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A biópsia líquida (BL) é um conceito que vem ganhando popularidade rapidamente na área biomédica. O conceito baseia-se principalmente na detecção de fragmentos de DNA extracelular circulante (ccfDNA), que são liberados principalmente como pequenos fragmentos após a morte celular em vários tecidos. Uma pequena proporção desses fragmentos se origina de tecidos ou organismos estranhos. No trabalho atual, aplicamos esse conceito a mexilhões, uma espécie sentinela conhecida por sua alta capacidade de filtração da água do mar. Utilizamos a capacidade dos mexilhões de atuarem como filtros naturais para capturar fragmentos de DNA ambientais de uma variedade de fontes para fornecer informações sobre a biodiversidade de ecossistemas costeiros marinhos. Nossos resultados mostram que a hemolinfa do mexilhão contém fragmentos de DNA que variam muito em tamanho, de 1 a 5 kb. O sequenciamento shotgun mostrou que um grande número de fragmentos de DNA são de origem microbiana estranha. Entre eles, encontramos fragmentos de DNA de bactérias, arqueas e vírus, incluindo vírus conhecidos por infectar uma variedade de hospedeiros comumente encontrados em ecossistemas marinhos costeiros. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB aplicado a mexilhões representa uma fonte rica, mas ainda inexplorada, de conhecimento sobre a diversidade microbiana em ecossistemas costeiros marinhos.
O impacto das mudanças climáticas (MC) na biodiversidade dos ecossistemas marinhos é uma área de pesquisa em rápido crescimento. O aquecimento global não só causa estresses fisiológicos importantes, mas também expande os limites evolutivos da estabilidade térmica dos organismos marinhos, afetando o habitat de uma série de espécies, levando-as a buscar condições mais favoráveis ​​[1, 2]. Além de afetar a biodiversidade dos metazoários, as MC interrompem o delicado equilíbrio das interações hospedeiro-microbiano. Essa disbacteriose microbiana representa uma séria ameaça aos ecossistemas marinhos, pois torna os organismos marinhos mais suscetíveis a patógenos infecciosos [3, 4]. Acredita-se que as MC desempenham um papel importante nas mortes em massa, o que é um problema sério para a gestão dos ecossistemas marinhos globais [5, 6]. Esta é uma questão importante, dados os impactos econômicos, ecológicos e nutricionais de muitas espécies marinhas. Isso é especialmente verdadeiro para bivalves que vivem nas regiões polares, onde os efeitos das MC são mais imediatos e severos [6, 7]. De fato, bivalves como Mytilus spp. são amplamente utilizados para monitorar os efeitos do CC em ecossistemas marinhos. Não surpreendentemente, um número relativamente grande de biomarcadores foi desenvolvido para monitorar sua saúde, frequentemente usando uma abordagem de dois níveis envolvendo biomarcadores funcionais baseados na atividade enzimática ou funções celulares, como viabilidade celular e atividade fagocítica [8]. Esses métodos também incluem a medição da concentração de indicadores de pressão específicos que se acumulam em tecidos moles após a absorção de grandes quantidades de água do mar. No entanto, a alta capacidade de filtração e o sistema circulatório semiaberto dos bivalves fornecem uma oportunidade para desenvolver novos biomarcadores de hemolinfa usando o conceito de biópsia líquida (BL), uma abordagem simples e minimamente invasiva para o gerenciamento de pacientes. amostras de sangue [9, 10]. Embora vários tipos de moléculas circulantes possam ser encontrados no LB humano, esse conceito é baseado principalmente na análise de sequenciamento de DNA de fragmentos de DNA extracelular circulante (ccfDNA) no plasma. De fato, a presença de DNA circulante no plasma humano é conhecida desde meados do século XX [11], mas foi somente nos últimos anos que o advento de métodos de sequenciamento de alto rendimento levou ao diagnóstico clínico baseado em ccfDNA. A presença desses fragmentos de DNA circulante se deve, em parte, à liberação passiva de DNA genômico (nuclear e mitocondrial) após a morte celular. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes que sofrem de diversas patologias ou submetidos a estresse, resultando em danos aos tecidos. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes que sofrem de diversas patologias ou submetidos a estresse, resultando em danos aos tecidos. Para manter a conexão segura em um nível normal (<10 ng/m), você não pode fazer isso em 5–10 dias. больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Em pessoas saudáveis, a concentração de cccDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com diversas patologias ou sob estresse que leva a danos nos tecidos.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤A conversão de cfDNA é baixa (<10 ng/m) no mundo, mas você não pode se atualizar em 5 a 10 dias. pacientes com patologias comuns ou стрессом, что приводит к повреждению тканей. As concentrações de ccfDNA são geralmente baixas (<10 ng/ml) em indivíduos saudáveis, mas podem aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com diversas patologias ou estresse, resultando em danos aos tecidos.O tamanho dos fragmentos de ccfDNA varia amplamente, mas geralmente varia de 150 a 200 pb. [12]. A análise de ccfDNA autoderivado, ou seja, ccfDNA de células hospedeiras normais ou transformadas, pode ser usada para detectar alterações genéticas e epigenéticas presentes no genoma nuclear e/ou mitocondrial, ajudando assim os médicos a selecionar terapias moleculares específicas [13]. No entanto, o ccfDNA pode ser obtido de fontes estranhas, como o ccfDNA de células fetais durante a gravidez ou de órgãos transplantados [14,15,16,17]. O ccfDNA também é uma importante fonte de informações para detectar a presença de ácidos nucleicos de um agente infeccioso (estranho), o que permite a detecção não invasiva de infecções disseminadas não identificadas por hemoculturas, evitando a biópsia invasiva de tecido infectado [18]. Estudos recentes mostraram de fato que o sangue humano contém uma rica fonte de informações que pode ser usada para identificar patógenos virais e bacterianos, e que cerca de 1% do ccfDNA encontrado no plasma humano é de origem estranha [19]. Esses estudos demonstram que a biodiversidade do microbioma circulante de um organismo pode ser avaliada por meio da análise de ccfDNA. No entanto, até recentemente, esse conceito era utilizado exclusivamente em humanos e, em menor grau, em outros vertebrados [20, 21].
No presente artigo, usamos o potencial LB para analisar o ccfDNA de Aulacomya atra, uma espécie do sul comumente encontrada nas Ilhas Kerguelen subantárticas, um grupo de ilhas no topo de um grande planalto que se formou há 35 milhões de anos. erupção vulcânica. Usando um sistema experimental in vitro, descobrimos que fragmentos de DNA na água do mar são rapidamente absorvidos por mexilhões e entram no compartimento da hemolinfa. O sequenciamento shotgun mostrou que o ccfDNA da hemolinfa de mexilhões contém fragmentos de DNA de sua própria origem e não própria, incluindo bactérias simbióticas e fragmentos de DNA de biomas típicos de ecossistemas costeiros marinhos vulcânicos frios. O ccfDNA da hemolinfa também contém sequências virais derivadas de vírus com diferentes gamas de hospedeiros. Também encontramos fragmentos de DNA de animais multicelulares, como peixes ósseos, anêmonas-do-mar, algas e insetos. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito LB pode ser aplicado com sucesso a invertebrados marinhos para gerar um rico repertório genômico em ecossistemas marinhos.
Adultos (55-70 mm de comprimento) Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) foram coletados nas costas rochosas intermareais de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.), Ilhas Kerguelen, em dezembro de 2018. Outros mexilhões azuis adultos (Mytilus spp.) foram obtidos de um fornecedor comercial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canadá) e colocados em um tanque aerado com temperatura controlada (4°C) contendo 10–20 L de salmoura artificial de 32‰ (sal marinho artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virgínia, EUA). Para cada experimento, o comprimento e o peso de conchas individuais foram medidos.
Um protocolo de acesso aberto e gratuito para este programa está disponível online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Resumidamente, a hemolinfa LB foi coletada dos músculos abdutores conforme descrito [22]. A hemolinfa foi clarificada por centrifugação a 1200×g por 3 minutos, e o sobrenadante foi congelado (-20°C) até o uso. Para isolamento e purificação do cfDNA, amostras (1,5-2,0 ml) foram descongeladas e processadas usando o kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) de acordo com as instruções do fabricante. O ccfDNA foi armazenado a -80°C até análise posterior. Em alguns experimentos, o ccfDNA foi isolado e purificado usando o kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontário, Canadá). O DNA purificado foi quantificado usando um ensaio PicoGreen padrão. A distribuição dos fragmentos do ccfDNA isolado foi analisada por eletroforese capilar utilizando um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) e um kit de DNA de alta sensibilidade. O ensaio foi realizado utilizando 1 µl da amostra de ccfDNA, de acordo com as instruções do fabricante.
Para o sequenciamento de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa, a Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparou bibliotecas shotgun utilizando o kit Illumina DNA Mix do kit Illumina MiSeq PE75. Um adaptador padrão (BioO) foi utilizado. Arquivos de dados brutos estão disponíveis no Arquivo de Leitura de Sequências do NCBI (SRR8924808 e SRR8924809). A qualidade básica da leitura foi avaliada utilizando FastQC [23]. Trimmomatic [24] foi utilizado para adaptadores de recorte e leituras de baixa qualidade. Leituras shotgun com extremidades pareadas foram mescladas via FLASH em leituras únicas mais longas, com sobreposição mínima de 20 pb para evitar incompatibilidades [25]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados de taxonomia NCBI bivalve (valor e < 1e−3 e homologia de 90%) e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados de taxonomia NCBI bivalve (valor e < 1e−3 e homologia de 90%) e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. A arquitetura de segurança é anotada com o BLASTN e o isolamento de taxas de danos двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 e 90% гомологии). As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados de taxonomia de bivalves do NCBI (valor e < 1e-3 e homologia de 90%) e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 poeira [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽A solução de segurança é anotada com o uso do BLASTN com o uso de dados táticos двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 e 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием PÓ [26]. As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados taxonômico de bivalves do NCBI (valor e <1e-3 e homologia de 90%) e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].As leituras foram divididas em dois grupos: relacionadas a sequências bivalves (aqui chamadas de autoleituras) e não relacionadas (não autoleituras). Dois grupos foram montados separadamente usando o MEGAHIT para gerar contigs [27]. Enquanto isso, a distribuição taxonômica das leituras do microbioma alienígena foi classificada usando o Kraken2 [28] e representada graficamente por um gráfico de pizza Krona no Galaxy [29, 30]. Os kmers ideais foram determinados como kmers-59 em nossos experimentos preliminares. Os autocontigs foram então identificados por alinhamento com BLASTN (banco de dados NCBI de bivalves, valor e < 1e−10 e homologia de 60%) para uma anotação final. Os autocontigs foram então identificados por alinhamento com BLASTN (banco de dados NCBI de bivalves, valor e < 1e−10 e homologia de 60%) para uma anotação final. Este conteúdo confiável pode ser identificado por meio de uma solicitação do BLASTN (por exemplo, um cliente potencial моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) para anotações de confirmação. Os autocontigs foram então identificados por comparação com BLASTN (banco de dados de bivalves do NCBI, valor e <1e-10 e homologia de 60%) para anotação final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Esta é uma identificação de conteúdo confiável para uma assinatura anual do BLASTN (em inglês). Dano NCBI para двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 e гомология 60%). Os autocontigs foram então identificados para anotação final por comparação com BLASTN (banco de dados de bivalves NCBI, valor e <1e-10 e homologia de 60%). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (banco de dados nt NCBI, valor e < 1e−10 e homologia de 60%). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (banco de dados nt NCBI, valor e < 1e−10 e homologia de 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 e hemoglobina 60%). Paralelamente, contigs de grupos estrangeiros foram anotados com BLASTN (banco de dados NT NCBI, valor e <1e-10 e homologia de 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%). Paralelamente, contigs de grupos não próprios foram anotados com BLASTN (banco de dados nt NCBI, valor e <1e-10 e homologia de 60%). O BLASTX também foi conduzido em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e < 1e−10 e homologia de 60%). O BLASTX também foi conduzido em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e < 1e−10 e homologia de 60%). O BLASTX também foi testado em um número ilimitado de contatos com o uso de um número de banco de dados e RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e < 1e-10 e homologia de 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 O BLASTX também é fornecido com um contador desconhecido com o uso do banco de dados Belka nr e RefSeq NCBI (criado e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq NCBI (valor e <1e-10 e homologia de 60%).Os conjuntos BLASTN e BLASTX de contigs não autocontigs representam os contigs finais (ver arquivo suplementar).
Os primers utilizados para PCR estão listados na Tabela S1. A Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) foi utilizada para amplificar os genes-alvo do ccfDNA. As seguintes condições de reação foram utilizadas: desnaturação a 95 °C por 3 minutos, 95 °C por 1 minuto, temperatura de anelamento ajustada por 1 minuto, alongamento a 72 °C por 1 minuto, 35 ciclos e, finalmente, 72 °C em 10 minutos. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em géis de agarose (1,5%) contendo corante em gel de DNA seguro SYBRTM (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Mexilhões (Mytilus spp.) foram aclimatados em 500 ml de água do mar oxigenada (32 PSU) por 24 horas a 4 °C. DNA plasmidial contendo um inserto que codifica a sequência de cDNA da galectina-7 humana (número de acesso NCBI L07769) foi adicionado ao frasco a uma concentração final de 190 μg/μl. Mexilhões incubados sob as mesmas condições sem adição de DNA foram o controle. O terceiro tanque de controle continha DNA sem mexilhões. Para monitorar a qualidade do DNA na água do mar, amostras de água do mar (20 μl; três repetições) foram coletadas de cada tanque no tempo indicado. Para rastreabilidade do DNA plasmidial, mexilhões LB foram coletados nos tempos indicados e analisados ​​por qPCR e ddPCR. Devido ao alto teor de sal da água do mar, alíquotas foram diluídas em água de qualidade para PCR (1:10) antes de todos os ensaios de PCR.
A PCR digital em gotas (ddPCR) foi realizada usando o protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontário, Canadá). Use o perfil de temperatura para determinar a temperatura ótima (Tabela S1). As gotas foram geradas usando um gerador de gotas QX200 (BioRad). A ddPCR foi realizada da seguinte forma: 95 °C por 5 min, 50 ciclos de 95 °C por 30 s e uma determinada temperatura de anelamento por 1 min e 72 °C por 30 s, 4 °C por 5 min e 90 °C em 5 minutos. O número de gotas e as reações positivas (número de cópias/µl) foram medidos usando um leitor de gotas QX200 (BioRad). Amostras com menos de 10.000 gotas foram rejeitadas. O controle de padrão não foi realizado todas as vezes que a ddPCR foi executada.
A qPCR foi realizada utilizando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) e primers específicos para LGALS7. Todas as PCRs quantitativas foram realizadas em 20 µl utilizando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). A qPCR foi iniciada com uma incubação de 15 minutos a 95 °C, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 10 segundos e a 60 °C por 60 segundos, com uma única coleta de dados. Curvas de melting foram geradas utilizando medições sucessivas a 95 °C por 5 segundos, 65 °C por 60 segundos e 97 °C ao final da qPCR. Cada qPCR foi realizada em triplicata, exceto para as amostras de controle.
Como os mexilhões são conhecidos por sua alta taxa de filtração, primeiro investigamos se eles poderiam filtrar e reter fragmentos de DNA presentes na água do mar. Também estávamos interessados ​​em saber se esses fragmentos se acumulam em seu sistema linfático semiaberto. Resolvemos essa questão experimentalmente rastreando o destino de fragmentos de DNA solúvel adicionados a tanques de mexilhões azuis. Para facilitar o rastreamento de fragmentos de DNA, usamos DNA plasmidial estranho (não próprio) contendo o gene galectina-7 humana. A ddPCR rastreia fragmentos de DNA plasmidial na água do mar e em mexilhões. Nossos resultados mostram que, se a quantidade de fragmentos de DNA na água do mar permaneceu relativamente constante ao longo do tempo (até 7 dias) na ausência de mexilhões, então, na presença de mexilhões, esse nível desapareceu quase completamente em 8 horas (Fig. 1a,b). Fragmentos de DNA exógeno foram facilmente detectados em 15 minutos no fluido intravalvar e na hemolinfa (Fig. 1c). Esses fragmentos ainda puderam ser detectados até 4 horas após a exposição. Essa atividade de filtragem em relação a fragmentos de DNA é comparável à atividade de filtragem de bactérias e algas [31]. Esses resultados sugerem que os mexilhões podem filtrar e acumular DNA estranho em seus compartimentos de fluidos.
Concentrações relativas de DNA plasmidial na água do mar na presença (A) ou ausência (B) de mexilhões, medidas por ddPCR. Em A, os resultados são expressos como porcentagens, com as bordas das caixas representando os percentis 75 e 25. A curva logarítmica ajustada é mostrada em vermelho, e a área sombreada em cinza representa o intervalo de confiança de 95%. Em B, a linha vermelha representa a média e a linha azul representa o intervalo de confiança de 95% para a concentração. C Acúmulo de DNA plasmidial na hemolinfa e no fluido valvar de mexilhões em diferentes momentos após a adição de DNA plasmidial. Os resultados são apresentados como cópias absolutas detectadas/mL (±EP).
Em seguida, investigamos a origem do ccfDNA em mexilhões coletados em bancos de mexilhões nas Ilhas Kerguelen, um grupo remoto de ilhas com influência antropogênica limitada. Para esse propósito, o cccDNA de hemolinfas de mexilhões foi isolado e purificado por métodos comumente usados ​​para purificar cccDNA humano [32, 33]. Descobrimos que as concentrações médias de ccfDNA na hemolinfa em mexilhões estão na faixa de microgramas por ml de hemolinfa (ver Tabela S2, Informações Suplementares). Essa faixa de concentrações é muito maior do que em pessoas saudáveis ​​(baixos nanogramas por mililitro), mas em casos raros, em pacientes com câncer, o nível de ccfDNA pode atingir vários microgramas por mililitro [34, 35]. Uma análise da distribuição de tamanho do ccfDNA da hemolinfa mostrou que esses fragmentos variam muito em tamanho, variando de 1.000 pb a 1.000 pb até 5.000 pb (Fig. 2). Resultados semelhantes foram obtidos usando o QIAamp Investigator Kit à base de sílica, um método comumente usado na ciência forense para isolar e purificar rapidamente o DNA genômico de amostras de DNA de baixa concentração, incluindo ccfDNA [36].
Eletroforegrama representativo de ccfDNA da hemolinfa de mexilhão. Extraído com o Kit de Plasma NucleoSnap (acima) e o Kit QIAamp DNA Investigator. B Diagrama de violino mostrando a distribuição das concentrações de ccfDNA da hemolinfa (±EP) em mexilhões. As linhas preta e vermelha representam a mediana e o primeiro e terceiro quartis, respectivamente.
Aproximadamente 1% do ccfDNA em humanos e primatas possui uma fonte externa [21, 37]. Dado o sistema circulatório semiaberto dos bivalves, a água do mar rica em micróbios e a distribuição de tamanho do ccfDNA do mexilhão, formulamos a hipótese de que o ccfDNA da hemolinfa do mexilhão pode conter um conjunto rico e diverso de DNA microbiano. Para testar essa hipótese, sequenciamos o ccfDNA da hemolinfa de amostras de Aulacomya atra coletadas nas Ilhas Kerguelen, resultando em mais de 10 milhões de leituras, 97,6% das quais passaram pelo controle de qualidade. As leituras foram então classificadas de acordo com fontes próprias e não próprias, utilizando os bancos de dados de bivalves BLASTN e NCBI (Fig. S1, Informações Suplementares).
Em humanos, tanto o DNA nuclear quanto o mitocondrial podem ser liberados na corrente sanguínea [38]. No entanto, no presente estudo, não foi possível descrever em detalhes o DNA genômico nuclear de mexilhões, visto que o genoma de A. atra não foi sequenciado ou descrito. No entanto, conseguimos identificar vários fragmentos de ccfDNA de nossa própria origem usando a biblioteca de bivalves (Fig. S2, Informações Suplementares). Também confirmamos a presença de fragmentos de DNA de nossa própria origem por amplificação por PCR direcionada dos genes de A. atra que foram sequenciados (Fig. 3). Da mesma forma, dado que o genoma mitocondrial de A. atra está disponível em bancos de dados públicos, é possível encontrar evidências da presença de fragmentos de ccfDNA mitocondrial na hemolinfa de A. atra. A presença de fragmentos de DNA mitocondrial foi confirmada por amplificação por PCR (Fig. 3).
Vários genes mitocondriais estavam presentes na hemolinfa de A. atra (pontos vermelhos – número de estoque: SRX5705969) e M. platensis (pontos azuis – número de estoque: SRX5705968) amplificados por PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011 B. Amplificação do sobrenadante da hemolinfa de A. atra. Armazenado em papel FTA. Use um punch de 3 mm para adicionar diretamente ao tubo de PCR contendo a mistura de PCR.
Dado o abundante conteúdo microbiano na água do mar, inicialmente nos concentramos na caracterização de sequências de DNA microbiano na hemolinfa. Para isso, utilizamos duas estratégias diferentes. A primeira estratégia utilizou o Kraken2, um programa de classificação de sequências baseado em algoritmos que pode identificar sequências microbianas com precisão comparável ao BLAST e outras ferramentas [28]. Mais de 6.719 leituras foram determinadas como sendo de origem bacteriana, enquanto 124 e 64 eram de arqueas e vírus, respectivamente (Fig. 4). Os fragmentos de DNA bacteriano mais abundantes foram Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Essa distribuição é consistente com estudos anteriores do microbioma do mexilhão azul marinho [39, 40]. Gammaproteobacteria foi a principal classe de Proteobacteria (44%), incluindo muitos Vibrionales (Fig. 4b). O método ddPCR confirmou a presença de fragmentos de DNA de Vibrio no ccfDNA da hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41]. Para obter mais informações sobre a origem bacteriana do ccfDNA, uma abordagem adicional foi adotada (Fig. S2, Informações Suplementares). Neste caso, as leituras que se sobrepuseram foram montadas como leituras de extremidade pareada e foram classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando BLASTN e um valor e de 1e−3 e um corte com homologia >90%. Neste caso, as leituras que se sobrepuseram foram montadas como leituras de extremidade pareada e foram classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando BLASTN e um valor e de 1e−3 e um corte com homologia >90%. Neste caso, a configuração de segurança será garantida como a segurança do casamento e da classificação. собственные (двустворчатые моллюски) ou чужие по происхождению с использованием BLASTN e значения e 1e-3 e отсечения с гомологией> 90%. Neste caso, leituras sobrepostas foram coletadas como leituras pareadas e classificadas como nativas (bivalves) ou não originais usando BLASTN e valor e de 1e-3 e corte com homologia >90%.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Neste caso, a configuração de segurança será garantida para que você possa estabelecer uma relação de parceria e classificação como собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Neste caso, leituras sobrepostas foram coletadas como leituras pareadas e classificadas como próprias (bivalves) ou não originais usando valores e BLASTN e 1e-3 e um limite de homologia >90%.Como o genoma de A. atra ainda não foi sequenciado, utilizamos a estratégia de montagem de novo do montador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Um total de 147.188 contigs foram identificados como dependentes (bivalves) de origem. Esses contigs foram então explodidos com e-valores de 1e-10 usando BLASTN e BLASTX. Essa estratégia nos permitiu identificar 482 fragmentos não bivalves presentes no ccfDNA de A. atra. Mais da metade (57%) desses fragmentos de DNA foram obtidos de bactérias, principalmente de simbiontes branquiais, incluindo simbiontes sulfotróficos, e de simbiontes branquiais Solemya velum (Fig. 5).
Abundância relativa no nível do tipo. B Diversidade microbiana de dois filos principais (Firmicutes e Proteobacteria). Amplificação representativa de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmentos do gene 16S rRNA (azul) em três atra hemolinfas.
Um total de 482 contigs coletados foram analisados. Perfil geral da distribuição taxonômica das anotações de contigs metagenômicos (procariontes e eucariontes). B Distribuição detalhada de fragmentos de DNA bacteriano identificados por BLASTN e BLASTX.
A análise do Kraken2 também mostrou que o ccfDNA do mexilhão continha fragmentos de DNA arqueano, incluindo fragmentos de DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). A presença de fragmentos de DNA derivados de Euryarchaeota e Crenarchaeota, previamente encontrados na comunidade microbiana de mexilhões da Califórnia, não deve ser uma surpresa [42]. Embora Euryarchaeota seja frequentemente associada a condições extremas, agora se reconhece que tanto Euryarchaeota quanto Crenarcheota estão entre os procariontes mais comuns no ambiente criogênico marinho [43, 44]. A presença de microrganismos metanogênicos em mexilhões não é surpreendente, dados os relatos recentes de extensos vazamentos de metano provenientes de vazamentos de fundo no Planalto de Kerguelen [45] e a possível produção microbiana de metano observada na costa das Ilhas Kerguelen [46].
Nossa atenção então se voltou para leituras de vírus de DNA. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo fora do alvo do conteúdo viral de mexilhões. Como esperado, encontramos fragmentos de DNA de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b). No entanto, o DNA viral mais comum vem de um filo de nucleocitovírus, também conhecido como vírus de DNA citoplasmático nuclear grande (NCLDV), que possui o maior genoma de todos os vírus. Dentro desse filo, a maioria das sequências de DNA pertence às famílias Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), cujos hospedeiros naturais incluem vertebrados e artrópodes, enquanto uma pequena proporção dessas sequências de DNA pertence a algas virológicas conhecidas. Infecta algas eucarióticas marinhas. As sequências também foram obtidas do vírus Pandora, o vírus gigante com o maior tamanho de genoma de todos os gêneros virais conhecidos. Curiosamente, a gama de hospedeiros conhecidos por estarem infectados com o vírus, conforme determinado pelo sequenciamento de ccfDNA da hemolinfa, foi relativamente ampla (Figura S3, Informações Suplementares). Inclui vírus que infectam insetos como Baculoviridae e Iridoviridae, bem como vírus que infectam amebas, algas e vertebrados. Também encontramos sequências correspondentes ao genoma do Pithovirus sibericum. Os pitovírus (também conhecidos como “vírus zumbis”) foram isolados pela primeira vez em permafrost de 30.000 anos na Sibéria [47]. Portanto, nossos resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que nem todas as espécies modernas desses vírus estão extintas [48] e que esses vírus podem estar presentes em ecossistemas marinhos subárticos remotos.
Por fim, testamos para verificar se poderíamos encontrar fragmentos de DNA de outros animais multicelulares. Um total de 482 contigs estranhos foram identificados por BLASTN e BLASTX com bibliotecas nt, nr e RefSeq (genômicas e proteicas). Nossos resultados mostram que, entre os fragmentos estranhos de ccfDNA de animais multicelulares, predomina o DNA de ossos (Fig. 5). Fragmentos de DNA de insetos e outras espécies também foram encontrados. Uma parte relativamente grande dos fragmentos de DNA não foi identificada, possivelmente devido à sub-representação de um grande número de espécies marinhas em bancos de dados genômicos em comparação com espécies terrestres [49].
No presente artigo, aplicamos o conceito de LB a mexilhões, argumentando que o sequenciamento de tiros de ccfDNA de hemolinfa pode fornecer insights sobre a composição de ecossistemas costeiros marinhos. Em particular, descobrimos que 1) a hemolinfa do mexilhão contém concentrações relativamente altas (níveis de microgramas) de fragmentos de DNA circulantes relativamente grandes (~1-5 kb); 2) esses fragmentos de DNA são independentes e não independentes 3) Entre as fontes estranhas desses fragmentos de DNA, encontramos DNA bacteriano, arqueano e viral, bem como DNA de outros animais multicelulares; 4) O acúmulo desses fragmentos estranhos de ccfDNA na hemolinfa ocorre rapidamente e contribui para a atividade de filtragem interna dos mexilhões. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB, que até agora tem sido aplicado principalmente no campo da biomedicina, codifica uma fonte rica, mas inexplorada, de conhecimento que pode ser usada para melhor compreender a interação entre espécies sentinelas e seu ambiente.
Além de primatas, o isolamento de ccfDNA foi relatado em mamíferos, incluindo camundongos, cães, gatos e cavalos [50, 51, 52]. No entanto, até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a relatar a detecção e o sequenciamento de ccfDNA em espécies marinhas com um sistema de circulação aberto. Essa característica anatômica e a capacidade de filtragem dos mexilhões podem, pelo menos em parte, explicar as diferentes características de tamanho dos fragmentos de DNA circulantes em comparação com outras espécies. Em humanos, a maioria dos fragmentos de DNA que circulam no sangue são pequenos fragmentos que variam em tamanho de 150 a 200 pb, com um pico máximo de 167 pb [34, 53]. Uma pequena, mas significativa porção dos fragmentos de DNA tem entre 300 e 500 pb de tamanho, e cerca de 5% são maiores que 900 pb [54]. A razão para essa distribuição de tamanho é que a principal fonte de ccfDNA no plasma ocorre como resultado da morte celular, seja por morte celular ou por necrose de células hematopoiéticas circulantes em indivíduos saudáveis ​​ou por apoptose de células tumorais em pacientes com câncer (conhecido como DNA tumoral circulante). , ctDNA). A distribuição de tamanho do ccfDNA da hemolinfa que encontramos em mexilhões variou de 1000 a 5000 pb, sugerindo que o ccfDNA do mexilhão tem uma origem diferente. Esta é uma hipótese lógica, visto que os mexilhões têm um sistema vascular semiaberto e vivem em ambientes aquáticos marinhos contendo altas concentrações de DNA genômico microbiano. De fato, nossos experimentos de laboratório usando DNA exógeno mostraram que os mexilhões acumulam fragmentos de DNA na água do mar, pelo menos após algumas horas eles são degradados após a captação celular e/ou liberados e/ou armazenados em vários organismos. Dada a raridade das células (procarióticas e eucarióticas), o uso de compartimentos intravalvares reduzirá a quantidade de ccfDNA de fontes próprias, bem como de fontes estranhas. Considerando a importância da imunidade inata dos bivalves e o grande número de fagócitos circulantes, levantamos ainda a hipótese de que mesmo o ccfDNA estranho é enriquecido nos fagócitos circulantes, que acumulam DNA estranho após a ingestão de microrganismos e/ou detritos celulares. Em conjunto, nossos resultados mostram que o ccfDNA da hemolinfa bivalve é um repositório único de informações moleculares e reforça seu status como espécie sentinela.
Nossos dados indicam que o sequenciamento e a análise de fragmentos de ccfDNA de hemolinfa derivados de bactérias podem fornecer informações importantes sobre a flora bacteriana do hospedeiro e as bactérias presentes no ecossistema marinho circundante. Técnicas de sequenciamento por disparos revelaram sequências da brânquia da bactéria comensal A. atra que teriam sido perdidas se métodos convencionais de identificação por rRNA 16S tivessem sido utilizados, devido, em parte, a um viés da biblioteca de referência. De fato, nosso uso de dados de LB coletados de M. platensis na mesma camada de mexilhões em Kerguelen mostrou que a composição de simbiontes bacterianos associados às brânquias foi a mesma para ambas as espécies de mexilhões (Fig. S4, Informações Suplementares). Essa similaridade entre dois mexilhões geneticamente diferentes pode refletir a composição das comunidades bacterianas nos depósitos frios, sulfurosos e vulcânicos de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Níveis mais elevados de microrganismos redutores de enxofre foram bem descritos na coleta de mexilhões em áreas costeiras bioturbadas [59], como a costa de Port-au-France. Outra possibilidade é que a flora comensal de mexilhões possa ser afetada pela transmissão horizontal [60, 61]. Mais pesquisas são necessárias para determinar a correlação entre o ambiente marinho, a superfície do fundo do mar e a composição de bactérias simbióticas em mexilhões. Esses estudos estão em andamento.
O comprimento e a concentração do ccfDNA da hemolinfa, sua facilidade de purificação e alta qualidade para permitir o sequenciamento rápido por shotgun são algumas das muitas vantagens do uso do ccfDNA de mexilhões para avaliar a biodiversidade em ecossistemas costeiros marinhos. Essa abordagem é especialmente eficaz para caracterizar comunidades virais (viromas) em um determinado ecossistema [62, 63]. Ao contrário de bactérias, arqueas e eucariotos, os genomas virais não contêm genes filogeneticamente conservados, como sequências 16S. Nossos resultados indicam que biópsias líquidas de espécies indicadoras, como mexilhões, podem ser usadas para identificar um número relativamente grande de fragmentos de vírus ccfDNA conhecidos por infectar hospedeiros que tipicamente habitam ecossistemas marinhos costeiros. Isso inclui vírus conhecidos por infectar protozoários, artrópodes, insetos, plantas e vírus bacterianos (por exemplo, bacteriófagos). Uma distribuição semelhante foi encontrada quando examinamos o viroma do ccfDNA da hemolinfa de mexilhões azuis (M. platensis) coletados na mesma camada de mexilhões em Kerguelen (Tabela S2, Informações Suplementares). O sequenciamento shotgun do ccfDNA é, de fato, uma nova abordagem que vem ganhando força no estudo do viroma de humanos ou de outras espécies [21, 37, 64]. Essa abordagem é particularmente útil para o estudo de vírus de DNA fita dupla, uma vez que nenhum gene é conservado entre todos os vírus de DNA fita dupla, representando a classe mais diversa e ampla de vírus em Baltimore [65]. Embora a maioria desses vírus permaneça sem classificação e possa incluir vírus de uma parte completamente desconhecida do mundo viral [66], descobrimos que os viromas e as gamas de hospedeiros dos mexilhões A. atra e M. platensis se situam entre as duas espécies de forma semelhante (ver figura S3, informações adicionais). Essa semelhança não é surpreendente, pois pode refletir uma falta de seletividade na absorção do DNA presente no ambiente. Estudos futuros usando RNA purificado são atualmente necessários para caracterizar o viroma de RNA.
Em nosso estudo, utilizamos um pipeline muito rigoroso adaptado do trabalho de Kowarski e colegas [37], que usaram uma exclusão em duas etapas de leituras agrupadas e contigs antes e depois da montagem do ccfDNA nativo, resultando em uma alta proporção de leituras não mapeadas. Portanto, não podemos descartar que algumas dessas leituras não mapeadas ainda possam ter sua própria origem, principalmente porque não temos um genoma de referência para essa espécie de mexilhão. Também utilizamos esse pipeline porque estávamos preocupados com as quimeras entre leituras próprias e não próprias e com os comprimentos de leitura gerados pelo Illumina MiSeq PE75. Outro motivo para a maioria das leituras não mapeadas é que muitos dos micróbios marinhos, especialmente em áreas remotas como Kerguelen, não foram anotados. Utilizamos o Illumina MiSeq PE75, assumindo comprimentos de fragmentos de ccfDNA semelhantes aos do ccfDNA humano. Para estudos futuros, considerando nossos resultados que mostram que o ccfDNA da hemolinfa possui leituras mais longas do que em humanos e/ou mamíferos, recomendamos o uso de uma plataforma de sequenciamento mais adequada para fragmentos de ccfDNA mais longos. Essa prática facilitará muito a identificação de mais indicações para análises mais aprofundadas. A obtenção da sequência completa do genoma nuclear de A. atra, atualmente indisponível, também facilitaria significativamente a discriminação do ccfDNA de fontes próprias e não próprias. Considerando que nossa pesquisa se concentrou na possibilidade de aplicar o conceito de biópsia líquida a mexilhões, esperamos que, à medida que esse conceito for utilizado em pesquisas futuras, novas ferramentas e pipelines sejam desenvolvidos para aumentar o potencial desse método no estudo da diversidade microbiana de mexilhões no ecossistema marinho.
Como um biomarcador clínico não invasivo, níveis plasmáticos elevados de ccfDNA em humanos estão associados a diversas doenças, danos teciduais e condições de estresse [67,68,69]. Esse aumento está associado à liberação de fragmentos de DNA de sua própria origem após danos teciduais. Abordamos essa questão usando estresse térmico agudo, no qual mexilhões foram brevemente expostos a uma temperatura de 30 °C. Realizamos essa análise em três tipos diferentes de mexilhões em três experimentos independentes. No entanto, não encontramos nenhuma alteração nos níveis de ccfDNA após estresse térmico agudo (ver Figura S5, informações adicionais). Essa descoberta pode explicar, pelo menos em parte, o fato de os mexilhões possuírem um sistema circulatório semiaberto e acumularem grandes quantidades de DNA estranho devido à sua alta atividade de filtragem. Por outro lado, os mexilhões, como muitos invertebrados, podem ser mais resistentes a danos teciduais induzidos por estresse, limitando assim a liberação de ccfDNA em sua hemolinfa [70, 71].
Até o momento, a análise de DNA da biodiversidade em ecossistemas aquáticos tem se concentrado principalmente na metabarcodificação do DNA ambiental (eDNA). No entanto, esse método geralmente é limitado na análise da biodiversidade quando primers são usados. O uso do sequenciamento shotgun contorna as limitações da PCR e a seleção tendenciosa de conjuntos de primers. Assim, em certo sentido, nosso método está mais próximo do método de sequenciamento shotgun de eDNA de alto rendimento recentemente usado, que é capaz de sequenciar diretamente DNA fragmentado e analisar quase todos os organismos [72, 73]. No entanto, há uma série de questões fundamentais que distinguem o LB dos métodos de eDNA padrão. É claro que a principal diferença entre eDNA e LB é o uso de hospedeiros de filtro naturais. O uso de espécies marinhas, como esponjas e bivalves (Dresseina spp.), como filtro natural para estudar eDNA foi relatado [74, 75]. No entanto, o estudo de Dreissena utilizou biópsias de tecido das quais o DNA foi extraído. A análise de ccfDNA de LB não requer biópsia de tecido, equipamento especializado e, às vezes, caro, nem logística associada ao eDNA ou biópsia de tecido. De fato, relatamos recentemente que o ccfDNA de LB pode ser armazenado e analisado com suporte de FTA sem manter uma cadeia de frio, o que é um grande desafio para pesquisas em áreas remotas [76]. A extração de ccfDNA de biópsias líquidas também é simples e fornece DNA de alta qualidade para sequenciamento shotgun e análise de PCR. Esta é uma grande vantagem, dadas algumas das limitações técnicas associadas à análise de eDNA [77]. A simplicidade e o baixo custo do método de amostragem também são particularmente adequados para programas de monitoramento de longo prazo. Além de sua alta capacidade de filtragem, outra característica bem conhecida dos bivalves é a composição química de mucopolissacarídeos de seu muco, que promove a absorção de vírus [78, 79]. Isso torna os bivalves um filtro natural ideal para caracterizar a biodiversidade e o impacto das mudanças climáticas em um determinado ecossistema aquático. Embora a presença de fragmentos de DNA derivados do hospedeiro possa ser vista como uma limitação do método em comparação ao eDNA, o custo associado à obtenção de um ccfDNA nativo, em comparação ao eDNA, é simultaneamente compreensível, considerando a vasta quantidade de informações disponíveis para estudos de saúde. Isso inclui a presença de sequências virais integradas ao genoma do hospedeiro. Isso é especialmente importante para mexilhões, dada a presença de retrovírus leucêmicos transmitidos horizontalmente em bivalves [80, 81]. Outra vantagem do LB em relação ao eDNA é que ele explora a atividade fagocítica das células sanguíneas circulantes na hemolinfa, que engloba microrganismos (e seus genomas). A fagocitose é a principal função das células sanguíneas em bivalves [82]. Por fim, o método aproveita a alta capacidade de filtragem dos mexilhões (média de 1,5 l/h de água do mar) e a circulação de dois dias, que aumentam a mistura de diferentes camadas de água do mar, permitindo a captura de eDNA heterólogo [83, 84]. Assim, a análise de ccfDNA de mexilhões é uma via interessante, dados os impactos nutricionais, econômicos e ambientais dos mexilhões. Semelhante à análise de LB coletada de humanos, esse método também abre a possibilidade de medir alterações genéticas e epigenéticas no DNA do hospedeiro em resposta a substâncias exógenas. Por exemplo, tecnologias de sequenciamento de terceira geração podem ser consideradas para realizar análises de metilação em todo o genoma em ccfDNA nativo usando sequenciamento de nanoporos. Esse processo deve ser facilitado pelo fato de que o comprimento dos fragmentos de ccfDNA de mexilhões é idealmente compatível com plataformas de sequenciamento de leitura longa que permitem a análise de metilação de DNA em todo o genoma a partir de uma única execução de sequenciamento sem a necessidade de transformações químicas.85,86] Essa é uma possibilidade interessante, pois foi demonstrado que os padrões de metilação do DNA refletem uma resposta ao estresse ambiental e persistem por muitas gerações. Portanto, pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes que governam a resposta após a exposição a mudanças climáticas ou poluentes [87]. No entanto, o uso de LB não é isento de limitações. Nem é preciso dizer que isso requer a presença de espécies indicadoras no ecossistema. Como mencionado acima, usar LB para avaliar a biodiversidade de um determinado ecossistema também requer um rigoroso pipeline de bioinformática que leve em consideração a presença de fragmentos de DNA da fonte. Outro grande problema é a disponibilidade de genomas de referência para espécies marinhas. Espera-se que iniciativas como o Marine Mammal Genomes Project e o recentemente estabelecido projeto Fish10k [88] facilitem essa análise no futuro. A aplicação do conceito de LB a organismos marinhos que se alimentam por filtração também é compatível com os últimos avanços na tecnologia de sequenciamento, tornando-o adequado para o desenvolvimento de biomarcadores multi-ohm para fornecer informações importantes sobre a saúde dos habitats marinhos em resposta ao estresse ambiental.
Dados de sequenciamento do genoma foram depositados no NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 em Bioprojetos SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacto das mudanças climáticas na vida marinha e nos ecossistemas. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpandiou V, Bevilacqua S, et al. Considere os impactos combinados das mudanças climáticas e de outros estressores locais no ambiente marinho. Ambiente científico geral. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Ciência do primeiro de março. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. A redução da tolerância ao calor sob condições repetitivas de estresse térmico explica a alta mortalidade de mexilhões azuis no verão. Relatório científico de 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Mudanças recentes na frequência, causas e extensão das mortes de animais. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Vários patógenos não específicos da espécie podem ter causado mortalidade em massa de Pinna nobilis. Vida. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Impacto potencial das mudanças climáticas nas doenças zoonóticas do Ártico. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Mexilhões azuis (Mytilus edulis spp.) como organismos sinalizadores no monitoramento da poluição costeira: uma revisão. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integração da biópsia líquida no tratamento do câncer. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Maturação da biópsia líquida: permite a circulação do DNA tumoral. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Ácidos nucleicos no plasma humano. Atas de reunião das subsidiárias da Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Um novo papel para o DNA livre de células como marcador molecular para o tratamento do câncer. Quantificação da análise biomolar. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS A biópsia líquida chega à clínica – questões de implementação e desafios futuros. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW e outros. O DNA fetal está presente no plasma e soro materno. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudo do curso da gravidez e suas complicações utilizando RNA extracelular circulante no sangue de mulheres durante a gravidez. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Biópsia líquida: DNA livre de células do doador é usado para detectar lesões alogênicas em um enxerto renal. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovações em diagnóstico pré-natal: sequenciamento do genoma do plasma materno. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Detecção rápida de patógenos com sequenciamento metagenômico de última geração de fluidos corporais infectados. Medicina Natural. 2021;27:115-24.