Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Неконтролируемое кровотечение является одной из основных причин смерти. Быстрое достижение гемостаза обеспечивает выживание пострадавшего в качестве первой помощи при боевых действиях, дорожно-транспортных происшествиях и операциях по снижению риска смерти. Нанопористый волокнисто-армированный композитный каркас (НФРК), полученный из простой гемостатической пленкообразующей композиции (ГФПЦ) в качестве непрерывной фазы, может инициировать и усиливать гемостаз. Разработка НФРК основана на конструкции крыла стрекозы. Структура крыла стрекозы состоит из поперечных и продольных крыльев, а мембраны крыльев соединены друг с другом для поддержания целостности микроструктуры. ГФПЦ равномерно покрывает поверхность волокна пленкой нанометровой толщины и соединяет хаотично распределенную хлопковую пленку (Ct) (дисперсную фазу), образуя нанопористую структуру. Сочетание непрерывной и дисперсной фаз снижает стоимость продукта в десять раз по сравнению с коммерчески доступными продуктами. Модифицированные НФРК (тампоны или браслеты) могут использоваться в различных биомедицинских приложениях. Исследования in vivo показали, что разработанный Cp NFRCS запускает и усиливает процесс коагуляции в месте применения. Благодаря своей нанопористой структуре NFRCS способен модулировать микроокружение и действовать на клеточном уровне, что приводит к лучшему заживлению ран в модели эксцизионной раны.
Неконтролируемое кровотечение во время боевых действий, интраоперационных и экстренных ситуаций может представлять серьезную угрозу для жизни раненого1. Эти состояния также приводят к общему увеличению периферического сосудистого сопротивления, вызывая геморрагический шок. Соответствующие меры по контролю кровотечения во время и после операции считаются потенциально опасными для жизни2,3. Повреждение крупных сосудов приводит к массивной кровопотере, что приводит к смертности ≤ 50% в боевых условиях и 31% во время операции1. Массивная кровопотеря приводит к уменьшению объема тела, что снижает сердечный выброс. Увеличение общего периферического сосудистого сопротивления и прогрессирующее нарушение микроциркуляции приводят к гипоксии органов жизнеобеспечения. Геморрагический шок может возникнуть, если состояние продолжается без эффективного вмешательства1,4,5. Другие осложнения включают прогрессирование гипотермии и метаболического ацидоза, а также нарушение свертываемости крови, препятствующее процессу коагуляции. Тяжелый геморрагический шок связан с более высоким риском смерти6,7,8. При шоке III степени (прогрессирующем) переливание крови имеет решающее значение для выживания пациента во время операции и в послеоперационном периоде, что приводит к заболеваемости и смертности. Для преодоления всех вышеперечисленных угрожающих жизни ситуаций мы разработали нанопористый волокнистый композитный каркас (NFRCS), в котором используется минимальная концентрация полимера (0,5%) в сочетании с водорастворимыми гемостатическими полимерами.
Использование армирующих волокон позволяет разрабатывать экономически эффективные продукты. Случайно расположенные волокна напоминают структуру крыла стрекозы, уравновешенную горизонтальными и вертикальными полосами на крыльях. Поперечные и продольные жилки крыла сообщаются с крыловой мембраной (рис. 1). NFRCS состоит из армированного хлопкового волокна (Ct) в качестве каркасной системы с лучшей физической и механической прочностью (рис. 1). Благодаря доступности и качеству изготовления, хирурги предпочитают использовать хлопковые нити (Ct) во время операций и перевязок. Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая содержание более 90% кристаллической целлюлозы (способствующей усилению гемостатической активности), Ct был использован в качестве основы для NFRCS9,10. Таким образом, учитывая его многочисленные преимущества, включая содержание более 90% кристаллической целлюлозы (способствующей усилению гемостатической активности), Ct был использован в качестве основы для NFRCS9,10. Следовательно, вследствие его преобладания, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct используется в скелетной системе NFRCS9,10. Поэтому, учитывая его многочисленные преимущества, включая содержание более 90% кристаллической целлюлозы (способствующей усилению гемостатической активности), Ct был использован в качестве компонента скелетной системы NFRCS9,10.因此, 考虑到它的多重益处, 包括> 90% 的结晶纤维素(有助于增强止血活性),Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此, 考虑到它的多重益处, 包括> 90%Поэтому, учитывая его многочисленные преимущества, включая содержание более 90% кристаллической целлюлозы (способствует усилению гемостатической активности), Ct был использован в качестве каркаса для NFRCS9,10.Ct был поверхностно покрыт (наблюдалось образование нанотолстой пленки) и соединен с гемостатической пленкообразующей композицией (HFFC). HFFC действует как матригель, удерживая хаотично расположенные частицы Ct вместе. Разработанная конструкция передает напряжение внутри дисперсной фазы (армирующие волокна). Трудно получить нанопористые структуры с хорошей механической прочностью, используя минимальные концентрации полимера. Кроме того, сложно адаптировать различные формы для различных биомедицинских применений.
На рисунке представлена ​​схема конструкции NFRCS, основанная на структуре крыла стрекозы (A). На этом изображении показана сравнительная аналогия структуры крыла стрекозы (пересекающиеся и продольные жилки крыла взаимосвязаны) и микрофотография поперечного сечения Cp NFRCS (B). Схематическое представление NFRCS.
Для решения вышеуказанных проблем были разработаны NFRC с использованием HFFC в качестве непрерывной фазы. HFFC состоит из различных пленкообразующих гемостатических полимеров, включая хитозан (в качестве основного гемостатического полимера) с метилцеллюлозой (MC), гидроксипропилметилцеллюлозой (HPMC 50 сП) и поливиниловым спиртом (PVA) (125 кДа) в качестве вспомогательного полимера, способствующего образованию тромбов. Добавление поливинилпирролидина K30 (PVP K30) улучшило влагопоглощающую способность NFRCS. Полиэтиленгликоль 400 (PEG 400) был добавлен для улучшения сшивания полимеров в связанных полимерных смесях. Три различных гемостатических состава HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), а именно хитозан с MC (Cm), хитозан с HPMC (Ch) и хитозан с PVA (Cp), были применены к Ct. Различные исследования in vitro и in vivo подтвердили гемостатическую и ранозаживляющую активность NFRCS. Композитные материалы, предлагаемые NFRCS, могут быть использованы для создания различных форм каркасов, отвечающих конкретным потребностям.
Кроме того, NFRCS можно модифицировать в виде бинта или рулона, чтобы покрыть всю область повреждения нижних конечностей и других частей тела. В частности, при боевых травмах конечностей разработанная конструкция NFRCS может быть изменена на половину руки или всю ногу (дополнительный рисунок S11). NFRCS можно превратить в браслет с помощью тканевого клея, который можно использовать для остановки кровотечения при тяжелых травмах запястья, полученных в результате попыток самоубийства. Наша главная цель — разработать NFRCS с минимальным содержанием полимера, который можно будет доставить большому количеству людей (ниже черты бедности) и который можно будет поместить в аптечку первой помощи. Простой, эффективный и экономичный по конструкции, NFRCS приносит пользу местным сообществам и может оказать глобальное воздействие.
Хитин (молекулярная масса 80 кДа) и амарант были приобретены у компании Merck, Индия. Гидроксипропилметилцеллюлоза 50 Cp, полиэтиленгликоль 400 и метилцеллюлоза были приобретены у компании Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбаи. Поливиниловый спирт (молекулярная масса 125 кДа) (87-90% гидролизованный) был приобретен у компании National Chemicals, Гуджарат. Поливинилпирролидин K30 был приобретен у компании Molychem, Мумбаи, стерильные тампоны были приобретены у компании Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, в качестве носителя использовалась вода Milli Q (система очистки воды Direct-Q3, Merck, Индия).
NFRCS был разработан с использованием метода лиофилизации11,12. Все композиции HFFC (таблица 1) были приготовлены с использованием механической мешалки. Приготовьте 0,5%-ный раствор хитозана, используя 1%-ную уксусную кислоту в воде, путем непрерывного перемешивания со скоростью 800 об/мин на механической мешалке. Точное количество загруженного полимера, указанное в таблице 1, добавляли к раствору хитозана и перемешивали до получения прозрачного полимерного раствора. ПВП К30 и ПЭГ 400 добавляли к полученной смеси в количествах, указанных в таблице 1, и перемешивание продолжали до получения прозрачного вязкого полимерного раствора. Полученный раствор полимера подвергали ультразвуковой обработке в течение 60 минут для удаления пузырьков воздуха из полимерной смеси. Как показано на дополнительном рисунке S1(b), Ct равномерно распределяли в каждой лунке 6-луночного планшета (формы), дополненного 5 мл HFFC.
Шестилуночный планшет подвергали ультразвуковой обработке в течение 60 минут для достижения равномерного смачивания и распределения HFFC в сетке Ct. Затем шестилуночный планшет замораживали при -20°C в течение 8-12 часов. Замороженные планшеты лиофилизировали в течение 48 часов для получения различных составов NFRCS. Аналогичная процедура используется для получения различных форм и структур, таких как тампоны или цилиндрические тампоны, или любой другой формы для различных применений.
Точно отмеренный хитозан (80 кДа) (3%) растворяют в 1% уксусной кислоте с помощью магнитной мешалки. К полученному раствору хитозана добавляют 1% ПЭГ 400 и перемешивают в течение 30 минут. Полученный раствор выливают в квадратную или прямоугольную емкость и замораживают при -80°C в течение 12 часов. Замороженные образцы лиофилизируют в течение 48 часов для получения пористого Cs13.
Разработанный NFRCS был подвергнут экспериментам с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Япония) для подтверждения химической совместимости хитозана с другими полимерами14,15. Спектры FTIR (ширина спектрального диапазона от 400 до 4000 см⁻¹) всех исследованных образцов были получены путем выполнения 32 сканирований.
Скорость всасывания крови (BAR) для всех составов оценивали с использованием метода, описанного Ченом и др.¹⁶, с небольшими модификациями. Разработанные НФРК всех составов сушили в вакуумной печи при 105°C в течение ночи для удаления остаточного растворителя. 30 мг НФРК (начальный вес образца – W0) и 30 мг Ct (положительный контроль) помещали в отдельные чашки, содержащие премикс 3,8% цитрата натрия. Через заданные интервалы времени, а именно 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунд, НФРК извлекали, а их поверхности очищали от невсосавшейся крови, помещая образцы на Ct на 30 секунд. Конечный вес крови, всосавшейся НФРК¹⁶, принимали за (W1) в каждой временной точке. Процент BAR рассчитывали по следующей формуле:
Время свертывания крови (ВСК) определяли, как описано Вангом и др.¹⁷. Время, необходимое для свертывания цельной крови (крысиной крови, предварительно смешанной с 3,8% цитратом натрия) в присутствии NFRCS, рассчитывали как ВСК исследуемого образца. Различные компоненты NFRCS (30 мг) помещали в 10-мл флаконы с завинчивающимися крышками и инкубировали при 37°C. В флакон добавляли 0,5 мл крови и 0,3 мл 0,2 М CaCl₂ для активации свертывания крови. Наконец, флакон переворачивали каждые 15 секунд (до 180°) до образования плотного сгустка. ВСК образца оценивали по количеству переворачиваний флаконов^17,18. На основе ВСК были выбраны два оптимальных состава NFRCS: Cm, Ch и Cp для дальнейших исследований.
Определение BCT композиций Ch NFRCS и Cp NFRCS проводилось методом, описанным Ли и др. 19. Образцы Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (положительный контроль) размером 15 х 15 мм2 помещали в отдельные чашки Петри (37 °C). Кровь, содержащую 3,8% цитрата натрия, смешивали с 0,2 М CaCl2 в объемном соотношении 10:1 для запуска процесса свертывания крови. 20 мкл смеси крысиной крови с 0,2 М CaCl2 наносили на поверхность образца и помещали в пустую чашку Петри. В качестве контроля использовали кровь, налитую в пустые чашки Петри без Ct. Через фиксированные интервалы времени 0, 3 и 5 минут свертывание останавливали добавлением 10 мл деионизированной воды к образцу в чашке, не нарушая свертываемость. Некоагулированные эритроциты подвергаются гемолизу в присутствии деионизированной воды и высвобождают гемоглобин. Уровень гемоглобина в разные моменты времени (HA(t)) измеряли при 540 нм (λmax гемоглобина) с помощью УФ-спектрофотометра. В качестве эталонного стандарта принимали абсолютное поглощение гемоглобина (AH(0)) в момент времени 0 мин 20 мкл крови в 10 мл деионизированной воды. Относительное поглощение гемоглобина (RHA) свернувшейся крови рассчитывали как отношение HA(t)/HA(0) с использованием той же партии крови.
С помощью текстурного анализатора (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, США) были определены адгезионные свойства NFRK к поврежденной ткани. Цилиндрическая чашка с открытым дном прижималась к внутренней стороне свиной кожи (без слоя жира). Образцы (Ch NFRCS и Cp NFRCS) наносились с помощью канюли в цилиндрические формы для создания адгезии к коже свиньи. После 3-минутной инкубации при комнатной температуре (25°C) прочность адгезии NFRCS регистрировалась с постоянной скоростью 0,5 мм/сек.
Главная особенность хирургических герметиков заключается в повышении свертываемости крови при одновременном снижении кровопотери. Беспотерная коагуляция в NFRCS оценивалась с использованием ранее опубликованного метода с небольшими модификациями¹⁹. Изготовили микроцентрифужную пробирку (2 мл) (внутренний диаметр 10 мм) с отверстием 8 × 5 мм² на одной стороне (имитируя открытую рану). NFRCS использовали для закрытия отверстия, а для герметизации внешних краев использовали ленту. В микроцентрифужную пробирку, содержащую 3,8% премикс цитрата натрия, добавили 20 мкл 0,2 М CaCl₂. Через 10 минут микроцентрифужные пробирки извлекли из чашек Петри, и определили увеличение массы чашек Петри за счет оттока крови из NFRK (n = 3). Кровопотерю Ch NFRCS и Cp NFRCS сравнивали с Cs.
Влажная целостность NFRCS определялась на основе метода, описанного Мишрой и Чаудхари21, с небольшими модификациями. Поместите NFRCS в колбу Эрленмейера объемом 100 мл с 50 мл воды и перемешивайте в течение 60 секунд, не допуская образования крышки. Проводится визуальный осмотр и определение приоритетности образцов по физической целостности на основе их сбора.
Прочность связывания HFFC с Ct изучали с использованием ранее опубликованных методов с небольшими модификациями. Целостность поверхностного покрытия оценивали путем воздействия акустических волн (внешний стимул) на NFRK в присутствии воды MilliQ (Ct). Разработанные NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS помещали в стакан, заполненный водой, и подвергали ультразвуковой обработке в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минут соответственно. После высушивания процентное различие между начальным и конечным весом NFRCS использовали для расчета процентной потери материала (HFFC). Исследование in vitro BCT дополнительно подтвердило прочность связывания или потерю поверхностных материалов. Эффективность связывания HFFC с Ct обеспечивает коагуляцию крови и эластичное покрытие на поверхности Ct22.
Однородность разработанной NFRCS определяли методом BCT образцов (30 мг), взятых из случайно выбранных общих мест NFRCS. Для определения соответствия NFRCS следуйте ранее описанной процедуре BCT. Близость всех пяти образцов обеспечивает равномерное покрытие поверхности и осаждение HFFC на сетке Ct.
Номинальная площадь контакта крови (NBCA) определялась, как описано ранее, с некоторыми модификациями. Кровь коагулировали, зажимая 20 мкл крови между двумя поверхностями Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. Через 1 час две части стента разделяли и вручную измеряли площадь сгустка. Среднее значение трех повторений принималось за NBCA NFRCS19.
Для оценки эффективности NFRCS в поглощении воды из внешней среды или из места повреждения, ответственного за инициирование коагуляции, использовался метод динамической сорбции паров (DVS). Метод DVS позволяет гравиметрически оценить или зарегистрировать поглощение и потерю паров в образце с помощью сверхчувствительных весов с разрешением по массе ±0,1 мкг. Парциальное давление паров (относительная влажность) создается электронным регулятором массового расхода вокруг образца путем смешивания насыщенного и сухого газов-носителей. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, на основе процента поглощенной образцами влаги, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% масс./масс. – негигроскопичные, 0,2–2% масс./масс. – слабогигроскопичные, 2–15% – умеренно гигроскопичные и > 15% – очень гигроскопичные)23. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, на основе процента поглощенной образцами влаги, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% масс./масс. – негигроскопичные, 0,2–2% масс./масс. – слабогигроскопичные, 2–15% – умеренно гигроскопичные и > 15% – очень гигроскопичные)23.В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи, в зависимости от процента поглощения влаги образцами, образцы были разделены на 4 категории (0–0,012% масс./масс. – негигроскопичные, 0,2–2% масс./масс. – слабогигроскопичные, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % умеренно гигроскопичных и > 15% очень гигроскопичных)23.0-0,012% мас./мас.非吸湿性、0,2-2% по массе 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% Масс.- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 мас.% 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 % масс.В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи образцы делятся на 4 класса в зависимости от процента поглощенной образцом влаги (0-0,012% по весу – негигроскопичные, 0,2-2% по весу – слабогигроскопичные, 2-15% по весу).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % умеренно гигроскопичных, > 15% очень гигроскопичных) 23.Гигроскопическая эффективность NFCS X NFCS и TsN NFCS определялась на анализаторе DVS TA TGA Q5000 SA. В ходе анализа регистрировались время работы, относительная влажность (ОВ) и масса образца в режиме реального времени при температуре 25°C. Содержание влаги рассчитывалось с помощью точного анализа массы NFCS по следующей формуле:
MC — это влажность NFRCS. m1 — сухой вес НПВП. m2 — масса NFRCS в реальном времени при заданной относительной влажности.
Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после удаления его из образцов при 25 °C в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после удаления его из образцов при 25 °C в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности измерялась с помощью эксперимента по адсорбции жидкого азота после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25°C в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр).Температура 25°C и температура 10°C (< 7 × 10-3 Торр).Температура 25°C Общая площадь поверхности измерялась с помощью экспериментов по адсорбции жидкого азота после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Общая площадь поверхности была оценена с помощью экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после того, как образцы были очищены в течение 10 часов при 25°C (< 7 x 10⁻³ торр).Общая площадь поверхности, объем пор и размер пор NFRCS определялись с помощью прибора Quantachrome от NOVA 1000e (Австрия) с использованием программного обеспечения RS 232.
Подготовьте 5% раствор эритроцитов (физиологический раствор в качестве разбавителя) из цельной крови. Затем перенесите аликвоту HFFC (0,25 мл) в 96-луночный планшет и 0,1 мл 5% массы эритроцитов. Инкубируйте смесь при 37°C в течение 40 минут. Смесь эритроцитов и сыворотки рассматривалась как положительный контроль, а смесь физиологического раствора и эритроцитов — как отрицательный контроль. Гемагглютинацию определяли по шкале Стайцкого. Предложенные шкалы следующие: + + + + плотные гранулярные агрегаты; + + + гладкие донные подушечки с закругленными краями; + + гладкие донные подушечки с рваными краями; + узкие красные кольца по краям гладких подушечек; – (отрицательный) дискретная красная кнопка 12 в центре нижней лунки.
Гемосовместимость NFRCS изучали по методу Международной организации по стандартизации (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Гравиметрический метод, описанный Сингхом и др., был немного изменен для оценки образования тромбов в присутствии или на поверхности NFRCS. 500 мг Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS инкубировали в фосфатно-буферном растворе (PBS) в течение 24 часов при 37°C. Через 24 часа PBS удаляли, и NFRCS обрабатывали 2 мл крови, содержащей 3,8% цитрата натрия. На поверхность NFRCS добавляли 0,04 мл 0,1 М CaCl2 к инкубированным образцам. Через 45 минут добавляли 5 мл дистиллированной воды для остановки коагуляции. Коагулированную кровь на поверхности NFRK обрабатывали 36-38% раствором формальдегида. Сгустки, зафиксированные формальдегидом, высушивали и взвешивали. Процент тромбообразования оценивали, рассчитывая вес стакана без крови и образца (отрицательный контроль) и стакана с кровью (положительный контроль).
В качестве первоначального подтверждения образцы были исследованы под оптическим микроскопом, чтобы понять способность поверхностного покрытия HFFC, взаимосвязанных Ct-структур и Ct-сетки образовывать поры. Тонкие срезы Ch и Cp из NFRCS были вырезаны скальпелем. Полученный срез поместили на предметное стекло, накрыли покровным стеклом, а края закрепили клеем. Подготовленные препараты рассматривали под оптическим микроскопом, и были сделаны фотографии при различном увеличении.
Отложение полимера в сетях Ct визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, используя метод, описанный Райсом и др.29. Состав HFFC, использованный для приготовления, смешивали с флуоресцентным красителем (амарантом), а NFRCS (Ch и Cp) готовили согласно ранее описанному методу. Состав HFFC, использованный для приготовления, смешивали с флуоресцентным красителем (амарантом), а NFRCS (Ch и Cp) готовили согласно ранее описанному методу.Состав HFFC, использованный для приготовления, смешивали с флуоресцентным красителем (амарантом), и NFRCS (Ch и Cp) получали согласно ранее упомянутому методу.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & КП）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & КП）。Состав HFFC, использованный в рецептуре, был смешан с флуоресцентным красителем (амарант) и получил NFRCS (Ch и Cp), как упоминалось ранее.Из полученных образцов были нарезаны тонкие срезы NFRK, помещены на предметные стекла и покрыты покровными стеклами. Подготовленные препараты исследовали под флуоресцентным микроскопом с использованием зеленого фильтра (310-380 нм). Изображения получали при 4-кратном увеличении для понимания взаимосвязи Ct и избыточного осаждения полимера в сетке Ct.
Топография поверхности NFRCS Ch и Cp определялась с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) со сверхтонким кантилевером TESP в режиме сканирования: 42 Н/м, 320 кГц, ROC 2-5 нм, Bruker, Тайвань. Шероховатость поверхности определялась методом среднеквадратичного отклонения (RMS) с использованием программного обеспечения (Scanning Probe Image Processor). Для проверки однородности поверхности на 3D-изображениях были визуализированы различные участки NFRCS. Стандартное отклонение оценки для данной области определяется как шероховатость поверхности. Уравнение RMS использовалось для количественной оценки шероховатости поверхности NFRCS31.
Исследования с использованием сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией (FESEM) проводились на приборе SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токио, для изучения морфологии поверхности Ch NFRCS и Cp NFRCS, которые показали лучшие показатели BCT, чем Cm NFRCS. Исследование FESEM проводилось по методу, описанному Zhao et al. 32, с небольшими модификациями. 20–30 мг Ch NFRCS и Cp NFRCS предварительно смешивали с 20 мкл 3,8% цитрата натрия, предварительно смешанного с кровью крысы. К образцам, обработанным кровью, добавляли 20 мкл 0,2 М CaCl2 для инициирования коагуляции, после чего образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Кроме того, избыток эритроцитов удаляли с поверхности NFRCS путем промывания физиологическим раствором.
Последующие образцы обрабатывали 0,1% раствором глутарового альдегида, а затем сушили в сушильном шкафу с горячим воздухом при 37 °C для удаления влаги. Высушенные образцы покрывали и анализировали 32. Другие изображения, полученные в ходе анализа, включали образование сгустков на поверхности отдельных хлопковых волокон, отложение полимера между Ct, морфологию (форму) эритроцитов, целостность сгустка и морфологию эритроцитов в присутствии NFRCS. Необработанные участки NFRCS и участки NFRCS, обработанные Ch и Cp и инкубированные с кровью, сканировали на наличие элементарных ионов (натрий, калий, азот, кальций, магний, цинк, медь и селен)33. Сравнивали процентное содержание элементарных ионов между обработанными и необработанными образцами, чтобы понять накопление элементарных ионов во время образования сгустка и однородность сгустка.
Толщина поверхностного покрытия Cp HFFC на поверхности Ct была определена с помощью FESEM. Поперечные сечения Cp NFRCS были вырезаны из каркаса и покрыты методом магнетронного распыления. Полученные образцы с магнетронным покрытием были исследованы с помощью FESEM, и была измерена толщина поверхностного покрытия 34, 35, 36.
Рентгеновская микрокомпьютерная томография (микро-КТ) обеспечивает высокоразрешающее трехмерное неразрушающее изображение и позволяет изучать внутреннюю структурную организацию NFRK. Микро-КТ использует рентгеновский луч, проходящий через образец, для регистрации локального линейного коэффициента затухания рентгеновских лучей в образце, что помогает получить морфологическую информацию. Внутреннее расположение Ct в Cp NFRCS и Cp NFRCS, обработанном кровью, было исследовано с помощью микро-КТ для понимания эффективности поглощения и свертывания крови в присутствии NFRCS37,38,39. Трехмерные структуры образцов Cp NFRCS, обработанных и необработанных кровью, были реконструированы с использованием микро-КТ (V|tome|x S240, Phoenix, Германия). С помощью программного обеспечения VG STUDIO-MAX версии 2.2 было получено несколько рентгеновских изображений под разными углами (в идеале, охват 360°) для создания трехмерных изображений NFRCS. Собранные проекционные данные были реконструированы в трехмерные объемные изображения с использованием соответствующего простого программного обеспечения 3D ScanIP Academic.
Кроме того, для понимания распределения сгустка к NFRCS добавляли 20 мкл предварительно смешанной цитратной крови и 20 мкл 0,2 М CaCl2 для инициирования свертывания крови. Подготовленные образцы оставляли затвердевать. Поверхность NFRK обрабатывали 0,5% раствором глутарового альдегида и сушили в сушильном шкафу при температуре 30–40 °C в течение 30 мин. Образовавшийся на NFRCS сгусток крови сканировали, реконструировали и визуализировали 3D-изображение сгустка крови.
Антибактериальные анализы Cp NFRCS (лучший по сравнению с Ch NFRCS) проводились с использованием ранее описанного метода с небольшими модификациями. Антибактериальная активность Cp NFRCS и Cp HFFC определялась с использованием трех различных тест-микроорганизмов [S.aureus (грамположительные бактерии), E.coli (грамотрицательные бактерии) и белая кандида (C.albicans)], растущих на агаре в чашках Петри в инкубаторе. Равномерно инокулировали 50 мл разбавленной суспензии бактериальной культуры в концентрации 105-106 КОЕ/мл на агаровую среду. Выливали среду в чашку Петри и давали ей застыть. На поверхности агаровой пластины делали лунки для заполнения HFFC (3 лунки для HFFC и 1 для отрицательного контроля). Добавляли 200 мкл HFFC в 3 лунки и 200 мкл PBS с pH 7,4 в 4-ю лунку. На другой стороне чашки Петри поместите диск Cp NFRCS диаметром 12 мм на затвердевший агар и смочите его фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4). Таблетки ципрофлоксацина, ампициллина и флуконазола считаются эталонными стандартами для Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Измерьте зону ингибирования вручную и сделайте цифровое изображение зоны ингибирования.
После получения одобрения этического комитета, исследование проводилось в Медицинском колледже Кастурба в Манипале, штат Карнатака, на юге Индии. Протокол эксперимента по тромбоэластографии (ТЭГ) in vitro был рассмотрен и одобрен Институциональным этическим комитетом Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). В исследовании участвовали добровольцы (в возрасте от 18 до 55 лет), сдавшие кровь в банк крови больницы. Кроме того, от добровольцев было получено информированное согласие на сбор образцов крови. Нативная тромбоэластография (Н-ТЭГ) использовалась для изучения влияния препарата Cp HFFC на цельную кровь, предварительно смешанную с цитратом натрия. Н-ТЭГ широко известна своей ролью в реанимации на месте оказания помощи, что создает проблемы для врачей из-за потенциальной клинически значимой задержки результатов (рутинные коагуляционные тесты). Анализ Н-ТЭГ проводился с использованием цельной крови. У всех участников было получено информированное согласие и подробный медицинский анамнез. В исследование не включались участники с гемостатическими или тромботическими осложнениями, такими как беременность/послеродовой период или заболевания печени. Также из исследования были исключены лица, принимающие препараты, влияющие на каскад свертывания крови. Всем участникам были проведены основные лабораторные анализы (гемоглобин, протромбиновое время, активированный тромбопластин и количество тромбоцитов) в соответствии со стандартными процедурами. N-TEG определяет вязкоупругость сгустка крови, исходную структуру сгустка, взаимодействие частиц, упрочнение сгустка и лизис сгустка. Анализ N-TEG предоставляет графические и числовые данные о совокупном воздействии нескольких клеточных элементов и плазмы. Анализ N-TEG проводился на двух разных объемах Cp HFFC (10 мкл и 50 мкл). В результате к 10 мкл Cp HFFC добавляли 1 мл цельной крови с лимонной кислотой. Добавьте 1 мл (Cp HFFC + цитратная кровь), 340 мкл смешанной крови в чашку Петри с 20 мкл 0,2 М CaCl2. Затем чашки Петри загружали в TEG® 5000 (США) для измерения R, K, угла альфа, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% образцов крови в присутствии Cp HFFC41.
Протокол исследования in vivo был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по этике животных (IAEC) Медицинской школы Кастурба, Манипальского института высшего образования, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA). Все исследования in vivo NFRCS (2 × 2 см2) проводились на самках крыс Wistar (весом от 200 до 250 г). Все животные были акклиматизированы при температуре 24-26°C, имели свободный доступ к стандартному корму и воде ad libitum. Все животные были случайным образом разделены на разные группы, каждая группа состояла из трех животных. Все исследования проводились в соответствии с отчетом об исследованиях на животных: Отчет об экспериментах in vivo 43. Перед началом исследования животным вводили внутрибрюшинно (в/б) смесь 20-50 мг кетамина (на 1 кг массы тела) и 2-10 мг ксилазина (на 1 кг массы тела). После исследования объем кровопотери рассчитывали путем оценки разницы между начальным и конечным весом образцов; среднее значение, полученное по результатам трех тестов, принимали за объем кровопотери образца.
Модель ампутации хвоста у крысы была использована для понимания потенциала NFRCS в модулировании кровотечения при травмах, боевых действиях или дорожно-транспортных происшествиях (модель травмы). 50% хвоста отрезали скальпелем и помещали на воздух на 15 секунд для обеспечения нормального кровотечения. Кроме того, на хвост крысы накладывали образцы, оказывая давление (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS). Кровотечение и PCT регистрировали для образцов (n = 3)17,45.
Эффективность контроля давления с помощью NFRCS в боевых условиях исследовалась на модели поверхностной бедренной артерии. Бедренная артерия обнажалась, прокалывалась троакаром 24G и вызывалось кровотечение в течение 15 секунд. После обнаружения неконтролируемого кровотечения в место прокола помещался тестовый образец с приложением давления. Сразу после нанесения тестового образца регистрировалось время свертывания крови, а эффективность гемостаза наблюдалась в течение следующих 5 минут. Та же процедура повторялась с Cs и Ct46.
Даулинг и др. 47 предложили модель повреждения печени для оценки гемостатического потенциала гемостатических материалов в контексте интраоперационного кровотечения. BCT регистрировали для образцов Ct (отрицательный контроль), каркаса Cs (положительный контроль), образцов Ch NFRCS и образцов Cp NFRCS. Надпеченочную полую вену крысы обнажали, выполняя срединную лапаротомию. После этого дистальную часть левой доли вырезали ножницами. Делали надрез на печени скальпелем и давали ей кровоточить в течение нескольких секунд. Точно взвешенные тест-образцы Ch NFRCS и Cp NFRCS помещали на поврежденную поверхность без какого-либо положительного давления, и регистрировали BCT. Затем в контрольной группе (Ct) прикладывали давление, после чего применяли Cs 30 s47, не нарушая повреждения.
Для оценки ранозаживляющих свойств разработанных полимерных NFRCS были проведены исследования заживления ран in vivo с использованием модели эксцизионной раны. Модели эксцизионных ран были выбраны и исследованы в соответствии с ранее опубликованными методами с небольшими изменениями19,32,48. Все животные были анестезированы, как описано ранее. С помощью биопсийного пробойника (12 мм) был сделан круговой глубокий разрез на коже спины. Подготовленные участки ран были обработаны Cs (положительный контроль), Ct (учитывая, что ватные диски препятствуют заживлению), Ch NFRCS и Cp NFRCS (экспериментальная группа), а также отрицательным контролем без какого-либо лечения. Каждый день исследования площадь раны измерялась у всех крыс. С помощью цифровой камеры был сделан снимок области раны, после чего накладывалась новая повязка. Процент закрытия раны измерялся по следующей формуле:
Исходя из процента заживления ран на 12-й день исследования, кожу крыс из лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали и исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также окрашивания по Массону. Исходя из процента заживления ран на 12-й день исследования, кожу крыс из лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали и исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также окрашивания по Массону.Исходя из процента заживления ран на 12-й день исследования, кожу крыс из лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) иссекали и исследовали с помощью окрашивания гематоксилином-эозином и трихромом Массона.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS), компания H&E, компания Masson, компания Masson, компания NFRCS.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）У крыс из лучшей группы ((Cp NFRCS) и контрольной группы) были взяты образцы для окрашивания гематоксилином-эозином и трихромом Массона в зависимости от процента закрытия раны на 12-й день исследования.Процедура окрашивания проводилась в соответствии с ранее описанными методами49,50. Вкратце, после фиксации в 10% формалине образцы обезвоживали с помощью серии спиртов различной концентрации. С помощью микротома получали тонкие срезы (толщиной 5 мкм) иссеченной ткани. Тонкие серийные срезы контрольных образцов и образцов Cp NFRCS обрабатывали гематоксилином и эозином для изучения гистопатологических изменений. Для выявления образования коллагеновых фибрилл использовали трихромное окрашивание по Массону. Полученные результаты изучались патологоанатомами вслепую.
Стабильность образцов Cp NFRCS изучали при комнатной температуре (25°C ± 2°C/60% относительной влажности ± 5%) в течение 12 месяцев51. Образцы Cp NFRCS (изменение цвета поверхности и рост микроорганизмов) визуально осматривали и тестировали на износостойкость и прочность на сгиб в соответствии с методами, описанными в разделе «Материалы и методы».
Масштабируемость и воспроизводимость Cp NFRCS были изучены путем приготовления Cp NFRCS размером 15×15 см2. Кроме того, из различных фракций Cp NFRCS были отобраны образцы массой 30 мг (n = 5), и была оценена биохимическая плотность исследуемых образцов, как описано ранее в разделе «Методы».
Мы предприняли попытки разработать различные формы и структуры с использованием композиций Cp NFRCS для различных биомедицинских применений. К таким формам или конфигурациям относятся конические тампоны для носовых кровотечений, стоматологических процедур и цилиндрические тампоны для вагинальных кровотечений.
Все наборы данных представлены как среднее значение ± стандартное отклонение и были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) в программе Prism 5.03 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США) с последующим применением поправки Бонферрони для множественных сравнений (*p<0,05).
Все процедуры, проведенные в исследованиях на людях, соответствовали стандартам Института и Национального исследовательского совета, а также Декларации Хельсинки 1964 года и ее последующим поправкам, или аналогичным этическим стандартам. Все участники были проинформированы об особенностях исследования и его добровольном характере. Данные участников остаются конфиденциальными после сбора. Экспериментальный протокол TEG in vitro был рассмотрен и одобрен Институциональным этическим комитетом Медицинского колледжа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Добровольцы подписали информированное согласие на сбор образцов крови.
Все процедуры, выполненные в ходе исследований на животных, проводились в соответствии с требованиями медицинского факультета Кастуба, Манипальского института высшего образования, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по контролю и надзору за экспериментами на животных (CPCSEA). Все авторы следуют рекомендациям ARRIVE.
ИК-спектры всех NFRCS были проанализированы и сравнены со спектром хитозана, показанным на рисунке 2А. Характерные спектральные пики хитозана (зарегистрированные) при 3437 см⁻¹ (валентные колебания OH и NH, перекрытие), 2945 и 2897 см⁻¹ (валентные колебания CH), 1660 см⁻¹ (деформация NH₂), 1589 см⁻¹ (деформационные колебания N–H), 1157 см⁻¹ (валентные колебания мостика O⁻), 1067 см⁻¹ (валентные колебания C–O, вторичная гидроксильная группа), 993 см⁻¹ (валентные колебания CO, Bo-OH) 52,53,54. В дополнительной таблице S1 показаны значения спектров поглощения ИК-спектров NFRCS для хитозана (репортер), чистого хитозана, Cm, Ch и Cp. ИК-спектры всех NFRCS (Cm, Ch и Cp) показали те же характерные полосы поглощения, что и чистый хитозан, без каких-либо существенных изменений (рис. 2А). Результаты ИК-спектроскопии подтвердили отсутствие химических или физических взаимодействий между полимерами, использованными для разработки NFRCS, что указывает на инертность используемых полимеров.
Характеристика Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs in vitro. (A) Представляет собой объединенные ИК-спектры композиций хитозана и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS при сжатии. (B) а) Скорость поглощения NFRCS Cm, Ch, Cp и Cg цельной кровью (n = 3); образцы Ct показали более высокую скорость поглощения, поскольку ватный тампон обладает более высокой эффективностью поглощения; б) Кровь после поглощения кровью. Иллюстрация поглощенного образца. Графическое представление времени поглощения крови тестовым образцом C (Cp NFRCS показал наилучшее время поглощения (15 с, n = 3)). Данные в разделах C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение, ***p < 0,0001. Данные в разделах C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение, ***p < 0,0001. Данные C, D, E и G представляют собой среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в разделах C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение, ***p<0,0001. C, D, E и G 中的数据显示为平均值± SD, 代表SD,***p < 0,0001. C, D, E и G 中的数据显示为平均值± SD, 代表SD,***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G показывают среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, ***p <0,0001. Данные в разделах C, D, E и G представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение, ***p<0,0001.