuma zədələnməsinə səbəb olan stress altında olan xəstələrdə bu göstərici 5-10 dəfə arta bilər.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而毼致羻。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 戏 或 戗中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伍损伤ccfDNA konsentrasiyası insanlar üçün çox zəifdir (<10 нг/мл), lakin xəstələrin müxtəlif xəstəlikləri və ya stresləri ilə 5-10 dəqiqə ərzində yüksək səviyyəyə qalxa bilər. Sağlam fərdlərdə ccfDNT konsentrasiyaları adətən aşağı olur (<10 ng/ml), lakin müxtəlif patologiyaları və ya stressi olan xəstələrdə 5-10 dəfə artırıla bilər və bu da toxuma zədələnməsinə səbəb olur.ccfDNA fraqmentlərinin ölçüsü geniş şəkildə dəyişir, lakin adətən 150 ilə 200 bp arasında dəyişir. [12]. Öz-özünə əldə edilən ccfDNA-nın, yəni normal və ya transformasiya olunmuş sahib hüceyrələrdən alınan ccfDNA-nın təhlili nüvə və/və ya mitoxondrial genomda mövcud olan genetik və epigenetik dəyişiklikləri aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər və bununla da klinisyenlərə spesifik molekulyar hədəfli terapiyaları seçməyə kömək edə bilər [13]. Bununla belə, ccfDNA hamiləlik dövründə döl hüceyrələrindən və ya transplantasiya edilmiş orqanlardan alınan ccfDNA kimi xarici mənbələrdən əldə edilə bilər [14,15,16,17]. ccfDNA həmçinin yoluxucu agentin (xarici) nuklein turşularının mövcudluğunu aşkar etmək üçün vacib məlumat mənbəyidir ki, bu da qan kulturaları ilə müəyyən edilməyən geniş yayılmış infeksiyaların qeyri-invaziv aşkarlanmasına imkan verir və yoluxmuş toxumanın invaziv biopsiyasından qaçınır [18]. Son tədqiqatlar həqiqətən də insan qanının viral və bakterial patogenləri müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilən zəngin məlumat mənbəyinə malik olduğunu və insan plazmasında tapılan ccfDNA-nın təxminən 1%-nin xarici mənşəli olduğunu göstərmişdir [19]. Bu tədqiqatlar göstərir ki, orqanizmin dövran edən mikrobiomunun biomüxtəlifliyi ccfDNA analizi istifadə edilərək qiymətləndirilə bilər. Lakin, bu yaxınlara qədər bu konsepsiya yalnız insanlarda və daha az dərəcədə digər onurğalılarda istifadə olunurdu [20, 21].
Bu məqalədə, 35 milyon il əvvəl əmələ gəlmiş böyük bir yaylanın üstündəki adalar qrupu olan subantarktik Kerguelen adalarında geniş yayılmış cənub növü olan Aulacomya atranın ccfDNT-sini təhlil etmək üçün LB potensialından istifadə edirik. vulkan püskürməsi. In vitro eksperimental sistemdən istifadə edərək, dəniz suyundakı DNT fraqmentlərinin midiyalar tərəfindən tez bir zamanda mənimsənildiyini və hemolimfa bölməsinə daxil olduğunu aşkar etdik. Tüfəng ardıcıllığı göstərdi ki, midiya hemolimfası ccfDNT-də soyuq vulkanik dəniz sahil ekosistemlərinə xas olan biomlardan simbiotik bakteriyalar və DNT fraqmentləri daxil olmaqla, öz və öz-özünə mənşəli DNT fraqmentləri var. Hemolimfa ccfDNT-də həmçinin müxtəlif sahib diapazonlarına malik viruslardan əldə edilən virus ardıcıllıqları da var. Sümüklü balıqlar, dəniz anemonları, yosunlar və həşəratlar kimi çoxhüceyrəli heyvanlardan DNT fraqmentləri də tapdıq. Nəticə olaraq, tədqiqatımız göstərir ki, LB konsepsiyası dəniz ekosistemlərində zəngin genom repertuarı yaratmaq üçün dəniz onurğasızlarına uğurla tətbiq oluna bilər.
Yetkin (55-70 mm uzunluğunda) Mytilus platensis (M. platensis) və Aulacomya atra (A. atra) 2018-ci ilin dekabr ayında Port-o-Fransın (049°21.235 C., 070°13.490 E.) qayalıq sahillərindən Kerguelen adalarından toplanmışdır. Digər yetkin mavi midiyalar (Mytilus spp.) kommersiya təchizatçısından (PEI Mussel King Inc., Şahzadə Eduard Adası, Kanada) əldə edilmiş və 10-20 litr 32‰ süni duzlu su (süni dəniz duzu Reef Crystal, Instant Ocean, Virciniya, ABŞ) olan temperaturu nəzarət edilən (4°C) havalandırılan çənə yerləşdirilmişdir. Hər təcrübə üçün fərdi qabıqların uzunluğu və çəkisi ölçülmüşdür.
Bu proqram üçün pulsuz açıq giriş protokolu onlayn mövcuddur (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Qısaca desək, LB hemolimfa abduktor əzələlərindən [22] təsvir olunduğu kimi toplanmışdır. Hemolimfa 1200 × g-də 3 dəqiqə ərzində santrifüqləmə yolu ilə aydınlaşdırılmış, supernatant istifadə olunana qədər (-20°C) dondurulmuşdur. cfDNT-nin təcrid edilməsi və təmizlənməsi üçün nümunələr (1,5-2,0 ml) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq NucleoSnap cfDNT dəsti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) istifadə edilərək əridilmiş və emal edilmişdir. ccfDNT əlavə təhlillərə qədər -80°C-də saxlanılmışdır. Bəzi təcrübələrdə ccfDNT QIAamp DNT Tədqiqatçısı Dəsti (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) istifadə edilərək təcrid olunmuş və təmizlənmişdir. Təmizlənmiş DNT standart PicoGreen analizi istifadə edilərək kəmiyyətləndirilmişdir. İzolyasiya edilmiş ccfDNT-nin fraqment paylanması, Yüksək Həssaslıqlı DNT Dəsti istifadə edərək Agilent 2100 bioanalizatorundan (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) istifadə edərək kapilyar elektroforez ilə təhlil edilmişdir. Təhlil istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq 1 µl ccfDNT nümunəsindən istifadə etməklə aparılmışdır.
Hemolimf ccfDNA fraqmentlərinin ardıcıllığı üçün Génome Québec (Monreal, Kvebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 dəstinin Illumina DNA Mix dəstindən istifadə edərək ov tüfəngi kitabxanaları hazırladı. Standart adapter (BioO) istifadə edildi. Xam məlumat faylları NCBI Ardıcıllıq Oxu Arxivindən (SRR8924808 və SRR8924809) əldə edilə bilər. Əsas oxu keyfiyyəti FastQC [23] istifadə edilərək qiymətləndirildi. Trimmomatic [24] adapterləri kəsmək və keyfiyyətsiz oxumalar üçün istifadə edilmişdir. Uyğunsuzluqların qarşısını almaq üçün qoşalaşmış ucları olan ov tüfəngi oxumaları FLASH minimum 20 bp üst-üstə düşmə ilə daha uzun tək oxumalara birləşdirildi [25]. Birləşdirilmiş oxunuşlar ikiqatlı NCBI Taksonomiya verilənlər bazasından (e dəyəri < 1e−3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə qeyd edildi və aşağı mürəkkəblikli ardıcıllıqların maskalanması DUST [26] istifadə edilərək həyata keçirildi. Birləşdirilmiş oxunuşlar ikiqatlı NCBI Taksonomiya verilənlər bazasından (e dəyəri < 1e−3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə qeyd edildi və aşağı mürəkkəblikli ardıcıllıqların maskalanması DUST [26] istifadə edilərək həyata keçirildi. Obъedindennıe chtenia by annotirovanıs pomoщью BLASTN ilə istifadə olunur bazası dannıx taksonomii dvustvorcatıx mollyuskov NCBI (znachénie e < 1e-3 və 90% гомологии), a maskirovanie posledovatelnostey səliqəli işlərin görülməsi ilə bağlı [26]. Birləşdirilmiş oxunuşlar NCBI ikitaylı taksonomiya verilənlər bazasından istifadə edərək BLASTN ilə qeyd edildi (e dəyəri < 1e-3 və 90% homologiya) və aşağı mürəkkəblikli ardıcıllıq maskalanması DUST [26] istifadə edilərək həyata keçirildi.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读合并的读合并的读合并的读合 湿唼唼帽]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 合并 读数 唨 唶进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Obъedindennıe chteniya by annotirovanıs pomoщью BLASTN ilə istifadə olunan təxminlərə uyğun olaraq dannıx dvustvorcatıx mollyuskov NCBI (znachie e <1e-3 və 90% гомологии), a maskirovanie posledovatelnostey azlo DUVARLIK sərmayələri ilə [26]. Birləşdirilmiş oxunuşlar NCBI ikitaylı taksonomik verilənlər bazasından (e dəyəri <1e-3 və 90% homologiya) istifadə edərək BLASTN ilə qeyd edildi və aşağı mürəkkəblikli ardıcıllıq maskalanması DUST [26] istifadə edilərək həyata keçirildi.Oxunmalar iki qrupa bölündü: ikitaylı qapaqlı ardıcıllıqlarla əlaqəli (burada öz-özünə oxunmalar adlanır) və əlaqəsiz (öz-özünə oxunmayan) ardıcıllıqlar. İki qrup MEGAHIT istifadə edərək ayrıca toplanaraq ardıcıllıqlar yaradıldı [27]. Bu vaxt, yadplanetli mikrobiom oxunmalarının taksonomik paylanması Kraken2 [28] istifadə edərək təsnif edildi və qrafik olaraq Qalaktikada Krona dairəvi diaqramı ilə təmsil olundu [29, 30]. İlkin təcrübələrimizdən optimal kmerlərin kmer-59 olduğu müəyyən edildi. Öz-özünə bağlılıqlar daha sonra yekun annotasiya üçün BLASTN (ikitaylı NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq müəyyən edildi. Öz-özünə bağlılıqlar daha sonra yekun annotasiya üçün BLASTN (ikitaylı NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq müəyyən edildi. BLASTN (baza dannıx dvustvennıe contiqy by identificrovanı putem sopostavleniya NCBI, значение e <1e-10 və гомология 60%) üçün okonchatelnoy annotacii. Daha sonra öz-özünə bağlılıqlar yekun annotasiya üçün BLASTN (NCBI ikitaylı molyusk verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq müəyyən edildi.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN (dvustvorcatıx mollyuskov üçün NCBI bazası, <1e-10 və гомология 60%) üçün identifikasiya sənədləri. Daha sonra öz-özünə bağlılıqlar BLASTN (NCBI ikitaylı molyusk verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə uyğunlaşdırılaraq son annotasiya üçün müəyyən edildi. Paralel olaraq, öz-özünə qrup olmayan kontiqlər BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə qeyd edildi. Paralel olaraq, öz-özünə qrup olmayan kontiqlər BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya) ilə qeyd edildi. BLASTN (baza dannıx nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Paralel olaraq, xarici qrup əlaqələri BLASTN (NT NCBI verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə qeyd edildi.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组释非自身组重参参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组释非自身组重参参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (baza dannıx nt NCBI, значение e <1e-10 və гомология 60%). Paralel olaraq, öz-özünə qrup olmayan kontiqlər BLASTN (nt NCBI verilənlər bazası, e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya) ilə qeyd edildi. BLASTX həmçinin nr və RefSeq protein NCBI verilənlər bazalarından istifadə edərək öz-özünə bağlı olmayan cisimlər üzərində də aparılmışdır (e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya). BLASTX həmçinin nr və RefSeq protein NCBI verilənlər bazalarından istifadə edərək öz-özünə bağlı olmayan cisimlər üzərində də aparılmışdır (e dəyəri < 1e−10 və 60% homologiya). BLASTX eyni zamanda qeyri-müəyyən kontiqahları istifadə edərək, dannıx belka nr və RefSeq NCBI (znachie e <1e-10 və гомология 60%) ilə sübut edilmişdir. BLASTX həmçinin nr və RefSeq NCBI protein verilənlər bazalarından istifadə edərək öz-özünə bağlı olmayan cisimlər üzərində də həyata keçirilmişdir (e dəyəri < 1e-10 və 60% homologiya).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 撌60% 吧 吧 BLASTX eyni zamanda dannıx belka nr və RefSeq NCBI (znachie e <1e-10 və гомология 60%) ilə istifadə olunur. BLASTX həmçinin nr və RefSeq NCBI protein verilənlər bazalarından istifadə edərək öz-özünə bağlı olmayan cisimlər üzərində də aparılmışdır (e dəyəri <1e-10 və 60% homologiya).Öz-özünə bağlı olmayan BLASTN və BLASTX hovuzları son uyğunluqları təmsil edir (Əlavə fayla baxın).
PCR üçün istifadə edilən praymerlər Cədvəl S1-də verilmişdir. ccfDNT hədəf genlərini gücləndirmək üçün Taq DNT polimerazası (Bio Basic Canada, Markham, ON) istifadə edilmişdir. Aşağıdakı reaksiya şərtləri istifadə edilmişdir: 95°C-də 3 dəqiqə denaturasiya, 1 dəqiqə 95°C, 1 dəqiqə tavlama temperaturu təyin etmək, 72°C-də 1 dəqiqə uzadılma, 35 dövr və nəhayət 10 dəqiqə ərzində 72°C. . PCR məhsulları 95 V-da SYBRTM Safe DNT Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) tərkibli aqaroza gellərində (1,5%) elektroforezlə ayrılmışdır.
Midyələr (Mytilus spp.) 4°C-də 24 saat ərzində 500 ml oksigenli dəniz suyunda (32 PSU) akklimatizasiya edildi. İnsan qalektin-7 kDNT ardıcıllığını kodlayan əlavə (NCBI giriş nömrəsi L07769) olan plazmid DNT-si 190 μq/μl son konsentrasiyada flakona əlavə edildi. DNT əlavə edilmədən eyni şəraitdə inkubasiya edilmiş midiyalar nəzarət idi. Üçüncü nəzarət çənində midiyasız DNT var idi. Dəniz suyundakı DNT-nin keyfiyyətini izləmək üçün hər çəndən göstərilən vaxtda dəniz suyu nümunələri (20 μl; üç təkrar) götürüldü. Plazmid DNT-sinin izlənməsi üçün LB midiyaları göstərilən vaxtlarda toplandı və qPCR və ddPCR ilə təhlil edildi. Dəniz suyunun yüksək duz tərkibinə görə, bütün PCR analizlərindən əvvəl alikvotlar PCR keyfiyyətli suda (1:10) durulaşdırıldı.
Rəqəmsal damcı PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokolu (Mississauga, Ontario, Kanada) istifadə edilərək həyata keçirildi. Optimal temperaturu təyin etmək üçün temperatur profilindən istifadə edin (Cədvəl S1). Damcılar QX200 damcı generatoru (BioRad) istifadə edilərək yaradıldı. ddPCR aşağıdakı kimi həyata keçirildi: 5 dəqiqə 95°C, 30 saniyə 95°C-nin 50 dövrü və verilən tavlama temperaturu 1 dəqiqə və 30 saniyə 72°C, 5 dəqiqə 4°C və 90°C 5 dəqiqə ərzində. Damcıların sayı və müsbət reaksiyalar (nüsxələrin sayı/µl) QX200 damcı oxuyucusu (BioRad) istifadə edilərək ölçüldü. 10.000-dən az damcı olan nümunələr rədd edildi. Nümunə nəzarəti hər dəfə ddPCR aparıldıqda aparılmadı.
kVPZR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avstraliya) və LGALS7 spesifik praymerləri istifadə edilərək həyata keçirildi. Bütün kəmiyyət PZR-ləri QuantiFast SYBR Yaşıl PZR Dəsti (QIAGEN) istifadə edilərək 20 µl-də aparıldı. kVPZR 95°C-də 15 dəqiqəlik inkubasiya ilə başladı, ardınca 95°C-də 10 saniyə və 60°C-də 60 saniyə ərzində 40 dövrə bir məlumat toplamaqla davam etdi. Ərimə əyriləri kVPZR-nin sonunda 95°C-də 5 saniyə, 65°C-də 60 saniyə və 97°C-də ardıcıl ölçmələr istifadə edilərək yaradıldı. Nəzarət nümunələri istisna olmaqla, hər bir kVPZR üçqat nüsxədə aparıldı.
Midyələr yüksək filtrasiya sürəti ilə tanındığından, əvvəlcə dəniz suyunda mövcud olan DNT fraqmentlərini süzgəcdən keçirib saxlaya bilib-bilmədiklərini araşdırdıq. Həmçinin, bu fraqmentlərin yarı açıq limfa sistemində toplanıb-toplanmadığı ilə maraqlandıq. Bu məsələni mavi midiya çənlərinə əlavə edilən həll olan DNT fraqmentlərinin taleyini izləməklə eksperimental olaraq həll etdik. DNT fraqmentlərinin izlənməsini asanlaşdırmaq üçün insan qalektin-7 genini ehtiva edən yad (öz-özünə deyil) plazmid DNT-sindən istifadə etdik. ddPCR dəniz suyunda və midiyalarda plazmid DNT fraqmentlərini izləyir. Nəticələrimiz göstərir ki, dəniz suyundakı DNT fraqmentlərinin miqdarı midiya olmadığı zaman (7 günə qədər) nisbətən sabit qalıbsa, midiyaların iştirakı ilə bu səviyyə 8 saat ərzində demək olar ki, tamamilə yox olub (Şəkil 1a, b). Ekzogen DNT fraqmentləri klapan içi mayedə və hemolimfada 15 dəqiqə ərzində asanlıqla aşkar edilib (Şəkil 1c). Bu fraqmentlər məruz qaldıqdan 4 saata qədər aşkar edilə bilər. DNT fraqmentlərinə münasibətdə bu filtrasiya fəaliyyəti bakteriya və yosunların filtrasiya fəaliyyəti ilə müqayisə edilə bilər [31]. Bu nəticələr göstərir ki, midiyalar maye bölmələrində yad DNT-ni süzə və toplaya bilir.
Dəniz suyunda plazmid DNT-nin nisbi konsentrasiyaları, ddPCR ilə ölçülür, midiyaların iştirakı (A) və ya olmaması (B) halında. A-da nəticələr faizlə ifadə olunur, qutuların sərhədləri 75-ci və 25-ci persentilləri təmsil edir. Uyğun loqarifmik əyri qırmızı rəngdə, boz rənglə kölgələnmiş sahə isə 95% etibarlılıq intervalını təmsil edir. B-də qırmızı xətt orta qiyməti, mavi xətt isə konsentrasiya üçün 95% etibarlılıq intervalını təmsil edir. C Plazmid DNT-si əlavə edildikdən sonra müxtəlif vaxtlarda midiyaların hemolimfa və klapan mayesində plazmid DNT-nin toplanması. Nəticələr aşkar edilmiş mütləq nüsxələr/ml (±SE) kimi təqdim olunur.
Daha sonra, antropogen təsiri məhdud olan ucqar adalar qrupu olan Kerguelen adalarında midiya yataqlarından toplanan midiyalarda ccfDNA-nın mənşəyini araşdırdıq. Bu məqsədlə, midiya hemolimflərindən cccDNA təcrid edildi və insan cccDNA-sını təmizləmək üçün geniş istifadə olunan üsullarla təmizləndi [32, 33]. Midiyalarda orta hemolimf ccfDNA konsentrasiyalarının hemolimf ml-də aşağı mikroqram diapazonunda olduğunu aşkar etdik (Əlavə Məlumat, Cədvəl S2-yə baxın). Bu konsentrasiya diapazonu sağlam insanlarda olduğundan daha böyükdür (millilitrdə aşağı nanoqram), lakin nadir hallarda xərçəng xəstələrində ccfDNA səviyyəsi millilitrdə bir neçə mikroqrama çata bilər [34, 35]. Hemolimf ccfDNA-nın ölçü paylanmasının təhlili göstərdi ki, bu fraqmentlər ölçü baxımından çox dəyişir, 1000 bp-dən 1000 bp-yə qədər. 5000 bp-yə qədər dəyişir (Şəkil 2). Oxşar nəticələr, kriminalistika elmində ccfDNA da daxil olmaqla, aşağı konsentrasiyalı DNT nümunələrindən genomik DNT-ni sürətlə təcrid etmək və təmizləmək üçün geniş istifadə olunan bir üsul olan silisium əsaslı QIAamp Tədqiqatçı Dəsti istifadə edilərək əldə edilmişdir [36].
Midiya hemolimfasının nümunəvi ccfDNT elektroforeqramı. NucleoSnap Plazma Dəsti (yuxarıda) və QIAamp DNT Tədqiqatçı Dəsti ilə çıxarılıb. Midiyalarda hemolimfa ccfDNT konsentrasiyalarının (±SE) paylanmasını göstərən B Skripka qrafiki. Qara və qırmızı xətlər müvafiq olaraq medianı və birinci və üçüncü kvartilləri təmsil edir.
İnsanlarda və primatlarda ccfDNT-nin təxminən 1%-i xarici mənbəyə malikdir [21, 37]. İkitaylı molyuskların yarı açıq qan dövranı sistemi, mikroblarla zəngin dəniz suyu və midiya ccfDNT-nin ölçü paylanması nəzərə alınmaqla, midiya hemolimfası ccfDNT-nin zəngin və müxtəlif mikrob DNT hovuzuna malik ola biləcəyi fərziyyəsini irəli sürdük. Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün Kerguelen adalarından toplanan Aulacomya atra nümunələrindən hemolimfa ccfDNT-ni ardıcıllıqla araşdırdıq və 10 milyondan çox oxunuş əldə etdik ki, bunların 97,6%-i keyfiyyət nəzarətindən keçdi. Daha sonra oxunuşlar BLASTN və NCBI ikitaylı molyusk verilənlər bazalarından istifadə edərək öz-özünə və öz-özünə olmayan mənbələrə görə təsnif edildi (Şəkil S1, Əlavə Məlumat).
İnsanlarda həm nüvə, həm də mitoxondrial DNT qan dövranına buraxıla bilər [38]. Lakin, bu tədqiqatda, A. atra genomunun ardıcıllığı və ya təsviri olmadığı nəzərə alınmaqla, midiyaların nüvə genomik DNT-sini ətraflı təsvir etmək mümkün olmadı. Bununla belə, ikitaylı qapaqlı kitabxanadan istifadə edərək öz mənşəyimizə aid bir sıra ccfDNA fraqmentlərini müəyyən edə bildik (Şəkil S2, Əlavə Məlumat). Həmçinin ardıcıllığı olan A. atra genlərinin yönləndirilmiş PCR amplifikasiyası ilə öz mənşəyimizə aid DNT fraqmentlərinin mövcudluğunu təsdiqlədik (Şəkil 3). Eynilə, A. atra mitoxondrial genomu ictimai verilənlər bazalarında mövcud olduğundan, A. atra hemolimfində mitoxondrial ccfDNA fraqmentlərinin mövcudluğuna dair dəlillər tapmaq olar. Mitoxondrial DNT fraqmentlərinin mövcudluğu PCR amplifikasiyası ilə təsdiqləndi (Şəkil 3).
A. atra (qırmızı nöqtələr - stok nömrəsi: SRX5705969) və M. platensis (mavi nöqtələr - stok nömrəsi: SRX5705968) hemolimfasında PCR ilə gücləndirilmiş müxtəlif mitoxondrial genlər mövcud idi. Şəkil Breton və digərləri, 2011 B-dən uyğunlaşdırılmışdır. A. atra-dan hemolimfa supernatantının gücləndirilməsi FTA kağızında saxlanılır. PCR qarışığı olan PCR borusuna birbaşa əlavə etmək üçün 3 mm-lik yumruqdan istifadə edin.
Dəniz suyundakı bol mikrob tərkibini nəzərə alaraq, əvvəlcə hemolimfadakı mikrob DNT ardıcıllıqlarının xarakteristikasına diqqət yetirdik. Bunun üçün iki fərqli strategiyadan istifadə edirik. Birinci strategiyada BLAST və digər alətlərlə müqayisə edilə bilən dəqiqliklə mikrob ardıcıllıqlarını müəyyən edə bilən alqoritm əsaslı ardıcıllıq təsnifatı proqramı olan Kraken2 istifadə edilmişdir [28]. 6719-dan çox oxunuşun bakterial mənşəli olduğu, 124 və 64-ün isə müvafiq olaraq arxeya və viruslardan olduğu müəyyən edilmişdir (Şəkil 4). Ən çox rast gəlinən bakterial DNT fraqmentləri Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) və Bacteroidetes (17%) idi (Şəkil 4a). Bu paylanma dəniz mavi midiya mikrobiomunun əvvəlki tədqiqatları ilə uyğun gəlir [39, 40]. Gammaproteobacteria, bir çox Vibrionales də daxil olmaqla, Proteobacteria-nın əsas sinfi idi (44%) (Şəkil 4b). ddPCR metodu A. atra hemolimfinin ccfDNT-sində Vibrio DNT fraqmentlərinin mövcudluğunu təsdiqlədi (Şəkil 4c) [41]. ccfDNT-nin bakterial mənşəyi haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün əlavə bir yanaşma tətbiq edildi (Şəkil S2, Əlavə Məlumat). Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşa uclu oxunuşlar kimi yığılmış və BLASTN, 1e−3 e dəyəri və >90% homologiya ilə kəsişmə istifadə edilərək öz-özünə (ikitaylı molyusk) və ya öz-özünə mənşəli kimi təsnif edilmişdir. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşa uclu oxunuşlar kimi yığılmış və BLASTN, 1e−3 e dəyəri və >90% homologiya ilə kəsişmə istifadə edilərək öz-özünə (ikitaylı molyusk) və ya öz-özünə mənşəli kimi təsnif edilmişdir. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами və были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN və значения в 190%. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi toplanmış və BLASTN və 1e-3 e dəyəri və >90% homologiya ilə kəsişmə istifadə edilərək doğma (ikitaylı) və ya qeyri-orijinal kimi təsnif edilmişdir.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值% 值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 佚用 使用 佚用 用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения бли собраны как чтения с парными концами və классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) və ya несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN i 1e-i BLASTN və 1e. Bu halda, üst-üstə düşən oxunuşlar qoşalaşmış oxunuşlar kimi toplanmış və e BLASTN və 1e-3 dəyərlərindən və homologiya həddi >90% istifadə edilərək öz (ikitaylı mopsiküllü) və ya qeyri-orijinal kimi təsnif edilmişdir.A. atra genomu hələ ardıcıllıqla müəyyən edilmədiyindən, MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler-in de novo yığım strategiyasından istifadə etdik. Cəmi 147.188 kontiq mənşəli asılı (ikitaylı) kimi müəyyən edilmişdir. Bu kontiqlər daha sonra BLASTN və BLASTX istifadə edərək 1e-10 e-dəyərləri ilə partladıldı. Bu strategiya bizə A. atra ccfDNT-də mövcud olan 482 ikitaylı olmayan fraqmenti müəyyən etməyə imkan verdi. Bu DNT fraqmentlərinin yarıdan çoxu (57%) bakteriyalardan, əsasən sulfotrofik simbiontlar da daxil olmaqla qəlsəmə simbiontlarından və qəlsəmə simbiontları Solemya velum-dan əldə edilmişdir (Şəkil 5).
Tip səviyyəsində nisbi bolluq. B İki əsas filanın (Firmicutes və Proteobacteria) mikrob müxtəlifliyi. ddPCR-in nümayəndəli amplifikasiyası C Vibrio spp. A. Üç atra hemolimfasında 16S rRNA geninin fraqmentləri (mavi).
Toplanmış 482 kontiq təhlil edilmişdir. Metagenomik kontiq annotasiyalarının (prokaryotlar və ökaryotlar) taksonomik paylanmasının ümumi profili. B BLASTN və BLASTX tərəfindən müəyyən edilmiş bakterial DNT fraqmentlərinin ətraflı paylanması.
Kraken2 təhlili həmçinin göstərdi ki, midiya ccfDNT-sində Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) və Thaurmarcheota (11%) DNT fraqmentləri də daxil olmaqla arxaeal DNT fraqmentləri var (Şəkil 6a). Əvvəllər Kaliforniya midiyalarının mikrob icmasında tapılan Euryarchaeota və Crenarchaeota-dan əldə edilən DNT fraqmentlərinin olması təəccüblü olmamalıdır [42]. Euryarchaeota tez-tez ekstremal şəraitlə əlaqələndirilsə də, indi həm Euryarchaeota, həm də Crenarcheota-nın dəniz kriogen mühitində ən çox yayılmış prokaryotlar arasında olduğu qəbul edilir [43, 44]. Kerguelen Yaylasında dib sızmalarından geniş metan sızmaları [45] və Kerguelen adaları sahillərində müşahidə edilən mümkün mikrob metan istehsalı [46] nəzərə alınmaqla, midiyalarda metanogen mikroorqanizmlərin olması təəccüblü deyil.
Daha sonra diqqətimiz DNT viruslarından alınan göstəricilərə yönəldi. Bildiyimiz qədəri ilə, bu, midiyaların virus tərkibinin ilk hədəfdən kənar tədqiqatıdır. Gözlənildiyi kimi, bakteriofaqların (Caudovirales) DNT fraqmentlərini tapdıq (Şəkil 6b). Lakin, ən çox yayılmış virus DNT-si, nüvə sitoplazmatik böyük DNT virusu (NCLDV) kimi də tanınan və istənilən virusun ən böyük genomuna malik olan nukleotsitoviruslar filumundan gəlir. Bu filum daxilində əksər DNT ardıcıllıqları təbii sahibləri onurğalılar və artropodlar olan Mimimidoviridae (58%) və Poxviridae (21%) ailələrinə aiddir, bu DNT ardıcıllıqlarının kiçik bir hissəsi isə məlum virusoloji yosunlara aiddir. Dəniz ökaryotik yosunlarını yoluxdurur. Ardıcıllıqlar həmçinin məlum olan istənilən virus cinsinin ən böyük genom ölçüsünə malik nəhəng virus olan Pandora virusundan da əldə edilmişdir. Maraqlıdır ki, hemolimf ccfDNA ardıcıllığı ilə müəyyən edilən virusa yoluxduğu bilinən sahiblərin diapazonu nisbətən böyük idi (Şəkil S3, Əlavə Məlumat). Buraya Baculoviridae və Iridoviridae kimi həşəratları yoluxduran viruslar, eləcə də amöb, yosun və onurğalıları yoluxduran viruslar daxildir. Həmçinin Pithovirus sibericum genomuna uyğun ardıcıllıqlar tapdıq. Pitoviruslar (həmçinin "zombi virusları" kimi tanınır) ilk dəfə Sibirdəki 30.000 illik əbədi buzlaqdan təcrid olunmuşdur [47]. Beləliklə, nəticələrimiz bu virusların bütün müasir növlərinin nəsli kəsilmədiyini [48] və bu virusların ucqar subarktik dəniz ekosistemlərində mövcud ola biləcəyini göstərən əvvəlki hesabatlarla uyğun gəlir.
Nəhayət, digər çoxhüceyrəli heyvanlardan DNT fraqmentlərini tapa biləcəyimizi yoxlamaq üçün testlər apardıq. BLASTN və BLASTX vasitəsilə nt, nr və RefSeq kitabxanaları (genom və protein) ilə cəmi 482 xarici kontiq müəyyən edildi. Nəticələrimiz göstərir ki, çoxhüceyrəli heyvanların ccfDNT-sinin xarici fraqmentləri arasında sümüklü sümüklərin DNT-si üstünlük təşkil edir (Şəkil 5). Həşəratlardan və digər növlərdən DNT fraqmentləri də tapılıb. DNT fraqmentlərinin nisbətən böyük bir hissəsi müəyyən edilməyib, bu, ehtimal ki, quru növləri ilə müqayisədə genom verilənlər bazalarında çox sayda dəniz növünün az təmsil olunması ilə əlaqədardır [49].
Bu məqalədə, hemolimfa ccfDNA atış ardıcıllığının dəniz sahil ekosistemlərinin tərkibinə dair məlumat verə biləcəyini iddia edərək, LB konsepsiyasını midiyalara tətbiq edirik. Xüsusilə, 1) midiya hemolimfasının nisbətən böyük (~1-5 kb) dövran edən DNT fraqmentlərinin nisbətən yüksək konsentrasiyalarını (mikroqram səviyyələri) ehtiva etdiyini; 2) bu DNT fraqmentlərinin həm müstəqil, həm də müstəqil olmadığını müəyyən etdik. 3) Bu DNT fraqmentlərinin xarici mənbələri arasında bakterial, arxeal və virus DNT-sini, eləcə də digər çoxhüceyrəli heyvanların DNT-sini tapdıq; 4) Bu xarici ccfDNA fraqmentlərinin hemolimfada toplanması sürətlə baş verir və midiyaların daxili filtrasiya fəaliyyətinə töhfə verir. Nəticə olaraq, tədqiqatımız göstərir ki, indiyə qədər əsasən biotibb sahəsində tətbiq olunan LB konsepsiyası, keşikçi növləri ilə onların mühiti arasındakı qarşılıqlı təsiri daha yaxşı başa düşmək üçün istifadə edilə bilən zəngin, lakin araşdırılmamış bilik mənbəyini kodlaşdırır.
Primatlardan əlavə, siçan, it, pişik və at da daxil olmaqla məməlilərdə ccfDNA-nın təcrid olunması barədə məlumat verilmişdir [50, 51, 52]. Lakin, bildiyimiz qədər, tədqiqatımız açıq dövran sistemi olan dəniz növlərində ccfDNA-nın aşkarlanması və ardıcıllığı barədə məlumat verən ilk tədqiqatdır. Midyələrin bu anatomik xüsusiyyəti və filtrasiya qabiliyyəti, ən azı qismən, digər növlərlə müqayisədə dövran edən DNT fraqmentlərinin fərqli ölçülü xüsusiyyətlərini izah edə bilər. İnsanlarda qanda dövran edən DNT fraqmentlərinin əksəriyyəti 150 ilə 200 bp arasında dəyişən kiçik fraqmentlərdir və maksimum zirvəsi 167 bp-dir [34, 53]. DNT fraqmentlərinin kiçik, lakin əhəmiyyətli bir hissəsi 300 ilə 500 bp arasında ölçüdədir və təxminən 5%-i 900 bp-dən uzundur [54]. Bu ölçü bölgüsünün səbəbi, plazmadakı ccfDNT-nin əsas mənbəyinin hüceyrə ölümü nəticəsində, ya sağlam fərdlərdə hüceyrə ölümü, ya da qan dövranı hüceyrələrinin nekrozu, ya da xərçəng xəstələrində şiş hüceyrələrinin apoptozu (qan dövranı şiş DNT-si kimi tanınır) nəticəsində meydana gəlməsidir. , ctDNA). Midyelərdə tapdığımız hemolimfa ccfDNT-nin ölçü bölgüsü 1000 ilə 5000 bp arasında dəyişdi, bu da midye ccfDNT-nin fərqli bir mənşəyə malik olduğunu göstərir. Bu, məntiqi bir fərziyyədir, çünki midyelər yarı açıq damar sisteminə malikdir və yüksək konsentrasiyalı mikrob genom DNT-si olan dəniz su mühitlərində yaşayırlar. Əslində, ekzogen DNT istifadə edərək apardığımız laboratoriya təcrübələri göstərdi ki, midyelər dəniz suyunda DNT fraqmentləri toplayır, ən azı bir neçə saatdan sonra hüceyrə tərəfindən mənimsənildikdən və/və ya buraxıldıqdan və/və ya müxtəlif təşkilatlarda saxlanıldıqdan sonra parçalanırlar. Hüceyrələrin (həm prokaryotik, həm də eukaryotik) nadir olması nəzərə alınmaqla, qapaqdaxili bölmələrin istifadəsi həm öz mənbələrindən, həm də xarici mənbələrdən gələn ccfDNT miqdarını azaldacaq. İkiqat qapaqlı anadangəlmə immunitetin və çox sayda dövran edən faqositlərin əhəmiyyətini nəzərə alaraq, hətta xarici ccfDNT-nin belə mikroorqanizmlərin və/və ya hüceyrə qalıqlarının qəbulu zamanı xarici DNT toplayan dövran edən faqositlərlə zənginləşdiyini fərz etdik. Ümumilikdə, nəticələrimiz göstərir ki, ikiqat qapaqlı hemolimfa ccfDNT molekulyar məlumatların unikal anbarıdır və onların keşikçi növ kimi statusunu gücləndirir.
Məlumatlarımız göstərir ki, bakteriyalardan əldə edilən hemolimf ccfDNT fraqmentlərinin ardıcıllığı və təhlili, sahib bakteriya florası və ətraf dəniz ekosistemində mövcud olan bakteriyalar haqqında əsas məlumat verə bilər. Atış ardıcıllığı üsulları, qismən istinad kitabxanası qərəzliliyi səbəbindən ənənəvi 16S rRNA identifikasiya metodlarından istifadə olunsaydı, əldən düşəcək kommensal bakteriya A. atra gill ardıcıllıqlarını aşkar etmişdir. Əslində, Kerguelendəki eyni midiya təbəqəsindəki M. platensis-dən toplanan LB məlumatlarından istifadəmiz göstərdi ki, qəlsəmə ilə əlaqəli bakteriya simbiontlarının tərkibi hər iki midiya növü üçün eynidir (Şəkil S4, Əlavə Məlumat). İki genetik cəhətdən fərqli midiyanın bu oxşarlığı Kerguelenin soyuq, kükürdlü və vulkanik çöküntülərindəki bakteriya icmalarının tərkibini əks etdirə bilər [55, 56, 57, 58]. Port-o-Frans sahilləri kimi bioturbasiya olunmuş sahil ərazilərindən [59] midiyalar yığılarkən daha yüksək səviyyəli kükürd azaldıcı mikroorqanizmlər yaxşı təsvir edilmişdir. Digər bir ehtimal isə, kommensal midiya florasının üfüqi ötürülmədən təsirlənə bilməsidir [60, 61]. Dəniz mühiti, dəniz dibi səthi və midiyalardakı simbiotik bakteriyaların tərkibi arasındakı əlaqəni müəyyən etmək üçün daha çox tədqiqata ehtiyac var. Bu tədqiqatlar hazırda davam edir.
Hemolimf ccfDNT-nin uzunluğu və konsentrasiyası, təmizlənməsinin asanlığı və sürətli ov tüfəngi ardıcıllığına imkan verən yüksək keyfiyyət, dəniz sahil ekosistemlərində biomüxtəlifliyi qiymətləndirmək üçün midiya ccfDNT-dən istifadənin bir çox üstünlüklərindən bəziləridir. Bu yanaşma, xüsusilə müəyyən bir ekosistemdə virus icmalarını (viromları) xarakterizə etmək üçün təsirlidir [62, 63]. Bakteriyalardan, arxeyalardan və eukaryotlardan fərqli olaraq, virus genomlarında 16S ardıcıllığı kimi filogenetik olaraq qorunan genlər yoxdur. Nəticələrimiz göstərir ki, midiya kimi indikator növlərindən alınan maye biopsiyalar, adətən sahil dəniz ekosistemlərində yaşayan sahibləri yoluxdurduğu bilinən nisbətən çox sayda ccfDNT virus fraqmentlərini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Buraya protozoa, artropodlar, həşəratlar, bitkilər və bakterial virusları (məsələn, bakteriofaqlar) yoluxdurduğu bilinən viruslar daxildir. Kerguelendə eyni midiya təbəqəsində toplanan mavi midiyaların (M. platensis) hemolimf ccfDNT viromunu araşdırdığımız zaman oxşar bir paylanma aşkar edilmişdir (Cədvəl S2, Əlavə Məlumat). ccfDNT-nin tüfənglə ardıcıllıqla təyin edilməsi, həqiqətən də, insan və ya digər növlərin viromunun öyrənilməsində geniş vüsət alan yeni bir yanaşmadır [21, 37, 64]. Bu yanaşma, xüsusilə ikiqat zəncirli DNT viruslarının öyrənilməsi üçün faydalıdır, çünki Baltimordakı ən müxtəlif və geniş virus sinfini təmsil edən bütün ikiqat zəncirli DNT virusları arasında heç bir gen qorunub saxlanılmayıb [65]. Bu virusların əksəriyyəti təsnif olunmamış qalsa da və virus dünyasının tamamilə naməlum bir hissəsindən olan virusları da əhatə edə bilsə də [66], A. atra və M. platensis midiyalarının viromlarının və sahib diapazonlarının iki növ arasında oxşar şəkildə düşdüyünü aşkar etdik (əlavə məlumat üçün şəkil S3-ə baxın). Bu oxşarlıq təəccüblü deyil, çünki ətraf mühitdə mövcud olan DNT-nin mənimsənilməsində selektivliyin olmamasını əks etdirə bilər. RNT viromunu xarakterizə etmək üçün təmizlənmiş RNT istifadə edən gələcək tədqiqatlara hazırda ehtiyac var.
Tədqiqatımızda, Kowarski və həmkarlarının [37] işlərindən uyğunlaşdırılmış çox ciddi bir boru kəmərindən istifadə etdik. Onlar yerli ccfDNA-nın yığılmasından əvvəl və sonra birləşdirilmiş oxunuşların və əlaqəli məlumatların iki mərhələli silinməsindən istifadə etdilər və nəticədə xəritələşdirilməmiş oxunuşların yüksək nisbəti yarandı. Buna görə də, bu xəritələşdirilməmiş oxunuşların bəzilərinin hələ də öz mənşəyinə malik ola biləcəyini istisna edə bilmərik, əsasən bu midiya növü üçün istinad genomumuz yoxdur. Biz həmçinin bu boru kəmərindən istifadə etdik, çünki öz-özünə və öz-özünə olmayan oxunuşlar arasındakı ximeralar və Illumina MiSeq PE75 tərəfindən yaradılan oxunuş uzunluqları ilə bağlı narahat idik. Xəritələşdirilməmiş oxunuşların əksəriyyətinin digər bir səbəbi, xüsusən Kerguelen kimi ucqar ərazilərdə dəniz mikroblarının çoxunun qeyd edilməməsidir. Biz ccfDNA fraqmentlərinin uzunluqlarının insan ccfDNA-sına bənzər olduğunu fərz edərək Illumina MiSeq PE75-dən istifadə etdik. Gələcək tədqiqatlar üçün hemolimfa ccfDNA-nın insanlara və/və ya məməlilərə nisbətən daha uzun oxuma qabiliyyətinə malik olduğunu göstərən nəticələrimizi nəzərə alaraq, daha uzun ccfDNA fraqmentləri üçün daha uyğun bir ardıcıllıq platformasından istifadə etməyi tövsiyə edirik. Bu təcrübə daha dərin təhlil üçün daha çox göstəricinin müəyyən edilməsini daha asanlaşdıracaq. Hal-hazırda mövcud olmayan tam A. atra nüvə genom ardıcıllığının əldə edilməsi ccfDNA-nın öz və öz olmayan mənbələrdən fərqləndirilməsini də xeyli asanlaşdıracaq. Tədqiqatımızın maye biopsiyası konsepsiyasının midiyalara tətbiq edilməsi ehtimalına yönəldiyini nəzərə alsaq, ümid edirik ki, bu konsepsiya gələcək tədqiqatlarda istifadə olunduqca, midiyaların mikrob müxtəlifliyini öyrənmək üçün bu metodun potensialını artırmaq üçün yeni alətlər və boru kəmərləri hazırlanacaq. dəniz ekosistemləri.
Qeyri-invaziv klinik biomarker kimi, insan plazmasında ccfDNT-nin yüksək səviyyəsi müxtəlif xəstəliklər, toxuma zədələnməsi və stress şəraiti ilə əlaqələndirilir [67,68,69]. Bu artım toxuma zədələnməsindən sonra öz mənşəli DNT fraqmentlərinin sərbəst buraxılması ilə əlaqələndirilir. Bu məsələni kəskin istilik stressindən istifadə edərək həll etdik, bu zaman midiyalar qısa müddətə 30 °C temperatura məruz qalırdı. Bu təhlili üç müstəqil təcrübədə üç fərqli midiya növü üzərində apardıq. Lakin, kəskin istilik stressindən sonra ccfDNT səviyyələrində heç bir dəyişiklik aşkar etmədik (əlavə məlumat üçün Şəkil S5-ə baxın). Bu kəşf, ən azı qismən, midiyaların yarı açıq qan dövranı sisteminə malik olması və yüksək filtrasiya aktivliyinə görə çox miqdarda yad DNT toplaması faktını izah edə bilər. Digər tərəfdən, bir çox onurğasızlar kimi, midiyalar da stressdən qaynaqlanan toxuma zədələnməsinə daha davamlı ola bilər və bununla da hemolimfalarında ccfDNT-nin sərbəst buraxılmasını məhdudlaşdırır [70, 71].
Bu günə qədər su ekosistemlərində biomüxtəlifliyin DNT analizi əsasən ətraf mühit DNT-sinin (eDNT) metabarkodlaşdırmasına yönəlmişdir. Lakin, primerlər istifadə edildikdə bu metod adətən biomüxtəliflik analizində məhdud olur. Tüfəng ardıcıllığının istifadəsi PCR-in məhdudiyyətlərini və primer dəstlərinin qərəzli seçimini aradan qaldırır. Beləliklə, müəyyən mənada bizim metodumuz, parçalanmış DNT-ni birbaşa ardıcıllaşdırmağa və demək olar ki, bütün orqanizmləri təhlil etməyə qadir olan, bu yaxınlarda istifadə edilən yüksək məhsuldarlıqlı eDNT Tüfəng ardıcıllığı metoduna daha yaxındır [72, 73]. Bununla belə, LB-ni standart eDNT metodlarından fərqləndirən bir sıra fundamental məsələlər mövcuddur. Əlbəttə ki, eDNT və LB arasındakı əsas fərq təbii filtr sahiblərinin istifadəsidir. Süngərlər və ikitaylı molyusklar (Dresseina spp.) kimi dəniz növlərinin eDNT-ni öyrənmək üçün təbii filtr kimi istifadəsi bildirilmişdir [74, 75]. Lakin Dreissenanın tədqiqatında DNT-nin çıxarıldığı toxuma biopsiyalarından istifadə edilmişdir. LB-dən ccfDNA-nın təhlili toxuma biopsiyası, eDNA və ya toxuma biopsiyası ilə əlaqəli ixtisaslaşmış və bəzən bahalı avadanlıq və logistika tələb etmir. Əslində, bu yaxınlarda bildirmişdik ki, LB-dən ccfDNA soyuq zəncir saxlamadan FTA dəstəyi ilə saxlanıla və təhlil edilə bilər ki, bu da ucqar ərazilərdə tədqiqatlar üçün böyük bir çətinlikdir [76]. Maye biopsiyalardan ccfDNA-nın çıxarılması da sadədir və ov tüfəngi ardıcıllığı və PCR analizi üçün yüksək keyfiyyətli DNT təmin edir. Bu, eDNA analizi ilə əlaqəli bəzi texniki məhdudiyyətlər nəzərə alınmaqla böyük üstünlükdür [77]. Nümunə götürmə metodunun sadəliyi və aşağı qiyməti uzunmüddətli monitorinq proqramları üçün də xüsusilə uyğundur. Yüksək filtrasiya qabiliyyətinə əlavə olaraq, ikitaylı molyuskların digər tanınmış xüsusiyyəti, virusların udulmasını təşviq edən seliklərinin kimyəvi mukopolisakkarid tərkibidir [78, 79]. Bu, ikitaylı molyuskları müəyyən bir su ekosistemində biomüxtəlifliyi və iqlim dəyişikliyinin təsirini xarakterizə etmək üçün ideal təbii filtrə çevirir. Ev sahibindən əldə edilən DNT fraqmentlərinin olması metodun eDNT ilə müqayisədə məhdudiyyəti kimi qəbul edilə bilsə də, eDNT ilə müqayisədə belə bir doğma ccfDNT-yə sahib olmağın dəyəri eyni zamanda sağlamlıq tədqiqatları üçün mövcud olan çoxlu məlumat üçün başa düşüləndir. ofset ev sahibi. Buraya ev sahibinin genomuna inteqrasiya olunmuş virus ardıcıllıqlarının olması daxildir. Bu, xüsusilə ikitaylı molyusklarda üfüqi ötürülən leykemik retrovirusların olması nəzərə alınmaqla midiyalar üçün vacibdir [80, 81]. LB-nin eDNT-yə nisbətən digər bir üstünlüyü, mikroorqanizmləri (və onların genomlarını) udan hemolimfada dövran edən qan hüceyrələrinin faqositik aktivliyindən istifadə etməsidir. Faqositoz ikitaylı molyusklarda qan hüceyrələrinin əsas funksiyasıdır [82]. Nəhayət, metod midiyaların yüksək filtrasiya qabiliyyətindən (orta hesabla 1,5 l/saat dəniz suyu) və iki günlük dövrandan istifadə edir ki, bu da dəniz suyunun müxtəlif təbəqələrinin qarışmasını artırır və heteroloji eDNT-nin tutulmasına imkan verir. [83, 84]. Beləliklə, midiya ccfDNA analizi midiyaların qidalanma, iqtisadi və ətraf mühitə təsirləri nəzərə alınmaqla maraqlı bir yoldur. İnsanlardan toplanan LB analizinə bənzər şəkildə, bu metod həmçinin ekzogen maddələrə cavab olaraq ev sahibi DNT-də genetik və epigenetik dəyişikliklərin ölçülməsi imkanını açır. Məsələn, nanoməsamə ardıcıllığı istifadə edərək yerli ccfDNA-da genom üzrə metilləşmə analizini aparmaq üçün üçüncü nəsil ardıcıllıq texnologiyaları nəzərdə tutula bilər. Bu proses, midiya ccfDNA fraqmentlərinin uzunluğunun kimyəvi transformasiyalara ehtiyac olmadan tək bir ardıcıllıqla genom üzrə DNT metilləşmə analizinə imkan verən uzun oxunan ardıcıllıq platformaları ilə ideal şəkildə uyğun olması ilə asanlaşdırılmalıdır.85,86] Bu, maraqlı bir ehtimaldır, çünki DNT metilləşmə nümunələrinin ətraf mühit stressinə cavabı əks etdirdiyi və bir çox nəsillər boyu davam etdiyi göstərilmişdir. Buna görə də, iqlim dəyişikliyinə və ya çirkləndiricilərə məruz qaldıqdan sonra reaksiyanı tənzimləyən əsas mexanizmlər haqqında dəyərli məlumat verə bilər [87]. Lakin, LB-nin istifadəsi məhdudiyyətsiz deyil. Sözsüz ki, bunun üçün ekosistemdə göstərici növlərinin olması tələb olunur. Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, müəyyən bir ekosistemin biomüxtəlifliyini qiymətləndirmək üçün LB-dən istifadə etmək, mənbədən DNT fraqmentlərinin mövcudluğunu nəzərə alan ciddi bioinformatika boru kəməri tələb edir. Digər əsas problem dəniz növləri üçün istinad genomlarının mövcudluğudur. Dəniz Məməli Genomları Layihəsi və bu yaxınlarda yaradılmış Fish10k layihəsi [88] kimi təşəbbüslərin gələcəkdə bu cür təhlili asanlaşdıracağına ümid edilir. LB konsepsiyasının dəniz filtri ilə qidalanan orqanizmlərə tətbiqi də ardıcıllıq texnologiyasındakı ən son nailiyyətlərlə uyğundur və ətraf mühitin stresinə cavab olaraq dəniz yaşayış mühitlərinin sağlamlığı haqqında vacib məlumat vermək üçün çoxohmlu biomarkerlərin hazırlanması üçün çox uyğundur.
Genom ardıcıllığı məlumatları NCBI Ardıcıllıq Oxu Arxivində https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ünvanında Bioprojects SRR8924808 bölməsində yerləşdirilib.
Brierley AS, Kingsford MJ İqlim dəyişikliyinin dəniz həyatı və ekosistemlərinə təsiri. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S və b. İqlim dəyişikliyinin və digər yerli stress faktorlarının dəniz mühitinə birgə təsirlərini nəzərdən keçirin. ümumi elmi mühit. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P və s. ). Martın birinci elmi. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Təkrarlanan istilik stressi şəraitində istiliyə dözümlülüyünün azalması mavi midiyaların yayda yüksək ölüm nisbətini izah edir. Elmi hesabat 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER və b. Heyvan ölümlərinin tezliyində, səbəblərində və həcmində son dəyişikliklər. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Bir çox qeyri-spesifik patogenlər Pinna nobilis-in kütləvi ölümünə səbəb ola bilər. Həyat. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. İqlim dəyişikliyinin Arktika zoonotik xəstəliklərinə potensial təsiri. Beynəlxalq Circumpolar sağlamlıq jurnalı. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. və b. Sahil çirklənməsinin monitorinqində siqnal orqanizmləri kimi mavi midiyalar (Mytilus edulis spp.): icmal. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Xərçəng müalicəsində maye biopsiyasının inteqrasiyası. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C və b. Maye biopsiyasının yetkinləşməsi: Şiş DNT-sinin dövran etməsinə imkan verir. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. İnsan plazmasındakı nuklein turşuları. Soc Biol törəmə şirkətlərinin iclas protokolları. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Xərçəng müalicəsi üçün molekulyar marker kimi hüceyrəsiz DNT-nin yeni rolu. Biomolyar analizin kəmiyyətləndirilməsi. 2019;17:100087.
İqnatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Maye biopsiya klinikaya daxil olur - tətbiq problemləri və gələcək çətinliklər. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW və başqaları. Dölün DNT-si ananın plazmasında və serumunda mövcuddur. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Hamiləlik dövründə qadınların qanında dövran edən hüceyrədənkənar RNT-dən istifadə edərək hamiləliyin gedişatının və onun ağırlaşmalarının öyrənilməsi. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J və b. Maye biopsiya: böyrək transplantatında allogenik lezyonları aşkar etmək üçün donor hüceyrəsiz DNT istifadə olunur. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Prenatal diaqnostikada innovasiyalar: ana plazma genomunun ardıcıllığı. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D və b. Yoluxmuş bədən mayelərinin növbəti nəsil metagenomik ardıcıllığı ilə sürətli patogen aşkarlanması. Nat Medicine. 2021;27:115-24.