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A biópsia líquida (BL) é um conceito que vem ganhando popularidade rapidamente na área biomédica. O conceito baseia-se principalmente na detecção de fragmentos de DNA extracelular circulante (cfDNA), que são liberados principalmente como pequenos fragmentos após a morte celular em diversos tecidos. Uma pequena proporção desses fragmentos tem origem em tecidos ou organismos estranhos. Neste trabalho, aplicamos esse conceito a mexilhões, uma espécie sentinela conhecida por sua alta capacidade de filtração da água do mar. Utilizamos a capacidade dos mexilhões de atuarem como filtros naturais para capturar fragmentos de DNA ambiental de diversas fontes, fornecendo informações sobre a biodiversidade de ecossistemas marinhos costeiros. Nossos resultados mostram que a hemolinfa dos mexilhões contém fragmentos de DNA que variam muito em tamanho, de 1 a 5 kb. O sequenciamento shotgun revelou que um grande número de fragmentos de DNA é de origem microbiana estranha. Entre eles, encontramos fragmentos de DNA de bactérias, arqueas e vírus, incluindo vírus conhecidos por infectar uma variedade de hospedeiros comumente encontrados em ecossistemas marinhos costeiros. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB aplicado a mexilhões representa uma fonte rica, porém ainda inexplorada, de conhecimento sobre a diversidade microbiana em ecossistemas costeiros marinhos.
O impacto das mudanças climáticas (MC) na biodiversidade dos ecossistemas marinhos é uma área de pesquisa em rápido crescimento. O aquecimento global não só causa importantes estresses fisiológicos, como também amplia os limites evolutivos da estabilidade térmica dos organismos marinhos, afetando o habitat de diversas espécies e levando-as a buscar condições mais favoráveis ​​[1, 2]. Além de afetar a biodiversidade dos metazoários, as MC perturbam o delicado equilíbrio das interações hospedeiro-microorganismo. Essa disbiose microbiana representa uma séria ameaça aos ecossistemas marinhos, pois torna os organismos marinhos mais suscetíveis a patógenos infecciosos [3, 4]. Acredita-se que as MC desempenhem um papel importante em mortes em massa, o que representa um grave problema para a gestão dos ecossistemas marinhos globais [5, 6]. Essa é uma questão importante, considerando os impactos econômicos, ecológicos e nutricionais em muitas espécies marinhas. Isso é especialmente verdadeiro para os bivalves que vivem nas regiões polares, onde os efeitos das MC são mais imediatos e severos [6, 7]. De fato, bivalves como Mytilus spp. são amplamente utilizados para monitorar os efeitos das MC nos ecossistemas marinhos. Não surpreendentemente, um número relativamente grande de biomarcadores foi desenvolvido para monitorar a saúde desses animais, frequentemente utilizando uma abordagem de duas etapas envolvendo biomarcadores funcionais baseados na atividade enzimática ou em funções celulares, como viabilidade celular e atividade fagocítica [8]. Esses métodos também incluem a medição da concentração de indicadores de pressão específicos que se acumulam nos tecidos moles após a absorção de grandes quantidades de água do mar. No entanto, a alta capacidade de filtração e o sistema circulatório semiaberto dos bivalves oferecem uma oportunidade para o desenvolvimento de novos biomarcadores na hemolinfa, utilizando o conceito de biópsia líquida (BL), uma abordagem simples e minimamente invasiva para o manejo de pacientes. Embora diversos tipos de moléculas circulantes possam ser encontrados em amostras de sangue coletadas em humanos, esse conceito se baseia principalmente na análise de sequenciamento de DNA de fragmentos de DNA extracelular circulante (cfDNA) no plasma. De fato, a presença de DNA circulante no plasma humano é conhecida desde meados do século XX [11], mas foi somente nos últimos anos que o advento de métodos de sequenciamento de alto rendimento possibilitou o diagnóstico clínico baseado em cfDNA. A presença desses fragmentos de DNA circulantes deve-se, em parte, à liberação passiva de DNA genômico (nuclear e mitocondrial) após a morte celular. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes que sofrem de diversas patologias ou são submetidos a estresse, resultando em danos aos tecidos. Em indivíduos saudáveis, a concentração de ccfDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes que sofrem de diversas patologias ou são submetidos a estresse, resultando em danos aos tecidos. Para manter a conexão segura em um nível normal (<10 ng/m), você não pode fazer isso em 5–10 dias. больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Em pessoas saudáveis, a concentração de cccDNA é normalmente baixa (<10 ng/mL), mas pode aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com diversas patologias ou sob estresse que leva a danos nos tecidos.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤A conversão de cfDNA é baixa (<10 ng/m) no mundo, mas você não pode se atualizar em 5 a 10 dias. pacientes com patologias comuns ou стрессом, что приводит к повреждению тканей. As concentrações de ccfDNA são geralmente baixas (<10 ng/ml) em indivíduos saudáveis, mas podem aumentar de 5 a 10 vezes em pacientes com diversas patologias ou estresse, resultando em danos aos tecidos.O tamanho dos fragmentos de ccfDNA varia amplamente, mas geralmente varia de 150 a 200 pb [12]. A análise do ccfDNA autoderivado, ou seja, ccfDNA de células hospedeiras normais ou transformadas, pode ser usada para detectar alterações genéticas e epigenéticas presentes no genoma nuclear e/ou mitocondrial, auxiliando assim os médicos na seleção de terapias moleculares específicas [13]. No entanto, o ccfDNA pode ser obtido de fontes externas, como o ccfDNA de células fetais durante a gravidez ou de órgãos transplantados [14,15,16,17]. O ccfDNA também é uma importante fonte de informação para detectar a presença de ácidos nucleicos de um agente infeccioso (externo), o que permite a detecção não invasiva de infecções disseminadas não identificadas por hemoculturas, evitando a biópsia invasiva do tecido infectado [18]. Estudos recentes demonstraram que o sangue humano contém uma rica fonte de informação que pode ser usada para identificar patógenos virais e bacterianos, e que cerca de 1% do ccfDNA encontrado no plasma humano é de origem externa [19]. Esses estudos demonstram que a biodiversidade do microbioma circulante de um organismo pode ser avaliada usando a análise de ccfDNA. No entanto, até recentemente, esse conceito era usado exclusivamente em humanos e, em menor grau, em outros vertebrados [20, 21].
Neste artigo, utilizamos o potencial da abordagem de ligação ao DNA (LB) para analisar o DNA livre circulante (cfDNA) de Aulacomya atra, uma espécie do sul comumente encontrada nas Ilhas Kerguelen, um grupo de ilhas subantárticas no topo de um grande planalto formado há 35 milhões de anos por uma erupção vulcânica. Utilizando um sistema experimental in vitro, descobrimos que fragmentos de DNA presentes na água do mar são rapidamente absorvidos pelos mexilhões e entram no compartimento da hemolinfa. O sequenciamento shotgun mostrou que o cfDNA da hemolinfa dos mexilhões contém fragmentos de DNA de origem própria e não própria, incluindo bactérias simbióticas e fragmentos de DNA de biomas típicos de ecossistemas costeiros marinhos vulcânicos frios. O cfDNA da hemolinfa também contém sequências virais derivadas de vírus com diferentes gamas de hospedeiros. Também encontramos fragmentos de DNA de animais multicelulares, como peixes ósseos, anêmonas-do-mar, algas e insetos. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB pode ser aplicado com sucesso a invertebrados marinhos para gerar um rico repertório genômico em ecossistemas marinhos.
Exemplares adultos (55-70 mm de comprimento) de Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) foram coletados nas margens rochosas da zona entre-marés de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E), Ilhas Kerguelen, em dezembro de 2018. Outros mexilhões azuis adultos (Mytilus spp.) foram obtidos de um fornecedor comercial (PEI Mussel King Inc., Ilha do Príncipe Eduardo, Canadá) e colocados em um tanque aerado com temperatura controlada (4°C) contendo 10–20 L de salmoura artificial a 32‰ (sal marinho artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virgínia, EUA). Para cada experimento, o comprimento e o peso das conchas individuais foram medidos.
Um protocolo de acesso aberto gratuito para este programa está disponível online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Resumidamente, a hemolinfa LB foi coletada dos músculos abdutores conforme descrito [22]. A hemolinfa foi clarificada por centrifugação a 1200×g por 3 minutos, e o sobrenadante foi congelado (-20°C) até o uso. Para isolamento e purificação do cfDNA, as amostras (1,5-2,0 ml) foram descongeladas e processadas utilizando o kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) de acordo com as instruções do fabricante. O ccfDNA foi armazenado a -80°C até análises posteriores. Em alguns experimentos, o ccfDNA foi isolado e purificado utilizando o kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontário, Canadá). O DNA purificado foi quantificado utilizando um ensaio padrão com PicoGreen. A distribuição dos fragmentos do ccfDNA isolado foi analisada por eletroforese capilar utilizando um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) com um kit de DNA de alta sensibilidade. O ensaio foi realizado utilizando 1 µl da amostra de ccfDNA, de acordo com as instruções do fabricante.
Para o sequenciamento de fragmentos de ccfDNA da hemolinfa, a Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadá) preparou bibliotecas shotgun utilizando o kit Illumina DNA Mix do kit Illumina MiSeq PE75. Um adaptador padrão (BioO) foi utilizado. Os arquivos de dados brutos estão disponíveis no NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 e SRR8924809). A qualidade básica de leitura foi avaliada utilizando o FastQC [23]. O Trimmomatic [24] foi utilizado para remover adaptadores e leituras de baixa qualidade. As leituras shotgun com extremidades pareadas foram unidas por FLASH em leituras únicas mais longas com uma sobreposição mínima de 20 pb para evitar incompatibilidades [25]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados de taxonomia de bivalves do NCBI (valor e < 1e−3 e 90% de homologia), e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. As leituras mescladas foram anotadas com BLASTN usando um banco de dados de taxonomia de bivalves do NCBI (valor e < 1e−3 e 90% de homologia), e o mascaramento de sequências de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26]. A arquitetura de segurança é anotada com o BLASTN e o isolamento de taxas de danos двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados de taxonomia de bivalves do NCBI (valor e < 1e-3 e 90% de homologia), e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 poeira [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽A solução de segurança é anotada com o uso do BLASTN com o uso de dados táticos двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 e 90% de гомологии), e a máscara é usada para usar poeira [26]. As leituras agrupadas foram anotadas com BLASTN usando o banco de dados taxonômico de bivalves do NCBI (valor e <1e-3 e 90% de homologia), e o mascaramento de sequência de baixa complexidade foi realizado usando DUST [26].As sequências foram divididas em dois grupos: relacionadas a sequências de bivalves (aqui chamadas de auto-sequências) e não relacionadas (não-auto-sequências). Os dois grupos foram montados separadamente usando o MEGAHIT para gerar contigs [27]. Enquanto isso, a distribuição taxonômica das sequências do microbioma alienígena foi classificada usando o Kraken2 [28] e representada graficamente por um gráfico de pizza Krona no Galaxy [29, 30]. O k-mers ideal foi determinado como sendo o k-mers-59 a partir de nossos experimentos preliminares. Em seguida, os contigs próprios foram identificados por alinhamento com o BLASTN (banco de dados de bivalves do NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia) para uma anotação final. Em seguida, os contigs próprios foram identificados por alinhamento com o BLASTN (banco de dados de bivalves do NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia) para uma anotação final. Este conteúdo confiável pode ser identificado por meio de uma solicitação do BLASTN (por exemplo, um cliente potencial моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) para anotações de confirmação. Em seguida, os contigs próprios foram identificados por meio de comparação com o BLASTN (banco de dados de bivalves do NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia) para a anotação final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Esta é uma identificação de conteúdo confiável para uma assinatura anual do BLASTN (em inglês). Dano NCBI para двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 e гомология 60%). Em seguida, os contigs próprios foram identificados para anotação final por meio de comparação com o BLASTN (banco de dados de bivalves do NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia). Em paralelo, os contigs do grupo não-próprio foram anotados com BLASTN (banco de dados NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia). Em paralelo, os contigs do grupo não-próprio foram anotados com BLASTN (banco de dados NCBI, valor e < 1e−10 e 60% de homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 e hemoglobina 60%). Em paralelo, os contigs de grupos estrangeiros foram anotados com BLASTN (banco de dados NT NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%). Em paralelo, os contigs do grupo não-próprio foram anotados com BLASTN (banco de dados NCBI, valor e <1e-10 e 60% de homologia). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e < 1e−10 e 60% de homologia). O BLASTX também foi realizado em contigs não próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e < 1e−10 e 60% de homologia). O BLASTX também foi testado em um número ilimitado de contatos com o uso de um número de banco de dados e RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não-próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e < 1e-10 e 60% de homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 O BLASTX também é fornecido com um contador desconhecido com o uso do banco de dados Belka nr e RefSeq NCBI (criado e <1e-10 и гомология 60%). O BLASTX também foi realizado em contigs não-próprios usando os bancos de dados de proteínas nr e RefSeq do NCBI (valor e <1e-10 e 60% de homologia).Os conjuntos de contigs não-auto-identificados obtidos por BLASTN e BLASTX representam os contigs finais (ver arquivo suplementar).
As sequências dos primers utilizados para PCR estão listadas na Tabela S1. A Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) foi utilizada para amplificar os genes-alvo do ccfDNA. As seguintes condições de reação foram utilizadas: desnaturação a 95 °C por 3 minutos, 95 °C por 1 minuto, temperatura de anelamento definida por 1 minuto, extensão a 72 °C por 1 minuto, 35 ciclos e, finalmente, 72 °C por 10 minutos. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose (1,5%) contendo SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) a 95 V.
Mexilhões (Mytilus spp.) foram aclimatados em 500 ml de água do mar oxigenada (32 PSU) por 24 horas a 4°C. DNA plasmídico contendo um inserto que codifica a sequência de cDNA da galectina-7 humana (número de acesso NCBI L07769) foi adicionado ao frasco a uma concentração final de 190 μg/μl. Mexilhões incubados nas mesmas condições, sem adição de DNA, serviram como controle. O terceiro tanque de controle continha DNA sem mexilhões. Para monitorar a qualidade do DNA na água do mar, amostras de água do mar (20 μl; três repetições) foram coletadas de cada tanque nos tempos indicados. Para rastreabilidade do DNA plasmídico, mexilhões LB foram coletados nos tempos indicados e analisados ​​por qPCR e ddPCR. Devido ao alto teor de sal da água do mar, alíquotas foram diluídas em água de qualidade para PCR (1:10) antes de todos os ensaios de PCR.
A PCR digital em gotas (ddPCR) foi realizada utilizando o protocolo BioRad QX200 (Mississauga, Ontário, Canadá). Utilize o perfil de temperatura para determinar a temperatura ideal (Tabela S1). As gotas foram geradas utilizando um gerador de gotas QX200 (BioRad). A ddPCR foi realizada da seguinte forma: 95 °C por 5 min, 50 ciclos de 95 °C por 30 s e uma determinada temperatura de anelamento por 1 min, seguidos de 72 °C por 30 s, 4 °C por 5 min e 90 °C em 5 minutos. O número de gotas e reações positivas (número de cópias/µl) foi medido utilizando um leitor de gotas QX200 (BioRad). Amostras com menos de 10.000 gotas foram descartadas. O controle de padrão não foi realizado em todas as execuções de ddPCR.
A qPCR foi realizada utilizando o Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) e primers específicos para LGALS7. Todas as PCRs quantitativas foram realizadas em um volume de 20 µl utilizando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN). A qPCR foi iniciada com uma incubação de 15 minutos a 95 °C, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 10 segundos e a 60 °C por 60 segundos, com uma única coleta de dados. As curvas de fusão foram geradas utilizando medições sucessivas a 95 °C por 5 segundos, 65 °C por 60 segundos e 97 °C ao final da qPCR. Cada qPCR foi realizada em triplicata, exceto para as amostras de controle.
Como os mexilhões são conhecidos por sua alta taxa de filtração, investigamos inicialmente se eles conseguiam filtrar e reter fragmentos de DNA presentes na água do mar. Também tínhamos interesse em saber se esses fragmentos se acumulavam em seu sistema linfático semiaberto. Resolvemos essa questão experimentalmente rastreando o destino de fragmentos de DNA solúveis adicionados aos tanques de mexilhões azuis. Para facilitar o rastreamento dos fragmentos de DNA, utilizamos DNA plasmídico exógeno (não próprio) contendo o gene da galectina-7 humana. A técnica ddPCR rastreia os fragmentos de DNA plasmídico na água do mar e nos mexilhões. Nossos resultados mostram que, enquanto a quantidade de fragmentos de DNA na água do mar permaneceu relativamente constante ao longo do tempo (até 7 dias) na ausência de mexilhões, na presença deles esse nível desapareceu quase completamente em 8 horas (Fig. 1a,b). Fragmentos de DNA exógeno foram facilmente detectados em 15 minutos no fluido intravalvular e na hemolinfa (Fig. 1c). Esses fragmentos ainda puderam ser detectados por até 4 horas após a exposição. Esta atividade de filtragem em relação aos fragmentos de DNA é comparável à atividade de filtragem de bactérias e algas [31]. Estes resultados sugerem que os mexilhões podem filtrar e acumular DNA estranho nos seus compartimentos de fluidos.
Concentrações relativas de DNA plasmídico na água do mar na presença (A) ou ausência (B) de mexilhões, medidas por ddPCR. Em A, os resultados são expressos em porcentagens, com as bordas das caixas representando os percentis 75 e 25. A curva logarítmica ajustada é mostrada em vermelho e a área sombreada em cinza representa o intervalo de confiança de 95%. Em B, a linha vermelha representa a média e a linha azul representa o intervalo de confiança de 95% para a concentração. C. Acúmulo de DNA plasmídico na hemolinfa e no fluido valvular de mexilhões em diferentes momentos após a adição de DNA plasmídico. Os resultados são apresentados como cópias absolutas detectadas/mL (±EP).
Em seguida, investigamos a origem do ccfDNA em mexilhões coletados em bancos de mexilhões nas Ilhas Kerguelen, um grupo remoto de ilhas com influência antropogênica limitada. Para isso, o cccDNA da hemolinfa dos mexilhões foi isolado e purificado por métodos comumente usados ​​para purificar cccDNA humano [32, 33]. Descobrimos que as concentrações médias de ccfDNA na hemolinfa dos mexilhões estão na faixa de microgramas por ml de hemolinfa (ver Tabela S2, Informações Suplementares). Essa faixa de concentrações é muito maior do que em pessoas saudáveis ​​(nanogramas por mililitro), mas, em casos raros, em pacientes com câncer, o nível de ccfDNA pode atingir vários microgramas por mililitro [34, 35]. Uma análise da distribuição de tamanho do ccfDNA da hemolinfa mostrou que esses fragmentos variam muito em tamanho, variando de 1000 pb a 5000 pb (Fig. 2). Resultados semelhantes foram obtidos usando o kit QIAamp Investigator baseado em sílica, um método comumente usado em ciência forense para isolar e purificar rapidamente o DNA genômico de amostras de DNA de baixa concentração, incluindo ccfDNA [36].
Eletroforese representativa de ccfDNA da hemolinfa de mexilhão. Extraída com o kit NucleoSnap Plasma (acima) e o kit QIAamp DNA Investigator. B. Gráfico de violino mostrando a distribuição das concentrações de ccfDNA na hemolinfa (±EP) dos mexilhões. As linhas pretas e vermelhas representam a mediana e o primeiro e terceiro quartis, respectivamente.
Aproximadamente 1% do ccfDNA em humanos e primatas tem origem externa [21, 37]. Considerando o sistema circulatório semiaberto dos bivalves, a água do mar rica em microrganismos e a distribuição de tamanho do ccfDNA dos mexilhões, levantamos a hipótese de que o ccfDNA da hemolinfa dos mexilhões possa conter um conjunto rico e diversificado de DNA microbiano. Para testar essa hipótese, sequenciamos o ccfDNA da hemolinfa de amostras de Aulacomya atra coletadas nas Ilhas Kerguelen, obtendo mais de 10 milhões de sequências, das quais 97,6% passaram pelo controle de qualidade. As sequências foram então classificadas de acordo com as fontes (própria e não própria) usando os bancos de dados BLASTN e NCBI para bivalves (Fig. S1, Informações Suplementares).
Em humanos, tanto o DNA nuclear quanto o mitocondrial podem ser liberados na corrente sanguínea [38]. No entanto, no presente estudo, não foi possível descrever em detalhes o DNA genômico nuclear dos mexilhões, visto que o genoma de A. atra não foi sequenciado nem descrito. Contudo, conseguimos identificar diversos fragmentos de ccfDNA de nossa própria origem utilizando a biblioteca de bivalves (Fig. S2, Informações Suplementares). Também confirmamos a presença de fragmentos de DNA de nossa própria origem por meio da amplificação por PCR direcionada dos genes de A. atra que foram sequenciados (Fig. 3). De forma semelhante, considerando que o genoma mitocondrial de A. atra está disponível em bancos de dados públicos, é possível encontrar evidências da presença de fragmentos de ccfDNA mitocondrial na hemolinfa de A. atra. A presença de fragmentos de DNA mitocondrial foi confirmada por amplificação por PCR (Fig. 3).
Diversos genes mitocondriais estavam presentes na hemolinfa de A. atra (pontos vermelhos – número de estoque: SRX5705969) e M. platensis (pontos azuis – número de estoque: SRX5705968) amplificados por PCR. Figura adaptada de Breton et al., 2011. B. Amplificação do sobrenadante da hemolinfa de A. atra. Armazenado em papel FTA. Utilize um perfurador de 3 mm para adicionar diretamente ao tubo de PCR contendo a mistura de PCR.
Dada a abundante composição microbiana na água do mar, inicialmente focamos na caracterização de sequências de DNA microbiano na hemolinfa. Para isso, utilizamos duas estratégias diferentes. A primeira estratégia utilizou o Kraken2, um programa de classificação de sequências baseado em algoritmos que pode identificar sequências microbianas com uma precisão comparável ao BLAST e outras ferramentas [28]. Mais de 6719 leituras foram determinadas como sendo de origem bacteriana, enquanto 124 e 64 eram de arqueas e vírus, respectivamente (Fig. 4). Os fragmentos de DNA bacteriano mais abundantes foram Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Essa distribuição é consistente com estudos anteriores do microbioma do mexilhão-azul marinho [39, 40]. Gammaproteobacteria foi a principal classe de Proteobacteria (44%), incluindo muitas Vibrionales (Fig. 4b). O método ddPCR confirmou a presença de fragmentos de DNA de Vibrio no ccfDNA da hemolinfa de A. atra (Fig. 4c) [41]. Para obter mais informações sobre a origem bacteriana do ccfDNA, uma abordagem adicional foi adotada (Fig. S2, Informações Suplementares). Neste caso, as sequências sobrepostas foram agrupadas em pares de extremidades e classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando o BLASTN, com um valor e de 1e−3 e um limite de >90% de homologia. Neste caso, as sequências sobrepostas foram agrupadas em pares de extremidades e classificadas como de origem própria (bivalves) ou não própria usando o BLASTN, com um valor e de 1e−3 e um limite de >90% de homologia. Neste caso, a configuração de segurança será garantida como a segurança do casamento e da classificação. собственные (двустворчатые моллюски) ou чужие по происхождению с использованием BLASTN e значения e 1e-3 e отсечения с гомологией> 90%. Neste caso, as sequências sobrepostas foram coletadas como sequências pareadas e classificadas como nativas (bivalves) ou não originais usando BLASTN, com valor e de 1e-3 e limite de >90% de homologia.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Neste caso, a configuração de segurança será garantida para que você possa estabelecer uma relação de parceria e classificação como собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Neste caso, as sequências sobrepostas foram coletadas como sequências pareadas e classificadas como próprias (bivalves) ou não originais usando o BLASTN e valores de 1e-3 e um limiar de homologia >90%.Como o genoma de A. atra ainda não foi sequenciado, utilizamos a estratégia de montagem de novo do montador de sequenciamento de nova geração (NGS) MEGAHIT. Um total de 147.188 contigs foram identificados como de origem dependente (bivalves). Esses contigs foram então expandidos com valores-e de 1e-10 usando BLASTN e BLASTX. Essa estratégia nos permitiu identificar 482 fragmentos não bivalves presentes no ccfDNA de A. atra. Mais da metade (57%) desses fragmentos de DNA foram obtidos de bactérias, principalmente de simbiontes branquiais, incluindo simbiontes sulfotróficos, e do simbionte branquial Solemya velum (Fig. 5).
Abundância relativa ao nível do tipo. B Diversidade microbiana de dois filos principais (Firmicutes e Proteobacteria). Amplificação representativa de ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmentos do gene 16S rRNA (azul) em três hemolinfas de atra.
Um total de 482 contigs coletados foram analisados. Perfil geral da distribuição taxonômica das anotações de contigs metagenômicos (procariontes e eucariontes). B Distribuição detalhada dos fragmentos de DNA bacteriano identificados por BLASTN e BLASTX.
A análise do Kraken2 também mostrou que o ccfDNA dos mexilhões continha fragmentos de DNA arqueano, incluindo fragmentos de DNA de Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). A presença de fragmentos de DNA derivados de Euryarchaeota e Crenarchaeota, previamente encontrados na comunidade microbiana de mexilhões californianos, não deve ser uma surpresa [42]. Embora Euryarchaeota seja frequentemente associada a condições extremas, atualmente reconhece-se que tanto Euryarchaeota quanto Crenarcheota estão entre os procariontes mais comuns no ambiente criogênico marinho [43, 44]. A presença de microrganismos metanogênicos em mexilhões não é surpreendente, considerando relatos recentes de extensos vazamentos de metano provenientes de infiltrações no fundo do mar no Planalto de Kerguelen [45] e a possível produção microbiana de metano observada na costa das Ilhas Kerguelen [46].
Nossa atenção então se voltou para as sequências de vírus de DNA. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo não direcionado ao conteúdo viral de mexilhões. Como esperado, encontramos fragmentos de DNA de bacteriófagos (Caudovirales) (Fig. 6b). No entanto, o DNA viral mais comum provém de um filo de nucleocitovírus, também conhecido como vírus de DNA nuclear citoplasmático grande (NCLDV), que possui o maior genoma de qualquer vírus. Dentro desse filo, a maioria das sequências de DNA pertence às famílias Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), cujos hospedeiros naturais incluem vertebrados e artrópodes, enquanto uma pequena proporção dessas sequências de DNA pertence a algas marinhas eucarióticas conhecidas por infectarem organismos virológicos. Sequências também foram obtidas do vírus Pandora, o vírus gigante com o maior tamanho de genoma de qualquer gênero viral conhecido. Curiosamente, a gama de hospedeiros conhecidos por estarem infectados com o vírus, conforme determinado pelo sequenciamento de ccfDNA da hemolinfa, foi relativamente ampla (Figura S3, Informações Suplementares). Inclui vírus que infectam insetos, como Baculoviridae e Iridoviridae, bem como vírus que infectam amebas, algas e vertebrados. Também encontramos sequências correspondentes ao genoma do Pithovirus sibericum. Os pitovírus (também conhecidos como “vírus zumbis”) foram isolados pela primeira vez do permafrost de 30.000 anos na Sibéria [47]. Assim, nossos resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que nem todas as espécies modernas desses vírus estão extintas [48] e que esses vírus podem estar presentes em ecossistemas marinhos subárticos remotos.
Finalmente, testamos se conseguiríamos encontrar fragmentos de DNA de outros animais multicelulares. Um total de 482 contigs estranhos foram identificados por BLASTN e BLASTX com bibliotecas nt, nr e RefSeq (genômicas e proteicas). Nossos resultados mostram que, entre os fragmentos estranhos de ccfDNA de animais multicelulares, o DNA de ossos ósseos predomina (Fig. 5). Fragmentos de DNA de insetos e outras espécies também foram encontrados. Uma parte relativamente grande dos fragmentos de DNA não foi identificada, possivelmente devido à sub-representação de um grande número de espécies marinhas em bancos de dados genômicos em comparação com espécies terrestres [49].
Neste artigo, aplicamos o conceito de LB (Biblioteca Linear) a mexilhões, argumentando que o sequenciamento de DNA livre circulante (cfDNA) da hemolinfa pode fornecer informações sobre a composição de ecossistemas costeiros marinhos. Em particular, descobrimos que: 1) a hemolinfa dos mexilhões contém concentrações relativamente altas (níveis de microgramas) de fragmentos de DNA circulantes relativamente grandes (~1-5 kb); 2) esses fragmentos de DNA são tanto independentes quanto não independentes; 3) entre as fontes externas desses fragmentos de DNA, encontramos DNA bacteriano, arqueano e viral, bem como DNA de outros animais multicelulares; 4) o acúmulo desses fragmentos de cfDNA exógenos na hemolinfa ocorre rapidamente e contribui para a atividade de filtragem interna dos mexilhões. Em conclusão, nosso estudo demonstra que o conceito de LB, que até agora tem sido aplicado principalmente no campo da biomedicina, codifica uma rica, porém inexplorada, fonte de conhecimento que pode ser usada para melhor compreender a interação entre espécies sentinelas e seu ambiente.
Além de primatas, o isolamento de ccfDNA foi relatado em mamíferos, incluindo camundongos, cães, gatos e cavalos [50, 51, 52]. No entanto, até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a relatar a detecção e o sequenciamento de ccfDNA em espécies marinhas com sistema circulatório aberto. Essa característica anatômica e a capacidade de filtragem dos mexilhões podem, pelo menos em parte, explicar as diferentes características de tamanho dos fragmentos de DNA circulantes em comparação com outras espécies. Em humanos, a maioria dos fragmentos de DNA circulantes no sangue são pequenos fragmentos com tamanhos variando de 150 a 200 pb, com um pico máximo de 167 pb [34, 53]. Uma pequena, mas significativa, porção de fragmentos de DNA tem entre 300 e 500 pb, e cerca de 5% são maiores que 900 pb [54]. A razão para essa distribuição de tamanho é que a principal fonte de ccfDNA no plasma ocorre como resultado da morte celular, seja por morte celular ou necrose de células hematopoiéticas circulantes em indivíduos saudáveis, ou por apoptose de células tumorais em pacientes com câncer (conhecido como DNA tumoral circulante, ctDNA). A distribuição de tamanho do ccfDNA da hemolinfa que encontramos em mexilhões variou de 1000 a 5000 pb, sugerindo que o ccfDNA dos mexilhões tem uma origem diferente. Essa é uma hipótese lógica, visto que os mexilhões possuem um sistema vascular semiaberto e vivem em ambientes aquáticos marinhos com altas concentrações de DNA genômico microbiano. De fato, nossos experimentos em laboratório com DNA exógeno mostraram que os mexilhões acumulam fragmentos de DNA na água do mar, sendo que, após algumas horas, esses fragmentos são degradados após a absorção celular e/ou liberados e/ou armazenados em diversas estruturas. Dada a raridade das células (tanto procarióticas quanto eucarióticas), o uso de compartimentos intravalvulares reduzirá a quantidade de ccfDNA proveniente tanto de fontes próprias quanto de fontes externas. Considerando a importância da imunidade inata dos bivalves e o grande número de fagócitos circulantes, hipotetizamos ainda que mesmo o ccfDNA exógeno se encontra enriquecido em fagócitos circulantes que acumulam DNA exógeno após a ingestão de microrganismos e/ou detritos celulares. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o ccfDNA da hemolinfa de bivalves é um repositório único de informações moleculares e reforça seu status como espécie sentinela.
Nossos dados indicam que o sequenciamento e a análise de fragmentos de ccfDNA da hemolinfa derivados de bactérias podem fornecer informações essenciais sobre a flora bacteriana do hospedeiro e as bactérias presentes no ecossistema marinho circundante. Técnicas de sequenciamento rápido revelaram sequências da bactéria comensal A. atra branquial que teriam passado despercebidas se métodos convencionais de identificação de rRNA 16S tivessem sido utilizados, em parte devido a um viés da biblioteca de referência. De fato, nosso uso de dados de LB coletados de M. platensis na mesma camada de mexilhões em Kerguelen mostrou que a composição de simbiontes bacterianos associados às brânquias era a mesma para ambas as espécies de mexilhões (Fig. S4, Informações Suplementares). Essa similaridade entre dois mexilhões geneticamente diferentes pode refletir a composição das comunidades bacterianas nos depósitos vulcânicos, sulfurosos e frios de Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Níveis mais elevados de microrganismos redutores de enxofre foram bem descritos na coleta de mexilhões em áreas costeiras bioturbadas [59], como a costa de Port-au-France. Outra possibilidade é que a flora comensal de mexilhões possa ser afetada pela transmissão horizontal [60, 61]. Mais pesquisas são necessárias para determinar a correlação entre o ambiente marinho, a superfície do fundo do mar e a composição de bactérias simbióticas em mexilhões. Esses estudos estão em andamento.
O comprimento e a concentração do ccfDNA da hemolinfa, a facilidade de purificação e a alta qualidade que permite o sequenciamento rápido por shotgun são algumas das muitas vantagens do uso do ccfDNA de mexilhões para avaliar a biodiversidade em ecossistemas marinhos costeiros. Essa abordagem é especialmente eficaz para caracterizar comunidades virais (viromas) em um determinado ecossistema [62, 63]. Ao contrário de bactérias, arqueas e eucariotos, os genomas virais não contêm genes filogeneticamente conservados, como as sequências 16S. Nossos resultados indicam que biópsias líquidas de espécies indicadoras, como mexilhões, podem ser usadas para identificar um número relativamente grande de fragmentos de ccfDNA de vírus conhecidos por infectar hospedeiros que tipicamente habitam ecossistemas marinhos costeiros. Isso inclui vírus conhecidos por infectar protozoários, artrópodes, insetos, plantas e vírus bacterianos (por exemplo, bacteriófagos). Uma distribuição semelhante foi encontrada quando examinamos o viroma de ccfDNA da hemolinfa de mexilhões azuis (M. platensis) coletados na mesma camada de mexilhões em Kerguelen (Tabela S2, Informações Suplementares). O sequenciamento shotgun de ccfDNA é, de fato, uma nova abordagem que vem ganhando impulso no estudo do viroma de humanos e outras espécies [21, 37, 64]. Essa abordagem é particularmente útil para o estudo de vírus de DNA de fita dupla, visto que nenhum gene é conservado entre todos os vírus de DNA de fita dupla, que representam a classe de vírus mais diversa e abrangente em Baltimore [65]. Embora a maioria desses vírus permaneça não classificada e possa incluir vírus de uma parte completamente desconhecida do mundo viral [66], descobrimos que os viromas e as gamas de hospedeiros dos mexilhões A. atra e M. platensis situam-se entre as duas espécies, de forma semelhante (ver figura S3, informações adicionais). Essa semelhança não é surpreendente, pois pode refletir uma falta de seletividade na absorção de DNA presente no ambiente. Estudos futuros utilizando RNA purificado são necessários para caracterizar o viroma de RNA.
Em nosso estudo, utilizamos um pipeline bastante rigoroso, adaptado do trabalho de Kowarski e colaboradores [37], que empregaram uma exclusão em duas etapas de leituras agrupadas e contigs antes e depois da montagem do ccfDNA nativo, resultando em uma alta proporção de leituras não mapeadas. Portanto, não podemos descartar a possibilidade de que algumas dessas leituras não mapeadas ainda tenham sua própria origem, principalmente porque não possuímos um genoma de referência para essa espécie de mexilhão. Também utilizamos esse pipeline devido à preocupação com as quimeras entre leituras próprias e não próprias e com os comprimentos de leitura gerados pelo Illumina MiSeq PE75. Outro motivo para a maioria das leituras não mapeadas é que grande parte dos microrganismos marinhos, especialmente em áreas remotas como Kerguelen, não foi anotada. Utilizamos o Illumina MiSeq PE75, assumindo comprimentos de fragmentos de ccfDNA semelhantes aos do ccfDNA humano. Para estudos futuros, considerando nossos resultados que demonstram que o ccfDNA da hemolinfa apresenta leituras mais longas do que as de humanos e/ou mamíferos, recomendamos o uso de uma plataforma de sequenciamento mais adequada para fragmentos de ccfDNA mais longos. Essa prática facilitará muito a identificação de mais indícios para análises mais aprofundadas. A obtenção da sequência completa do genoma nuclear de A. atra, atualmente indisponível, também facilitaria bastante a discriminação do ccfDNA de fontes próprias e não próprias. Dado que nossa pesquisa se concentrou na possibilidade de aplicar o conceito de biópsia líquida a mexilhões, esperamos que, à medida que esse conceito for utilizado em pesquisas futuras, novas ferramentas e fluxos de trabalho sejam desenvolvidos para aumentar o potencial desse método no estudo da diversidade microbiana de mexilhões no ecossistema marinho.
Como um biomarcador clínico não invasivo, níveis elevados de ccfDNA no plasma humano estão associados a diversas doenças, danos teciduais e condições de estresse [67,68,69]. Esse aumento está associado à liberação de fragmentos de DNA de sua própria origem após danos teciduais. Investigamos essa questão utilizando estresse térmico agudo, no qual mexilhões foram brevemente expostos a uma temperatura de 30 °C. Realizamos essa análise em três tipos diferentes de mexilhões em três experimentos independentes. No entanto, não encontramos nenhuma alteração nos níveis de ccfDNA após o estresse térmico agudo (ver Figura S5, informações adicionais). Essa descoberta pode explicar, pelo menos em parte, o fato de os mexilhões possuírem um sistema circulatório semiaberto e acumularem grandes quantidades de DNA exógeno devido à sua alta atividade filtradora. Por outro lado, os mexilhões, como muitos invertebrados, podem ser mais resistentes a danos teciduais induzidos por estresse, limitando assim a liberação de ccfDNA em sua hemolinfa [70, 71].
Até o momento, a análise de DNA da biodiversidade em ecossistemas aquáticos tem se concentrado principalmente no metabarcoding de DNA ambiental (eDNA). No entanto, esse método geralmente apresenta limitações na análise da biodiversidade quando primers são utilizados. O uso do sequenciamento shotgun contorna as limitações da PCR e a seleção tendenciosa de conjuntos de primers. Assim, em certo sentido, nosso método se aproxima do método de sequenciamento shotgun de eDNA de alto rendimento utilizado recentemente, que é capaz de sequenciar diretamente o DNA fragmentado e analisar quase todos os organismos [72, 73]. Contudo, existem algumas questões fundamentais que distinguem o LB dos métodos padrão de eDNA. Obviamente, a principal diferença entre eDNA e LB é o uso de hospedeiros filtradores naturais. O uso de espécies marinhas, como esponjas e bivalves (Dresseina spp.), como filtro natural para o estudo de eDNA já foi relatado [74, 75]. Entretanto, o estudo de Dreissena utilizou biópsias de tecido das quais o DNA foi extraído. A análise de ccfDNA por LB não requer biópsia de tecido, equipamentos especializados e, por vezes, dispendiosos, nem a logística associada ao eDNA ou à biópsia de tecido. De fato, relatamos recentemente que o ccfDNA de biópsias líquidas pode ser armazenado e analisado com suporte de FTA sem a necessidade de manter uma cadeia de frio, o que representa um grande desafio para pesquisas em áreas remotas [76]. A extração de ccfDNA de biópsias líquidas também é simples e fornece DNA de alta qualidade para sequenciamento shotgun e análise por PCR. Essa é uma grande vantagem, considerando algumas das limitações técnicas associadas à análise de eDNA [77]. A simplicidade e o baixo custo do método de amostragem também são particularmente adequados para programas de monitoramento de longo prazo. Além de sua alta capacidade de filtragem, outra característica bem conhecida dos bivalves é a composição química de mucopolissacarídeos de seu muco, que promove a absorção de vírus [78, 79]. Isso torna os bivalves um filtro natural ideal para caracterizar a biodiversidade e o impacto das mudanças climáticas em um determinado ecossistema aquático. Embora a presença de fragmentos de DNA derivados do hospedeiro possa ser vista como uma limitação do método em comparação com o eDNA, o custo associado à obtenção de ccfDNA nativo em comparação com o eDNA é, ao mesmo tempo, compreensível devido à vasta quantidade de informações disponíveis para estudos de saúde. Isso inclui a presença de sequências virais integradas ao genoma do hospedeiro. Isso é especialmente importante para mexilhões, dada a presença de retrovírus leucêmicos transmitidos horizontalmente em bivalves [80, 81]. Outra vantagem do LB sobre o eDNA é que ele explora a atividade fagocítica das células sanguíneas circulantes na hemolinfa, que engloba microrganismos (e seus genomas). A fagocitose é a principal função das células sanguíneas em bivalves [82]. Finalmente, o método aproveita a alta capacidade de filtração dos mexilhões (média de 1,5 l/h de água do mar) e a circulação de dois dias, que aumentam a mistura de diferentes camadas de água do mar, permitindo a captura de eDNA heterólogo [83, 84]. Assim, a análise de ccfDNA de mexilhões é uma via interessante, dados os impactos nutricionais, econômicos e ambientais dos mexilhões. Semelhante à análise de LB coletado de humanos, esse método também abre a possibilidade de medir alterações genéticas e epigenéticas no DNA do hospedeiro em resposta a substâncias exógenas. Por exemplo, tecnologias de sequenciamento de terceira geração podem ser consideradas para realizar análises de metilação em todo o genoma no ccfDNA nativo usando sequenciamento de nanoporos. Esse processo deve ser facilitado pelo fato de que o comprimento dos fragmentos de ccfDNA do mexilhão é idealmente compatível com plataformas de sequenciamento de leitura longa, que permitem a análise de metilação de DNA em todo o genoma a partir de uma única execução de sequenciamento, sem a necessidade de transformações químicas.85,86] Essa é uma possibilidade interessante, visto que foi demonstrado que os padrões de metilação do DNA refletem uma resposta ao estresse ambiental e persistem por muitas gerações. Portanto, pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes que governam a resposta após a exposição às mudanças climáticas ou poluentes [87]. No entanto, o uso de LB não está isento de limitações. É evidente que isso requer a presença de espécies indicadoras no ecossistema. Como mencionado acima, o uso de LB para avaliar a biodiversidade de um determinado ecossistema também requer um pipeline bioinformático rigoroso que leve em consideração a presença de fragmentos de DNA da fonte. Outro grande problema é a disponibilidade de genomas de referência para espécies marinhas. Espera-se que iniciativas como o Projeto Genomas de Mamíferos Marinhos e o projeto Fish10k, recentemente criado [88], facilitem essa análise no futuro. A aplicação do conceito de LB a organismos marinhos filtradores também é compatível com os avanços mais recentes na tecnologia de sequenciamento, tornando-o adequado para o desenvolvimento de biomarcadores multi-ohm para fornecer informações importantes sobre a saúde dos habitats marinhos em resposta ao estresse ambiental.
Os dados de sequenciamento do genoma foram depositados no NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sob o projeto SRR8924808.
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