Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Pendarahan yang tidak terkawal merupakan salah satu punca utama kematian. Mencapai hemostasis yang cepat memastikan kemandirian subjek sebagai pertolongan cemas semasa pertempuran, kemalangan jalan raya, dan operasi pengurangan kematian. Perancah komposit bertetulang gentian nanoporous (NFRCS) yang diperoleh daripada komposisi pembentuk filem hemostatik ringkas (HFFC) sebagai fasa berterusan boleh mencetuskan dan meningkatkan hemostasis. Pembangunan NFRCS adalah berdasarkan reka bentuk sayap pepatung. Struktur sayap pepatung terdiri daripada sayap melintang dan membujur, dan membran sayap disambungkan antara satu sama lain untuk mengekalkan integriti mikrostruktur. HFFC menyalut permukaan gentian secara seragam dengan filem setebal nanometer dan menghubungkan ketebalan kapas yang diagihkan secara rawak (Ct) (fasa tersebar) untuk membentuk struktur nanoporous. Gabungan fasa berterusan dan tersebar mengurangkan kos produk sebanyak sepuluh kali ganda berbanding produk yang tersedia secara komersial. NFRCS yang diubah suai (tampon atau gelang tangan) boleh digunakan dalam pelbagai aplikasi bioperubatan. Kajian in vivo telah merumuskan bahawa Cp NFRCS yang dibangunkan mencetuskan dan meningkatkan proses pembekuan di tapak aplikasi. NFRCS boleh memodulasi persekitaran mikro dan bertindak pada peringkat selular kerana struktur nanoporousnya yang menghasilkan penyembuhan luka yang lebih baik dalam model luka eksisi.
Pendarahan yang tidak terkawal semasa pertempuran, situasi intraoperatif dan kecemasan boleh menimbulkan ancaman serius kepada nyawa mangsa yang cedera1. Keadaan ini seterusnya membawa kepada peningkatan keseluruhan dalam rintangan vaskular periferi, yang membawa kepada renjatan hemoragik. Langkah-langkah yang sesuai untuk mengawal pendarahan semasa dan selepas pembedahan dianggap berpotensi mengancam nyawa2,3. Kerosakan pada saluran darah besar menyebabkan kehilangan darah yang banyak, mengakibatkan kadar kematian ≤ 50% dalam pertempuran dan 31% semasa pembedahan1. Kehilangan darah yang banyak menyebabkan penurunan isipadu badan, yang mengurangkan output jantung. Peningkatan dalam rintangan vaskular periferi keseluruhan dan gangguan peredaran mikro yang progresif menyebabkan hipoksia dalam organ sokongan hayat. Renjatan hemoragik mungkin berlaku jika keadaan berterusan tanpa intervensi yang berkesan1,4,5. Komplikasi lain termasuk perkembangan hipotermia dan asidosis metabolik, serta gangguan pembekuan yang menghalang proses pembekuan. Renjatan hemoragik yang teruk dikaitkan dengan risiko kematian yang lebih tinggi6,7,8. Dalam renjatan gred III (progresif), pemindahan darah adalah penting untuk kelangsungan hidup pesakit semasa morbiditi dan mortaliti intraoperatif dan pascaoperasi. Untuk mengatasi semua situasi yang mengancam nyawa di atas, kami telah membangunkan perancah komposit bertetulang gentian nanoporous (NFRCS) yang menggunakan kepekatan polimer minimum (0.5%) menggunakan gabungan polimer hemostatik larut air.
Dengan penggunaan tetulang gentian, produk yang kos efektif dapat dibangunkan. Gentian yang disusun secara rawak menyerupai struktur sayap pepatung, diimbangi oleh jalur mendatar dan menegak pada sayap. Urat melintang dan membujur sayap berkomunikasi dengan membran sayap (Rajah 1). NFRCS terdiri daripada Ct yang diperkukuh sebagai sistem perancah dengan kekuatan fizikal dan mekanikal yang lebih baik (Rajah 1). Disebabkan oleh kemampuan dan mutu kerja, pakar bedah lebih suka menggunakan tolok benang kapas (Ct) semasa pembedahan dan pembalut. Oleh itu, memandangkan pelbagai manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10. Oleh itu, memandangkan pelbagai manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвушпозы) гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Oleh itu, memandangkan banyak manfaatnya, termasuk >90% selulosa kristal (terlibat dalam peningkatan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai sistem rangka NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），NC00的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Oleh itu, memandangkan banyak manfaatnya, termasuk lebih 90% selulosa kristal (membantu meningkatkan aktiviti hemostatik), Ct telah digunakan sebagai perancah untuk NFRCS9,10.Ct disalut secara superfisial (pembentukan filem nano-tebal diperhatikan) dan saling berkaitan dengan komposisi pembentuk filem hemostatik (HFFC). HFFC bertindak seperti matrigel, menyatukan Ct yang diletakkan secara rawak. Reka bentuk yang dibangunkan menghantar tekanan dalam fasa tersebar (gentian pengukuh). Sukar untuk mendapatkan struktur nanoporous dengan kekuatan mekanikal yang baik menggunakan kepekatan polimer yang minimum. Di samping itu, tidak mudah untuk menyesuaikan acuan yang berbeza untuk aplikasi bioperubatan yang berbeza.
Rajah menunjukkan gambar rajah reka bentuk NFRCS berdasarkan struktur sayap pepatung (A). Imej ini menunjukkan analogi perbandingan struktur sayap pepatung (urat sayap yang bersilang dan membujur saling berkaitan) dan fotomikrograf keratan rentas Cp NFRCS (B). Perwakilan skematik NFRCS.
NFRC telah dibangunkan menggunakan HFFC sebagai fasa berterusan untuk menangani batasan di atas. HFFC terdiri daripada pelbagai polimer hemostatik pembentuk filem termasuk kitosan (sebagai polimer hemostatik utama) dengan metilselulosa (MC), hidroksipropil metilselulosa (HPMC 50 cp) dan polivinil alkohol (PVA)) (125 kDa) sebagai polimer sokongan yang menggalakkan pembentukan trombus. Penambahan polivinilpirolidina K30 (PVP K30) meningkatkan kapasiti penyerapan lembapan NFRCS. Polietilena glikol 400 (PEG 400) telah ditambah untuk meningkatkan pengikatan silang polimer dalam campuran polimer terikat. Tiga komposisi hemostatik HFFC yang berbeza (Cm HFFC, Ch HFFC dan Cp HFFC), iaitu kitosan dengan MC (Cm), kitosan dengan HPMC (Ch), dan kitosan dengan PVA (Cp), telah digunakan pada Ct. Pelbagai kajian pencirian in vitro dan in vivo telah mengesahkan aktiviti hemostatik dan penyembuhan luka NFRCS. Bahan komposit yang ditawarkan oleh NFRCS boleh digunakan untuk menyesuaikan pelbagai bentuk perancah bagi memenuhi keperluan khusus.
Di samping itu, NFRCS boleh diubah suai sebagai pembalut atau gulungan untuk menutup seluruh kawasan kecederaan pada bahagian bawah kaki dan bahagian badan yang lain. Khususnya untuk kecederaan anggota badan tempur, reka bentuk NFRCS yang direka bentuk boleh diubah kepada separuh lengan atau kaki penuh (Rajah Tambahan S11). NFRCS boleh dijadikan gelang tangan dengan gam tisu, yang boleh digunakan untuk menghentikan pendarahan daripada kecederaan pergelangan tangan bunuh diri yang teruk. Matlamat utama kami adalah untuk membangunkan NFRCS dengan polimer sesedikit mungkin yang boleh dihantar kepada populasi yang besar (di bawah garis kemiskinan) dan boleh diletakkan di dalam kit pertolongan cemas. Reka bentuk yang ringkas, cekap dan menjimatkan, NFRCS memberi manfaat kepada komuniti tempatan dan boleh memberi impak global.
Kitosan (berat molekul 80 kDa) dan bayam telah dibeli dari Merck, India. Hidroksipropil metilselulosa 50 Cp, polietilena glikol 400 dan metilselulosa telah dibeli dari Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Alkohol polivinil (berat molekul 125 kDa) (87-90% terhidrolisis) telah dibeli dari National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidina K30 telah dibeli dari Molychem, Mumbai, dan swab steril telah dibeli dari Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, dengan air Milli Q (sistem penulenan air Direct-Q3, Merck, India) sebagai pembawa.
NFRCS telah dibangunkan menggunakan kaedah liofilisasi11,12. Semua komposisi HFFC (Jadual 1) telah disediakan menggunakan pengacau mekanikal. Sediakan larutan kitosan 0.5% menggunakan asid asetik 1% dalam air dengan mengacau berterusan pada 800 rpm pada pengacau mekanikal. Berat sebenar polimer yang dimuatkan yang ditunjukkan dalam Jadual 1 telah ditambah kepada larutan kitosan dan dikacau sehingga larutan polimer jernih diperolehi. PVP K30 dan PEG 400 telah ditambah kepada campuran yang terhasil dalam jumlah yang ditunjukkan dalam Jadual 1, dan pengacauan diteruskan sehingga larutan polimer likat jernih diperolehi. Mandi larutan polimer yang terhasil telah disonikasi selama 60 minit untuk membuang buih udara yang terperangkap daripada campuran polimer. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S1(b), Ct diagihkan secara sama rata dalam setiap telaga plat 6-telaga (acuan) yang ditambah dengan 5 ml HFFC.
Plat enam telaga telah disonikasi selama 60 minit untuk mencapai pembasahan dan pengagihan HFFC yang seragam dalam rangkaian Ct. Kemudian, bekukan plat enam telaga pada -20°C selama 8-12 jam. Plat bekukan telah diliofilisasi selama 48 jam untuk mendapatkan pelbagai formulasi NFRCS. Prosedur yang sama digunakan untuk menghasilkan bentuk dan struktur yang berbeza, seperti tampon atau tampon silinder, atau sebarang bentuk lain untuk aplikasi yang berbeza.
Kitosan (80 kDa) (3%) yang ditimbang dengan tepat dilarutkan dalam 1% asid asetik menggunakan pengaduk magnet. 1% PEG 400 telah ditambah kepada larutan kitosan yang terhasil dan dikacau selama 30 minit. Tuangkan larutan yang terhasil ke dalam bekas segi empat sama atau segi empat tepat dan bekukan pada suhu -80°C selama 12 jam. Sampel beku telah diliofilisasi selama 48 jam untuk mendapatkan Cs13 berliang.
NFRCS yang dibangunkan telah menjalani eksperimen menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Jepun) untuk mengesahkan keserasian kimia kitosan dengan polimer lain14,15. Spektrum FTIR (lebar julat spektrum dari 400 hingga 4000 cm-1) bagi semua sampel yang diuji telah diperoleh dengan melakukan 32 imbasan.
Kadar penyerapan darah (BAR) untuk semua formulasi telah dinilai menggunakan kaedah yang diterangkan oleh Chen et al. 16 dengan sedikit pengubahsuaian. NFRK yang dibangunkan bagi semua komposisi telah dikeringkan dalam ketuhar vakum pada suhu 105°C semalaman untuk membuang sisa pelarut. 30 mg NFRCS (berat sampel awal – W0) dan 30 mg Ct (kawalan positif) telah diletakkan dalam pinggan berasingan yang mengandungi pracampuran 3.8% natrium sitrat. Pada selang masa yang telah ditetapkan, iaitu 5, 10, 20, 30, 40 dan 60 saat, NFRCS telah dibuang dan permukaannya dibersihkan daripada darah yang tidak diserap dengan meletakkan sampel pada Ct selama 30 saat. Berat akhir darah yang diserap oleh NFRCS 16 telah dipertimbangkan (W1) pada setiap titik masa. Kira peratusan BAR menggunakan formula berikut:
Masa pembekuan darah (BCT) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Wang et al. 17. Masa yang diperlukan untuk darah penuh (darah tikus yang dicampurkan dengan 3.8% natrium sitrat) untuk menggumpal dengan kehadiran NFRCS dikira sebagai BCT sampel ujian. Pelbagai komponen NFRCS (30 mg) diletakkan di dalam vial penutup skru 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C. Darah (0.5 ml) ditambah ke dalam vial dan 0.3 ml 0.2 M CaCl2 ditambah untuk mengaktifkan pembekuan darah. Akhir sekali, terbalikkan vial setiap 15 saat (sehingga 180°) sehingga bekuan yang kukuh terbentuk. BCT sampel dianggarkan dengan bilangan pusingan vial17,18. Berdasarkan BCT, dua komposisi optimum daripada NFRCS Cm, Ch dan Cp telah dipilih untuk kajian pencirian selanjutnya.
BCT bagi komposisi Ch NFRCS dan Cp NFRCS ditentukan dengan melaksanakan kaedah yang diterangkan oleh Li et al. 19. Letakkan 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs (kawalan positif) ke dalam piring Petri berasingan (37 °C). Darah yang mengandungi 3.8% natrium sitrat dicampurkan dengan 0.2 M CaCl2 dalam nisbah isipadu 10:1 untuk memulakan proses pembekuan darah. 20 µl campuran darah tikus 0.2 M CaCl2 disapu pada permukaan sampel dan diletakkan di dalam piring Petri kosong. Kawalannya ialah darah yang dituang ke dalam piring Petri kosong tanpa Ct. Pada selang masa tetap 0, 3, dan 5 minit, hentikan pembekuan dengan menambah 10 ml air ternyahion (DI) ke dalam sampel yang mengandungi piring tanpa mengganggu bekuan. Eritrosit (eritrosit) yang tidak terkoagulasi menjalani hemolisis dengan kehadiran air ternyahion dan melepaskan hemoglobin. Hemoglobin pada titik masa yang berbeza (HA(t)) diukur pada 540 nm (hemoglobin λmaks) menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Penyerapan mutlak hemoglobin (AH(0)) dalam 0 minit 20 µl darah dalam 10 ml air ternyahion diambil sebagai piawai rujukan. Serapan hemoglobin relatif (RHA) darah yang terkumpul dikira daripada nisbah HA(t)/HA(0) menggunakan kelompok darah yang sama.
Menggunakan penganalisis tekstur (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sifat pelekat NFRK pada tisu yang rosak telah ditentukan. Tekan piring silinder berdasar terbuka ke bahagian dalam kulit babi (tanpa lapisan lemak). Sampel (Ch NFRCS dan Cp NFRCS) telah disapu melalui kanula ke dalam acuan silinder untuk menghasilkan lekatan pada kulit babi. Selepas pengeraman selama 3 minit pada suhu bilik (RT) (25° C), kekuatan pelekat NFRCS direkodkan pada kadar malar 0.5 mm/saat.
Ciri utama pengedap pembedahan adalah untuk meningkatkan pembekuan darah sambil mengurangkan kehilangan darah. Penggumpalan tanpa kehilangan dalam NFRCS telah dinilai menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan sedikit pengubahsuaian 19. Buat tiub mikroempar (2 ml) (diameter dalam 10 mm) dengan lubang 8 × 5 mm2 pada satu sisi tiub empar (mewakili luka terbuka). NFRCS digunakan untuk menutup bukaan dan pita digunakan untuk menutup tepi luar. Tambahkan 20 µl 0.2 M CaCl2 ke dalam tiub mikroempar yang mengandungi pracampuran natrium sitrat 3.8%. Selepas 10 minit, tiub mikroempar dikeluarkan dari piring dan peningkatan jisim piring ditentukan disebabkan oleh aliran keluar darah dari NFRK (n = 3). Kehilangan darah Ch NFRCS dan Cp NFRCS dibandingkan dengan Cs.
Integriti basah NFRCS ditentukan berdasarkan kaedah yang diterangkan oleh Mishra dan Chaudhary21 dengan sedikit pengubahsuaian. Letakkan NFRCS dalam kelalang Erlenmeyer 100 ml dengan 50 ml air dan pusarkan selama 60 saat tanpa membentuk bahagian atas. Pemeriksaan visual dan penentuan keutamaan sampel untuk integriti fizikal berdasarkan pengumpulan.
Kekuatan pengikatan HFFC kepada Ct telah dikaji menggunakan kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil. Integriti salutan permukaan dinilai dengan mendedahkan NFRK kepada gelombang akustik (rangsangan luaran) dengan kehadiran air milliQ (Ct). NFRCS Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang dibangunkan telah diletakkan di dalam bikar yang diisi dengan air dan disonikasi selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 30 minit, masing-masing. Selepas pengeringan, perbezaan peratusan antara berat awal dan akhir NFRCS telah digunakan untuk mengira peratus kehilangan bahan (HFFC). BCT in vitro seterusnya menyokong kekuatan pengikatan atau kehilangan bahan permukaan. Kecekapan pengikatan HFFC kepada Ct menyediakan pembekuan darah dan salutan elastik pada permukaan Ct22.
Kehomogenan NFRCS yang dibangunkan ditentukan oleh BCT sampel (30 mg) yang diambil dari lokasi umum NFRCS yang dipilih secara rawak. Ikuti prosedur BCT yang dinyatakan sebelum ini untuk menentukan pematuhan NFRCS. Jarak antara kelima-lima sampel memastikan liputan permukaan yang seragam dan pemendapan HFFC dalam jaringan Ct.
Kawasan sentuhan darah nominal (NBCA) telah ditentukan seperti yang dilaporkan sebelum ini dengan beberapa pengubahsuaian. Bekukan darah dengan mengapit 20 µl darah di antara dua permukaan Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs. Selepas 1 jam, kedua-dua bahagian stent dipisahkan dan diukur secara manual luas bekuan darah. Nilai purata tiga ulangan dianggap sebagai NBCA NFRCS19.
Analisis Penyerapan Wap Dinamik (DVS) telah digunakan untuk menilai keberkesanan NFRCS dalam menyerap air daripada persekitaran luaran atau daripada tapak kecederaan yang bertanggungjawab untuk memulakan pembekuan. DVS menilai atau merekodkan pengambilan dan kehilangan wap dalam sampel secara gravimetri menggunakan imbangan ultra-sensitif dengan resolusi jisim ±0.1 µg. Tekanan wap separa (kelembapan relatif) dijana oleh pengawal aliran jisim elektronik di sekeliling sampel dengan mencampurkan gas pembawa tepu dan kering. Menurut garis panduan Farmakope Eropah, berdasarkan peratusan penyerapan lembapan oleh sampel, sampel dikategorikan kepada 4 kategori (0–0.012% b/b− tidak higroskopik, 0.2–2% b/b sedikit higroskopik, 2–15% sederhana higroskopik, dan > 15% sangat higroskopik)23. Menurut garis panduan Farmakope Eropah, berdasarkan peratusan penyerapan lembapan oleh sampel, sampel dikategorikan kepada 4 kategori (0–0.012% b/b− tidak higroskopik, 0.2–2% b/b sedikit higroskopik, 2–15% sederhana higroskopik, dan > 15% sangat higroskopik)23.Selaras dengan cadangan Farmakope Eropah, bergantung pada peratusan penyerapan lembapan oleh sampel, sampel dibahagikan kepada 4 kategori (0–0.012% b/b – tidak higroskopik, 0.2–2% b/b sedikit higroskopik, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % sederhana higroskopik dan > 15% sangat higroskopik)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w.吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w.012% w/w- 湁%倐【、水、 w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分为 分为 分为 w.（ 0.（ 0.（ 类 1吸湿 性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Selaras dengan cadangan Farmakope Eropah, sampel dibahagikan kepada 4 kelas bergantung pada peratusan kelembapan yang diserap oleh sampel (0-0.012% berat – tidak higroskopik, 0.2-2% berat sedikit higroskopik, 2-15% berat).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % sederhana higroskopik, > 15% sangat higroskopik) 23.Kecekapan higroskopik NFCS X NFCS dan TsN NFCS ditentukan pada penganalisis DVS TA TGA Q5000 SA. Semasa proses ini, masa larian, kelembapan relatif (RH), dan berat sampel masa nyata pada 25°C24 telah diperoleh. Kandungan lembapan dikira melalui analisis jisim NFRCS yang tepat menggunakan persamaan berikut:
MC ialah kelembapan NFRCS. m1 – berat kering NSAID. m2 ialah jisim NFRCS masa nyata pada RH yang diberikan.
Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнрась ° 5 течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas sampel dikosongkan pada suhu 25°C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом порослеоц течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Jumlah luas permukaan dianggarkan menggunakan eksperimen penjerapan nitrogen dengan nitrogen cecair selepas sampel dikosongkan selama 10 jam pada suhu 25°C (< 7 x 10-3 torr).Jumlah luas permukaan, isipadu liang dan saiz liang NFRCS ditentukan dengan Quantachrome dari NOVA 1000e, Austria menggunakan perisian RS 232.
Sediakan 5% RBC (salin sebagai pencair) daripada darah penuh. Kemudian pindahkan alikuot HFFC (0.25 ml) ke plat 96-telaga dan 5% jisim RBC (0.1 ml). Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 40 minit. Campuran sel darah merah dan serum dianggap sebagai kawalan positif, dan campuran salin dan sel darah merah sebagai kawalan negatif. Hemagglutinasi ditentukan mengikut skala Stajitzky. Skala yang dicadangkan adalah seperti berikut: + + + + agregat berbutir padat; + + + pad bawah licin dengan tepi melengkung; + + pad bawah licin dengan tepi koyak; + cincin merah sempit di sekeliling tepi pad licin; – (negatif) butang merah diskret 12 di tengah telaga bawah.
Hemokerapatan NFRCS dikaji mengikut kaedah Pertubuhan Piawaian Antarabangsa (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Kaedah gravimetrik yang diterangkan oleh Singh et al. Pengubahsuaian kecil telah dibuat untuk menilai pembentukan trombus dengan kehadiran atau pada permukaan NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS diinkubasi dalam salin penimbal fosfat (PBS) selama 24 jam pada suhu 37°C. Selepas 24 jam, PBS telah dikeluarkan dan NFRCS dirawat dengan 2 ml darah yang mengandungi 3.8% natrium sitrat. Pada permukaan NFRCS, tambahkan 0.04 ml 0.1 M CaCl2 kepada sampel yang diinkubasi. Selepas 45 minit, 5 ml air suling telah ditambah untuk menghentikan pembekuan. Darah yang terkumpul pada permukaan NFRK telah dirawat dengan larutan formaldehid 36-38%. Gumpalan yang difiksasi dengan formaldehid telah dikeringkan dan ditimbang. Peratusan trombosis dianggarkan dengan mengira berat gelas tanpa darah dan sampel (kawalan negatif) dan gelas dengan darah (kawalan positif).
Sebagai pengesahan awal, sampel telah divisualisasikan di bawah mikroskop optik untuk memahami keupayaan salutan permukaan HFFC, Ct yang saling berkaitan, dan rangkaian Ct untuk membentuk liang. Bahagian nipis Ch dan Cp daripada NFRCS telah dipotong dengan pisau bedah. Bahagian yang terhasil diletakkan di atas slaid kaca, ditutup dengan penutup, dan tepinya dilekatkan dengan gam. Slaid yang disediakan telah dilihat di bawah mikroskop optik dan gambar diambil pada pembesaran yang berbeza.
Pemendapan polimer dalam rangkaian Ct telah divisualisasikan menggunakan mikroskopi pendarfluor berdasarkan kaedah yang diterangkan oleh Rice et al.29. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi telah dicampurkan dengan pewarna pendarfluor (bawang merah), dan NFRCS (Ch & Cp) telah disediakan mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi telah dicampurkan dengan pewarna pendarfluor (bawang merah), dan NFRCS (Ch & Cp) telah disediakan mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini.Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi telah dicampurkan dengan pewarna pendarfluor (bawang merah) dan NFRCS (Ch dan Cp) telah diperoleh mengikut kaedah yang dinyatakan sebelum ini.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法到的方法制法制&Ch。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法到的方法制法制&Ch。Komposisi HFFC yang digunakan dalam formulasi telah dicampurkan dengan pewarna pendarfluor (Amaranth) dan menerima NFRCS (Ch dan Cp), seperti yang dinyatakan sebelum ini.Keratan nipis NFRK dipotong daripada sampel yang diperoleh, diletakkan di atas slaid kaca, dan ditutup dengan slip penutup. Perhatikan slaid yang disediakan di bawah mikroskop pendarfluor menggunakan penapis hijau (310-380 nm). Imej diambil pada pembesaran 4x untuk memahami hubungan Ct dan pemendapan polimer berlebihan dalam rangkaian Ct.
Topografi permukaan NFRCS Ch dan Cp ditentukan menggunakan mikroskop daya atom (AFM) dengan kantilever TESP ultra tajam dalam mod penorehan: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Kekasaran permukaan ditentukan oleh punca min kuasa dua (RMS) menggunakan perisian (Scanning Probe Image Processor). Pelbagai lokasi NFRCS telah dipaparkan pada imej 3D untuk memeriksa keseragaman permukaan. Sisihan piawai skor untuk kawasan tertentu ditakrifkan sebagai kekasaran permukaan. Persamaan RMS digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan NFRCS31.
Kajian berasaskan FESEM telah dijalankan menggunakan FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, untuk memahami morfologi permukaan Ch NFRCS dan Cp NFRCS, yang menunjukkan BCT yang lebih baik daripada Cm NFRCS. Kajian FESEM telah dijalankan mengikut kaedah yang diterangkan oleh Zhao et al. 32 dengan sedikit pengubahsuaian. NFRCS 20 hingga 30 mg Ch NFRCS dan Cp NFRCS telah dicampurkan terlebih dahulu dengan 20 µl 3.8% natrium sitrat yang telah dicampurkan terlebih dahulu dengan darah tikus. 20 μl 0.2 M CaCl2 telah ditambah kepada sampel yang dirawat darah untuk memulakan pembekuan dan sampel telah diinkubasi pada suhu bilik selama 10 minit. Di samping itu, eritrosit berlebihan telah dikeluarkan dari permukaan NFRCS dengan membilasnya dengan garam.
Sampel berikutnya dirawat dengan 0.1% glutaraldehida dan kemudian dikeringkan dalam ketuhar udara panas pada suhu 37°C untuk menghilangkan kelembapan. Sampel kering disalut dan dianalisis 32. Imej lain yang diperoleh semasa analisis ialah pembentukan gumpalan pada permukaan gentian kapas individu, pemendapan polimer antara Ct, morfologi (bentuk) eritrosit, integriti gumpalan, dan morfologi eritrosit dengan kehadiran NFRCS. Kawasan NFRCS yang tidak dirawat dan kawasan NFRCS yang dirawat Ch dan Cp yang diinkubasi dengan darah telah diimbas untuk ion unsur (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, zink, kuprum dan selenium) 33. Bandingkan peratusan ion unsur antara sampel yang dirawat dan tidak dirawat untuk memahami pengumpulan ion unsur semasa pembentukan gumpalan dan kehomogenan gumpalan.
Ketebalan salutan permukaan Cp HFFC pada permukaan Ct ditentukan menggunakan FESEM. Keratan rentas Cp NFRCS dipotong daripada rangka kerja dan disalut dengan percikan. Sampel salutan percikan yang terhasil diperhatikan oleh FESEM dan ketebalan salutan permukaan diukur 34, 35, 36.
Mikro-CT sinar-X menyediakan pengimejan tanpa pemusnah 3D resolusi tinggi dan membolehkan anda mengkaji susunan struktur dalaman NFRK. Mikro-CT menggunakan pancaran sinar-X yang melalui sampel untuk merekodkan pekali pelemahan linear tempatan sinar-X dalam sampel, yang membantu mendapatkan maklumat morfologi. Lokasi dalaman Ct dalam Cp NFRCS dan Cp NFRCS yang dirawat darah telah diperiksa oleh mikro-CT untuk memahami kecekapan penyerapan dan pembekuan darah dengan kehadiran NFRCS37,38,39. Struktur 3D sampel Cp NFRCS yang dirawat darah dan tidak dirawat telah dibina semula menggunakan mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Jerman). Menggunakan perisian VG STUDIO-MAX versi 2.2, beberapa imej sinar-X telah diambil dari sudut berbeza (idealnya liputan 360°) untuk membangunkan imej 3D untuk NFRCS. Data unjuran yang dikumpul telah dibina semula menjadi imej volumetrik 3D menggunakan perisian 3D ScanIP Academic yang sepadan.
Di samping itu, untuk memahami taburan bekuan darah, 20 µl darah sitrat pracampuran dan 20 µl 0.2 M CaCl2 telah ditambah ke dalam NFRCS untuk memulakan pembekuan darah. Sampel yang disediakan dibiarkan mengeras. Permukaan NFRK dirawat dengan 0.5% glutaraldehid dan dikeringkan dalam ketuhar udara panas pada suhu 30–40°C selama 30 minit. Bekuan darah yang terbentuk pada NFRCS telah diimbas, dibina semula dan imej 3D bekuan darah telah divisualisasikan.
Pengujian antibakteria telah dijalankan ke atas Cp NFRCS (terbaik berbanding Ch NFRCS) menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini dengan sedikit pengubahsuaian. Aktiviti antibakteria Cp NFRCS dan Cp HFFC telah ditentukan menggunakan tiga mikroorganisma ujian yang berbeza [S.aureus (bakteria gram-positif), E.coli (bakteria gram-negatif) dan Candida putih (C.albicans)] yang tumbuh pada agar dalam piring Petri dalam inkubator. Inokulasikan secara seragam 50 ml suspensi kultur bakteria yang dicairkan pada kepekatan 105-106 CFU ml-1 ke atas medium agar. Tuangkan medium ke dalam piring Petri dan biarkan ia memejal. Telaga telah dibuat pada permukaan plat agar untuk diisi dengan HFFC (3 telaga untuk HFFC dan 1 untuk kawalan negatif). Tambahkan 200 µl HFFC ke dalam 3 telaga dan 200 µl pH 7.4 PBS ke dalam telaga ke-4. Di bahagian lain piring petri, letakkan cakera Cp NFRCS 12 mm pada agar yang telah dipejalkan dan lembapkan dengan PBS (pH 7.4). Tablet Ciprofloxacin, ampicillin dan fluconazole dianggap sebagai piawaian rujukan untuk Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Candida albicans. Ukur zon perencatan secara manual dan ambil imej digital zon perencatan.
Selepas kelulusan etika institusi, kajian ini dijalankan di Kolej Pendidikan dan Penyelidikan Perubatan Kasturba di Manipal, Karnataka, di selatan India. Protokol eksperimen TEG in vitro telah dikaji semula dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi Kolej Perubatan Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Subjek telah direkrut daripada penderma darah sukarelawan (berumur 18 hingga 55 tahun) dari bank darah hospital. Di samping itu, borang persetujuan termaklum telah diperoleh daripada sukarelawan untuk pengumpulan sampel darah. TEG Natif (N-TEG) ​​​​digunakan untuk mengkaji kesan formulasi Cp HFFC pada darah penuh yang dicampur dengan natrium sitrat. N-TEG diiktiraf secara meluas kerana peranannya dalam resusitasi di tempat penjagaan, yang menimbulkan masalah kepada doktor kerana potensi kelewatan keputusan yang ketara secara klinikal (ujian pembekuan rutin). Analisis N-TEG telah dilakukan menggunakan darah penuh. Persetujuan termaklum dan sejarah perubatan terperinci telah diperoleh daripada semua peserta. Kajian ini tidak melibatkan peserta yang mempunyai komplikasi hemostatik atau trombotik seperti kehamilan/selepas bersalin atau penyakit hati. Subjek yang mengambil ubat-ubatan yang mempengaruhi lata pembekuan juga dikecualikan daripada kajian ini. Ujian makmal asas (hemoglobin, masa protrombin, tromboplastin diaktifkan dan kiraan platelet) telah dijalankan ke atas semua peserta mengikut prosedur standard. N-TEG menentukan viskoelastik pembekuan darah, struktur pembekuan awal, interaksi zarah, penguatan pembekuan darah, dan lisis pembekuan darah. Analisis N-TEG menyediakan data grafik dan berangka tentang kesan kolektif beberapa unsur selular dan plasma. Analisis N-TEG telah dijalankan ke atas dua isipadu Cp HFFC yang berbeza (10 µl dan 50 µl). Hasilnya, 1 ml darah penuh dengan asid sitrik telah ditambah kepada 10 μl Cp HFFC. Tambahkan 1 ml (Cp HFFC + darah sitrat), 340 µl darah campuran kepada 20 µl 0.2 M CaCl2 yang mengandungi piring TEG. Selepas itu, piring TEG dimuatkan ke dalam TEG® 5000, US untuk mengukur R, K, sudut alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% sampel darah dengan kehadiran Cp HFFC41.
Protokol kajian in vivo telah dikaji semula dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi (IAEC), Sekolah Perubatan Kasturba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua eksperimen haiwan telah dijalankan mengikut cadangan Jawatankuasa Kawalan dan Penyeliaan Eksperimen Haiwan (CPCSEA). Semua kajian NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) telah dijalankan ke atas tikus Wistar betina (berat 200 hingga 250 g). Semua haiwan telah diaklimatisasi pada suhu 24-26°C, haiwan mempunyai akses percuma kepada makanan dan air standard ad libitum. Semua haiwan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan yang berbeza, setiap kumpulan terdiri daripada tiga haiwan. Semua kajian telah dijalankan mengikut Kajian Haiwan: Laporan Eksperimen In Vivo 43. Sebelum kajian dijalankan, haiwan-haiwan tersebut telah dibius melalui pemberian intraperitoneal (ip) campuran 20-50 mg ketamin (setiap 1 kg berat badan) dan 2-10 mg xylazine (setiap 1 kg berat badan). Selepas kajian dijalankan, isipadu pendarahan dikira dengan menilai perbezaan antara berat awal dan akhir sampel, nilai purata yang diperoleh daripada ketiga-tiga ujian diambil sebagai isipadu pendarahan sampel.
Model amputasi ekor tikus telah dilaksanakan untuk memahami potensi NFRCS untuk memodulasi pendarahan dalam trauma, pertempuran atau kemalangan jalan raya (model kecederaan). Potong 50% ekor dengan pisau bedah dan letakkan di udara selama 15 saat untuk memastikan pendarahan normal. Di samping itu, sampel ujian diletakkan pada ekor tikus dengan mengenakan tekanan (Ct, Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS). Pendarahan dan PCT telah dilaporkan untuk spesimen ujian (n = 3)17,45.
Keberkesanan kawalan tekanan NFRCS dalam pertempuran telah dikaji pada model arteri femoral superfisial. Arteri femoral didedahkan, ditusuk dengan trokar 24G, dan didarah dalam masa 15 saat. Selepas pendarahan yang tidak terkawal diperhatikan, spesimen ujian diletakkan di tapak tusukan dengan tekanan dikenakan. Sejurus selepas penggunaan sampel ujian, masa pembekuan direkodkan dan kecekapan hemostatik diperhatikan selama 5 minit seterusnya. Prosedur yang sama diulangi dengan Cs dan Ct46.
Dowling et al. 47 mencadangkan model kecederaan hati untuk menilai potensi hemostatik bahan hemostatik dalam konteks pendarahan intraoperatif. BCT direkodkan untuk sampel Ct (kawalan negatif), rangka kerja Cs (kawalan positif), sampel Ch NFRCS, dan sampel Cp NFRCS. Vena kava suprahepatik tikus didedahkan dengan melakukan laparotomi median. Selepas itu, bahagian distal lobus kiri dipotong dengan gunting. Buat hirisan pada hati dengan pisau bedah dan biarkan ia berdarah selama beberapa saat. Sampel ujian Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang ditimbang dengan tepat diletakkan pada permukaan yang rosak tanpa sebarang tekanan positif dan BCT direkodkan. Kumpulan kawalan (Ct) kemudian mengenakan tekanan diikuti oleh Cs 30 s47 tanpa memecahkan kecederaan.
Ujian penyembuhan luka in vivo telah dijalankan menggunakan model luka eksisi untuk menilai sifat penyembuhan luka NFRCS berasaskan polimer yang dibangunkan. Model luka eksisi telah dipilih dan dijalankan mengikut kaedah yang diterbitkan sebelum ini dengan pengubahsuaian kecil19,32,48. Semua haiwan telah dibius seperti yang diterangkan sebelum ini. Gunakan penebuk biopsi (12 mm) untuk membuat hirisan bulat yang dalam pada kulit belakang. Tapak luka yang disediakan telah dibalut dengan Cs (kawalan positif), Ct (mengenal pasti bahawa pad kapas mengganggu penyembuhan), Ch NFRCS dan Cp NFRCS (kumpulan eksperimen) dan kawalan negatif tanpa sebarang rawatan. Pada setiap hari kajian, luas luka diukur pada semua tikus. Gunakan kamera digital untuk mengambil gambar kawasan luka dan memakai pembalut baharu. Peratusan penutupan luka diukur dengan formula berikut:
Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik telah dibuang ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) dan dikaji melalui pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson. Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik telah dibuang ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) dan dikaji melalui pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson.Berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian, kulit tikus kumpulan terbaik ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) telah dibuang dan diperiksa dengan pewarnaan dengan hematoxylin-eosin dan trikrom Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Tikus dalam kumpulan terbaik ((Cp NFRCS) dan kumpulan kawalan) telah dikeluarkan untuk pewarnaan hematoxylin-eosin dan pewarnaan trikrom Masson berdasarkan peratusan penutupan luka pada hari ke-12 kajian.Prosedur pewarnaan yang dilaksanakan telah dijalankan mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini49,50. Secara ringkas, selepas fiksasi dalam formalin 10%, sampel telah dinyahhidratkan menggunakan satu siri alkohol bergred. Gunakan mikrotom untuk mendapatkan bahagian nipis (tebal 5 µm) daripada tisu yang dipotong. Bahagian bersiri nipis kawalan dan Cp NFRCS telah dirawat dengan hematoxylin dan eosin untuk mengkaji perubahan histopatologi. Pewarnaan trikrom Masson telah digunakan untuk mengesan pembentukan fibril kolagen. Keputusan yang diperoleh telah dikaji secara membuta tuli oleh ahli patologi.
Kestabilan sampel Cp NFRCS telah dikaji pada suhu bilik (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) selama 12 bulan51. Cp NFRCS (perubahan warna permukaan dan pertumbuhan mikrob) telah diperiksa secara visual dan diuji untuk rintangan haus lipatan dan BCT mengikut kaedah di atas yang digariskan dalam bahagian Bahan dan Kaedah.
Kebolehskalaan dan kebolehulangan Cp NFRCS telah diperiksa dengan menyediakan Cp NFRCS dengan saiz 15×15 cm2. Di samping itu, 30 mg sampel (n = 5) telah diasingkan daripada pelbagai pecahan Cp NFRCS dan BCT sampel yang dikaji telah dinilai seperti yang diterangkan sebelum ini dalam bahagian Kaedah.
Kami telah cuba membangunkan pelbagai bentuk dan struktur menggunakan komposisi Cp NFRCS untuk pelbagai aplikasi bioperubatan. Bentuk atau konfigurasi tersebut termasuk swab kon untuk pendarahan hidung, prosedur pergigian dan swab silinder untuk pendarahan faraj.
Semua set data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai dan dianalisis dengan ANOVA menggunakan Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) diikuti dengan ujian perbandingan berganda Bonferroni (*p<0.05).
Semua prosedur yang dijalankan dalam kajian manusia adalah selaras dengan piawaian Institut dan Majlis Penyelidikan Kebangsaan, serta Deklarasi Helsinki 1964 dan pindaan berikutnya, atau piawaian etika yang serupa. Semua peserta dimaklumkan tentang ciri-ciri kajian dan sifat sukarelanya. Data peserta kekal sulit setelah dikumpulkan. Protokol eksperimen TEG in vitro telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi Kolej Perubatan Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Sukarelawan menandatangani persetujuan termaklum untuk mengumpul sampel darah.
Semua prosedur yang dijalankan dalam kajian haiwan telah dijalankan mengikut Fakulti Perubatan Kastuba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua eksperimen haiwan yang direka telah dijalankan mengikut garis panduan Jawatankuasa Kawalan dan Penyeliaan Eksperimen Haiwan (CPCSEA). Semua penulis mematuhi garis panduan ARRIVE.
Spektrum FTIR bagi semua NFRCS telah dianalisis dan dibandingkan dengan spektrum kitosan yang ditunjukkan dalam Rajah 2A. Puncak spektrum ciri kitosan (direkodkan) pada 3437 cm-1 (regangan OH dan NH, pertindihan), 2945 dan 2897 cm-1 (regangan CH), 1660 cm-1 (strain NH2), 1589 cm-1 (lenturan N–H), 1157 cm-1 (regangan jambatan O-), 1067 cm-1 (regangan C–O, hidroksil sekunder), 993 cm-1 (regangan CO, Bo-OH) 52.53.54. Jadual Tambahan S1 menunjukkan nilai spektrum penyerapan FTIR NFRCS untuk kitosan (pelapor), kitosan tulen, Cm, Ch, dan Cp. Spektrum FTIR bagi semua NFRCS (Cm, Ch dan Cp) menunjukkan jalur penyerapan ciri yang sama seperti kitosan tulen tanpa sebarang perubahan ketara (Rajah 2A). Keputusan FTIR mengesahkan ketiadaan interaksi kimia atau fizikal antara polimer yang digunakan untuk membangunkan NFRCS, menunjukkan bahawa polimer yang digunakan adalah lengai.
Pencirian in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs. (A) mewakili spektrum FTIR gabungan komposisi kitosan dan Cm NFRCS, Ch NFRCS dan Cp NFRCS di bawah pemampatan. (B) a) Kadar pengambilan darah keseluruhan NFRCS Cm, Ch, Cp, dan Cg (n = 3); Sampel Ct menunjukkan BAR yang lebih tinggi kerana kapas mempunyai kecekapan penyerapan yang lebih tinggi; b) Darah selepas penyerapan darah Ilustrasi sampel yang diserap. Perwakilan grafik BCT sampel ujian C (Cp NFRCS mempunyai BCT terbaik (15 s, n = 3)). Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± SD, dan bar ralat mewakili SD, ***p < 0.0001. Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai min ± SD, dan bar ralat mewakili SD, ***p < 0.0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют сталнд, *** <0,0001. Data dalam C, D, E dan G dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai, dan bar ralat mewakili sisihan piawai, ***p<0.0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют сталнд, *** <0,0001. Data dalam C, D, E dan G ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai, bar ralat mewakili sisihan piawai, ***p<0.0001.