Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
L'hemorràgia incontrolada és una de les principals causes de mort. Aconseguir una hemostàsia ràpida garanteix la supervivència del subjecte com a primers auxilis durant el combat, els accidents de trànsit i les operacions de reducció de morts. La bastida composta reforçada amb fibra nanoporosa (NFRCS) derivada d'una simple composició formadora de pel·lícula hemostàtica (HFFC) com a fase contínua pot desencadenar i millorar l'hemostàsia. El desenvolupament de l'NFRCS es basa en el disseny de l'ala de la libèl·lula. L'estructura de l'ala de la libèl·lula consta d'ales transversals i longitudinals, i les membranes de l'ala estan connectades entre si per mantenir la integritat de la microestructura. L'HFFC recobreix uniformement la superfície de la fibra amb una pel·lícula de gruix nanomètric i connecta el gruix de cotó (Ct) distribuït aleatòriament (fase dispersa) per formar una estructura nanoporosa. La combinació de fases contínues i disperses redueix el cost del producte deu vegades en comparació amb els productes disponibles comercialment. Els NFRCS modificats (tampons o polseres) es poden utilitzar en una varietat d'aplicacions biomèdiques. Estudis in vivo han conclòs que el Cp NFRCS desenvolupat desencadena i millora el procés de coagulació al lloc d'aplicació. El NFRCS pot modular el microambient i actuar a nivell cel·lular gràcies a la seva estructura nanoporosa, la qual cosa resulta en una millor cicatrització de les ferides en el model de ferida d'excisió.
L'hemorràgia incontrolada durant el combat, les situacions intraoperatòries i d'emergència pot representar una greu amenaça per a la vida dels ferits1. Aquestes afeccions, a més, provoquen un augment general de la resistència vascular perifèrica, cosa que provoca un xoc hemorràgic. Les mesures adequades per controlar l'hemorràgia durant i després de la cirurgia es consideren potencialment mortals2,3. El dany als vasos grans provoca una pèrdua massiva de sang, cosa que resulta en una taxa de mortalitat ≤ 50% en combat i 31% durant la cirurgia1. La pèrdua massiva de sang provoca una disminució del volum corporal, cosa que redueix el cabal cardíac. Un augment de la resistència vascular perifèrica total i un deteriorament progressiu de la microcirculació provoquen hipòxia als òrgans de suport vital. Es pot produir un xoc hemorràgic si la condició continua sense una intervenció eficaç1,4,5. Altres complicacions inclouen la progressió de la hipotèrmia i l'acidosi metabòlica, així com un trastorn de la coagulació que impedeix el procés de coagulació. El xoc hemorràgic greu s'associa amb un major risc de mort6,7,8. En el xoc de grau III (progressiu), la transfusió de sang és essencial per a la supervivència del pacient durant la morbimortalitat intraoperatòria i postoperatòria. Per superar totes les situacions de perill mortal esmentades anteriorment, hem desenvolupat una estructura composta reforçada amb fibra nanoporosa (NFRCS) que utilitza una concentració mínima de polímer (0,5%) mitjançant una combinació de polímers hemostàtics solubles en aigua.
Amb l'ús de reforç de fibra, es poden desenvolupar productes rendibles. Les fibres disposades aleatòriament s'assemblen a l'estructura de l'ala d'una libèl·lula, equilibrada per les franges horitzontals i verticals de les ales. Les venes transversals i longitudinals de l'ala es comuniquen amb la membrana de l'ala (Fig. 1). El NFRCS consisteix en Ct reforçat com a sistema de bastida amb una millor resistència física i mecànica (Figura 1). A causa de la seva assequibilitat i la seva artesania, els cirurgians prefereixen utilitzar calibres de fil de cotó (Ct) durant les operacions i els apòsits. Per tant, considerant els seus múltiples beneficis, incloent-hi > 90% de cel·lulosa cristal·lina (que contribueix a la millora de l'activitat hemostàtica), es va utilitzar Ct com a sistema esquelètic de NFRCS9,10. Per tant, considerant els seus múltiples beneficis, incloent-hi > 90% de cel·lulosa cristal·lina (que contribueix a la millora de l'activitat hemostàtica), es va utilitzar Ct com a sistema esquelètic de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалличесесклой (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной скелетной скелетной сис9,10 N.FRCS9 Per tant, atesos els seus molts beneficis, incloent-hi >90% de cel·lulosa cristal·lina (implicada en l'augment de l'activitat hemostàtica), es va utilitzar Ct com a sistema esquelètic NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血滴止血滴，，被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Per tant, atesos els seus molts beneficis, incloent-hi més del 90% de cel·lulosa cristal·lina (que ajuda a millorar l'activitat hemostàtica), es va utilitzar Ct com a bastida per a NFRCS9,10.El Ct es va recobrir superficialment (es va observar la formació d'una pel·lícula de gruix nanomètric) i es va interconnectar amb una composició hemostàtica formadora de pel·lícula (HFFC). L'HFFC actua com una matrigel, mantenint unit el Ct col·locat aleatòriament. El disseny desenvolupat transmet l'estrès dins de la fase dispersa (fibres de reforç). És difícil obtenir estructures nanoporoses amb bona resistència mecànica utilitzant concentracions mínimes de polímer. A més, no és fàcil personalitzar diferents motlles per a diferents aplicacions biomèdiques.
La figura mostra un diagrama del disseny de l'NFRCS basat en l'estructura de l'ala de la libèl·lula (A). Aquesta imatge mostra una analogia comparativa de l'estructura de l'ala d'una libèl·lula (les venes interseccionals i longitudinals de l'ala estan interconnectades) i una microfotografia de secció transversal de l'NFRCS de Cp (B). Representació esquemàtica de l'NFRCS.
Els NFRC es van desenvolupar utilitzant HFFC com a fase contínua per abordar les limitacions anteriors. L'HFFC està compost per diversos polímers hemostàtics formadors de pel·lícula, incloent-hi quitosà (com a principal polímer hemostàtic) amb metilcel·lulosa (MC), hidroxipropilmetilcel·lulosa (HPMC 50 cp) i alcohol polivinílic (PVA) (125 kDa) com a polímer de suport que promou la formació de trombes. L'addició de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) va millorar la capacitat d'absorció d'humitat dels NFRCS. Es va afegir polietilenglicol 400 (PEG 400) per millorar la reticulació dels polímers en mescles de polímers units. Es van aplicar a Ct tres composicions hemostàtiques diferents d'HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), és a dir, quitosà amb MC (Cm), quitosà amb HPMC (Ch) i quitosà amb PVA (Cp). Diversos estudis de caracterització in vitro i in vivo han confirmat l'activitat hemostàtica i de cicatrització de ferides dels NFRCS. Els materials compostos que ofereix NFRCS es poden utilitzar per personalitzar diverses formes de bastides per satisfer necessitats específiques.
A més, els NFRCS es poden modificar com un embenat o un rotlle per cobrir tota la zona de la lesió de les extremitats inferiors i altres parts del cos. Específicament per a lesions de les extremitats en combat, el disseny dels NFRCS es pot canviar a mig braç o cama sencera (Figura suplementària S11). Els NFRCS es poden convertir en una polsera amb cola de teixit, que es pot utilitzar per aturar el sagnat per lesions suïcides greus al canell. El nostre objectiu principal és desenvolupar un NFRCS amb el mínim polímer possible que es pugui lliurar a una gran població (per sota del llindar de la pobresa) i que es pugui col·locar en un kit de primers auxilis. De disseny senzill, eficient i econòmic, els NFRCS beneficien les comunitats locals i poden tenir un impacte global.
El quitosà (pes molecular 80 kDa) i l'amarant es van comprar a Merck, Índia. La hidroxipropilmetilcel·lulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 i la metilcel·lulosa es van comprar a Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. L'alcohol polivinílic (pes molecular 125 kDa) (87-90% hidrolitzat) es va comprar a National Chemicals, Gujarat. La polivinilpirrolidina K30 es va comprar a Molychem, Mumbai, i els hisops estèrils es van comprar a Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, amb aigua Milli Q (sistema de purificació d'aigua Direct-Q3, Merck, Índia) com a vehicle.
L'NFRCS es va desenvolupar mitjançant un mètode de liofilització11,12. Totes les composicions de HFFC (Taula 1) es van preparar mitjançant un agitador mecànic. Prepareu una solució de quitosà al 0,5% utilitzant àcid acètic a l'1% en aigua mitjançant agitació contínua a 800 rpm en un agitador mecànic. El pes exacte del polímer carregat indicat a la Taula 1 es va afegir a la solució de quitosà i es va agitar fins que es va obtenir una solució de polímer transparent. Es van afegir PVP K30 i PEG 400 a la barreja resultant en les quantitats indicades a la Taula 1 i es va continuar a remenar fins que es va obtenir una solució de polímer viscosa transparent. El bany resultant de solució de polímer es va sonicar durant 60 minuts per eliminar les bombolles d'aire atrapades de la barreja de polímer. Com es mostra a la Figura Suplementària S1(b), el Ct es va distribuir uniformement a cada pou d'una placa (motlle) de 6 pous suplementada amb 5 ml de HFFC.
La placa de sis pous es va sonicar durant 60 minuts per aconseguir una humectació i distribució uniformes de HFFC a la xarxa Ct. A continuació, es va congelar la placa de sis pous a -20 °C durant 8-12 hores. Les plaques de congelació es van liofilitzar durant 48 hores per obtenir diverses formulacions de NFRCS. El mateix procediment s'utilitza per produir diferents formes i estructures, com ara tampons o tampons cilíndrics, o qualsevol altra forma per a diferents aplicacions.
El quitosà (80 kDa) (3%), pesat amb precisió, es dissol en àcid acètic a l'1% amb un agitador magnètic. A la solució resultant de quitosà s'hi afegeix PEG 400 a l'1% i es remena durant 30 minuts. Aboqueu la solució resultant en un recipient quadrat o rectangular i congeleu-lo a -80 °C durant 12 hores. Les mostres congelades es liofilitzen durant 48 hores per obtenir Cs13 porós.
El NFRCS desenvolupat es va sotmetre a experiments mitjançant espectroscòpia d'infrarojos per transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tòquio, Japó) per confirmar la compatibilitat química del quitosà amb altres polímers14,15. Els espectres FTIR (amplada del rang espectral de 400 a 4000 cm-1) de totes les mostres provades es van obtenir realitzant 32 escanejos.
La taxa d'absorció en sang (BAR) per a totes les formulacions es va avaluar mitjançant el mètode descrit per Chen et al. 16 amb lleugeres modificacions. Els NFRC desenvolupats de totes les composicions es van assecar en un forn de buit a 105 °C durant la nit per eliminar el dissolvent residual. Es van col·locar 30 mg de NFRCS (pes inicial de la mostra – W0) i 30 mg de Ct (control positiu) en plats separats que contenien una premescla de citrat de sodi al 3,8%. A intervals de temps predeterminats, és a dir, 5, 10, 20, 30, 40 i 60 segons, es van retirar els NFRCS i se'n van netejar les superfícies de sang no absorbida col·locant les mostres sobre Ct durant 30 segons. Es va considerar el pes final de la sang absorbida pels NFRCS 16 (W1) en cada punt de temps. Calculeu el percentatge de BAR mitjançant la fórmula següent:
El temps de coagulació de la sang (TCS) es va determinar tal com van informar Wang et al. 17. El temps necessari perquè la sang sencera (sang de rata premesclada amb un 3,8% de citrat de sodi) coagulés en presència de NFRCS es va calcular com el TCS de la mostra de prova. Els diversos components de l'NFRCS (30 mg) es van col·locar en vials amb tap de rosca de 10 ml i es van incubar a 37 °C. Es va afegir sang (0,5 ml) al vial i es van afegir 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M per activar la coagulació de la sang. Finalment, invertiu el vial cada 15 segons (fins a 180 °) fins que es formi un coàgul ferm. El TCS de la mostra s'estima mitjançant el nombre de voltes17,18. Basant-se en el TCS, es van seleccionar dues composicions òptimes de Cm, Ch i Cp de l'NFRCS per a estudis de caracterització posteriors.
El BCT de les composicions de Ch NFRCS i Cp NFRCS es va determinar implementant el mètode descrit per Li et al. 19. Col·loqueu 15 x 15 mm2 de Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (control positiu) en plaques de Petri separades (37 °C). Es va barrejar sang que contenia citrat de sodi al 3,8% amb CaCl2 0,2 ​​M en una proporció de volum de 10:1 per iniciar el procés de coagulació de la sang. Es van aplicar 20 µl de barreja de sang de rata CaCl2 0,2 ​​M a la superfície de la mostra i es van col·locar en una placa de Petri buida. El control va ser sang abocada en plaques de Petri buides sense Ct. A intervals fixos de 0, 3 i 5 minuts, atureu la coagulació afegint 10 ml d'aigua desionitzada (DI) a la mostra que conté la placa sense pertorbar el coàgul. Els eritròcits no coagulats (eritròcits) experimenten hemòlisi en presència d'aigua desionitzada i alliberen hemoglobina. L'hemoglobina en diferents moments (HA(t)) es va mesurar a 540 nm (λmax hemoglobina) utilitzant un espectrofotòmetre UV-Vis. L'absorció absoluta d'hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sang en 10 ml d'aigua desionitzada es va prendre com a estàndard de referència. La captació relativa d'hemoglobina (RHA) de la sang coagulada es va calcular a partir de la relació HA(t)/HA(0) utilitzant el mateix lot de sang.
Utilitzant un analitzador de textures (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), es van determinar les propietats adhesives de l'NFRC al teixit danyat. Es va pressionar una placa cilíndrica de fons obert contra l'interior de la pell del porc (sense la capa de greix). Es van aplicar mostres (Ch NFRCS i Cp NFRCS) mitjançant una cànula en motlles cilíndrics per crear adhesió a la pell del porc. Després d'una incubació de 3 minuts a temperatura ambient (RT) (25 °C), es va registrar la força adhesiva de l'NFRCS a una velocitat constant de 0,5 mm/seg.
La característica principal dels segelladors quirúrgics és augmentar la coagulació de la sang alhora que redueix la pèrdua de sang. La coagulació sense pèrdues en NFRCS es va avaluar mitjançant un mètode publicat anteriorment amb lleugeres modificacions 19. Feu un tub de microcentrífuga (2 ml) (diàmetre interior 10 mm) amb un forat de 8 × 5 mm2 a un costat del tub de centrífuga (que representa una ferida oberta). S'utilitza NFRCS per tancar l'obertura i s'utilitza cinta adhesiva per segellar les vores exteriors. Afegiu 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tub de microcentrífuga que conté la premescla de citrat de sodi al 3,8%. Després de 10 minuts, es van treure els tubs de microcentrífuga de les plaques i es va determinar l'augment de la massa de les plaques a causa del flux de sang de l'NFRK (n = 3). La pèrdua de sang es va comparar amb Ch NFRCS i Cp NFRCS amb Cs.
La integritat humida dels NFRCS es va determinar segons el mètode descrit per Mishra i Chaudhary21 amb petites modificacions. Col·loqueu els NFRCS en un matràs Erlenmeyer de 100 ml amb 50 ml d'aigua i remeneu-ho durant 60 s sense formar una tapa. Inspecció visual i priorització de les mostres per a la integritat física en funció de la recollida.
La força d'unió de HFFC a Ct es va estudiar utilitzant mètodes publicats prèviament amb modificacions menors. La integritat del recobriment superficial es va avaluar exposant NFRK a ones acústiques (estímul extern) en presència d'aigua milliQ (Ct). Els NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS desenvolupats es van col·locar en un vas de precipitats ple d'aigua i es van sonicar durant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 min, respectivament. Després de l'assecat, la diferència percentual entre el pes inicial i final dels NFRCS es va utilitzar per calcular el percentatge de pèrdua de material (HFFC). La BCT in vitro va confirmar encara més la força d'unió o pèrdua de materials superficials. L'eficiència de la unió de HFFC a Ct proporciona coagulació de la sang i un recobriment elàstic a la superfície de Ct22.
L'homogeneïtat de l'NFRCS desenvolupat es va determinar mitjançant la BCT de mostres (30 mg) preses d'ubicacions generals seleccionades aleatòriament de l'NFRCS. Seguiu el procediment BCT esmentat anteriorment per determinar el compliment de l'NFRCS. La proximitat entre les cinc mostres garanteix una cobertura superficial uniforme i la deposició de HFFC a la malla Ct.
L'àrea nominal de contacte amb la sang (NBCA) es va determinar com s'havia informat anteriorment amb algunes modificacions. Es va coagular la sang subjectant 20 µl de sang entre les dues superfícies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. Després d'1 hora, es van separar les dues parts del stent i es va mesurar manualment l'àrea del coàgul. Es va considerar el valor mitjà de tres repeticions NBCA NFRCS19.
L'anàlisi de sorció dinàmica de vapor (DVS) es va utilitzar per avaluar l'eficàcia de les NFRCS per absorbir aigua de l'entorn extern o del lloc de la lesió responsable d'iniciar la coagulació. La DVS avalua o registra l'absorció i la pèrdua de vapor en una mostra gravimètricament mitjançant una balança ultrasensible amb una resolució de massa de ±0,1 µg. Un controlador electrònic de flux màssic genera una pressió parcial de vapor (humitat relativa) al voltant de la mostra barrejant gasos portadors saturats i secs. Segons les directrius de la Farmacopea Europea, en funció del percentatge d'absorció d'humitat per part de les mostres, aquestes es van classificar en 4 categories (0–0,012% p/p− no higroscòpiques, 0,2–2% p/p lleugerament higroscòpiques, 2–15% moderadament higroscòpiques i > 15% molt higroscòpiques)23. Segons les directrius de la Farmacopea Europea, en funció del percentatge d'absorció d'humitat per part de les mostres, aquestes es van classificar en 4 categories (0–0,012% p/p− no higroscòpiques, 0,2–2% p/p lleugerament higroscòpiques, 2–15% moderadament higroscòpiques i > 15% molt higroscòpiques)23.D'acord amb les recomanacions de la Farmacopea Europea, depenent del percentatge d'absorció d'humitat de les mostres, aquestes es van dividir en 4 categories (0–0,012% p/p – no higroscòpica, 0,2–2% p/p lleugerament higroscòpica, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadament higroscòpic i > 15% molt higroscòpic)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% p/p非吸湿性、0,2-2% p/p 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 （012（0. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23〿）D'acord amb les recomanacions de la Farmacopea Europea, les mostres es divideixen en 4 classes segons el percentatge d'humitat absorbida per la mostra (0-0,012% en pes – no higroscòpica, 0,2-2% en pes lleugerament higroscòpica, 2-15% en pes).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadament higroscòpic, > 15% molt higroscòpic) 23.L'eficiència higroscòpica de NFCS X NFCS i TsN NFCS es va determinar en un analitzador DVS TA TGA Q5000 SA. Durant aquest procés, es va obtenir el temps d'execució, la humitat relativa (HR) i el pes de la mostra en temps real a 25 °C24. El contingut d'humitat es calcula mitjançant una anàlisi de massa precisa de NFRCS utilitzant l'equació següent:
MC és la humitat dels NFRCS. m1: pes sec dels AINE. m2 és la massa dels NFRCS en temps real a una HR determinada.
La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 °C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 °C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции аззотка помощью опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 °C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面总表。✨ 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцоди бцоди Обцик азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 °C (< 7 × 10-3 торр). La superfície total es va estimar mitjançant experiments d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres durant 10 hores a 25 °C (< 7 x 10-3 torr).La superfície total, el volum dels porus i la mida dels porus NFRCS es van determinar amb un Quantachrome de NOVA 1000e, Àustria, utilitzant el programari RS 232.
Prepareu un 5% de glòbuls vermells (solució salina com a diluent) de sang sencera. A continuació, transferiu una alíquota de HFFC (0,25 ml) a una placa de 96 pous i una massa de glòbuls vermells al 5% (0,1 ml). Incubeu la barreja a 37 °C durant 40 minuts. Es va considerar una barreja de glòbuls vermells i sèrum com a control positiu, i una barreja de solució salina i glòbuls vermells com a control negatiu. L'hemaglutinació es va determinar segons l'escala de Stajitzky. Les escales proposades són les següents: + + + + agregats granulars densos; + + + coixinets de fons llisos amb vores corbes; + + coixinets de fons llisos amb vores esquinçades; + anells vermells estrets al voltant de les vores dels coixinets llisos; – (negatiu) botó vermell discret 12 al centre del pou inferior.
L'hemocompatibilitat dels NFRCS es va estudiar segons el mètode de l'Organització Internacional per a l'Estandardització (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. El mètode gravimètric descrit per Singh et al. Es van fer petites modificacions per avaluar la formació de trombes en presència o a la superfície dels NFRCS. Es van incubar 500 mg de Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) durant 24 hores a 37 °C. Després de 24 hores, es va retirar el PBS i els NFRCS es van tractar amb 2 ml de sang que contenia citrat de sodi al 3,8%. A la superfície dels NFRCS, afegiu 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a les mostres incubades. Després de 45 minuts, es van afegir 5 ml d'aigua destil·lada per aturar la coagulació. La sang coagulada a la superfície dels NFRC es va tractar amb una solució de formaldehid al 36-38%. Els coàguls fixats amb formaldehid es van assecar i pesar. El percentatge de trombosi es va estimar calculant el pes del got sense sang ni mostra (control negatiu) i del got amb sang (control positiu).
Com a confirmació inicial, les mostres es van visualitzar amb un microscopi òptic per comprendre la capacitat del recobriment superficial HFFC, la interconnexió de Ct i la xarxa de Ct per formar porus. Es van retallar seccions primes de Ch i Cp de NFRCS amb una fulla de bisturí. La secció resultant es va col·locar en un portaobjectes de vidre, es va cobrir amb un cobreobjectes i les vores es van fixar amb cola. Els portaobjectes preparats es van observar amb un microscopi òptic i es van fer fotografies a diferents augments.
La deposició de polímer en xarxes de Ct es va visualitzar mitjançant microscòpia de fluorescència basada en el mètode descrit per Rice et al.29. La composició HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es van preparar NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment. La composició HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es van preparar NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment.La composició HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es va obtenir NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNFhRCS） Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNFhRCS） Cp）.La composició HFFC utilitzada en la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i va rebre NFRCS (Ch i Cp), com s'ha esmentat anteriorment.Es van tallar seccions primes de NFRK de les mostres obtingudes, es van col·locar en portaobjectes de vidre i es van cobrir amb cobreobjectes. Observeu els portaobjectes preparats sota un microscopi fluorescent utilitzant un filtre verd (310-380 nm). Es van prendre imatges amb un augment de 4x per comprendre les relacions Ct i l'excés de deposició de polímer a la xarxa Ct.
La topografia superficial de Ch i Cp de NFRCS es va determinar mitjançant un microscopi de força atòmica (AFM) amb un cantilever TESP ultra-nítid en mode de rosca: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. La rugositat superficial es va determinar mitjançant l'arrel quadràtica mitjana (RMS) mitjançant programari (Scanning Probe Image Processor). Es van representar diverses ubicacions de NFRCS en imatges 3D per comprovar la uniformitat de la superfície. La desviació estàndard de la puntuació per a una àrea determinada es defineix com la rugositat superficial. L'equació RMS es va utilitzar per quantificar la rugositat superficial de NFRCS31.
Es van dur a terme estudis basats en FESEM utilitzant FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tòquio, per comprendre la morfologia superficial dels NFRCS de Ch i els NFRCS de Cp, que van mostrar una millor BCT que els NFRCS de Cm. L'estudi FESEM es va dur a terme segons el mètode descrit per Zhao et al. 32 amb petites modificacions. Es van premesclar de 20 a 30 mg de NFRCS de Ch i NFRCS de Cp amb 20 µl de citrat de sodi al 3,8% premesclat amb sang de rata. Es van afegir 20 μl de CaCl2 0,2 ​​M a les mostres tractades amb sang per iniciar la coagulació i les mostres es van incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. A més, es va eliminar l'excés d'eritròcits de la superfície dels NFRCS esbandint-los amb solució salina.
Les mostres posteriors es van tractar amb glutaraldehid al 0,1% i després es van assecar en un forn d'aire calent a 37 °C per eliminar la humitat. Les mostres assecades es van recobrir i analitzar 32. Altres imatges obtingudes durant l'anàlisi van ser la formació de coàguls a la superfície de fibres de cotó individuals, la deposició de polímer entre Ct, la morfologia dels eritròcits (forma), la integritat del coàgul i la morfologia dels eritròcits en presència de NFRCS. Les zones de NFRCS no tractades i les zones de NFRCS tractades amb Ch i Cp incubades amb sang es van escanejar per detectar ions elementals (sodi, potassi, nitrogen, calci, magnesi, zinc, coure i seleni) 33. Compareu els percentatges d'ions elementals entre les mostres tractades i les no tractades per entendre l'acumulació d'ions elementals durant la formació de coàguls i l'homogeneïtat del coàgul.
El gruix del recobriment superficial de Cp HFFC a la superfície de Ct es va determinar mitjançant FESEM. Les seccions transversals de Cp NFRCS es van tallar de l'estructura i es van recobrir per pulverització catòdica. Les mostres de recobriment per pulverització catòdica resultants es van observar mitjançant FESEM i es va mesurar el gruix del recobriment superficial 34, 35, 36.
La micro-TC de raigs X proporciona imatges 3D d'alta resolució no destructives i permet estudiar la disposició estructural interna dels NFRC. La micro-TC utilitza un feix de raigs X que passa a través de la mostra per registrar el coeficient d'atenuació lineal local dels raigs X de la mostra, cosa que ajuda a obtenir informació morfològica. La ubicació interna de Ct en Cp NFRCS i Cp NFRCS tractats amb sang es va examinar mitjançant micro-TC per comprendre l'eficiència d'absorció i la coagulació de la sang en presència de NFRCS37,38,39. Les estructures 3D de mostres de Cp NFRCS tractades amb sang i sense tractament es van reconstruir mitjançant micro-TC (V|tome|x S240, Phoenix, Alemanya). Utilitzant el programari VG STUDIO-MAX versió 2.2, es van prendre diverses imatges de raigs X des de diferents angles (idealment una cobertura de 360°) per desenvolupar imatges 3D per a NFRCS. Les dades de projecció recollides es van reconstruir en imatges volumètriques 3D mitjançant el programari 3D ScanIP Academic senzill corresponent.
A més, per entendre la distribució del coàgul, es van afegir 20 µl de sang citratada premesclada i 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al NFRCS per iniciar la coagulació de la sang. Les mostres preparades es deixen endurir. La superfície de l'NFRC es va tractar amb glutaraldehid al 0,5% i es va assecar en un forn d'aire calent a 30-40 °C durant 30 min. El coàgul de sang format al NFRCS es va escanejar, reconstruir i es va visualitzar una imatge 3D del coàgul.
Es van realitzar assaigs antibacterians en Cp NFRCS (millor comparació amb Ch NFRCS) utilitzant el mètode descrit anteriorment amb petites modificacions. L'activitat antibacteriana de Cp NFRCS i Cp HFFC es va determinar utilitzant tres microorganismes de prova diferents [S. aureus (bacteris grampositius), E. coli (bacteris gramnegatius) i Candida blanca (C. albicans)] creixent en agar en plaques de Petri en una incubadora. Inocular uniformement 50 ml de la suspensió de cultiu bacterià diluïda a una concentració de 105-106 UFC ml-1 al medi d'agar. Abocar el medi en una placa de Petri i deixar-lo solidificar. Es van fer pous a la superfície de la placa d'agar per omplir-los amb HFFC (3 pous per a HFFC i 1 per a control negatiu). Afegir 200 µl de HFFC a 3 pous i 200 µl de PBS pH 7,4 al 4t pou. A l'altre costat de la placa de Petri, col·loqueu un disc de Cp NFRCS de 12 mm sobre l'agar solidificat i humitegeu-lo amb PBS (pH 7,4). Els comprimits de ciprofloxacina, ampicil·lina i fluconazol es consideren estàndards de referència per a Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Mesureu la zona d'inhibició manualment i feu una imatge digital de la zona d'inhibició.
Després de l'aprovació ètica institucional, l'estudi es va dur a terme al Kasturba Medical College of Education and Research de Manipal, Karnataka, al sud de l'Índia. El protocol experimental TEG in vitro ha estat revisat i aprovat pel Comitè d'Ètica Institucional del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Els subjectes van ser reclutats entre donants de sang voluntaris (d'entre 18 i 55 anys) del banc de sang de l'hospital. A més, es va obtenir un formulari de consentiment informat dels voluntaris per a la recollida de mostres de sang. Es va utilitzar TEG natiu (N-TEG) ​​per estudiar l'efecte de la formulació de Cp HFFC en sang sencera premesclada amb citrat de sodi. L'N-TEG és àmpliament reconegut pel seu paper en la reanimació al punt d'atenció, cosa que crea problemes per als clínics a causa del potencial de retard clínicament significatiu en els resultats (proves de coagulació rutinàries). L'anàlisi N-TEG es va realitzar utilitzant sang sencera. Es va obtenir el consentiment informat i l'historial mèdic detallat de tots els participants. L'estudi no va incloure participants amb complicacions hemostàtiques o trombòtiques, com ara malalties durant l'embaràs/postpart o el fetge. Els subjectes que prenien fàrmacs que afecten la cascada de la coagulació també van ser exclosos de l'estudi. Es van realitzar proves de laboratori bàsiques (hemoglobina, temps de protrombina, tromboplastina activada i recompte de plaquetes) a tots els participants segons els procediments estàndard. L'N-TEG determina la viscoelasticitat del coàgul sanguini, l'estructura inicial del coàgul, la interacció de partícules, l'enfortiment del coàgul i la lisi del coàgul. L'anàlisi N-TEG proporciona dades gràfiques i numèriques sobre els efectes col·lectius de diversos elements cel·lulars i plasma. L'anàlisi N-TEG es va realitzar en dos volums diferents de Cp HFFC (10 µl i 50 µl). Com a resultat, es va afegir 1 ml de sang sencera amb àcid cítric a 10 μl de Cp HFFC. Afegiu 1 ml (Cp HFFC + sang citrada) i 340 µl de sang mixta a 20 µl de placa de TEG que conté CaCl2 0,2 ​​M. A continuació, es van carregar plaques de TEG en TEG® 5000, US per mesurar R, K, angle alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY en un 30% de mostres de sang en presència de Cp HFFC41.
El protocol de l'estudi in vivo va ser revisat i aprovat pel Comitè Institucional d'Ètica Animal (IAEC), Escola de Medicina Kasturba, Institut d'Educació Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tots els experiments amb animals es van dur a terme d'acord amb les recomanacions del Comitè per al Control i la Supervisió de l'Experimentació Animal (CPCSEA). Tots els estudis NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) es van realitzar en rates Wistar femelles (amb un pes de 200 a 250 g). Tots els animals es van aclimatar a una temperatura de 24-26 °C, i els animals van tenir lliure accés a aliments i aigua estàndard ad libitum. Tots els animals es van dividir aleatòriament en diferents grups, cada grup estava format per tres animals. Tots els estudis es van dur a terme d'acord amb Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Abans de l'estudi, els animals van ser anestesiats mitjançant l'administració intraperitoneal (ip) d'una barreja de 20-50 mg de ketamina (per 1 kg de pes corporal) i 2-10 mg de xilazina (per 1 kg de pes corporal). Després de l'estudi, es va calcular el volum de sagnat avaluant la diferència entre el pes inicial i final de les mostres, i el valor mitjà obtingut de les tres proves es va prendre com a volum de sagnat de la mostra.
El model d'amputació de cua de rata es va implementar per entendre el potencial de les NFRCS per modular el sagnat en traumatismes, combats o accidents de trànsit (model de lesió). Es va tallar el 50% de la cua amb una fulla de bisturí i es va col·locar a l'aire durant 15 segons per garantir un sagnat normal. A més, es van col·locar mostres de prova a la cua d'una rata aplicant pressió (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS). Es va informar de sagnat i PCT per a mostres de prova (n = 3)17,45.
L'eficàcia del control de la pressió de la NFRCS en combat es va investigar en un model de l'artèria femoral superficial. L'artèria femoral s'exposa, es punxa amb un tròcar de 24G i es sagna en 15 segons. Després d'observar un sagnat incontrolat, la mostra de prova es col·loca al lloc de punció amb pressió aplicada. Immediatament després de l'aplicació de la mostra de prova, es va registrar el temps de coagulació i es va observar l'eficiència hemostàtica durant els següents 5 minuts. El mateix procediment es va repetir amb Cs i Ct46.
Dowling et al. 47 van proposar un model de lesió hepàtica per avaluar el potencial hemostàtic dels materials hemostàtics en el context de l'hemorràgia intraoperatòria. Es va registrar la BCT per a mostres de Ct (control negatiu), estructura de Cs (control positiu), mostres de Ch NFRCS i mostres de Cp NFRCS. La vena cava suprahepàtica de la rata es va exposar realitzant una laparotomia mitjana. Després, es va tallar la part distal del lòbul esquerre amb unes tisores. Es va fer una incisió al fetge amb una fulla de bisturí i es va deixar sagnar durant uns segons. Es van col·locar mostres de prova de Ch NFRCS i Cp NFRCS pesades amb precisió sobre la superfície danyada sense cap pressió positiva i es va registrar la BCT. El grup de control (Ct) va aplicar pressió seguida de Cs 30 s47 sense trencar la lesió.
Es van realitzar assaigs de cicatrització de ferides in vivo utilitzant un model de ferida excisional per avaluar les propietats de cicatrització de les ferides dels NFRCS basats en polímers desenvolupats. Es van seleccionar i realitzar models de ferides excisionals segons mètodes publicats anteriorment amb modificacions menors19,32,48. Tots els animals van ser anestesiats com s'ha descrit anteriorment. Es va utilitzar un punxó de biòpsia (12 mm) per fer una incisió circular profunda a la pell de l'esquena. Les zones de ferides preparades es van vestir amb Cs (control positiu), Ct (reconeixent que els coixinets de cotó interfereixen amb la cicatrització), Ch NFRCS i Cp NFRCS (grup experimental) i un control negatiu sense cap tractament. Cada dia de l'estudi, es va mesurar l'àrea de la ferida en totes les rates. Es va utilitzar una càmera digital per fer una foto de l'àrea de la ferida i es va posar un nou apòsit. El percentatge de tancament de la ferida es va mesurar mitjançant la fórmula següent:
Basant-se en el percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va excisar la pell de rata del millor grup ((Cp NFRCS) i el grup de control) i es va estudiar mitjançant tinció amb H&E i tinció amb tricrom de Masson. Basant-se en el percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va excisar la pell de rata del millor grup ((Cp NFRCS) i el grup de control) i es va estudiar mitjançant tinció amb H&E i tinció amb tricrom de Masson.Basant-se en el percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va excisar la pell de les rates del millor grup ((Cp NFRCS) i el grup de control) i es va examinar mitjançant tinció amb hematoxilina-eosina i tricrom de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Les rates del millor grup ((Cp NFRCS) i grups de control) van ser excisades per a la tinció d'hematoxilina-eosina i la tinció de tricrom de Masson basada en el percentatge de tancament de la ferida el dia 12 de l'estudi.El procediment de tinció implementat es va dur a terme d'acord amb els mètodes descrits anteriorment49,50. Breument, després de la fixació en formalina al 10%, les mostres es van deshidratar utilitzant una sèrie d'alcohols graduats. Utilitzeu un micròtom per obtenir seccions primes (5 µm de gruix) del teixit excisat. Les seccions seriades primes de controls i NFRCS Cp es van tractar amb hematoxilina i eosina per estudiar els canvis histopatològics. La tinció tricrom de Masson es va utilitzar per detectar la formació de fibril·les de col·lagen. Els resultats obtinguts van ser estudiats a cegues per patòlegs.
L'estabilitat de les mostres de Cp NFRCS es va estudiar a temperatura ambient (25 °C ± 2 °C/60 % HR ± 5 %) durant 12 mesos51. Els Cp NFRCS (decoloració superficial i creixement microbià) es van inspeccionar visualment i es van provar la resistència al desgast per plegament i la BCT d'acord amb els mètodes descrits anteriorment a la secció Materials i mètodes.
L'escalabilitat i la reproductibilitat dels NFRCS de Cp es van examinar preparant NFRCS de Cp amb una mida de 15 × 15 cm2. A més, es van excisar mostres de 30 mg (n = 5) de diverses fraccions de NFRCS de Cp i es va avaluar la BCT de les mostres estudiades tal com s'ha descrit anteriorment a la secció Mètodes.
Hem intentat desenvolupar diverses formes i estructures utilitzant composicions de Cp NFRCS per a diverses aplicacions biomèdiques. Aquestes formes o configuracions inclouen hisops cònics per a hemorràgies nasals, procediments dentals i hisops cilíndrics per a hemorràgies vaginals.
Tots els conjunts de dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard i es van analitzar mitjançant ANOVA utilitzant Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) seguit de la prova de comparacions múltiples de Bonferroni (*p <0,05).
Tots els procediments realitzats en estudis amb humans es van complir amb els estàndards de l'Institut i del Consell Nacional de Recerca, així com amb la Declaració de Hèlsinki de 1964 i les seves esmenes posteriors, o estàndards ètics similars. Tots els participants van ser informats sobre les característiques de l'estudi i la seva naturalesa voluntària. Les dades dels participants romanen confidencials un cop recollides. El protocol experimental in vitro TEG ha estat revisat i aprovat pel Comitè d'Ètica Institucional del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Els voluntaris van signar el consentiment informat per recollir mostres de sang.
Tots els procediments realitzats en estudis amb animals es van dur a terme d'acord amb la Facultat de Medicina Kastuba, Institut d'Educació Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tots els experiments amb animals dissenyats es van dur a terme d'acord amb les directrius del Comitè per al Control i la Supervisió de l'Experimentació Animal (CPCSEA). Tots els autors segueixen les directrius d'ARRIVE.
Els espectres FTIR de tots els NFRCS es van analitzar i comparar amb l'espectre de quitosà que es mostra a la Figura 2A. Pics espectrals característics del quitosà (enregistrats) a 3437 cm-1 (estirament OH i NH, superposició), 2945 i 2897 cm-1 (estirament CH), 1660 cm-1 (tensió NH2), 1589 cm-1 (flexió N–H), 1157 cm-1 (estirament del pont O-), 1067 cm-1 (estirament C–O, hidroxil secundari), 993 cm-1 (estirament CO, Bo-OH) 52,53,54. La Taula Suplementària S1 mostra els valors de l'espectre d'absorció FTIR dels NFRCS per al quitosà (reporter), quitosà pur, Cm, Ch i Cp. Els espectres FTIR de tots els NFRCS (Cm, Ch i Cp) van mostrar les mateixes bandes d'absorció característiques que el quitosà pur sense cap canvi significatiu (Fig. 2A). Els resultats de FTIR van confirmar l'absència d'interaccions químiques o físiques entre els polímers utilitzats per desenvolupar els NFRCS, cosa que indica que els polímers utilitzats són inerts.
Caracterització in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. (A) representa els espectres FTIR combinats de les composicions de quitosà i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS sota compressió. (B) a) Taxa d'absorció de sang completa de Cm, Ch, Cp i Cg NFRCS (n = 3); Les mostres de Ct van mostrar una BAR més alta perquè el bastonet de cotó té una eficiència d'absorció més alta; b) Sang després de l'absorció de sang Il·lustració de la mostra absorbida. Representació gràfica de la BCT de la mostra de prova C (Cp NFRCS va tenir la millor BCT (15 s, n = 3)). Les dades de C, D, E i G es van mostrar com a mitjana ± SD, i les barres d'error representen SD, *** p < 0,0001. Les dades de C, D, E i G es van mostrar com a mitjana ± SD, i les barres d'error representen SD, *** p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей прешностей отклонение, ***p <0,0001. Les dades de C, D, E i G es presenten com a mitjana ± desviació estàndard, i les barres d'error representen la desviació estàndard, *** p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештностестей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Les dades de C, D, E i G es mostren com a mitjana ± desviació estàndard, les barres d'error representen la desviació estàndard, *** p < 0,0001.