Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Biopsja płynna (LB) to koncepcja, która szybko zyskuje na popularności w dziedzinie biomedycyny. Opiera się ona głównie na wykrywaniu fragmentów krążącego pozakomórkowego DNA (ccfDNA), które są uwalniane głównie jako małe fragmenty po śmierci komórek w różnych tkankach. Niewielka część tych fragmentów pochodzi z obcych tkanek lub organizmów. W obecnej pracy zastosowaliśmy tę koncepcję do małży, gatunku strażniczego znanego z wysokiej zdolności filtracji wody morskiej. Wykorzystujemy zdolność małży do działania jako naturalne filtry do wychwytywania fragmentów DNA środowiskowego z różnych źródeł, aby dostarczyć informacji na temat bioróżnorodności morskich ekosystemów przybrzeżnych. Nasze wyniki pokazują, że hemolimfa małży zawiera fragmenty DNA o zróżnicowanej wielkości, od 1 do 5 kb. Sekwencjonowanie metodą shotgun wykazało, że duża liczba fragmentów DNA ma obce pochodzenie mikrobiologiczne. Wśród nich znaleźliśmy fragmenty DNA bakterii, archeonów i wirusów, w tym wirusów, o których wiadomo, że infekują wiele organizmów powszechnie występujących w przybrzeżnych ekosystemach morskich. Podsumowując, nasze badanie dowodzi, że koncepcja LB zastosowana do małży stanowi bogate, lecz jak dotąd niezbadane źródło wiedzy na temat różnorodności mikroorganizmów w morskich ekosystemach przybrzeżnych.
Wpływ zmian klimatu (CC) na bioróżnorodność ekosystemów morskich to szybko rozwijający się obszar badań. Globalne ocieplenie nie tylko powoduje istotne stresy fizjologiczne, ale także przesuwa ewolucyjne granice stabilności termicznej organizmów morskich, wpływając na siedliska wielu gatunków i zmuszając je do poszukiwania korzystniejszych warunków [1, 2]. Oprócz wpływu na bioróżnorodność organizmów wielokomórkowych, CC zaburza delikatną równowagę interakcji gospodarz-mikrobacje. Ta dysbakterioza mikrobiologiczna stanowi poważne zagrożenie dla ekosystemów morskich, ponieważ zwiększa podatność organizmów morskich na patogeny zakaźne [3, 4]. Uważa się, że SS odgrywają istotną rolę w masowych zgonach, co stanowi poważny problem dla zarządzania globalnymi ekosystemami morskimi [5, 6]. Jest to istotna kwestia, biorąc pod uwagę ekonomiczny, ekologiczny i odżywczy wpływ wielu gatunków morskich. Dotyczy to zwłaszcza małży żyjących w regionach polarnych, gdzie skutki CK są bardziej natychmiastowe i dotkliwe [6, 7]. W rzeczywistości małże takie jak Mytilus spp. są szeroko stosowane do monitorowania wpływu CC na ekosystemy morskie. Nic dziwnego, że opracowano stosunkowo dużą liczbę biomarkerów do monitorowania ich zdrowia, często wykorzystując dwustopniowe podejście obejmujące funkcjonalne biomarkery oparte na aktywności enzymatycznej lub funkcjach komórkowych, takich jak żywotność komórek i aktywność fagocytarna [8]. Metody te obejmują również pomiar stężenia specyficznych wskaźników ciśnienia, które kumulują się w tkankach miękkich po wchłonięciu dużych ilości wody morskiej. Jednak wysoka zdolność filtracji i półotwarty układ krążenia małży stwarzają możliwość opracowania nowych biomarkerów hemolimfy z wykorzystaniem koncepcji biopsji płynnej (LB), prostego i małoinwazyjnego podejścia do leczenia pacjentów. próbek krwi [9, 10]. Chociaż w ludzkiej LB można znaleźć kilka rodzajów krążących cząsteczek, koncepcja ta opiera się przede wszystkim na analizie sekwencjonowania DNA krążących fragmentów zewnątrzkomórkowego DNA (ccfDNA) w osoczu. W rzeczywistości obecność krążącego DNA w ludzkim osoczu jest znana od połowy XX wieku [11], ale dopiero w ostatnich latach pojawienie się metod sekwencjonowania o wysokiej przepustowości umożliwiło diagnozę kliniczną opartą na ccfDNA. Obecność tych krążących fragmentów DNA wynika częściowo z biernego uwalniania genomowego DNA (jądrowego i mitochondrialnego) po śmierci komórki. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, powodując uszkodzenie tkanek. U zdrowych osób stężenie ccfDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów cierpiących na różne patologie lub poddanych stresowi, powodując uszkodzenie tkanek. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/ml), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. U zdrowych osób stężenie cccDNA jest zazwyczaj niskie (<10 ng/ml), ale może wzrosnąć 5–10-krotnie u pacjentów z różnymi patologiami lub poddanych stresowi prowadzącemu do uszkodzenia tkanek.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低(<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены w 5-10 miesięcy пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Stężenia ccfDNA są zazwyczaj niskie (<10 ng/ml) u zdrowych osób, ale mogą wzrosnąć 5-10-krotnie u pacjentów z różnymi patologiami lub narażonych na stres, powodując uszkodzenie tkanek.Wielkość fragmentów ccfDNA jest bardzo zróżnicowana, ale zwykle mieści się w zakresie od 150 do 200 pb. [12]. Analiza samoistnego ccfDNA, tj. ccfDNA z normalnych lub transformowanych komórek gospodarza, może być stosowana do wykrywania zmian genetycznych i epigenetycznych obecnych w genomie jądrowym i/lub mitochondrialnym, pomagając w ten sposób lekarzom w wyborze konkretnych terapii ukierunkowanych molekularnie [13]. Jednakże ccfDNA można uzyskać ze źródeł obcych, takich jak ccfDNA z komórek płodu w czasie ciąży lub z przeszczepionych narządów [14,15,16,17]. ccfDNA jest również ważnym źródłem informacji do wykrywania obecności kwasów nukleinowych czynnika zakaźnego (obcego), co umożliwia nieinwazyjne wykrywanie rozległych zakażeń nieidentyfikowanych przez hodowle krwi, unikając inwazyjnej biopsji zakażonej tkanki [18]. Niedawne badania wykazały, że ludzka krew zawiera bogate źródło informacji, które można wykorzystać do identyfikacji patogenów wirusowych i bakteryjnych, a około 1% ccfDNA w ludzkim osoczu ma pochodzenie obce [19]. Badania te dowodzą, że bioróżnorodność krążącego mikrobiomu organizmu można ocenić za pomocą analizy ccfDNA. Jednak do niedawna koncepcja ta była stosowana wyłącznie u ludzi i, w mniejszym stopniu, u innych kręgowców [20, 21].
W niniejszym artykule wykorzystujemy potencjał LB do analizy ccfDNA Aulacomya atra, południowego gatunku powszechnie występującego na subantarktycznych Wyspach Kerguelena, grupie wysp na szczycie dużego płaskowyżu, który powstał 35 milionów lat temu w wyniku erupcji wulkanu. Za pomocą systemu eksperymentalnego in vitro odkryliśmy, że fragmenty DNA w wodzie morskiej są szybko wchłaniane przez małże i przedostają się do hemolimfy. Sekwencjonowanie metodą shotgun wykazało, że ccfDNA hemolimfy małży zawiera fragmenty DNA zarówno własnego, jak i obcego pochodzenia, w tym bakterie symbiotyczne oraz fragmenty DNA z biomów typowych dla zimnych, wulkanicznych morskich ekosystemów przybrzeżnych. ccfDNA hemolimfy zawiera również sekwencje wirusowe pochodzące od wirusów o różnych zakresach żywicieli. Znaleźliśmy również fragmenty DNA zwierząt wielokomórkowych, takich jak ryby kostnoszkieletowe, ukwiały, glony i owady. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcję LB można z powodzeniem zastosować do bezkręgowców morskich w celu wygenerowania bogatego repertuaru genomowego w ekosystemach morskich.
Dorosłe osobniki (55-70 mm długości) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) zebrano z pływowych skalistych brzegów Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Wyspy Kerguelena w grudniu 2018 r. Pozostałe dorosłe małże pospolite (Mytilus spp.) uzyskano od komercyjnego dostawcy (PEI Mussel King Inc., Wyspa Księcia Edwarda, Kanada) i umieszczono w napowietrzanym zbiorniku o kontrolowanej temperaturze (4°C) zawierającym 10-20 l 32‰ sztucznej solanki. (sztuczna sól morska Reef Crystal, Instant Ocean, Wirginia, USA). W każdym eksperymencie mierzono długość i wagę poszczególnych muszli.
Bezpłatny protokół otwartego dostępu do tego programu jest dostępny online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). W skrócie, hemolimfę LB pobrano z mięśni odwodzicieli zgodnie z opisem [22]. Hemolimfę sklarowano przez wirowanie przy 1200 × g przez 3 minuty, a supernatant zamrożono (-20°C) do momentu użycia. W celu izolacji i oczyszczenia cfDNA próbki (1,5–2,0 ml) rozmrożono i przetworzono przy użyciu zestawu NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) zgodnie z instrukcją producenta. ccfDNA przechowywano w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. W niektórych eksperymentach ccfDNA izolowano i oczyszczano przy użyciu zestawu QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Ilość oczyszczonego DNA oznaczono ilościowo za pomocą standardowego testu PicoGreen. Dystrybucję fragmentów wyizolowanego ccfDNA analizowano metodą elektroforezy kapilarnej na bioanalizatorze Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornia) z użyciem zestawu High Sensitivity DNA Kit. Test przeprowadzono z użyciem 1 µl próbki ccfDNA zgodnie z instrukcją producenta.
Do sekwencjonowania fragmentów ccfDNA hemolimfy firma Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) przygotowała biblioteki typu shotgun, używając zestawu Illumina DNA Mix zestawu Illumina MiSeq PE75. Użyto standardowego adaptera (BioO). Surowe pliki danych są dostępne w archiwum odczytów sekwencji NCBI (SRR8924808 i SRR8924809). Podstawową jakość odczytu oceniono za pomocą FastQC [23]. Do przycinania adapterów i odczytów o niskiej jakości użyto Trimmomatic [24]. Odczyty typu shotgun z parzystymi końcami zostały połączone w pamięci FLASH w dłuższe pojedyncze odczyty z minimalnym nakładaniem się 20 pb, aby uniknąć niezgodności [25]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu narzędzia BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii NCBI dla małży (wartość e < 1e−3 i homologia 90%), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu narzędzia DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu narzędzia BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii NCBI dla małży (wartość e < 1e−3 i homologia 90%), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu narzędzia DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN z использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomii małży NCBI (wartość e < 1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 pył [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN z использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 i 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Połączone odczyty adnotowano przy użyciu BLASTN, wykorzystując bazę danych taksonomicznych małży NCBI (wartość e <1e-3 i 90% homologii), a maskowanie sekwencji o niskiej złożoności przeprowadzono przy użyciu DUST [26].Odczyty podzielono na dwie grupy: powiązane z sekwencjami małży (tutaj zwane odczytami samoistnymi) i niepowiązane (odczyty niesamoistne). Dwie grupy zostały oddzielnie połączone za pomocą programu MEGAHIT w celu wygenerowania kontigów [27]. Jednocześnie rozkład taksonomiczny odczytów obcego mikrobiomu został sklasyfikowany za pomocą programu Kraken2 [28] i przedstawiony graficznie za pomocą wykresu kołowego Krona w programie Galaxy [29, 30]. Optymalne wartości kmerów ustalono na podstawie naszych wstępnych eksperymentów na poziomie kmerów-59. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%) для окончательной аннотации. Następnie zidentyfikowano kontigi własne poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii) w celu dokonania ostatecznej adnotacji.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 i гомология 60%). Następnie zidentyfikowano kontigi własne w celu ostatecznej adnotacji poprzez porównanie z bazą danych BLASTN (baza danych małży NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grup obcych zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych NT NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 i гомология 60%). Równolegle kontigi grup niebędących własnymi zostały adnotowane przy użyciu BLASTN (baza danych nt NCBI, wartość e <1e-10 i 60% homologii). Badanie BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e−10 i 60% homologii). Badanie BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e−10 i 60% homologii). BLASTX taki jak проведен на несамостоятельных контигах z использованием баз данных белка nr i RefSeq NCBI (значение e <1e-10 i гомология 60%). Test BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e < 1e-10 i 60% homologii).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX tak выполняли на несамостоятельных контигах z использованием баз данных белка nr i RefSeq NCBI (значение e <1e-10 i гомология 60%). Test BLASTX przeprowadzono również na kontigach nieswoistych, wykorzystując bazy danych białek nr i RefSeq NCBI (wartość e <1e-10 i 60% homologii).Pule BLASTN i BLASTX kontigów niebędących własnymi reprezentują kontigi końcowe (patrz plik uzupełniający).
Startery użyte do PCR wymieniono w Tabeli S1. Do amplifikacji genów docelowych ccfDNA użyto polimerazy DNA Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON). Zastosowano następujące warunki reakcji: denaturacja w temperaturze 95°C przez 3 minuty, 95°C przez 1 minutę, ustawiona temperatura hybrydyzacji przez 1 minutę, elongacja w temperaturze 72°C przez 1 minutę, 35 cykli i ostatecznie 72°C w ciągu 10 minut. Produkty PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelach agarozowych (1,5%) zawierających barwnik SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) przy napięciu 95 V.
Małże (Mytilus spp.) aklimatyzowano w 500 ml natlenionej wody morskiej (32 PSU) przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Do fiolki dodano DNA plazmidowe zawierające wstawkę kodującą sekwencję cDNA ludzkiej galektyny-7 (numer rejestracyjny NCBI L07769) w stężeniu końcowym 190 μg/μl. Małże inkubowane w tych samych warunkach bez dodatku DNA stanowiły kontrolę. Trzeci zbiornik kontrolny zawierał DNA bez małży. Aby monitorować jakość DNA w wodzie morskiej, próbki wody morskiej (20 μl; trzy powtórzenia) pobrano z każdego zbiornika o wskazanym czasie. W celu śledzenia DNA plazmidowego, małże LB zebrano o wskazanych porach i przeanalizowano za pomocą qPCR i ddPCR. Ze względu na wysoką zawartość soli w wodzie morskiej, przed wszystkimi testami PCR alikwoty rozcieńczono w wodzie o jakości odpowiedniej do PCR (1:10).
Cyfrową reakcję PCR kropelkową (ddPCR) przeprowadzono przy użyciu protokołu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Użyj profilu temperaturowego, aby określić optymalną temperaturę (Tabela S1). Krople wygenerowano przy użyciu generatora kropel QX200 (BioRad). ddPCR przeprowadzono w następujący sposób: 95°C przez 5 min, 50 cykli 95°C przez 30 s i podana temperatura hybrydyzacji przez 1 min i 72°C przez 30 s, 4°C przez 5 min i 90°C w ciągu 5 minut. Liczbę kropel i reakcji dodatnich (liczba kopii/µl) mierzono przy użyciu czytnika kropel QX200 (BioRad). Próbki zawierające mniej niż 10 000 kropel odrzucono. Kontrola wzoru nie była przeprowadzana przy każdym uruchomieniu ddPCR.
qPCR przeprowadzono z użyciem Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) i starterów specyficznych dla LGALS7. Wszystkie ilościowe reakcje PCR przeprowadzono w 20 µl, używając zestawu QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR rozpoczęto 15-minutową inkubacją w temperaturze 95°C, a następnie wykonano 40 cykli w temperaturze 95°C przez 10 sekund i w temperaturze 60°C przez 60 sekund, z jednym zebraniem danych. Krzywe topnienia wygenerowano, wykonując kolejne pomiary w temperaturze 95°C przez 5 sekund, 65°C przez 60 sekund i 97°C na końcu qPCR. Każda reakcja qPCR została przeprowadzona trzykrotnie, z wyjątkiem próbek kontrolnych.
Ponieważ małże znane są ze swojej wysokiej szybkości filtracji, najpierw zbadaliśmy, czy mogą filtrować i zatrzymywać fragmenty DNA obecne w wodzie morskiej. Interesowało nas również, czy te fragmenty kumulują się w ich półotwartym układzie limfatycznym. Rozwiązaliśmy ten problem eksperymentalnie, śledząc los rozpuszczalnych fragmentów DNA dodanych do zbiorników z omułkami pospolitymi. Aby ułatwić śledzenie fragmentów DNA, użyliśmy obcego (nie własnego) plazmidowego DNA zawierającego gen ludzkiej galektyny-7. ddPCR śledzi fragmenty plazmidowego DNA w wodzie morskiej i małżach. Nasze wyniki pokazują, że jeśli ilość fragmentów DNA w wodzie morskiej pozostawała względnie stała w czasie (do 7 dni) pod nieobecność małży, to w obecności małży poziom ten prawie całkowicie zanikał w ciągu 8 godzin (ryc. 1a, b). Fragmenty egzogennego DNA były łatwo wykrywalne w ciągu 15 minut w płynie wewnątrzzastawkowym i hemolimfie (ryc. 1c). Fragmenty te można było nadal wykrywać do 4 godzin po ekspozycji. Ta aktywność filtracyjna w odniesieniu do fragmentów DNA jest porównywalna z aktywnością filtracyjną bakterii i alg [31]. Wyniki te sugerują, że małże mogą filtrować i gromadzić obce DNA w swoich przedziałach płynowych.
Względne stężenia plazmidowego DNA w wodzie morskiej w obecności (A) lub nieobecności (B) małży, mierzone metodą ddPCR. W przykładzie A wyniki wyrażono w procentach, a granice pól reprezentują 75. i 25. percentyl. Dopasowana krzywa logarytmiczna jest pokazana na czerwono, a obszar zacieniowany na szaro przedstawia 95% przedział ufności. W przykładzie B czerwona linia przedstawia średnią, a niebieska linia przedstawia 95% przedział ufności dla stężenia. C Akumulacja plazmidowego DNA w hemolimfie i płynie zastawkowym małży w różnym czasie po dodaniu plazmidowego DNA. Wyniki przedstawiono jako bezwzględną liczbę wykrytych kopii/ml (±SE).
Następnie zbadaliśmy pochodzenie ccfDNA w małżach zebranych z pokładów małży na Wyspach Kerguelena, odległej grupie wysp o ograniczonym wpływie antropogenicznym. W tym celu wyizolowano cccDNA z hemolimf małży i oczyszczono metodami powszechnie stosowanymi do oczyszczania ludzkiego cccDNA [32, 33]. Stwierdziliśmy, że średnie stężenia ccfDNA hemolimfy w małżach mieszczą się w niskim zakresie mikrogramów na ml hemolimfy (patrz Tabela S2, Informacje uzupełniające). Ten zakres stężeń jest znacznie większy niż u zdrowych osób (niskie nanogramy na mililitr), ale w rzadkich przypadkach, u pacjentów onkologicznych, poziom ccfDNA może osiągnąć kilka mikrogramów na mililitr [34, 35]. Analiza dystrybucji wielkości ccfDNA hemolimfy wykazała, że ​​te fragmenty różnią się znacznie wielkością, od 1000 pb do 1000 pb. do 5000 pb (ryc. 2). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu zestawu QIAamp Investigator Kit na bazie krzemionki, metody powszechnie stosowanej w kryminalistyce do szybkiej izolacji i oczyszczania genomowego DNA z próbek DNA o niskim stężeniu, w tym ccfDNA [36].
Reprezentatywny elektroforegram ccfDNA hemolimfy małży. Ekstrakcja wykonana za pomocą zestawu NucleoSnap Plasma Kit (góra) i zestawu QIAamp DNA Investigator Kit. B Wykres skrzypcowy przedstawiający rozkład stężeń ccfDNA hemolimfy (± SE) w małżach. Linie czarne i czerwone oznaczają odpowiednio medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl.
Około 1% ccfDNA u ludzi i naczelnych ma obce źródło [21, 37]. Biorąc pod uwagę półotwarty układ krążenia małży, bogatą w mikroorganizmy wodę morską oraz rozkład wielkości ccfDNA małży, postawiliśmy hipotezę, że hemolimfa ccfDNA małży może zawierać bogatą i zróżnicowaną pulę DNA drobnoustrojów. Aby zweryfikować tę hipotezę, zsekwencjonowaliśmy hemolimfę ccfDNA z próbek Aulacomya atra pobranych z Wysp Kerguelena, uzyskując ponad 10 milionów odczytów, z których 97,6% przeszło kontrolę jakości. Odczyty zostały następnie sklasyfikowane według źródeł własnych i obcych, korzystając z baz danych małży BLASTN i NCBI (ryc. S1, Informacje uzupełniające).
U ludzi zarówno jądrowe, jak i mitochondrialne DNA może zostać uwolnione do krwiobiegu [38]. Jednak w niniejszym badaniu nie było możliwe szczegółowe opisanie genomowego DNA jądrowego małży, biorąc pod uwagę, że genom A. atra nie został zsekwencjonowany ani opisany. Jednakże byliśmy w stanie zidentyfikować szereg fragmentów ccfDNA naszego pochodzenia przy użyciu biblioteki małży (rys. S2, informacje uzupełniające). Potwierdziliśmy również obecność fragmentów DNA naszego pochodzenia poprzez ukierunkowaną amplifikację PCR tych genów A. atra, które zostały zsekwencjonowane (rys. 3). Podobnie, biorąc pod uwagę, że genom mitochondrialny A. atra jest dostępny w publicznych bazach danych, można znaleźć dowody na obecność mitochondrialnych fragmentów ccfDNA w hemolimfie A. atra. Obecność fragmentów mitochondrialnego DNA została potwierdzona poprzez amplifikację PCR (rys. 3).
W hemolimfie A. atra (czerwone kropki – numer referencyjny: SRX5705969) i M. platensis (niebieskie kropki – numer referencyjny: SRX5705968) amplifikowanej metodą PCR obecne były różne geny mitochondrialne. Rysunek zaadaptowany z pracy Breton i in., 2011 B. Amplifikacja supernatantu hemolimfy A. atra. Przechowywany na bibule FTA. Za pomocą dziurkacza 3 mm dodać bezpośrednio do probówki PCR zawierającej mieszaninę PCR.
Biorąc pod uwagę obfitą zawartość mikroorganizmów w wodzie morskiej, początkowo skupiliśmy się na charakterystyce sekwencji DNA drobnoustrojów w hemolimfie. Aby to zrobić, zastosowaliśmy dwie różne strategie. Pierwsza strategia wykorzystała Kraken2, program do klasyfikacji sekwencji oparty na algorytmach, który może identyfikować sekwencje mikroorganizmów z dokładnością porównywalną z BLAST i innymi narzędziami [28]. Ponad 6719 odczytów określono jako pochodzenia bakteryjnego, podczas gdy 124 i 64 pochodziło odpowiednio od archeonów i wirusów (ryc. 4). Najliczniejsze fragmenty DNA bakterii pochodziły od Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (ryc. 4a). Ten rozkład jest zgodny z wcześniejszymi badaniami mikrobiomu morskiego małża modrego [39, 40]. Gammaproteobacteria stanowiły główną klasę Proteobacteria (44%), w tym wiele Vibrionales (ryc. 4b). Metoda ddPCR potwierdziła obecność fragmentów DNA Vibrio w ccfDNA hemolimfy A. atra (ryc. 4c) [41]. Aby uzyskać więcej informacji na temat bakteryjnego pochodzenia ccfDNA, zastosowano dodatkowe podejście (ryc. S2, informacje uzupełniające). W tym przypadku nakładające się odczyty zostały złożone jako odczyty parzyste i sklasyfikowane jako pochodzące od siebie (małże) lub od kogoś obcego przy użyciu programu BLASTN i wartości e wynoszącej 1e−3 oraz punktu odcięcia z homologią >90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zostały złożone jako odczyty parzyste i sklasyfikowane jako pochodzące od siebie (małże) lub od kogoś obcego przy użyciu programu BLASTN i wartości e wynoszącej 1e−3 oraz punktu odcięcia z homologią >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными conцами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN i значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zebrano jako odczyty o sparowanych końcach i sklasyfikowano jako natywne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu BLASTN i wartości e wynoszącej 1e-3 oraz punktu odcięcia z homologią >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身(双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и clasсифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN i 1e-3 и порога гомологии> 90%. W tym przypadku nakładające się odczyty zebrano jako odczyty parzyste i sklasyfikowano jako własne (małże) lub nieoryginalne przy użyciu wartości e BLASTN i 1e-3 oraz progu homologii >90%.Ponieważ genom A. atra nie został jeszcze zsekwencjonowany, zastosowaliśmy strategię montażu de novo asemblera MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Zidentyfikowano łącznie 147 188 kontigów zależnych (małże) od pochodzenia. Kontigi te zostały następnie rozbite z wartościami e 1e-10 za pomocą BLASTN i BLASTX. Strategia ta pozwoliła nam zidentyfikować 482 fragmenty niepochodzące od małży obecne w ccfDNA A. atra. Ponad połowa (57%) tych fragmentów DNA pochodziła z bakterii, głównie z symbiontów skrzelowych, w tym symbiontów sulfotroficznych, oraz z symbiontów skrzelowych Solemya velum (ryc. 5).
Względna liczebność na poziomie typu. B. Różnorodność mikroorganizmów dwóch głównych typów (Firmicutes i Proteobacteria). Reprezentatywna amplifikacja ddPCR. C. Vibrio spp. A. Fragmenty genu 16S rRNA (niebieskie) w trzech atrahemolimfach.
Przeanalizowano łącznie 482 zebrane kontigi. Ogólny profil taksonomicznego rozmieszczenia adnotacji kontigów metagenomicznych (prokarionty i eukarionty). B Szczegółowy rozkład fragmentów DNA bakterii zidentyfikowanych za pomocą BLASTN i BLASTX.
Analiza Kraken2 wykazała również, że ccfDNA małży zawierało fragmenty archeonowego DNA, w tym fragmenty DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (ryc. 6a). Obecność fragmentów DNA pochodzących od Euryarchaeota i Crenarchaeota, wcześniej stwierdzonych w mikrobiomie małży kalifornijskich, nie powinna być zaskoczeniem [42]. Chociaż Euryarchaeota często wiąże się z ekstremalnymi warunkami, obecnie uznaje się, że zarówno Euryarchaeota, jak i Crenarcheota należą do najpowszechniejszych prokariotów w morskim środowisku kriogenicznym [43, 44]. Obecność mikroorganizmów metanogennych w małżach nie jest zaskakująca, biorąc pod uwagę ostatnie doniesienia o rozległych wyciekach metanu z przecieków dennych na płaskowyżu Kerguelen [45] i możliwej mikrobiologicznej produkcji metanu obserwowanej u wybrzeży Wysp Kerguelen [46].
Następnie nasza uwaga przeniosła się na odczyty z wirusów DNA. Według naszej najlepszej wiedzy, jest to pierwsze badanie poza celem zawartości wirusa w małżach. Zgodnie z oczekiwaniami, znaleźliśmy fragmenty DNA bakteriofagów (Caudovirales) (ryc. 6b). Jednak najpowszechniejsze wirusowe DNA pochodzi z typu nukleocytowirusów, znanego również jako jądrowy cytoplazmatyczny wirus dużego DNA (NCLDV), który ma największy genom spośród wszystkich wirusów. W obrębie tego typu większość sekwencji DNA należy do rodzin Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), których naturalnymi żywicielami są kręgowce i stawonogi, podczas gdy niewielka część tych sekwencji DNA należy do znanych glonów wirusologicznych. Infekuje morskie glony eukariotyczne. Sekwencje uzyskano również z wirusa Pandora, gigantycznego wirusa o największym rozmiarze genomu spośród wszystkich znanych rodzajów wirusów. Co ciekawe, zakres żywicieli znanych z zakażenia wirusem, określony na podstawie sekwencjonowania ccfDNA hemolimfy, był stosunkowo duży (Rysunek S3, Informacje uzupełniające). Obejmuje on wirusy infekujące owady, takie jak Baculoviridae i Iridoviridae, a także wirusy infekujące ameby, glony i kręgowce. Znaleźliśmy również sekwencje pasujące do genomu Pithovirus sibericum. Pitowirusy (znane również jako „wirusy zombie”) zostały po raz pierwszy wyizolowane z 30 000-letniej wiecznej zmarzliny na Syberii [47]. Zatem nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że nie wszystkie współczesne gatunki tych wirusów wymarły [48] i że wirusy te mogą występować w odległych subarktycznych ekosystemach morskich.
Na koniec przeprowadziliśmy test, aby sprawdzić, czy możemy znaleźć fragmenty DNA pochodzące od innych zwierząt wielokomórkowych. Łącznie 482 obce kontigi zostały zidentyfikowane przez BLASTN i BLASTX z bibliotekami nt, nr i RefSeq (genomowymi i białkowymi). Nasze wyniki pokazują, że wśród obcych fragmentów ccfDNA zwierząt wielokomórkowych przeważa DNA kości kostnych (ryc. 5). Znaleziono również fragmenty DNA owadów i innych gatunków. Stosunkowo duża część fragmentów DNA nie została zidentyfikowana, prawdopodobnie z powodu niedoreprezentacji dużej liczby gatunków morskich w bazach danych genomicznych w porównaniu z gatunkami lądowymi [49].
W niniejszym artykule stosujemy koncepcję LB do małży, argumentując, że sekwencjonowanie ccfDNA hemolimfy może dostarczyć wglądu w skład morskich ekosystemów przybrzeżnych. W szczególności odkryliśmy, że 1) hemolimfa małży zawiera stosunkowo wysokie stężenia (na poziomie mikrogramów) stosunkowo dużych (~1-5 kb) krążących fragmentów DNA; 2) te fragmenty DNA są zarówno niezależne, jak i nieniezależne; 3) Wśród obcych źródeł tych fragmentów DNA znaleźliśmy DNA bakterii, archeonów i wirusów, a także DNA innych zwierząt wielokomórkowych; 4) Akumulacja tych obcych fragmentów ccfDNA w hemolimfie następuje szybko i przyczynia się do wewnętrznej aktywności filtracyjnej małży. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że koncepcja LB, która do tej pory była stosowana głównie w dziedzinie biomedycyny, koduje bogate, ale niezbadane źródło wiedzy, które może być wykorzystane do lepszego zrozumienia interakcji między gatunkami wskaźnikowymi a ich środowiskiem.
Oprócz naczelnych, izolację ccfDNA odnotowano u ssaków, w tym myszy, psów, kotów i koni [50, 51, 52]. Jednak według naszej wiedzy, nasze badanie jest pierwszym, które opisuje wykrycie i sekwencjonowanie ccfDNA u gatunków morskich z otwartym systemem krążenia. Ta cecha anatomiczna i zdolność filtrowania małży mogą, przynajmniej częściowo, wyjaśniać różne charakterystyki wielkości krążących fragmentów DNA w porównaniu z innymi gatunkami. U ludzi większość fragmentów DNA krążących we krwi to małe fragmenty o wielkości od 150 do 200 pb, z maksymalnym szczytem 167 pb [34, 53]. Niewielka, ale znacząca część fragmentów DNA ma wielkość od 300 do 500 pb, a około 5% jest dłuższych niż 900 pb [54]. Powodem tego rozkładu wielkości jest to, że głównym źródłem ccfDNA w osoczu jest śmierć komórek, albo z powodu śmierci komórek, albo z powodu martwicy krążących komórek hematopoetycznych u zdrowych osób, albo z powodu apoptozy komórek nowotworowych u pacjentów onkologicznych (znane jako krążące DNA nowotworowe). , ctDNA). Rozkład wielkości hemolimfowego ccfDNA, który znaleźliśmy u małży, wahał się od 1000 do 5000 pb, co sugeruje, że ccfDNA małży ma inne pochodzenie. Jest to logiczna hipoteza, ponieważ małże mają półotwarty układ naczyniowy i żyją w morskich środowiskach wodnych zawierających wysokie stężenia genomowego DNA drobnoustrojów. W rzeczywistości nasze eksperymenty laboratoryjne z wykorzystaniem egzogennego DNA wykazały, że małże gromadzą fragmenty DNA w wodzie morskiej, co najmniej po kilku godzinach ulegają one degradacji po wchłonięciu przez komórkę i/lub są uwalniane i/lub przechowywane w różnych organizacjach. Biorąc pod uwagę rzadkość występowania komórek (zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych), zastosowanie przedziałów wewnątrzskorupowych zmniejszy ilość ccfDNA pochodzącego zarówno ze źródeł własnych, jak i obcych. Biorąc pod uwagę znaczenie wrodzonej odporności małży i dużą liczbę krążących fagocytów, postawiliśmy hipotezę, że nawet obcy ccfDNA jest wzbogacany w krążących fagocytach, które akumulują obce DNA po połknięciu mikroorganizmów i/lub resztek komórkowych. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że hemolimfowe ccfDNA małży stanowi unikalne repozytorium informacji molekularnej i wzmacnia ich status gatunku strażniczego.
Nasze dane wskazują, że sekwencjonowanie i analiza fragmentów ccfDNA hemolimfy pochodzących od bakterii może dostarczyć kluczowych informacji o florze bakteryjnej gospodarza i bakteriach obecnych w otaczającym ekosystemie morskim. Techniki sekwencjonowania strzałowego ujawniły sekwencje bakterii komensalnych A. atra gill, które zostałyby pominięte, gdyby zastosowano konwencjonalne metody identyfikacji 16S rRNA, częściowo z powodu błędu biblioteki referencyjnej. W rzeczywistości nasze wykorzystanie danych LB zebranych z M. platensis w tej samej warstwie małży na Kerguelen wykazało, że skład symbiontów bakteryjnych związanych ze skrzelami był taki sam dla obu gatunków małży (ryc. S4, informacje uzupełniające). To podobieństwo dwóch genetycznie różnych małży może odzwierciedlać skład społeczności bakteryjnych w zimnych, siarkowych i wulkanicznych osadach Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Wyższe poziomy mikroorganizmów redukujących siarkę zostały dobrze opisane podczas zbioru małży z bioturbowanych obszarów przybrzeżnych [59], takich jak wybrzeże Port-au-France. Inną możliwością jest to, że flora komensalna małży może być zaburzona przez transmisję poziomą [60, 61]. Konieczne są dalsze badania w celu określenia korelacji między środowiskiem morskim, powierzchnią dna morskiego a składem bakterii symbiotycznych w małżach. Badania te są obecnie w toku.
Długość i stężenie hemolimfowego ccfDNA, łatwość jego oczyszczania oraz wysoka jakość, umożliwiająca szybkie sekwencjonowanie metodą shotgun, to tylko niektóre z wielu zalet wykorzystania ccfDNA małży do oceny bioróżnorodności w morskich ekosystemach przybrzeżnych. To podejście jest szczególnie skuteczne w charakteryzowaniu społeczności wirusowych (wiromów) w danym ekosystemie [62, 63]. W przeciwieństwie do bakterii, archeonów i eukariontów, genomy wirusowe nie zawierają filogenetycznie konserwatywnych genów, takich jak sekwencje 16S. Nasze wyniki wskazują, że płynne biopsje z gatunków wskaźnikowych, takich jak małże, mogą być wykorzystane do identyfikacji stosunkowo dużej liczby fragmentów wirusa ccfDNA, o których wiadomo, że infekują żywicieli zazwyczaj zamieszkujących przybrzeżne ekosystemy morskie. Obejmuje to wirusy, o których wiadomo, że infekują pierwotniaki, stawonogi, owady, rośliny oraz wirusy bakteryjne (np. bakteriofagi). Podobny rozkład zaobserwowaliśmy, badając wirom hemolimfy ccfDNA małży modrych (M. platensis) zebrany w tej samej warstwie małży na Kerguelen (Tabela S2, Informacje uzupełniające). Sekwencjonowanie ccfDNA metodą shotgun jest rzeczywiście nowym podejściem zyskującym na popularności w badaniach wiromu ludzi i innych gatunków [21, 37, 64]. To podejście jest szczególnie przydatne do badania wirusów dwuniciowego DNA, ponieważ żaden pojedynczy gen nie jest zachowany wśród wszystkich wirusów dwuniciowego DNA, reprezentujących najróżnorodniejszą i najszerszą klasę wirusów w Baltimore [65]. Chociaż większość tych wirusów pozostaje niesklasyfikowana i może obejmować wirusy z całkowicie nieznanej części świata wirusów [66], odkryliśmy, że wiromy i zakresy żywicieli małży A. atra i M. platensis mieszczą się pomiędzy tymi dwoma gatunkami. (patrz rysunek S3, informacje dodatkowe). To podobieństwo nie jest zaskakujące, ponieważ może odzwierciedlać brak selektywności w pobieraniu DNA obecnego w środowisku. Obecnie konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem oczyszczonego RNA w celu scharakteryzowania wiromu RNA.
W naszym badaniu zastosowaliśmy bardzo rygorystyczny proces zaadaptowany z pracy Kowarskiego i współpracowników [37], którzy zastosowali dwuetapową delecję pulowanych odczytów i kontigów przed i po złożeniu natywnego ccfDNA, co skutkowało wysokim odsetkiem niezmapowanych odczytów. Dlatego nie możemy wykluczyć, że niektóre z tych niezmapowanych odczytów mogą nadal mieć swoje własne pochodzenie, głównie dlatego, że nie posiadamy genomu referencyjnego dla tego gatunku małża. Zastosowaliśmy ten proces również dlatego, że byliśmy zaniepokojeni chimerami między odczytami własnymi i nie-swoimi oraz długościami odczytów generowanymi przez Illumina MiSeq PE75. Innym powodem większości niezbadanych odczytów jest to, że wiele morskich mikrobów, zwłaszcza w odległych obszarach, takich jak Kerguelen, nie zostało adnotowanych. Użyliśmy Illumina MiSeq PE75, zakładając długości fragmentów ccfDNA podobne do ludzkiego ccfDNA. W przyszłych badaniach, biorąc pod uwagę nasze wyniki wskazujące na dłuższy czas odczytu ccfDNA hemolimfy niż u ludzi i/lub ssaków, zalecamy wykorzystanie platformy sekwencjonowania bardziej odpowiedniej dla dłuższych fragmentów ccfDNA. Taka praktyka znacznie ułatwi identyfikację większej liczby wskazań do głębszej analizy. Uzyskanie obecnie niedostępnej pełnej sekwencji genomu jądrowego A. atra znacznie ułatwiłoby również odróżnienie ccfDNA od źródeł własnych i obcych. Biorąc pod uwagę, że nasze badania koncentrowały się na możliwości zastosowania koncepcji biopsji płynnej do małży, mamy nadzieję, że w miarę jej wykorzystania w przyszłych badaniach powstaną nowe narzędzia i metody, które zwiększą potencjał tej metody w badaniu różnorodności mikrobiologicznej małży w ekosystemie morskim.
Jako nieinwazyjny biomarker kliniczny, podwyższone poziomy ccfDNA w osoczu ludzkim są związane z różnymi chorobami, uszkodzeniami tkanek i warunkami stresowymi [67,68,69]. Ten wzrost jest związany z uwalnianiem fragmentów DNA własnego pochodzenia po uszkodzeniu tkanki. Zajęliśmy się tym problemem, wykorzystując ostry stres cieplny, w którym małże były krótkotrwale wystawione na działanie temperatury 30°C. Przeprowadziliśmy tę analizę na trzech różnych rodzajach małży w trzech niezależnych eksperymentach. Nie zaobserwowaliśmy jednak żadnych zmian w poziomach ccfDNA po ostrym stresie cieplnym (patrz Rysunek S5, dodatkowe informacje). To odkrycie może wyjaśniać, przynajmniej częściowo, fakt, że małże mają półotwarty układ krążenia i gromadzą duże ilości obcego DNA ze względu na ich wysoką aktywność filtracyjną. Z drugiej strony, małże, podobnie jak wiele bezkręgowców, mogą być bardziej odporne na uszkodzenia tkanek wywołane stresem, ograniczając w ten sposób uwalnianie ccfDNA w ich hemolimfie [70, 71].
Do tej pory analiza DNA bioróżnorodności w ekosystemach wodnych koncentrowała się głównie na metabarkodowaniu DNA środowiskowego (eDNA). Jednakże ta metoda jest zazwyczaj ograniczona w analizie bioróżnorodności, gdy używane są startery. Zastosowanie sekwencjonowania shotgun omija ograniczenia PCR i stronniczy wybór zestawów starterów. Zatem, w pewnym sensie, nasza metoda jest bliższa ostatnio stosowanej wysokoprzepustowej metodzie sekwencjonowania eDNA shotgun, która umożliwia bezpośrednie sekwencjonowanie pofragmentowanego DNA i analizę prawie wszystkich organizmów [72, 73]. Istnieje jednak szereg fundamentalnych kwestii, które odróżniają LB od standardowych metod eDNA. Oczywiście główną różnicą między eDNA a LB jest wykorzystanie naturalnych gospodarzy filtrujących. Donoszono o wykorzystaniu gatunków morskich, takich jak gąbki i małże (Dresseina spp.), jako naturalnego filtra do badania eDNA [74, 75]. Jednak w badaniu Dreisseny wykorzystano biopsje tkanek, z których wyekstrahowano DNA. Analiza ccfDNA z LB nie wymaga biopsji tkanki, specjalistycznego i czasami drogiego sprzętu oraz logistyki związanej z eDNA lub biopsją tkanki. W rzeczywistości niedawno donieśliśmy, że ccfDNA z LB może być przechowywane i analizowane z wykorzystaniem FTA bez konieczności utrzymywania łańcucha chłodniczego, co stanowi poważne wyzwanie dla badań w odległych obszarach [76]. Ekstrakcja ccfDNA z płynnych biopsji jest również prosta i zapewnia wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania shotgun i analizy PCR. Jest to ogromna zaleta, biorąc pod uwagę niektóre ograniczenia techniczne związane z analizą eDNA [77]. Prostota i niski koszt metody pobierania próbek są szczególnie przydatne w długoterminowych programach monitorowania. Oprócz ich wysokiej zdolności filtracyjnej, inną dobrze znaną cechą małży jest chemiczny skład mukopolisacharydów w ich śluzie, który sprzyja absorpcji wirusów [78, 79]. To sprawia, że ​​małże są idealnym naturalnym filtrem do charakteryzowania bioróżnorodności i wpływu zmian klimatycznych na dany ekosystem wodny. Chociaż obecność fragmentów DNA pochodzących od gospodarza może być postrzegana jako ograniczenie tej metody w porównaniu z eDNA, koszt związany z posiadaniem takiego natywnego ccfDNA w porównaniu z eDNA jest jednocześnie zrozumiały ze względu na ogromną ilość informacji dostępnych dla badań nad zdrowiem. offset gospodarza. Obejmuje to obecność sekwencji wirusowych zintegrowanych z genomem gospodarza gospodarza. Jest to szczególnie ważne w przypadku małży, biorąc pod uwagę obecność retrowirusów białaczkowych przenoszonych poziomo u małży [80, 81]. Inną zaletą LB w porównaniu z eDNA jest to, że wykorzystuje ona aktywność fagocytarną krążących komórek krwi w hemolimfie, która pochłania mikroorganizmy (i ich genomy). Fagocytoza jest główną funkcją komórek krwi u małży [82]. Wreszcie, metoda wykorzystuje wysoką zdolność filtracyjną małży (średnio 1,5 l/h wody morskiej) i dwudniową cyrkulację, które zwiększają mieszanie różnych warstw wody morskiej, umożliwiając wychwytywanie heterologicznego eDNA. [83, 84]. Zatem analiza ccfDNA małży stanowi interesującą ścieżkę, biorąc pod uwagę wpływ małży na odżywianie, gospodarkę i środowisko. Podobnie jak analiza LB pobranego od ludzi, ta metoda otwiera również możliwość pomiaru zmian genetycznych i epigenetycznych w DNA gospodarza w odpowiedzi na substancje egzogenne. Na przykład, technologie sekwencjonowania trzeciej generacji mogą być przewidziane do przeprowadzenia analizy metylacji całego genomu w natywnym ccfDNA z wykorzystaniem sekwencjonowania nanoporowego. Proces ten powinien być ułatwiony dzięki temu, że długość fragmentów ccfDNA małży jest idealnie zgodna z platformami sekwencjonowania z długimi odczytami, które umożliwiają analizę metylacji DNA w całym genomie z pojedynczego sekwencjonowania bez konieczności transformacji chemicznych. [85,86] Jest to interesująca możliwość, ponieważ wykazano, że wzorce metylacji DNA odzwierciedlają odpowiedź na stres środowiskowy i utrzymują się przez wiele pokoleń. Dlatego może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw reakcji po narażeniu na zmiany klimatu lub zanieczyszczenia [87]. Jednak zastosowanie LB nie jest pozbawione ograniczeń. Nie trzeba dodawać, że wymaga to obecności gatunków wskaźnikowych w ekosystemie. Jak wspomniano powyżej, wykorzystanie LB do oceny bioróżnorodności danego ekosystemu wymaga również rygorystycznego procesu bioinformatycznego, który uwzględnia obecność fragmentów DNA ze źródła. Innym poważnym problemem jest dostępność genomów referencyjnych dla gatunków morskich. Mamy nadzieję, że inicjatywy takie jak Marine Mammal Genomes Project i niedawno utworzony projekt Fish10k [88] ułatwią taką analizę w przyszłości. Zastosowanie koncepcji LB do morskich organizmów filtrujących jest również zgodne z najnowszymi postępami w technologii sekwencjonowania, dzięki czemu dobrze nadaje się do rozwoju wieloomowych biomarkerów w celu dostarczenia ważnych informacji na temat stanu zdrowia siedlisk morskich w odpowiedzi na stres środowiskowy.
Dane dotyczące sekwencjonowania genomu zostały złożone w archiwum odczytów sekwencji NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 w sekcji Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Wpływ zmian klimatycznych na życie morskie i ekosystemy. Cole Biology. 2009; 19: s. 602–s. 614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S i in. Rozważ łączny wpływ zmiany klimatu i innych lokalnych czynników stresogennych na środowisko morskie. General Scientific Environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P i in. ). Nauka pierwszego marca. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Obniżona tolerancja na ciepło w warunkach powtarzającego się stresu cieplnego wyjaśnia wysoką śmiertelność małży modrych w okresie letnim. Raport naukowy 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER i in. Ostatnie zmiany w częstości, przyczynach i zakresie zgonów zwierząt. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S i in. Wiele niespecyficznych dla gatunku patogenów mogło spowodować masową śmiertelność Pinna nobilis. Życie. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potencjalny wpływ zmian klimatu na arktyczne choroby odzwierzęce. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. i in. Małże jadalne (Mytilus edulis spp.) jako organizmy sygnałowe w monitorowaniu zanieczyszczeń wybrzeża: przegląd. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracja biopsji płynnej w leczeniu raka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C i in. Dojrzewanie biopsji płynnej: umożliwia krążenie DNA guza. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Kwasy nukleinowe w osoczu ludzkim. Protokoły ze spotkań spółek zależnych Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nowa rola pozakomórkowego DNA jako markera molekularnego w leczeniu raka. Kwantyfikacja analizy biomolarnej. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsja płynna trafia do kliniki – problemy z wdrożeniem i wyzwania na przyszłość. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i inni. DNA płodu jest obecne w osoczu i surowicy matki. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Badanie przebiegu ciąży i jej powikłań z wykorzystaniem krążącego pozakomórkowego RNA we krwi kobiet w ciąży. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J i in. Biopsja płynna: DNA pozakomórkowe dawcy wykorzystywane do wykrywania zmian allogenicznych w przeszczepionej nerce. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innowacje w diagnostyce prenatalnej: sekwencjonowanie genomu osocza matczynego. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D i in. Szybkie wykrywanie patogenów z wykorzystaniem sekwencjonowania metagenomicznego nowej generacji w zakażonych płynach ustrojowych. Nat Medicine. 2021;27:115-24.