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O sangramento descontrolado é uma das principais causas de morte. A obtenção de hemostasia rápida garante a sobrevivência do indivíduo, sendo um socorro essencial em situações de combate, acidentes de trânsito e operações de redução de mortes. Um arcabouço compósito reforçado com fibra nanoporosa (NFRCS), derivado de uma composição formadora de filme hemostático (HFFC) simples como fase contínua, pode desencadear e potencializar a hemostasia. O desenvolvimento do NFRCS baseia-se no design da asa da libélula. A estrutura da asa da libélula consiste em asas transversais e longitudinais, e as membranas das asas são conectadas entre si para manter a integridade da microestrutura. A HFFC reveste uniformemente a superfície da fibra com um filme de espessura nanométrica e conecta a espessura de algodão (Ct) distribuída aleatoriamente (fase dispersa) para formar uma estrutura nanoporosa. A combinação das fases contínua e dispersa reduz o custo do produto em dez vezes em comparação com produtos disponíveis comercialmente. O NFRCS modificado (tampões ou pulseiras) pode ser utilizado em diversas aplicações biomédicas. Estudos in vivo concluíram que o Cp NFRCS desenvolvido desencadeia e intensifica o processo de coagulação no local de aplicação. O NFRCS pode modular o microambiente e atuar em nível celular devido à sua estrutura nanoporosa, resultando em melhor cicatrização de feridas no modelo de ferida excisional.
O sangramento descontrolado durante combates, cirurgias e situações de emergência pode representar uma séria ameaça à vida do ferido¹. Essas condições levam a um aumento geral da resistência vascular periférica, resultando em choque hemorrágico. Medidas adequadas para controlar o sangramento durante e após a cirurgia são consideradas potencialmente fatais²,³. Lesões em grandes vasos sanguíneos causam perda maciça de sangue, resultando em uma taxa de mortalidade de ≤ 50% em combate e 31% durante cirurgias¹. A perda maciça de sangue leva a uma diminuição do volume corporal, o que reduz o débito cardíaco. O aumento da resistência vascular periférica total e a deterioração progressiva da microcirculação levam à hipóxia nos órgãos vitais. O choque hemorrágico pode ocorrer se a condição persistir sem intervenção eficaz¹,⁴,⁵. Outras complicações incluem a progressão da hipotermia e da acidose metabólica, bem como distúrbios de coagulação que impedem o processo de coagulação. O choque hemorrágico grave está associado a um risco maior de morte⁶,⁷,⁸. Em casos de choque de grau III (progressivo), a transfusão sanguínea é essencial para a sobrevivência do paciente durante a morbidade e mortalidade intraoperatórias e pós-operatórias. Para superar todas as situações de risco de vida descritas acima, desenvolvemos um arcabouço compósito reforçado com fibras nanoporosas (NFRCS) que utiliza uma concentração mínima de polímero (0,5%) por meio de uma combinação de polímeros hemostáticos solúveis em água.
Com o uso de reforço de fibra, é possível desenvolver produtos com boa relação custo-benefício. As fibras dispostas aleatoriamente assemelham-se à estrutura da asa de uma libélula, equilibrada pelas listras horizontais e verticais presentes nas asas. As nervuras transversais e longitudinais da asa comunicam-se com a membrana alar (Figura 1). O NFRCS consiste em Ct reforçado como um sistema de suporte com melhor resistência física e mecânica (Figura 1). Devido ao seu baixo custo e à facilidade de fabricação, os cirurgiões preferem utilizar fios de algodão (Ct) durante cirurgias e curativos. Portanto, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (que confere ao aprimoramento da atividade hemostática), o Ct foi usado como sistema esquelético de NFRCS9,10. Portanto, considerando seus múltiplos benefícios, incluindo > 90% de celulose cristalina (que confere ao aprimoramento da atividade hemostática), o Ct foi usado como sistema esquelético de NFRCS9,10. Provavelmente, você terá muitas chances de obter uma cobertura cristalina > 90% (участвует em повышении гемостатической активности), Ct ispolьзовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Portanto, dados os seus muitos benefícios, incluindo >90% de celulose cristalina (envolvida no aumento da atividade hemostática), o Ct foi usado como sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Portanto, dados os seus muitos benefícios, incluindo mais de 90% de celulose cristalina (que ajuda a melhorar a atividade hemostática), a Ct foi usada como suporte para NFRCS9,10.O Ct foi revestido superficialmente (observou-se a formação de um filme nanométrico) e interconectado com uma composição formadora de filme hemostático (HFFC). A HFFC atua como um Matrigel, mantendo as partículas de Ct dispostas aleatoriamente unidas. O design desenvolvido transmite a tensão dentro da fase dispersa (fibras de reforço). É difícil obter estruturas nanoporosas com boa resistência mecânica utilizando concentrações mínimas de polímero. Além disso, não é fácil personalizar diferentes moldes para diferentes aplicações biomédicas.
A figura mostra um diagrama do projeto NFRCS baseado na estrutura da asa da libélula (A). Esta imagem mostra uma analogia comparativa da estrutura da asa de uma libélula (as veias transversais e longitudinais da asa estão interconectadas) e uma fotomicrografia da seção transversal do NFRCS de Cp (B). Representação esquemática do NFRCS.
Os NFRCs foram desenvolvidos utilizando HFFC como fase contínua para superar as limitações mencionadas. O HFFC é composto por diversos polímeros hemostáticos formadores de filme, incluindo quitosana (como principal polímero hemostático) com metilcelulose (MC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC 50 cp) e álcool polivinílico (PVA) (125 kDa) como polímero de suporte que promove a formação de trombos. A adição de polivinilpirrolidona K30 (PVP K30) melhorou a capacidade de absorção de umidade dos NFRCs. O polietilenoglicol 400 (PEG 400) foi adicionado para melhorar a reticulação dos polímeros nas misturas poliméricas ligadas. Três composições hemostáticas diferentes de HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), nomeadamente quitosana com MC (Cm), quitosana com HPMC (Ch) e quitosana com PVA (Cp), foram aplicadas ao Ct. Diversos estudos de caracterização in vitro e in vivo confirmaram a atividade hemostática e cicatrizante de feridas do NFRCS. Os materiais compósitos oferecidos pelo NFRCS podem ser usados ​​para personalizar várias formas de suporte para atender a necessidades específicas.
Além disso, o NFRCS pode ser modificado como uma bandagem ou rolo para cobrir toda a área lesionada dos membros inferiores e outras partes do corpo. Especificamente para lesões nos membros decorrentes de combate, o design do NFRCS pode ser adaptado para cobrir metade do braço ou toda a perna (Figura Suplementar S11). O NFRCS pode ser transformado em uma pulseira com cola cirúrgica, que pode ser usada para estancar sangramentos em casos de lesões graves no pulso causadas por suicídio. Nosso principal objetivo é desenvolver um NFRCS com a menor quantidade possível de polímero, que possa ser distribuído para uma grande parcela da população (abaixo da linha da pobreza) e que possa ser incluído em um kit de primeiros socorros. Simples, eficiente e econômico, o NFRCS beneficia comunidades locais e pode ter um impacto global.
Quitosana (peso molecular 80 kDa) e amaranto foram adquiridos da Merck, Índia. Hidroxipropilmetilcelulose 50 Cp, polietilenoglicol 400 e metilcelulose foram adquiridos da Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Álcool polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90% hidrolisado) foi adquirido da National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirrolidona K30 foi adquirida da Molychem, Mumbai, e swabs estéreis foram adquiridos da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, com água Milli-Q (sistema de purificação de água Direct-Q3, Merck, Índia) como veículo.
O NFRCS foi desenvolvido utilizando um método de liofilização^11,12. Todas as composições de HFFC (Tabela 1) foram preparadas utilizando um agitador mecânico. Prepare uma solução de quitosana a 0,5% utilizando ácido acético a 1% em água, sob agitação contínua a 800 rpm em um agitador mecânico. A massa exata do polímero carregado, indicada na Tabela 1, foi adicionada à solução de quitosana e agitada até a obtenção de uma solução polimérica límpida. PVP K30 e PEG 400 foram adicionados à mistura resultante nas quantidades indicadas na Tabela 1, e a agitação foi continuada até a obtenção de uma solução polimérica viscosa e límpida. O banho de solução polimérica resultante foi sonicado por 60 minutos para remover as bolhas de ar aprisionadas na mistura polimérica. Como mostrado na Figura Suplementar S1(b), o Ct foi distribuído uniformemente em cada poço de uma placa de 6 poços (molde) suplementada com 5 ml de HFFC.
A placa de seis poços foi sonicada por 60 minutos para obter umectação e distribuição uniformes do HFFC na rede de Ct. Em seguida, a placa de seis poços foi congelada a -20°C por 8 a 12 horas. As placas congeladas foram liofilizadas por 48 horas para obter diversas formulações de NFRCS. O mesmo procedimento é utilizado para produzir diferentes formatos e estruturas, como tampões ou tampões cilíndricos, ou qualquer outro formato para diferentes aplicações.
Uma quantidade precisamente pesada de quitosana (80 kDa) (3%) foi dissolvida em ácido acético a 1% utilizando um agitador magnético. À solução de quitosana resultante, adicionou-se PEG 400 a 1% e agitou-se por 30 minutos. A solução resultante foi vertida em um recipiente quadrado ou retangular e congelada a -80 °C por 12 horas. As amostras congeladas foram liofilizadas por 48 horas para obtenção do Cs13 poroso.
O NFRCS desenvolvido foi submetido a experimentos utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tóquio, Japão) para confirmar a compatibilidade química da quitosana com outros polímeros14,15. Os espectros de FTIR (largura da faixa espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas as amostras testadas foram obtidos realizando 32 varreduras.
A taxa de absorção sanguínea (TAS) para todas as formulações foi avaliada utilizando o método descrito por Chen et al.¹⁶ com ligeiras modificações. Os NFRKs desenvolvidos, de todas as composições, foram secos em estufa a vácuo a 105 °C durante a noite para remoção do solvente residual. 30 mg de NFRCS (peso inicial da amostra – W0) e 30 mg de Ct (controle positivo) foram colocados em placas separadas contendo uma pré-mistura de citrato de sódio a 3,8%. Em intervalos de tempo predeterminados, ou seja, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 segundos, os NFRCS foram removidos e suas superfícies limpas do sangue não absorvido, colocando as amostras sobre Ct por 30 segundos. O peso final de sangue absorvido pelo NFRCS¹⁶ foi considerado (W1) em cada ponto de tempo. Calcule a porcentagem de TAS utilizando a seguinte fórmula:
O tempo de coagulação sanguínea (TCS) foi determinado conforme descrito por Wang et al.¹⁷. O tempo necessário para a coagulação do sangue total (sangue de rato pré-misturado com citrato de sódio a 3,8%) na presença de NFRCS foi calculado como o TCS da amostra. Os diversos componentes de NFRCS (30 mg) foram colocados em frascos de 10 ml com tampa de rosca e incubados a 37 °C. Adicionou-se 0,5 ml de sangue ao frasco e 0,3 ml de CaCl₂ 0,2 M para ativar a coagulação sanguínea. Por fim, o frasco foi invertido a cada 15 segundos (até 180°) até a formação de um coágulo firme. O TCS da amostra foi estimado pelo número de inversões do frasco^17,18. Com base no TCS, duas composições ótimas de NFRCS (Cm, Ch e Cp) foram selecionadas para estudos de caracterização adicionais.
O tempo de coagulação sanguínea (TCS) das composições de Ch NFRCS e Cp NFRCS foi determinado implementando-se o método descrito por Li et al.¹⁹. Amostras de 15 x 15 mm² de Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controle positivo) foram colocadas em placas de Petri separadas (37 °C). Sangue contendo 3,8% de citrato de sódio foi misturado com CaCl₂ 0,2 M em uma proporção de 10:1 (v/v) para iniciar o processo de coagulação. Vinte microlitros da mistura de sangue de rato com CaCl₂ 0,2 M foram aplicados na superfície da amostra e colocados em uma placa de Petri vazia. O controle consistiu em sangue vertido em placas de Petri vazias sem Ct. Em intervalos fixos de 0, 3 e 5 minutos, a coagulação foi interrompida pela adição de 10 ml de água deionizada (DI) à amostra na placa, sem perturbar o coágulo. Eritrócitos não coagulados (eritrócitos) sofrem hemólise na presença de água deionizada e liberam hemoglobina. A hemoglobina em diferentes momentos (HA(t)) foi medida a 540 nm (λmax da hemoglobina) usando um espectrofotômetro UV-Vis. A absorção absoluta da hemoglobina (AH(0)) no tempo 0 de 20 µl de sangue em 10 ml de água deionizada foi considerada como padrão de referência. A captação relativa de hemoglobina (RHA) do sangue coagulado foi calculada a partir da razão HA(t)/HA(0) usando o mesmo lote de sangue.
Utilizando um analisador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), as propriedades adesivas do NFRK ao tecido danificado foram determinadas. Uma placa cilíndrica com fundo aberto foi pressionada contra a parte interna da pele de porco (sem a camada de gordura). As amostras (NFRCS Ch e NFRCS Cp) foram aplicadas por meio de cânula nos moldes cilíndricos para criar adesão à pele do porco. Após 3 minutos de incubação à temperatura ambiente (25 °C), a força adesiva do NFRCS foi registrada a uma taxa constante de 0,5 mm/s.
A principal função dos selantes cirúrgicos é aumentar a coagulação sanguínea, reduzindo a perda de sangue. A coagulação sem perdas em NFRCS foi avaliada utilizando um método previamente publicado com ligeiras modificações¹⁹. Confeccionou-se um tubo de microcentrífuga (2 ml) (diâmetro interno de 10 mm) com um orifício de 8 × 5 mm² em uma das extremidades (representando uma ferida aberta). O NFRCS foi utilizado para fechar a abertura e fita adesiva foi usada para selar as bordas externas. Adicionaram-se 20 µl de CaCl₂ 0,2 M ao tubo de microcentrífuga contendo a pré-mistura de citrato de sódio a 3,8%. Após 10 minutos, os tubos de microcentrífuga foram removidos das placas de cultura e o aumento de massa das placas foi determinado devido ao extravasamento de sangue do NFRCS (n = 3). A perda de sangue em NFRCS com coagulação (Ch NFRCS) e em NFRCS com coagulação (Cp NFRCS) foi comparada com a perda de sangue em NFRCS com coagulação (Cs).
A integridade em meio úmido do NFRCS foi determinada com base no método descrito por Mishra e Chaudhary21, com pequenas modificações. Coloque o NFRCS em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 50 ml de água e agite por 60 segundos sem formar uma borda. A inspeção visual e a priorização das amostras quanto à integridade física foram baseadas na ordem de coleta.
A força de ligação do HFFC ao Ct foi estudada utilizando métodos previamente publicados com pequenas modificações. A integridade do revestimento superficial foi avaliada expondo o NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) na presença de água Milli-Q (Ct). Os NFRCS Ch e Cp desenvolvidos foram colocados em um béquer contendo água e sonicados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 minutos, respectivamente. Após a secagem, a diferença percentual entre o peso inicial e final do NFRCS foi utilizada para calcular a porcentagem de perda de material (HFFC). O teste de coagulação sanguínea in vitro corroborou a força de ligação ou a perda de materiais superficiais. A eficiência da ligação do HFFC ao Ct proporciona coagulação sanguínea e um revestimento elástico na superfície do Ct22.
A homogeneidade do NFRCS desenvolvido foi determinada pelo BCT de amostras (30 mg) retiradas de locais gerais selecionados aleatoriamente no NFRCS. Siga o procedimento de BCT mencionado anteriormente para determinar a conformidade do NFRCS. A proximidade entre todas as cinco amostras garante cobertura uniforme da superfície e deposição de HFFC na malha de Ct.
A área nominal de contato sanguíneo (NBCA) foi determinada conforme relatado anteriormente, com algumas modificações. O sangue foi coagulado pela aplicação de 20 µl de sangue entre as duas superfícies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. Após 1 hora, as duas partes do stent foram separadas e a área do coágulo foi medida manualmente. O valor médio de três repetições foi considerado NBCA NFRCS19.
A análise de Sorção Dinâmica de Vapor (DVS) foi utilizada para avaliar a eficácia do NFRCS na absorção de água do ambiente externo ou do local da lesão responsável por iniciar a coagulação. A DVS avalia ou registra a absorção e a perda de vapor em uma amostra gravimetricamente, utilizando uma balança ultrassensível com resolução de massa de ±0,1 µg. Uma pressão parcial de vapor (umidade relativa) é gerada por um controlador eletrônico de fluxo de massa ao redor da amostra, através da mistura de gases de arraste saturados e secos. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p – não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2–15% moderadamente higroscópicas e > 15% muito higroscópicas)23. De acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia, com base na porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram categorizadas em 4 categorias (0–0,012% p/p – não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2–15% moderadamente higroscópicas e > 15% muito higroscópicas)23.De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, dependendo da porcentagem de absorção de umidade pelas amostras, as amostras foram divididas em 4 categorias (0–0,012% p/p – não higroscópicas, 0,2–2% p/p ligeiramente higroscópicas, 2–15%).% умеренно гигроскопичен e > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico e > 15% muito higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15%非常吸湿）23。De acordo com as recomendações da Farmacopeia Europeia, as amostras são divididas em 4 classes, dependendo da porcentagem de umidade absorvida pela amostra (0-0,012% em peso – não higroscópica, 0,2-2% em peso – ligeiramente higroscópica, 2-15% em peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15% muito higroscópico) 23.A eficiência higroscópica do NFCS X NFCS e do TsN NFCS foi determinada em um analisador DVS TA TGA Q5000 SA. Durante esse processo, foram obtidos o tempo de execução, a umidade relativa (UR) e a massa da amostra em tempo real a 25 °C. O teor de umidade foi calculado por meio de uma análise precisa da massa do NFCS utilizando a seguinte equação:
MC é a umidade medida pelo NFRCS. m1 – peso seco dos AINEs. m2 é a massa medida pelo NFRCS em tempo real para uma determinada umidade relativa.
A área superficial total foi estimada utilizando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após o esvaziamento das amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). A área superficial total foi estimada utilizando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após o esvaziamento das amostras a 25 °C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Use o plano de teste para obter a melhor experiência possível para obter uma boa experiência опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A área superficial total foi estimada utilizando um experimento de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após as amostras serem esvaziadas a 25°C por 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Mais de 25°C Use o plano de teste de atualização com os testes disponíveis para adsolução de imagem азотом после опорожнения образцов в temperatura 10 horas por 25°C (< 7 × 10-3 temperatura). A área superficial total foi estimada utilizando experimentos de adsorção de nitrogênio com nitrogênio líquido após as amostras serem esvaziadas por 10 horas a 25°C (< 7 x 10-3 torr).A área superficial total, o volume de poros e o tamanho dos poros NFRCS foram determinados com um Quantachrome da NOVA 1000e, Áustria, usando o software RS 232.
Prepare uma solução de 5% de hemácias (solução salina como diluente) a partir de sangue total. Em seguida, transfira uma alíquota de HFFC (0,25 ml) para uma placa de 96 poços, juntamente com 0,1 ml da massa de hemácias a 5%. Incube a mistura a 37 °C por 40 minutos. Uma mistura de hemácias e soro foi utilizada como controle positivo e uma mistura de solução salina e hemácias como controle negativo. A hemaglutinação foi determinada de acordo com a escala de Stajitzky. A escala proposta é a seguinte: + + + + agregados granulares densos; + + + almofadas lisas no fundo com bordas curvas; + + almofadas lisas no fundo com bordas rasgadas; + anéis vermelhos estreitos ao redor das bordas das almofadas lisas; – (negativo) botão vermelho discreto 12 no centro do poço inferior.
A hemocompatibilidade do NFRCS foi estudada de acordo com o método da Organização Internacional de Normalização (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. O método gravimétrico descrito por Singh et al. foi utilizado. Pequenas modificações foram feitas para avaliar a formação de trombos na presença ou na superfície do NFRCS. 500 mg de NFRCS de Cs, Ch e Cp foram incubados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 24 horas a 37 °C. Após 24 horas, o PBS foi removido e o NFRCS foi tratado com 2 ml de sangue contendo 3,8% de citrato de sódio. Na superfície do NFRCS, foram adicionados 0,04 ml de CaCl2 0,1 M às amostras incubadas. Após 45 minutos, 5 ml de água destilada foram adicionados para interromper a coagulação. O sangue coagulado na superfície do NFRCS foi tratado com solução de formaldeído a 36-38%. Os coágulos fixados com formaldeído foram secos e pesados. A porcentagem de trombose foi estimada calculando-se o peso do recipiente sem sangue e da amostra (controle negativo) e do recipiente com sangue (controle positivo).
Como confirmação inicial, as amostras foram visualizadas em microscópio óptico para compreender a capacidade do revestimento superficial HFFC, da interconexão Ct e da rede Ct em formar poros. Seções finas de Ch e Cp do NFRCS foram recortadas com uma lâmina de bisturi. A seção resultante foi colocada em uma lâmina de vidro, coberta com uma lamínula e as bordas foram fixadas com cola. As lâminas preparadas foram visualizadas em microscópio óptico e fotografias foram tiradas em diferentes ampliações.
A deposição de polímero em redes Ct foi visualizada usando microscopia de fluorescência com base no método descrito por Rice et al.29. A composição HFFC utilizada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto), e os NFRCS (Ch e Cp) foram preparados conforme o método mencionado anteriormente. A composição HFFC utilizada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto), e os NFRCS (Ch e Cp) foram preparados conforme o método mencionado anteriormente.A composição HFFC utilizada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (amaranto) e o NFRCS (Ch e Cp) foi obtido de acordo com o método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。A composição HFFC usada na formulação foi misturada com um corante fluorescente (Amaranto) e recebeu NFRCS (Ch e Cp), como mencionado anteriormente.Seções finas de NFRK foram cortadas das amostras obtidas, colocadas em lâminas de vidro e cobertas com lamínulas. As lâminas preparadas foram observadas em um microscópio de fluorescência utilizando um filtro verde (310-380 nm). As imagens foram capturadas com ampliação de 4x para compreender as relações de Ct e o excesso de deposição de polímero na rede de Ct.
A topografia da superfície de NFRCS Ch e Cp foi determinada utilizando um microscópio de força atômica (AFM) com uma ponta de prova TESP ultra-afiada no modo de contato intermitente: 42 N/m, 320 kHz, raio de curvatura de 2-5 nm, Bruker, Taiwan. A rugosidade da superfície foi determinada pelo método da raiz quadrada média (RMS) utilizando o software Scanning Probe Image Processor. Diversas localizações de NFRCS foram renderizadas em imagens 3D para verificar a uniformidade da superfície. O desvio padrão do valor para uma determinada área é definido como a rugosidade da superfície. A equação RMS foi utilizada para quantificar a rugosidade da superfície de NFRCS31.
Estudos baseados em FESEM foram realizados utilizando um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo (FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tóquio) para compreender a morfologia da superfície de NFRCS de quitosana (Ch NFRCS) e de celulose (Cp NFRCS), que apresentaram melhor BCT (coeficiente de coagulação) do que o NFRCS de celulose microcristalina (Cm NFRCS). O estudo de FESEM foi realizado de acordo com o método descrito por Zhao et al.³², com pequenas modificações. De 20 a 30 mg de NFRCS de Ch NFRCS e de Cp NFRCS foram pré-misturados com 20 µl de citrato de sódio a 3,8% previamente misturado com sangue de rato. 20 µl de CaCl₂ 0,2 M foram adicionados às amostras tratadas com sangue para iniciar a coagulação, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Além disso, o excesso de eritrócitos foi removido da superfície do NFRCS por lavagem com solução salina.
As amostras subsequentes foram tratadas com glutaraldeído a 0,1% e, em seguida, secas em estufa de ar quente a 37 °C para remoção da umidade. As amostras secas foram revestidas e analisadas³². Outras imagens obtidas durante a análise incluíram a formação de coágulos na superfície de fibras individuais de algodão, a deposição de polímero entre as fibras de algodão, a morfologia (formato) dos eritrócitos, a integridade do coágulo e a morfologia dos eritrócitos na presença de NFRCS. Áreas de NFRCS não tratadas e áreas de NFRCS tratadas com Ch e Cp, incubadas com sangue, foram analisadas quanto à presença de íons elementares (sódio, potássio, nitrogênio, cálcio, magnésio, zinco, cobre e selênio)³³. A comparação das porcentagens de íons elementares entre as amostras tratadas e não tratadas permitiu compreender o acúmulo de íons elementares durante a formação do coágulo e a homogeneidade do mesmo.
A espessura do revestimento superficial de Cp HFFC na superfície de Ct foi determinada usando FESEM. As seções transversais de Cp NFRCS foram cortadas da estrutura e revestidas por pulverização catódica. As amostras de revestimento por pulverização catódica resultantes foram observadas por FESEM e a espessura do revestimento superficial foi medida 34, 35, 36.
A microtomografia computadorizada (micro-CT) de raios X fornece imagens 3D não destrutivas de alta resolução e permite estudar o arranjo estrutural interno do NFRK. A micro-CT utiliza um feixe de raios X que atravessa a amostra para registrar o coeficiente de atenuação linear local dos raios X na amostra, o que auxilia na obtenção de informações morfológicas. A localização interna do Ct no Cp NFRCS e no Cp NFRCS tratado com sangue foi examinada por micro-CT para compreender a eficiência de absorção e a coagulação sanguínea na presença do NFRCS37,38,39. As estruturas 3D das amostras de Cp NFRCS tratadas e não tratadas com sangue foram reconstruídas utilizando micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Alemanha). Utilizando o software VG STUDIO-MAX versão 2.2, diversas imagens de raios X foram obtidas de diferentes ângulos (idealmente com cobertura de 360°) para desenvolver imagens 3D do NFRCS. Os dados de projeção coletados foram reconstruídos em imagens volumétricas 3D utilizando o software 3D ScanIP Academic.
Além disso, para compreender a distribuição do coágulo, 20 µl de sangue citratado pré-misturado e 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M foram adicionados ao NFRCS para iniciar a coagulação sanguínea. As amostras preparadas foram deixadas endurecer. A superfície do NFRK foi tratada com glutaraldeído a 0,5% e seca em estufa de ar quente a 30–40 °C por 30 min. O coágulo sanguíneo formado no NFRCS foi escaneado, reconstruído e uma imagem 3D do coágulo foi visualizada.
Ensaios antibacterianos foram realizados com Cp NFRCS (melhor comparado a Ch NFRCS) utilizando o método previamente descrito com pequenas modificações. A atividade antibacteriana de Cp NFRCS e Cp HFFC foi determinada utilizando três microrganismos diferentes [S. aureus (bactéria gram-positiva), E. coli (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (Candida branca)] cultivados em ágar em placas de Petri em uma incubadora. Inoculou-se uniformemente 50 ml da suspensão da cultura bacteriana diluída a uma concentração de 10⁵-10⁶ UFC ml⁻¹ no meio de ágar. O meio foi vertido em uma placa de Petri e deixado solidificar. Foram feitos poços na superfície da placa de ágar para serem preenchidos com HFFC (3 poços para HFFC e 1 para o controle negativo). Adicionaram-se 200 µl de HFFC a 3 poços e 200 µl de PBS pH 7,4 ao 4º poço. Do outro lado da placa de Petri, coloque um disco de 12 mm de Cp NFRCS sobre o ágar solidificado e umedeça com PBS (pH 7,4). Os comprimidos de ciprofloxacina, ampicilina e fluconazol são considerados padrões de referência para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Meça a zona de inibição manualmente e tire uma foto digital da mesma.
Após aprovação ética institucional, o estudo foi conduzido no Kasturba Medical College of Education and Research em Manipal, Karnataka, no sul da Índia. O protocolo experimental de TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI: 674/2020). Os participantes foram recrutados entre doadores de sangue voluntários (com idades entre 18 e 55 anos) do banco de sangue do hospital. Além disso, um termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido dos voluntários para a coleta de amostras de sangue. O TEG nativo (N-TEG) ​​foi utilizado para estudar o efeito da formulação Cp HFFC em sangue total pré-misturado com citrato de sódio. O N-TEG é amplamente reconhecido por seu papel na ressuscitação no local de atendimento, o que cria problemas para os médicos devido ao potencial de atraso clinicamente significativo nos resultados (testes de coagulação de rotina). A análise de N-TEG foi realizada utilizando sangue total. O consentimento livre e esclarecido e o histórico médico detalhado foram obtidos de todos os participantes. O estudo não incluiu participantes com complicações hemostáticas ou trombóticas, como gravidez/pós-parto ou doença hepática. Indivíduos que utilizavam medicamentos que afetam a cascata de coagulação também foram excluídos do estudo. Exames laboratoriais básicos (hemoglobina, tempo de protrombina, tromboplastina parcial ativada e contagem de plaquetas) foram realizados em todos os participantes de acordo com os procedimentos padrão. A N-TEG determina a viscoelasticidade do coágulo sanguíneo, a estrutura inicial do coágulo, a interação entre partículas, o fortalecimento do coágulo e a lise do coágulo. A análise N-TEG fornece dados gráficos e numéricos sobre os efeitos coletivos de diversos elementos celulares e do plasma. A análise N-TEG foi realizada em dois volumes diferentes de Cp HFFC (10 µl e 50 µl). Para isso, 1 ml de sangue total com ácido cítrico foi adicionado a 10 µl de Cp HFFC. Em seguida, adicionou-se 1 ml (Cp HFFC + sangue citratado), seguido de 340 µl de sangue misturado, a 20 µl de CaCl₂ 0,2 M na placa de TEG. Em seguida, as placas TEG foram carregadas no TEG® 5000, EUA, para medir R, K, ângulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY em 30% das amostras de sangue na presença de Cp HFFC41.
O protocolo do estudo in vivo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Medicina Kasturba, Instituto de Ensino Superior de Manipal, Manipal (CEUA/KMC/69/2020). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Comitê para o Controle e Supervisão da Experimentação Animal (CPCSEA). Todos os estudos in vivo de NFRCS (2 × 2 cm²) foram realizados em ratas Wistar (pesando de 200 a 250 g). Todos os animais foram aclimatados a uma temperatura de 24-26 °C e tiveram livre acesso a ração e água ad libitum. Os animais foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos, cada grupo composto por três animais. Todos os estudos foram realizados de acordo com o Relatório de Estudos com Animais: Experimentos In Vivo 43. Antes do estudo, os animais foram anestesiados por administração intraperitoneal (ip) de uma mistura de 20-50 mg de cetamina (por kg de peso corporal) e 2-10 mg de xilazina (por kg de peso corporal). Após o estudo, o volume de sangramento foi calculado avaliando-se a diferença entre o peso inicial e final das amostras, sendo o valor médio obtido a partir de três medições considerado como o volume de sangramento da amostra.
O modelo de amputação da cauda de rato foi implementado para compreender o potencial do NFRCS em modular o sangramento em casos de trauma, combate ou acidente de trânsito (modelo de lesão). Cinquenta por cento da cauda foi cortada com uma lâmina de bisturi e deixada ao ar por 15 segundos para garantir um sangramento normal. Além disso, amostras de teste foram colocadas na cauda de um rato aplicando-se pressão (NFRCS Ct, Cs, Ch e NFRCS Cp). O sangramento e o PCT foram relatados para as amostras de teste (n = 3)17,45.
A eficácia do controle de pressão NFRCS em combate foi investigada em um modelo da artéria femoral superficial. A artéria femoral é exposta, puncionada com um trocarte 24G e sangrada em 15 segundos. Após a observação de sangramento descontrolado, a amostra de teste é colocada no local da punção com aplicação de pressão. Imediatamente após a aplicação da amostra de teste, o tempo de coagulação foi registrado e a eficiência hemostática foi observada nos 5 minutos seguintes. O mesmo procedimento foi repetido com Cs e Ct46.
Dowling et al.⁴⁷ propuseram um modelo de lesão hepática para avaliar o potencial hemostático de materiais hemostáticos no contexto de sangramento intraoperatório. O tempo de contato hemostático (TCH) foi registrado para amostras de Ct (controle negativo), estrutura de Cs (controle positivo), amostras de Ch NFRCS e amostras de Cp NFRCS. A veia cava supra-hepática do rato foi exposta por meio de laparotomia mediana. Em seguida, a parte distal do lobo esquerdo foi removida com tesoura. Uma incisão foi feita no fígado com uma lâmina de bisturi e deixada sangrar por alguns segundos. Amostras de teste de Ch NFRCS e Cp NFRCS, pesadas com precisão, foram colocadas sobre a superfície lesada sem qualquer pressão positiva e o TCH foi registrado. No grupo controle (Ct), foi aplicada pressão seguida da aplicação de Cs 30 s47 sem romper a lesão.
Ensaios de cicatrização de feridas in vivo foram realizados utilizando um modelo de ferida excisional para avaliar as propriedades cicatrizantes dos NFRCSs à base de polímero desenvolvidos. Os modelos de feridas excisionais foram selecionados e realizados de acordo com métodos previamente publicados, com pequenas modificações^19,32,48. Todos os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente. Utilizou-se um punch de biópsia (12 mm) para fazer uma incisão circular profunda na pele das costas. Os locais da ferida preparados foram cobertos com Cs (controle positivo), Ct (considerando que compressas de algodão interferem na cicatrização), NFRCS Ch e NFRCS Cp (grupo experimental) e um controle negativo sem qualquer tratamento. Diariamente, a área da ferida foi medida em todos os ratos. Uma câmera digital foi utilizada para fotografar a área da ferida e um novo curativo foi aplicado. A porcentagem de fechamento da ferida foi calculada pela seguinte fórmula:
Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele dos ratos do melhor grupo (Cp NFRCS e grupo controle) foi excisada e estudada por coloração H&E e tricrômico de Masson. Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele dos ratos do melhor grupo (Cp NFRCS e grupo controle) foi excisada e estudada por coloração H&E e tricrômico de Masson.Com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo, a pele dos ratos do melhor grupo ((Cp NFRCS) e do grupo controle) foi excisada e examinada por coloração com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Os ratos do melhor grupo ((Cp NFRCS) e dos grupos de controle) foram submetidos a excisão para coloração com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson, com base na porcentagem de fechamento da ferida no 12º dia do estudo.O procedimento de coloração implementado foi realizado de acordo com métodos previamente descritos49,50. Resumidamente, após a fixação em formalina a 10%, as amostras foram desidratadas utilizando uma série de álcoois em concentrações crescentes. Utilizou-se um micrótomo para obter cortes finos (5 µm de espessura) do tecido excisado. Cortes seriados finos dos controles e dos Cp NFRCS foram tratados com hematoxilina e eosina para o estudo das alterações histopatológicas. A coloração tricrômica de Masson foi utilizada para detectar a formação de fibrilas de colágeno. Os resultados obtidos foram analisados ​​às cegas por patologistas.
A estabilidade das amostras de Cp NFRCS foi estudada à temperatura ambiente (25°C ± 2°C/60% UR ± 5%) durante 12 meses51. O Cp NFRCS (descoloração da superfície e crescimento microbiano) foi inspecionado visualmente e testado quanto à resistência ao desgaste por dobra e BCT de acordo com os métodos descritos na seção Materiais e Métodos.
A escalabilidade e a reprodutibilidade do Cp NFRCS foram examinadas preparando-se amostras de Cp NFRCS com dimensões de 15×15 cm². Além disso, amostras de 30 mg (n = 5) foram extraídas de várias frações de Cp NFRCS e o BCT das amostras estudadas foi avaliado conforme descrito anteriormente na seção Métodos.
Tentamos desenvolver diversas formas e estruturas utilizando composições de Cp NFRCS para várias aplicações biomédicas. Essas formas ou configurações incluem cotonetes cônicos para sangramentos nasais e procedimentos odontológicos, e cotonetes cilíndricos para sangramento vaginal.
Todos os conjuntos de dados são expressos como média ± desvio padrão e foram analisados ​​por ANOVA usando o Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA), seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni (*p<0,05).
Todos os procedimentos realizados em estudos com seres humanos estiveram em conformidade com os padrões do Instituto e do Conselho Nacional de Pesquisa, bem como com a Declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas subsequentes, ou padrões éticos similares. Todos os participantes foram informados sobre as características do estudo e sua natureza voluntária. Os dados dos participantes permanecem confidenciais após a coleta. O protocolo experimental de TEG in vitro foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI: 674/2020). Os voluntários assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de amostras de sangue.
Todos os procedimentos realizados em estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Faculdade de Medicina de Kastuba, Instituto de Ensino Superior de Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos os experimentos com animais foram planejados e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê para o Controle e Supervisão da Experimentação Animal (CPCSEA). Todos os autores seguem as diretrizes ARRIVE.
Os espectros FTIR de todos os NFRCS foram analisados ​​e comparados com o espectro da quitosana mostrado na Figura 2A. Picos espectrais característicos da quitosana (registrados) em 3437 cm-1 (estiramento OH e NH, sobreposição), 2945 e 2897 cm-1 (estiramento CH), 1660 cm-1 (deformação NH2), 1589 cm-1 (flexão N–H), 1157 cm-1 (estiramento da ponte O-), 1067 cm-1 (estiramento C–O, hidroxila secundária), 993 cm-1 (estiramento CO, Bo-OH). A Tabela Suplementar S1 mostra os valores do espectro de absorção FTIR dos NFRCS para quitosana (repórter), quitosana pura, Cm, Ch e Cp. Os espectros de FTIR de todos os NFRCS (Cm, Ch e Cp) apresentaram as mesmas bandas de absorção características da quitosana pura, sem alterações significativas (Fig. 2A). Os resultados de FTIR confirmaram a ausência de interações químicas ou físicas entre os polímeros utilizados no desenvolvimento dos NFRCS, indicando que os polímeros utilizados são inertes.
Caracterização in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. (A) Representa os espectros FTIR combinados das composições de quitosana e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sob compressão. (B) a) Taxa de absorção de sangue total de NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3); as amostras Ct apresentaram um BAR maior porque o cotonete tem uma eficiência de absorção maior; b) Sangue após a absorção. Ilustração da amostra absorvida. Representação gráfica do BCT da amostra de teste C (Cp NFRCS apresentou o melhor BCT (15 s, n = 3)). Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam o DP, ***p < 0,0001. Os dados em C, D, E e G foram apresentados como média ± DP, e as barras de erro representam o DP, ***p < 0,0001. Os ajustes em C, D, E e G são adequados para o padrão ± abertura padrão e uma placa de configuração classificação padrão, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são apresentados como média ± desvio padrão, e as barras de erro representam o desvio padrão, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Os ajustes em C, D, E e G são adequados para o ajuste correto ± abertura padrão, pranchas de ajuste padrão abertura padrão, ***p <0,0001. Os dados em C, D, E e G são apresentados como média ± desvio padrão, as barras de erro representam o desvio padrão, ***p<0,0001.