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L'emorragia incontrollata hè una di e principali cause di morte. Uttene una emostasi rapida assicura a sopravvivenza di u sughjettu cum'è primu aiutu durante u cumbattimentu, l'accidenti stradali è l'operazioni di riduzione di a morte. L'impalcatura cumposta rinforzata cù fibre nanoporose (NFRCS) derivata da una semplice cumposizione emostatica formante un film (HFFC) cum'è fase cuntinua pò scatenà è migliurà l'emostasi. U sviluppu di l'NFRCS hè basatu annantu à u disignu di l'ala di a libellula. A struttura di l'ala di a libellula hè custituita da ali trasversali è longitudinali, è e membrane di l'ala sò cunnesse trà di elle per mantene l'integrità di a microstruttura. L'HFFC riveste uniformemente a superficia di a fibra cù un film di spessore nanometricu è cunnetta u spessore di u cuttone distribuitu casualmente (Ct) (fase dispersa) per furmà una struttura nanoporosa. A cumminazione di fasi cuntinue è disperse riduce u costu di u pruduttu di dece volte paragunatu à i prudutti dispunibili cummercialmente. L'NFRCS mudificati (tamponi o braccialetti) ponu esse aduprati in una varietà di applicazioni biomediche. Studi in vivo anu cunclusu chì u Cp NFRCS sviluppatu attiva è migliora u prucessu di coagulazione in u situ di applicazione. L'NFRCS pò modulà u microambiente è agisce à u livellu cellulare per via di a so struttura nanoporosa, risultendu in una migliore guarigione di e ferite in u mudellu di ferita da escissione.
L'emorragia incontrollata durante u cumbattimentu, e situazioni intraoperatorie è d'emergenza pò rapprisintà una seria minaccia per a vita di i feriti1. Queste cundizioni portanu ancu à un aumentu generale di a resistenza vasculare periferica, purtendu à un shock emorragicu. Misure adatte per cuntrullà l'emorragia durante è dopu a chirurgia sò cunsiderate potenzialmente periculose per a vita2,3. I danni à i grandi vasi portanu à una perdita di sangue massiccia, cù un tassu di mortalità ≤ 50% in cumbattimentu è 31% durante a chirurgia1. A perdita di sangue massiccia porta à una diminuzione di u vulume corpurale, chì riduce a gittata cardiaca. Un aumentu di a resistenza vasculare periferica tutale è una compromissione progressiva di a microcirculazione portanu à l'ipossia in l'organi di supportu vitale. U shock emorragicu pò accade se a cundizione cuntinua senza un interventu efficace1,4,5. Altre cumplicazioni includenu a progressione di l'ipotermia è di l'acidosi metabolica, è ancu un disordine di coagulazione chì impedisce u prucessu di coagulazione. U shock emorragicu severu hè assuciatu à un risicu più altu di morte6,7,8. In u shock di gradu III (progressivu), a trasfusione di sangue hè essenziale per a sopravvivenza di u paziente durante a morbilità è a mortalità intraoperatoria è postoperatoria. Per superà tutte e situazioni minaccianti di vita sopra menzionate, avemu sviluppatu un scaffold cumpostu rinforzatu cù fibre nanoporose (NFRCS) chì utilizza una concentrazione minima di polimeri (0,5%) aduprendu una cumminazione di polimeri emostatici solubili in acqua.
Cù l'usu di rinforzu di fibre, si ponu sviluppà prudutti à bon pattu. E fibre disposte à casu s'assumiglianu à a struttura di l'ala di una libellula, equilibrate da e strisce urizzuntali è verticali nantu à l'ale. E vene trasversali è longitudinali di l'ala cumunicanu cù a membrana di l'ala (Fig. 1). L'NFRCS hè custituitu da Ct rinforzatu cum'è un sistema di impalcatura cù una migliore resistenza fisica è meccanica (Figura 1). A causa di l'accessibilità economica è di l'artigianalità, i chirurghi preferiscenu aduprà calibri di filu di cuttone (Ct) durante l'operazioni è e medicazioni. Cusì, cunsiderendu i so multipli benefici, cumprese > 90% di cellulosa cristallina (cuntribuisce à u miglioramentu di l'attività emostatica), Ct hè statu utilizatu cum'è sistema scheletricu di NFRCS9,10. Cusì, cunsiderendu i so multipli benefici, cumprese > 90% di cellulosa cristallina (cuntribuisce à u miglioramentu di l'attività emostatica), Ct hè statu utilizatu cum'è sistema scheletricu di NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаличеслесклой (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной скелетной скелетной с.FRCS9,10 N. Dunque, datu i so numerosi vantaghji, cumprese >90% di cellulosa cristallina (implicata in una maggiore attività emostatica), Ct hè statu utilizatu cum'è sistema scheletricu NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血滴止血滴被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Dunque, datu i so numerosi benefici, cumpresi più di 90% di cellulosa cristallina (aiuta à migliurà l'attività emostatica), Ct hè statu utilizatu cum'è impalcatura per NFRCS9,10.U Ct hè statu superficialmente rivestitu (hè stata osservata a furmazione di film nano-spessi) è interconnessu cù una cumpusizione emostatica chì forma un film (HFFC). L'HFFC agisce cum'è un matrigel, tenendu inseme u Ct piazzatu à casu. U disignu sviluppatu trasmette u stress in a fase dispersa (fibre di rinforzu). Hè difficiule d'ottene strutture nanoporosi cù una bona resistenza meccanica aduprendu concentrazioni minime di polimeri. Inoltre, ùn hè micca faciule persunalizà stampi diversi per diverse applicazioni biomediche.
A figura mostra un diagrama di u disignu NFRCS basatu annantu à a struttura di l'ala di libellula (A). Sta maghjina mostra una analogia cumparativa di a struttura di l'ala di una libellula (e vene intersecanti è longitudinali di l'ala sò interconnesse) è una microfotografia trasversale di Cp NFRCS (B). Rappresentazione schematica di NFRCS.
I NFRC sò stati sviluppati aduprendu HFFC cum'è una fase cuntinua per affruntà e limitazioni sopra menzionate. HFFC hè cumpostu da vari polimeri emostatici chì formanu una film, cumpresi u chitosanu (cum'è u principale polimeru emostaticu) cù metilcellulosa (MC), idrossipropilmetilcellulosa (HPMC 50 cp) è alcolu polivinilicu (PVA) (125 kDa) cum'è polimeru di supportu chì prumove a furmazione di trombi. L'aghjunta di polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) hà migliuratu a capacità di assorbimentu di l'umidità di i NFRCS. U polietilenglicole 400 (PEG 400) hè statu aghjuntu per migliurà a reticolazione di i polimeri in miscele di polimeri legati. Trè diverse cumpusizioni emostatiche HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC è Cp HFFC), vale à dì chitosanu cù MC (Cm), chitosanu cù HPMC (Ch) è chitosanu cù PVA (Cp), sò state applicate à Ct. Diversi studii di caratterizazione in vitro è in vivo anu cunfirmatu l'attività emostatica è di guarigione di e ferite di i NFRCS. I materiali cumposti offerti da NFRCS ponu esse aduprati per persunalizà diverse forme di impalcature per risponde à bisogni specifici.
Inoltre, i NFRCS ponu esse mudificati cum'è una benda o un rotulu per copre tutta l'area di ferita di l'estremità inferiori è altre parti di u corpu. Specificamente per e ferite di l'estremità di cummattimentu, u disignu NFRCS cuncipitu pò esse cambiatu in un mezu bracciu o una gamba sana (Figura Supplementare S11). I NFRCS ponu esse trasformati in un braccialettu cù colla tissutale, chì pò esse aduprata per fermà u sanguinamentu da ferite suicide gravi à u polsu. U nostru scopu principale hè di sviluppà un NFRCS cù u menu polimeru pussibule chì pò esse furnitu à una grande pupulazione (sottu à a linea di puvertà) è chì pò esse piazzatu in un kit di primu aiutu. Semplice, efficiente è ecunomicu in u disignu, i NFRCS beneficianu e cumunità lucali è ponu avè un impattu glubale.
U chitosanu (pesu moleculare 80 kDa) è l'amaranto sò stati acquistati da Merck, India. L'idrossipropilmetilcellulosa 50 Cp, u polietilenglicole 400 è a metilcellulosa sò stati acquistati da Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. L'alcol polivinilicu (pesu moleculare 125 kDa) (87-90% idrolizzatu) hè statu acquistatu da National Chemicals, Gujarat. A polivinilpirrolidina K30 hè stata acquistata da Molychem, Mumbai, i tamponi sterili sò stati acquistati da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, cù acqua Milli Q (sistema di purificazione di l'acqua Direct-Q3, Merck, India) cum'è vettore.
L'NFRCS hè statu sviluppatu aduprendu un metudu di liofilizazione11,12. Tutte e cumpusizioni HFFC (Tavula 1) sò state preparate aduprendu un agitatore meccanicu. Preparate una suluzione di chitosanu à 0,5% aduprendu acidu aceticu à 1% in acqua per agitazione cuntinua à 800 rpm nantu à un agitatore meccanicu. U pesu esattu di u polimeru caricatu indicatu in a Tavula 1 hè statu aghjuntu à a suluzione di chitosanu è agitatu finu à ottene una suluzione di polimeru chjara. PVP K30 è PEG 400 sò stati aghjunti à a mistura risultante in e quantità indicate in a Tavula 1, è l'agitazione hè stata cuntinuata finu à ottene una suluzione di polimeru viscosa chjara. U bagnu risultante di suluzione di polimeru hè statu sonicatu per 60 minuti per rimuovere e bolle d'aria intrappulate da a mistura di polimeru. Cum'è mostratu in a Figura Supplementare S1(b), Ct hè statu distribuitu uniformemente in ogni pozzettu di una piastra à 6 pozzetti (stampu) supplementata cù 5 ml di HFFC.
A piastra à sei pozzetti hè stata sonicata per 60 minuti per ottene una bagnatura è una distribuzione uniforme di HFFC in a rete Ct. Dopu, congelate a piastra à sei pozzetti à -20 °C per 8-12 ore. E piastre di congelazione sò state liofilizzate per 48 ore per ottene varie formulazioni di NFRCS. A stessa prucedura hè aduprata per pruduce diverse forme è strutture, cum'è tamponi o tamponi cilindrici, o qualsiasi altra forma per diverse applicazioni.
U chitosanu (80 kDa) (3%) pesatu cù precisione hè dissoltu in 1% d'acidu aceticu aduprendu un agitatore magneticu. À a suluzione risultante di chitosanu hè statu aghjuntu 1% di PEG 400 è agitatu per 30 minuti. Versate a suluzione risultante in un cuntainer quadratu o rettangulare è congelate à -80 °C per 12 ore. I campioni congelati sò stati liofilizzati per 48 ore per ottene Cs13 porosu.
L'NFRCS sviluppatu hè statu sottumessu à esperimenti utilizendu a spettroscopia infrarossa à trasformata di Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Giappone) per cunfirmà a cumpatibilità chimica di u chitosanu cù altri polimeri14,15. I spettri FTIR (larghezza di a gamma spettrale da 400 à 4000 cm-1) di tutti i campioni testati sò stati ottenuti realizendu 32 scansioni.
A velocità di assorbimentu di u sangue (BAR) per tutte e formulazioni hè stata valutata aduprendu u metudu discrittu da Chen et al. 16 cù lievi mudificazioni. L'NFRK sviluppati di tutte e cumpusizioni sò stati secchi in un fornu à vuoto à 105 ° C durante a notte per rimuovere u solvente residuale. 30 mg di NFRCS (pesu iniziale di u campione - W0) è 30 mg di Ct (cuntrollu pusitivu) sò stati posti in piatti separati chì cuntenenu una premiscela di citratu di sodiu à 3,8%. À intervalli di tempu predeterminati, vale à dì 5, 10, 20, 30, 40 è 60 secondi, l'NFRCS sò stati rimossi è e so superfici sò state pulite da u sangue micca assorbitu piazzendu i campioni nantu à Ct per 30 secondi. U pesu finale di u sangue assorbitu da NFRCS 16 hè statu cunsideratu (W1) à ogni puntu di tempu. Calcula a percentuale di BAR aduprendu a seguente formula:
U tempu di coagulazione di u sangue (BCT) hè statu determinatu cum'è riportatu da Wang et al. 17. U tempu necessariu per chì u sangue interu (sangue di rattu premiscelatu cù 3,8% di citratu di sodiu) si coaguli in presenza di NFRCS hè statu calculatu cum'è u BCT di u campione di prova. I vari cumpunenti NFRCS (30 mg) sò stati posti in fiale cù tappu à vite da 10 ml è incubati à 37 ° C. U sangue (0,5 ml) hè statu aghjuntu à a fiala è 0,3 ml di CaCl2 0,2 ​​M hè statu aghjuntu per attivà a coagulazione di u sangue. Infine, invertisce a fiala ogni 15 secondi (finu à 180 °) finu à chì si forma un coagulu fermu. U BCT di u campione hè stimatu da u numeru di flip vails17,18. Basatu annantu à u BCT, duie cumpusizioni ottimali da NFRCS Cm, Ch è Cp sò state selezziunate per ulteriori studii di caratterizazione.
A BCT di e cumpusizioni di Ch NFRCS è Cp NFRCS hè stata determinata implementendu u metudu discrittu da Li et al. 19. Pone 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, è Cs (cuntrollu pusitivu) in piastre di Petri separate (37 °C). U sangue chì cuntene 3,8% di citratu di sodiu hè statu mischiatu cù 0,2 M CaCl2 in un rapportu di vulume 10:1 per inizià u prucessu di coagulazione di u sangue. 20 µl di mistura di sangue di rattu CaCl2 0,2 ​​M hè stata applicata à a superficia di u campione è piazzata in una piastra di Petri viota. U cuntrollu era sangue versatu in piastre di Petri viote senza Ct. À intervalli fissi di 0, 3 è 5 minuti, ferma a coagulazione aghjunghjendu 10 ml d'acqua deionizzata (DI) à u campione chì cuntene a piastra senza disturbà u coagulu. L'eritrociti micca coagulati (eritrociti) subiscenu emolisi in presenza d'acqua deionizzata è liberanu emoglobina. L'emoglobina à diversi punti di tempu (HA(t)) hè stata misurata à 540 nm (λmax emoglobina) utilizendu un spettrofotometru UV-Vis. L'assorbimentu assolutu di l'emoglobina (AH(0)) in 0 min di 20 µl di sangue in 10 ml d'acqua deionizzata hè statu pigliatu cum'è standard di riferimentu. L'assorbimentu relativu di l'emoglobina (RHA) di u sangue coagulatu hè statu calculatu da u rapportu HA(t)/HA(0) utilizendu u listessu lottu di sangue.
Cù un analizzatore di struttura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sò state determinate e proprietà adesive di NFRK à u tissutu dannighjatu. Pressate una piastra cilindrica à fondu apertu contr'à l'internu di a pelle di porcu (senza u stratu di grassu). I campioni (Ch NFRCS è Cp NFRCS) sò stati applicati via cannula in stampi cilindrici per creà adesione à a pelle di u porcu. Dopu una incubazione di 3 minuti à temperatura ambiente (RT) (25° C.), a forza adesiva NFRCS hè stata registrata à una velocità costante di 0,5 mm/sec.
A caratteristica principale di i sigillanti chirurgichi hè di aumentà a coagulazione di u sangue riducendu a perdita di sangue. A coagulazione senza perdita in NFRCS hè stata valutata utilizendu un metudu publicatu prima cù lievi mudificazioni 19. Fate un tubu di microcentrifuga (2 ml) (diametru internu 10 mm) cù un foru di 8 × 5 mm2 da un latu di u tubu di centrifuga (chì rapprisenta una ferita aperta). NFRCS hè adupratu per chjude l'apertura è u nastro adesivo hè adupratu per sigillà i bordi esterni. Aghjunghjite 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M à u tubu di microcentrifuga chì cuntene a premiscela di citratu di sodiu à 3,8%. Dopu à 10 minuti, i tubi di microcentrifuga sò stati rimossi da i piatti è l'aumentu di a massa di i piatti hè statu determinatu per via di u flussu di sangue da l'NFRK (n = 3). A perdita di sangue Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati paragunati cù Cs.
L'integrità umida di l'NFRCS hè stata determinata secondu u metudu discrittu da Mishra è Chaudhary21 cù modifiche minori. Pone l'NFRCS in un matrazzu Erlenmeyer di 100 ml cù 50 ml d'acqua è mischjà per 60 s senza furmà un otturatore. Ispezione visuale è prioritizazione di i campioni per l'integrità fisica basata annantu à a cullezzione.
A forza di legame di HFFC à Ct hè stata studiata aduprendu metudi publicati prima cù mudificazioni minori. L'integrità di u rivestimentu superficiale hè stata valutata espunendu NFRK à onde acustiche (stimulu esternu) in presenza d'acqua milliQ (Ct). L'NFRCS Ch NFRCS è Cp NFRCS sviluppati sò stati posti in un becher pienu d'acqua è sonicati per 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 è 30 minuti, rispettivamente. Dopu l'asciugatura, a differenza percentuale trà u pesu iniziale è finale di l'NFRCS hè stata aduprata per calculà a perdita percentuale di materiale (HFFC). A BCT in vitro hà ancu sustinutu a forza di legame o a perdita di materiali superficiali. L'efficienza di u ligame HFFC à Ct furnisce a coagulazione di u sangue è un rivestimentu elasticu nantu à a superficia di Ct22.
L'omogeneità di l'NFRCS sviluppatu hè stata determinata da a BCT di campioni (30 mg) prelevati da lochi generali scelti à casu di l'NFRCS. Segui a prucedura BCT citata prima per determinà a conformità NFRCS. A vicinanza trà tutti i cinque campioni assicura una copertura superficiale uniforme è a deposizione HFFC in a maglia Ct.
L'area nominale di cuntattu cù u sangue (NBCA) hè stata determinata cum'è riportatu prima cù alcune mudificazioni. Coagulate u sangue chjudendu 20 µl di sangue trà e duie superfici di Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS è Cs. Dopu à 1 ora, e duie parti di u stent sò state separate è misurata manualmente l'area di u coagulu. U valore mediu di trè ripetizioni hè statu cunsideratu NBCA NFRCS19.
L'analisi di l'assorbimentu dinamicu di vapore (DVS) hè stata aduprata per valutà l'efficacità di l'NFRCS per assorbe l'acqua da l'ambiente esternu o da u situ di a ferita rispunsevule di l'iniziu di a coagulazione. U DVS valuta o registra l'assorbimentu è a perdita di vapore in un campione gravimetricamente aduprendu una bilancia ultrasensibile cù una risoluzione di massa di ±0,1 µg. Una pressione parziale di vapore (umidità relativa) hè generata da un controller elettronicu di flussu di massa intornu à u campione mischjendu gas vettore saturi è secchi. Sicondu e linee guida di a Farmacopea Europea, basatu annantu à a percentuale di assorbimentu di umidità da i campioni, i campioni sò stati classificati in 4 categurie (0–0,012% p/p− non igroscopicu, 0,2–2% p/p ligeramente igroscopicu, 2–15% moderatamente igroscopicu, è > 15% assai igroscopicu)23. Sicondu e linee guida di a Farmacopea Europea, basatu annantu à a percentuale di assorbimentu di umidità da i campioni, i campioni sò stati classificati in 4 categurie (0-0,012% p/p− non igroscopicu, 0,2-2% p/p ligeramente igroscopicu, 2-15% moderatamente igroscopicu, è > 15% assai igroscopicu)23.In cunfurmità cù e raccomandazioni di a Farmacopea Europea, secondu a percentuale di assorbimentu di umidità da i campioni, i campioni sò stati divisi in 4 categurie (0-0,012% p/p - non igroscopicu, 0,2-2% p/p ligeramente igroscopicu, 2-15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderatamente igroscopicu è > 15% assai igroscopicu)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w-w非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分 0.0（ 0.00（0. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23〿）In cunfurmità cù e raccomandazioni di a Farmacopea Europea, i campioni sò divisi in 4 classi secondu a percentuale di umidità assorbita da u campione (0-0,012% in pesu - micca igroscopicu, 0,2-2% in pesu ligeramente igroscopicu, 2-15% in pesu).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderatamente igroscopicu, > 15% assai igroscopicu) 23.L'efficienza igroscopica di NFCS X NFCS è TsN NFCS hè stata determinata nantu à un analizzatore DVS TA TGA Q5000 SA. Durante stu prucessu, sò stati ottenuti u tempu di esecuzione, l'umidità relativa (RH) è u pesu di u campione in tempu reale à 25°C24. U cuntenutu d'umidità hè calculatu da un'analisi di massa NFRCS precisa utilizendu a seguente equazione:
MC hè l'umidità NFRCS. m1 – pesu seccu di i NSAID. m2 hè a massa NFRCS in tempu reale à una data RH.
A superficia tutale hè stata stimata aduprendu un esperimentu d'adsorbimentu d'azotu cù azotu liquidu dopu avè svuotatu i campioni à 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). A superficia tutale hè stata stimata aduprendu un esperimentu d'adsorbimentu d'azotu cù azotu liquidu dopu avè svuotatu i campioni à 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азоток по сперимента опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A superficia tutale hè stata stimata aduprendu un esperimentu d'adsorbimentu d'azotu cù azotu liquidu dopu chì i campioni sò stati svuotati à 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靂总表靂在 25 ° C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцик адсорбцик алась с использованием азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 ° C (< 7 × 10-3 торр). A superficia tutale hè stata stimata aduprendu esperimenti d'adsorbimentu d'azotu cù azotu liquidu dopu chì i campioni sò stati svuotati per 10 ore à 25 °C (< 7 x 10-3 torr).A superficia tutale, u vulume di i pori è a dimensione di i pori NFRCS sò stati determinati cù un Quantachrome di NOVA 1000e, Austria utilizendu u software RS 232.
Preparate 5% di globuli rossi (soluzione salina cum'è diluente) da sangue interu. Poi trasferisce una aliquota di HFFC (0,25 ml) à una piastra à 96 pozzetti è 5% di massa di globuli rossi (0,1 ml). Incubate a mistura à 37 °C per 40 minuti. Una mistura di globuli rossi è serum hè stata cunsiderata cum'è cuntrollu pusitivu, è una mistura di soluzione salina è globuli rossi cum'è cuntrollu negativu. L'emagglutinazione hè stata determinata secondu a scala Stajitzky. E scale pruposte sò e seguenti: + + + + aggregati granulari densi; + + + cuscinetti di fondu lisci cù bordi curvi; + + cuscinetti di fondu lisci cù bordi strappati; + anelli rossi stretti intornu à i bordi di i cuscinetti lisci; – (negativu) buttone rossu discretu 12 in u centru di u pozzettu inferiore.
L'emocompatibilità di i NFRCS hè stata studiata secondu u metudu di l'Organizazione Internaziunale per a Standardizazione (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. U metudu gravimetricu discrittu da Singh et al. Sò state fatte mudificazioni minori per valutà a furmazione di trombi in presenza di o nantu à a superficia di i NFRCS. 500 mg di Cs, Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati incubati in soluzione salina tamponata cù fosfatu (PBS) per 24 ore à 37°C. Dopu à 24 ore, u PBS hè statu eliminatu è i NFRCS sò stati trattati cù 2 ml di sangue chì cuntene 3,8% di citratu di sodiu. Nantu à a superficia di i NFRCS, aghjunghje 0,04 ml di CaCl2 0,1 M à i campioni incubati. Dopu à 45 minuti, sò stati aghjunti 5 ml d'acqua distillata per fermà a coagulazione. U sangue coagulatu nantu à a superficia di i NFRK hè statu trattatu cù una soluzione di formaldeide à 36-38%. I coaguli fissati cù formaldeide sò stati asciugati è pesati. A percentuale di trombosi hè stata stimata calculendu u pesu di u bicchieru senza sangue è campione (cuntrollu negativu) è di u bicchieru cù sangue (cuntrollu pusitivu).
Cum'è una prima cunferma, i campioni sò stati visualizati sottu à un microscopiu otticu per capisce a capacità di u rivestimentu superficiale HFFC, Ct interconnessu è a rete Ct di furmà pori. Sezioni fini di Ch è Cp da NFRCS sò state tagliate cù una lama di bisturi. A sezione risultante hè stata posta nantu à un vetrino, cuperta cù un coprioggetto, è i bordi sò stati fissati cù colla. I vetrini preparati sò stati osservati sottu à un microscopiu otticu è e fotografie sò state scattate à diversi ingrandimenti.
A deposizione di polimeri in e rete Ct hè stata visualizata aduprendu a microscopia di fluorescenza basata annantu à u metudu discrittu da Rice et al.29. A cumpusizione HFFC aduprata per a formulazione hè stata mischiata cù un colorante fluorescente (amarantu), è l'NFRCS (Ch & Cp) sò stati preparati secondu u metudu citatu prima. A cumpusizione HFFC aduprata per a formulazione hè stata mischiata cù un colorante fluorescente (amarantu), è l'NFRCS (Ch & Cp) sò stati preparati secondu u metudu citatu prima.A cumpusizione HFFC aduprata per a formulazione hè stata mischiata cù un colorante fluorescente (amarantu) è NFRCS (Ch è Cp) hè statu ottenutu secondu u metudu citatu prima.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNF Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNF Cp）。A cumpusizione HFFC aduprata in a formulazione hè stata mischiata cù un colorante fluorescente (Amaranth) è hà ricevutu NFRCS (Ch è Cp), cum'è mintuvatu prima.Sezioni fini di NFRK sò state tagliate da i campioni ottenuti, poste nantu à vetrini è cuperte cù vetrini. Osservate i vetrini preparati sottu à un microscopiu fluorescente aduprendu un filtru verde (310-380 nm). L'imagine sò state scattate à un ingrandimentu 4x per capisce e relazioni Ct è a deposizione eccessiva di polimeri in a rete Ct.
A topografia di a superficia di NFRCS Ch è Cp hè stata determinata aduprendu un microscopiu à forza atomica (AFM) cù un cantilever TESP ultra-affilatu in modu di picchiettamentu: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. A rugosità di a superficia hè stata determinata da a radica quadratica media (RMS) aduprendu u software (Scanning Probe Image Processor). Diverse pusizioni NFRCS sò state rese nantu à l'imagine 3D per verificà l'uniformità di a superficia. A deviazione standard di u puntu per una data zona hè definita cum'è a rugosità di a superficia. L'equazione RMS hè stata aduprata per quantificà a rugosità di a superficia di NFRCS31.
Studi basati nantu à FESEM sò stati realizati cù FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, per capisce a morfologia superficiale di Ch NFRCS è Cp NFRCS, chì anu mostratu una BCT megliu cà Cm NFRCS. U studiu FESEM hè statu realizatu secondu u metudu discrittu da Zhao et al. 32 cù mudificazioni minori. NFRCS 20 à 30 mg Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati premiscelati cù 20 µl di citratu di sodiu à 3,8% premiscelatu cù sangue di rattu. 20 μl di CaCl2 0,2 ​​M hè statu aghjuntu à i campioni trattati cù u sangue per inizià a coagulazione è i campioni sò stati incubati à temperatura ambiente per 10 minuti. Inoltre, l'eritrociti in eccessu sò stati rimossi da a superficia di NFRCS sciacquendu cù soluzione salina.
I campioni successivi sò stati trattati cù 0,1% di glutaraldeide è dopu asciugati in un fornu à aria calda à 37 ° C per rimuovere l'umidità. I ​​campioni secchi sò stati rivestiti è analizzati 32. Altre immagini ottenute durante l'analisi eranu a furmazione di coaguli nantu à a superficia di e singole fibre di cuttone, a deposizione di polimeri trà Ct, a morfologia di l'eritrociti (forma), l'integrità di u coagulu è a morfologia di l'eritrociti in presenza di NFRCS. E zone NFRCS micca trattate è e zone NFRCS trattate cù Ch è Cp incubate cù u sangue sò state scansionate per ioni elementali (sodiu, potassiu, azotu, calciu, magnesiu, zincu, rame è seleniu) 33. Paragunate e percentuali di ioni elementali trà i campioni trattati è micca trattati per capisce l'accumulazione di ioni elementali durante a furmazione di coaguli è l'omogeneità di u coagulu.
U spessore di u rivestimentu superficiale Cp HFFC nantu à a superficia Ct hè statu determinatu cù FESEM. E sezioni trasversali di Cp NFRCS sò state tagliate da a struttura è rivestite per sputtering. I campioni di rivestimentu per sputtering risultanti sò stati osservati da FESEM è u spessore di u rivestimentu superficiale hè statu misuratu 34, 35, 36.
A micro-CT à raggi X furnisce imaghjini 3D non distruttive à alta risoluzione è permette di studià a disposizione strutturale interna di NFRK. A micro-CT usa un fasciu di raggi X chì passa per u campione per registrà u cuefficiente di attenuazione lineare lucale di i raggi X in u campione, ciò chì aiuta à ottene informazioni morfologiche. A situazione interna di Ct in Cp NFRCS è Cp NFRCS trattati cù sangue hè stata esaminata da micro-CT per capisce l'efficienza di assorbimentu è a coagulazione di u sangue in presenza di NFRCS37,38,39. E strutture 3D di i campioni Cp NFRCS trattati cù sangue è micca trattati sò state ricustruite cù micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Germania). Usendu u software VG STUDIO-MAX versione 2.2, parechje imaghjini à raggi X sò state pigliate da diversi anguli (idealmente una copertura di 360°) per sviluppà imaghjini 3D per NFRCS. I dati di pruiezione raccolti sò stati ricustruiti in imaghjini volumetriche 3D utilizendu u software currispundente 3D ScanIP Academic simplice.
Inoltre, per capisce a distribuzione di u coagulu, 20 µl di sangue citratu premiscelatu è 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M sò stati aghjunti à l'NFRCS per inizià a coagulazione di u sangue. I campioni preparati sò lasciati indurisce. A superficia NFRK hè stata trattata cù 0,5% glutaraldeide è asciugata in un fornu à aria calda à 30-40 °C per 30 minuti. U coagulu di sangue furmatu nantu à l'NFRCS hè statu scansionatu, ricustruitu è ​​una maghjina 3D di u coagulu di sangue hè stata visualizata.
I testi antibatterichi sò stati realizati nantu à Cp NFRCS (megliu paragunatu à Ch NFRCS) utilizendu u metudu discrittu prima cù mudificazioni minori. L'attività antibatterica di Cp NFRCS è Cp HFFC hè stata determinata utilizendu trè diversi microrganismi di prova [S.aureus (batteri gram-pusitivi), E.coli (batteri gram-negativi) è Candida bianca (C.albicans)] chì crescenu nantu à agar in piastre di Petri in un incubatore. Inoculà uniformemente 50 ml di a sospensione di cultura batterica diluita à una cuncentrazione di 105-106 CFU ml-1 nantu à u mezu agar. Versà u mezu in una piastra di Petri è lasciarla solidificà. I pozzetti sò stati fatti nantu à a superficia di a piastra d'agar per riempie cù HFFC (3 pozzetti per HFFC è 1 per u cuntrollu negativu). Aghjunghje 200 µl di HFFC à 3 pozzetti è 200 µl di PBS pH 7.4 à u 4u pozzettu. Da l'altra parte di a piastra di Petri, mette un discu Cp NFRCS di 12 mm nantu à l'agar solidificatu è inumidite cù PBS (pH 7,4). E pasticche di ciprofloxacina, ampicillina è fluconazole sò cunsiderate standard di riferimentu per Staphylococcus aureus, Escherichia coli è Candida albicans. Misurate manualmente a zona d'inibizione è pigliate una maghjina digitale di a zona d'inibizione.
Dopu l'approvazione etica istituzionale, u studiu hè statu realizatu à u Kasturba Medical College of Education and Research in Manipal, Karnataka, in u sudu di l'India. U protocolu sperimentale TEG in vitro hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu Eticu Istituzionale di u Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I sughjetti sò stati reclutati da donatori di sangue vuluntarii (di età trà 18 è 55 anni) da a banca di sangue di l'uspidale. Inoltre, un modulu di cunsensu infurmatu hè statu ottenutu da i vuluntarii per a raccolta di campioni di sangue. U TEG nativu (N-TEG) ​​hè statu utilizatu per studià l'effettu di a formulazione Cp HFFC nantu à u sangue interu premiscelatu cù citratu di sodiu. N-TEG hè largamente ricunnisciutu per u so rolu in a rianimazione à u puntu di cura, chì crea prublemi per i clinici per via di u putenziale di ritardu clinicamente significativu in i risultati (testi di coagulazione di rutina). L'analisi N-TEG hè stata realizata utilizendu sangue interu. U cunsensu infurmatu è una storia medica dettagliata sò stati ottenuti da tutti i participanti. U studiu ùn hà micca inclusu participanti cun cumplicazioni emostatiche o trombotiche cum'è a gravidanza/postpartum o malatie di u fegatu. I sughjetti chì pigliavanu medicinali chì affettanu a cascata di a coagulazione sò stati ancu esclusi da u studiu. I testi di laburatoriu di basa (emoglobina, tempu di protrombina, tromboplastina attivata è contu di piastrine) sò stati realizati nantu à tutti i participanti secondu e procedure standard. N-TEG determina a viscoelasticità di u coagulu di sangue, a struttura iniziale di u coagulu, l'interazzione di e particelle, u rinfurzamentu di u coagulu è a lisi di u coagulu. L'analisi N-TEG furnisce dati grafichi è numerichi nantu à l'effetti cullettivi di parechji elementi cellulari è plasma. L'analisi N-TEG hè stata realizata nantu à dui volumi diversi di Cp HFFC (10 µl è 50 µl). Di cunsiguenza, 1 ml di sangue interu cù acidu citricu hè statu aghjuntu à 10 μl di Cp HFFC. Aghjunghjite 1 ml (Cp HFFC + sangue citratu), 340 µl di sangue mischiatu à 20 µl di piastra TEG chì cuntene CaCl2 0,2 ​​M. In seguitu, e piastre TEG sò state caricate in TEG® 5000, US per misurà R, K, angulu alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% di i campioni di sangue in presenza di Cp HFFC41.
U protocolu di studiu in vivo hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu Istituziunale d'Etica Animale (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti l'esperimenti nantu à l'animali sò stati realizati in cunfurmità cù e raccomandazioni di u Cumitatu per u Cuntrollu è a Supervisione di a Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti i studii NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) sò stati realizati nantu à ratti Wistar femine (chì pesanu da 200 à 250 g). Tutti l'animali sò stati acclimatati à una temperatura di 24-26 °C, l'animali avianu accessu liberu à l'alimentu è l'acqua standard ad libitum. Tutti l'animali sò stati divisi à casu in diversi gruppi, ogni gruppu era custituitu da trè animali. Tutti i studii sò stati realizati in cunfurmità cù Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Prima di u studiu, l'animali sò stati anestetizzati per via intraperitoneale (ip) di una mistura di 20-50 mg di ketamina (per 1 kg di pesu corpu) è 2-10 mg di xilazina (per 1 kg di pesu corpu). Dopu à u studiu, u vulume di sanguinamentu hè statu calculatu valutendu a differenza trà u pesu iniziale è finale di i campioni, u valore mediu ottenutu da i trè testi hè statu pigliatu cum'è u vulume di sanguinamentu di u campione.
U mudellu d'amputazione di a coda di u rattu hè statu implementatu per capisce u putenziale di NFRCS per modulà u sanguinamentu in traumi, cumbattimentu o incidente stradale (mudellu di ferita). Tagliate u 50% di a coda cù una lama di bisturi è mette in aria per 15 secondi per assicurà un sanguinamentu nurmale. Inoltre, i campioni di prova sò stati posti nantu à a coda di un rattu applicendu pressione (Ct, Cs, Ch NFRCS è Cp NFRCS). Sanguinamentu è PCT sò stati segnalati per i campioni di prova (n = 3)17,45.
L'efficacità di u cuntrollu di a pressione NFRCS in u cumbattimentu hè stata studiata annantu à un mudellu di l'arteria femorale superficiale. L'arteria femorale hè esposta, perforata cù un trocar 24G, è sanguinata in 15 secondi. Dopu avè osservatu un sanguinamentu incontrollatu, u campione di prova hè piazzatu in u situ di puntura cù pressione applicata. Subitu dopu l'applicazione di u campione di prova, u tempu di coagulazione hè statu registratu è l'efficienza emostatica hè stata osservata per i prossimi 5 minuti. A stessa prucedura hè stata ripetuta cù Cs è Ct46.
Dowling et al. 47 anu prupostu un mudellu di ferita à u fegatu per valutà u putenziale emostaticu di i materiali emostatici in u cuntestu di u sanguinamentu intraoperatoriu. A BCT hè stata registrata per i campioni Ct (cuntrollu negativu), u quadru Cs (cuntrollu pusitivu), i campioni Ch NFRCS è i campioni Cp NFRCS. A vena cava supraepatica di u rattu hè stata esposta realizendu una laparotomia mediana. Dopu à quessa, a parte distale di u lobu sinistro hè stata tagliata cù e forbici. Fate una incisione in u fegatu cù una lama di bisturi è lasciate sanguinà per uni pochi di secondi. I campioni di test Ch NFRCS è Cp NFRCS pesati accuratamente sò stati piazzati nantu à a superficia dannighjata senza alcuna pressione pusitiva è a BCT hè stata registrata. U gruppu di cuntrollu (Ct) hà poi applicatu a pressione seguita da Cs 30 s47 senza rompe a ferita.
I testi di guarigione di e ferite in vivo sò stati realizati utilizendu un mudellu di ferita escisionale per valutà e proprietà di guarigione di e ferite di i NFRCS sviluppati à basa di polimeri. I mudelli di ferite escisionali sò stati selezziunati è realizati secondu i metudi publicati prima cù modifiche minori19,32,48. Tutti l'animali sò stati anestetizzati cum'è descrittu prima. Aduprate un punch di biopsia (12 mm) per fà una incisione prufonda circulare in a pelle di u spinu. I siti di ferite preparati sò stati vestiti cù Cs (cuntrollu pusitivu), Ct (riconoscendu chì i dischetti di cuttone interferiscenu cù a guarigione), Ch NFRCS è Cp NFRCS (gruppu sperimentale) è un cuntrollu negativu senza alcun trattamentu. Ogni ghjornu di u studiu, l'area di a ferita hè stata misurata in tutti i ratti. Aduprate una camera digitale per fà una foto di l'area di a ferita è mette una nova medicazione. A percentuale di chjusura di a ferita hè stata misurata da a seguente formula:
Basatu annantu à a percentuale di chjusura di a ferita u 12esimu ghjornu di u studiu, a pelle di rattu di u megliu gruppu hè stata escisa ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) è studiata per culurazione H&E è culurazione tricromica di Masson. Basatu annantu à a percentuale di chjusura di a ferita u 12esimu ghjornu di u studiu, a pelle di rattu di u megliu gruppu hè stata escisa ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) è studiata per culurazione H&E è culurazione tricromica di Masson.Basatu annantu à a percentuale di chjusura di a ferita à u 12esimu ghjornu di u studiu, a pelle di i ratti di u megliu gruppu ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) hè stata escisa è esaminata per culurazione cù ematossilina-eosina è tricromu di Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）I ratti in u megliu gruppu ((Cp NFRCS) è gruppi di cuntrollu) sò stati escisi per a culurazione cù ematossilina-eosina è a culurazione tricromica di Masson basata annantu à a percentuale di chjusura di a ferita u ghjornu 12 di u studiu.A prucedura di culurazione implementata hè stata realizata secondu i metudi descritti prima49,50. In breve, dopu a fissazione in formalina à 10%, i campioni sò stati disidratati utilizendu una seria d'alcooli graduati. Aduprate un microtomu per ottene sezioni sottili (5 µm di spessore) di u tissutu escisatu. Sezioni seriali sottili di cuntrolli è Cp NFRCS sò state trattate cù ematossilina è eosina per studià i cambiamenti istopatologichi. A culurazione tricromica di Masson hè stata aduprata per rilevà a furmazione di fibrille di collagene. I risultati ottenuti sò stati studiati à l'aveugla da i patologi.
A stabilità di i campioni Cp NFRCS hè stata studiata à temperatura ambiente (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) per 12 mesi51. Cp NFRCS (decolorazione di a superficia è crescita microbica) hè stata ispezionata visivamente è testata per a resistenza à l'usura di e piegature è u BCT secondu i metudi sopra descritti in a sezione Materiali è Metodi.
A scalabilità è a riproducibilità di Cp NFRCS sò state esaminate preparendu Cp NFRCS cù una dimensione di 15 × 15 cm2. Inoltre, sò stati escisi campioni di 30 mg (n = 5) da varie frazioni di Cp NFRCS è u BCT di i campioni studiati hè statu valutatu cum'è descrittu prima in a sezione Metodi.
Avemu pruvatu à sviluppà diverse forme è strutture aduprendu cumpusizioni Cp NFRCS per diverse applicazioni biomediche. Tali forme o cunfigurazioni includenu tamponi conici per sanguinamenti nasali, procedure dentali è tamponi cilindrici per sanguinamenti vaginali.
Tutti i gruppi di dati sò espressi cum'è media ± deviazione standard è sò stati analizati da ANOVA utilizendu Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) seguitu da u test di paragoni multipli di Bonferroni (*p<0.05).
Tutte e procedure realizate in studii umani eranu conformi à i standard di l'Istitutu è di u Cunsigliu Naziunale di Ricerca, è ancu à a Dichjarazione di Helsinki 1964 è e so successive mudificazioni, o standard etici simili. Tutti i participanti sò stati infurmati nantu à e caratteristiche di u studiu è a so natura vuluntaria. I dati di i participanti restanu cunfidenziali una volta raccolti. U protocolu sperimentale TEG in vitro hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu Eticu Istituziunale di u Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I vuluntarii anu firmatu u so accunsentu infurmatu per a raccolta di campioni di sangue.
Tutte e procedure realizate in i studii nantu à l'animali sò state realizate in cunfurmità cù a Facultà di Medicina Kastuba, Istitutu di l'Educazione Superiore di Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti l'esperimenti nantu à l'animali cuncipiti sò stati realizati in cunfurmità cù e linee guida di u Cumitatu per u Cuntrollu è a Supervisione di a Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti l'autori seguitanu e linee guida ARRIVE.
I spettri FTIR di tutti i NFRCS sò stati analizati è paragunati cù u spettru di chitosanu mostratu in a Figura 2A. Picchi spettrali caratteristici di u chitosanu (registrati) à 3437 cm-1 (allungamentu OH è NH, sovrapposizione), 2945 è 2897 cm-1 (allungamentu CH), 1660 cm-1 (deformazione NH2), 1589 cm-1 (flessione N–H), 1157 cm-1 (allungamentu di u ponte O-), 1067 cm-1 (allungamentu C–O, idrossile secundariu), 993 cm-1 (allungamentu CO, Bo-OH) 52,53,54. A Tavula Supplementare S1 mostra i valori di u spettru d'assorbimentu FTIR NFRCS per u chitosanu (reporter), chitosanu puru, Cm, Ch è Cp. I spettri FTIR di tutti i NFRCS (Cm, Ch è Cp) anu mostratu e stesse bande d'assorbimentu caratteristiche cum'è u chitosanu puru senza cambiamenti significativi (Fig. 2A). I risultati FTIR anu cunfirmatu l'assenza d'interazzione chimiche o fisiche trà i polimeri utilizati per sviluppà l'NFRCS, ciò chì indica chì i polimeri utilizati sò inerti.
Caratterizazione in vitro di Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS è Cs. (A) rapprisenta i spettri FTIR cumminati di e cumpusizioni di chitosanu è Cm NFRCS, Ch NFRCS è Cp NFRCS sottu cumpressione. (B) a) Tassa di assorbimentu di sangue interu di NFRCS Cm, Ch, Cp è Cg (n = 3); I campioni di Ct anu mostratu un BAR più altu perchè u tampone di cuttone hà una efficienza di assorbimentu più alta; b) Sangue dopu l'assorbimentu di sangue Illustrazione di u campione assurbitu. Rapprisentazione grafica di u BCT di u campione di prova C (Cp NFRCS avia u megliu BCT (15 s, n = 3)). I dati in C, D, E, è G sò stati mostrati cum'è media ± SD, è e barre d'errore rapprisentanu SD, *** p < 0,0001. I dati in C, D, E, è G sò stati mostrati cum'è media ± SD, è e barre d'errore rapprisentanu SD, *** p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей преднет отклонение, ***p <0,0001. I dati in C, D, E è G sò presentati cum'è media ± deviazione standard, è e barre d'errore rapprisentanu a deviazione standard, *** p <0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештносдестестно стандартное отклонение, ***p <0,0001. I dati in C, D, E è G sò mostrati cum'è media ± deviazione standard, e barre d'errore rapprisentanu a deviazione standard, *** p <0,0001.