Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A hemorraxia incontrolada é unha das principais causas de morte. Lograr unha hemostase rápida garante a supervivencia do suxeito como primeiros auxilios durante o combate, os accidentes de tráfico e as operacións de redución de mortes. O armazón composto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS) derivado dunha composición formadora de película hemostática simple (HFFC) como fase continua pode desencadear e mellorar a hemostase. O desenvolvemento do NFRCS baséase no deseño da á da libélula. A estrutura da á da libélula consta de ás transversais e lonxitudinais, e as membranas das ás están conectadas entre si para manter a integridade da microestrutura. O HFFC recubre uniformemente a superficie da fibra cunha película de espesor nanométrico e conecta o espesor do algodón (Ct) distribuído aleatoriamente (fase dispersa) para formar unha estrutura nanoporosa. A combinación de fases continuas e dispersas reduce o custo do produto dez veces en comparación cos produtos dispoñibles comercialmente. Os NFRCS modificados (tampóns ou pulseiras) pódense usar nunha variedade de aplicacións biomédicas. Os estudos in vivo concluíron que o NFRCS Cp desenvolvido desencadea e mellora o proceso de coagulación no lugar de aplicación. O NFRCS pode modular o microambiente e actuar a nivel celular debido á súa estrutura nanoporosa, o que resulta nunha mellor cicatrización de feridas no modelo de ferida por escisión.
A hemorraxia incontrolada durante o combate, as situacións intraoperatorias e de emerxencia pode supoñer unha grave ameaza para a vida dos feridos1. Estas afeccións provocan ademais un aumento xeral da resistencia vascular periférica, o que provoca un choque hemorráxico. As medidas axeitadas para controlar a hemorraxia durante e despois da cirurxía considéranse potencialmente mortais2,3. Os danos nos vasos grandes provocan unha perda masiva de sangue, o que resulta nunha taxa de mortalidade ≤ 50 % en combate e 31 % durante a cirurxía1. A perda masiva de sangue provoca unha diminución do volume corporal, o que reduce o gasto cardíaco. Un aumento da resistencia vascular periférica total e un deterioro progresivo da microcirculación provocan hipoxia nos órganos de soporte vital. Pode producirse un choque hemorráxico se a afección continúa sen unha intervención eficaz1,4,5. Outras complicacións inclúen a progresión da hipotermia e a acidose metabólica, así como un trastorno da coagulación que impide o proceso de coagulación. O choque hemorráxico grave está asociado a un maior risco de morte6,7,8. No choque de grao III (progresivo), a transfusión de sangue é esencial para a supervivencia do paciente durante a morbilidade e a mortalidade intraoperatorias e posoperatorias. Para superar todas as situacións de risco para a vida mencionadas anteriormente, desenvolvemos un armazón composto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS) que utiliza unha concentración mínima de polímeros (0,5 %) empregando unha combinación de polímeros hemostáticos solubles en auga.
Co uso de reforzo de fibra, pódense desenvolver produtos rendibles. As fibras dispostas aleatoriamente lembran a estrutura da á dunha libélula, equilibrada polas raias horizontais e verticais das ás. As veas transversais e lonxitudinais da á comunícanse coa membrana da á (Fig. 1). O NFRCS consiste en Ct reforzado como sistema de andamio con mellor resistencia física e mecánica (Figura 1). Debido á súa accesibilidade e artesanía, os cirurxiáns prefiren usar calibres de fío de algodón (Ct) durante as operacións e os apósitos. Polo tanto, tendo en conta os seus múltiples beneficios, incluíndo > 90 % de celulosa cristalina (que contribúe á mellora da actividade hemostática), utilizouse Ct como sistema esquelético de NFRCS9,10. Polo tanto, tendo en conta os seus múltiples beneficios, incluíndo > 90 % de celulosa cristalina (que contribúe á mellora da actividade hemostática), utilizouse Ct como sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристалличесесклой (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной скелетной сис9CS,10 N. Polo tanto, dados os seus moitos beneficios, incluíndo >90 % de celulosa cristalina (implicada nun aumento da actividade hemostática), utilizouse o Ct como sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增强止血滴止血滴，被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Polo tanto, dados os seus moitos beneficios, incluíndo máis do 90 % de celulosa cristalina (que axuda a mellorar a actividade hemostática), o Ct empregouse como base para NFRCS9,10.O Ct foi revestido superficialmente (observouse a formación dunha película de grosor nanométrico) e interconectado cunha composición formadora de película hemostática (HFFC). A HFFC actúa como unha matrixel, mantendo unido o Ct colocado aleatoriamente. O deseño desenvolvido transmite a tensión dentro da fase dispersa (fibras de reforzo). É difícil obter estruturas nanoporosas con boa resistencia mecánica utilizando concentracións mínimas de polímeros. Ademais, non é doado personalizar diferentes moldes para diferentes aplicacións biomédicas.
A figura mostra un diagrama do deseño do NFRCS baseado na estrutura da á da libélula (A). Esta imaxe mostra unha analoxía comparativa da estrutura da á dunha libélula (as veas que se intersecan e lonxitudinais da á están interconectadas) e unha microfotografía en sección transversal do NFRCS de Cp (B). Representación esquemática do NFRCS.
Os NFRC desenvolvéronse empregando HFFC como fase continua para abordar as limitacións anteriores. O HFFC está composto por varios polímeros hemostáticos formadores de película, incluíndo quitosano (como principal polímero hemostático) con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) e alcohol polivinílico (PVA) (125 kDa) como polímero de soporte que promove a formación de trombos. A adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mellorou a capacidade de absorción de humidade dos NFRCS. Engadiuse polietilenglicol 400 (PEG 400) para mellorar a reticulación dos polímeros en mesturas de polímeros unidos. Aplicáronse a Ct tres composicións hemostáticas de HFFC diferentes (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), concretamente quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) e quitosano con PVA (Cp). Varios estudos de caracterización in vitro e in vivo confirmaron a actividade hemostática e de cicatrización de feridas dos NFRCS. Os materiais compostos que ofrece NFRCS pódense usar para personalizar varias formas de andamiaxe para satisfacer necesidades específicas.
Ademais, os NFRCS pódense modificar como unha venda ou un rolo para cubrir toda a área da lesión das extremidades inferiores e outras partes do corpo. Especificamente para lesións de extremidades de combate, o deseño do NFRCS deseñado pódese cambiar a medio brazo ou a perna completa (Figura suplementaria S11). O NFRCS pódese converter nunha pulseira con cola de tecido, que se pode usar para deter a hemorraxia por lesións suicidas graves no pulso. O noso obxectivo principal é desenvolver un NFRCS coa menor cantidade de polímero posible que se poida entregar a unha gran poboación (por debaixo do limiar da pobreza) e que se poida colocar nun kit de primeiros auxilios. De deseño sinxelo, eficiente e económico, o NFRCS beneficia ás comunidades locais e pode ter un impacto global.
A quitosana (peso molecular 80 kDa) e o amaranto adquiríronse a Merck, India. A hidroxipropilmetilcelulosa 50 Cp, o polietilenglicol 400 e a metilcelulosa adquiríronse a Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. O alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90 % hidrolizado) adquiríronse a National Chemicals, Gujarat. A polivinilpirrolidina K30 adquiríronse a Molychem, Mumbai e os hisopos estériles adquiríronse a Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con auga Milli Q (sistema de purificación de auga Direct-Q3, Merck, India) como vehículo.
O NFRCS desenvolveuse empregando un método de liofilización11,12. Todas as composicións de HFFC (Táboa 1) preparáronse empregando un axitador mecánico. Prepare unha solución de quitosano ao 0,5 % empregando ácido acético ao 1 % en auga mediante axitación continua a 800 rpm nun axitador mecánico. Engadiuse o peso exacto do polímero cargado indicado na Táboa 1 á solución de quitosano e axitouse ata obter unha solución de polímero transparente. Engadíronse PVP K30 e PEG 400 á mestura resultante nas cantidades indicadas na Táboa 1 e continuouse a axitación ata obter unha solución de polímero viscosa transparente. O baño resultante de solución de polímero sonicouse durante 60 minutos para eliminar as burbullas de aire atrapadas na mestura de polímeros. Como se mostra na Figura Suplementaria S1(b), o Ct distribuíuse uniformemente en cada pozo dunha placa (molde) de 6 pozos suplementada con 5 ml de HFFC.
A placa de seis pozos sonicouse durante 60 minutos para conseguir unha humectación e distribución uniformes de HFFC na rede Ct. Despois, conxelouse a placa de seis pozos a -20 °C durante 8-12 horas. As placas de conxelación liofilizáronse durante 48 horas para obter diversas formulacións de NFRCS. O mesmo procedemento utilízase para producir diferentes formas e estruturas, como tampóns ou tampóns cilíndricos, ou calquera outra forma para diferentes aplicacións.
A quitosana (80 kDa) (3 %) pesada con precisión disólvese en ácido acético ao 1 % usando un axitador magnético. Á solución resultante de quitosana engadíuselle PEG 400 ao 1 % e axitouse durante 30 minutos. Verteuse a solución resultante nun recipiente cadrado ou rectangular e conxélase a -80 °C durante 12 horas. As mostras conxeladas liofilizáronse durante 48 horas para obter Cs13 poroso.
O NFRCS desenvolvido foi sometido a experimentos mediante espectroscopia de infravermellos por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Toquio, Xapón) para confirmar a compatibilidade química da quitosana con outros polímeros14,15. Os espectros FTIR (ancho do rango espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas as mostras probadas obtivéronse realizando 32 exploracións.
A taxa de absorción no sangue (BAR) para todas as formulacións avaliouse empregando o método descrito por Chen et al. 16 con lixeiras modificacións. Os NFRC desenvolvidos de todas as composicións secáronse nun forno de baleiro a 105 °C durante a noite para eliminar o disolvente residual. Colocáronse 30 mg de NFRCS (peso inicial da mostra – W0) e 30 mg de Ct (control positivo) en pratos separados que contiñan unha premestura de citrato de sodio ao 3,8 %. A intervalos de tempo predeterminados, é dicir, 5, 10, 20, 30, 40 e 60 segundos, retiráronse os NFRCS e limpáronse as súas superficies de sangue non absorbido colocando as mostras en Ct durante 30 segundos. Considerouse o peso final do sangue absorbido polos NFRCS 16 (W1) en cada punto de tempo. Calcule a porcentaxe de BAR empregando a seguinte fórmula:
O tempo de coagulación do sangue (TCS) determinouse segundo o informado por Wang et al. 17. O tempo necesario para que o sangue enteiro (sangue de rata premezclado con citrato de sodio ao 3,8 %) coagule en presenza de NFRCS calculouse como o TCS da mostra de proba. Os distintos compoñentes do NFRCS (30 mg) colocáronse en frascos con tapa de rosca de 10 ml e incubáronse a 37 °C. Engadiuse sangue (0,5 ml) ao vial e 0,3 ml de CaCl2 0,2 M para activar a coagulación do sangue. Finalmente, inverte o vial cada 15 segundos (ata 180 °) ata que se forme un coágulo firme. O TCS da mostra estímase polo número de veces que se virou o vial 17,18. Con base no TCS, seleccionáronse dúas composicións óptimas de Cm, Ch e Cp do NFRCS para estudos de caracterización posteriores.
A BCT das composicións de Ch NFRCS e Cp NFRCS determinouse implementando o método descrito por Li et al. 19. Colocar 15 x 15 mm2 de Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (control positivo) en placas de Petri separadas (37 °C). O sangue que contiña citrato de sodio ao 3,8 % mesturouse con CaCl2 0,2 ​​M nunha proporción de volume de 10:1 para iniciar o proceso de coagulación do sangue. Aplicáronse 20 µl dunha mestura de sangue de rata CaCl2 0,2 ​​M á superficie da mostra e colocouse nunha placa de Petri baleira. O control foi sangue vertido en placas de Petri baleiras sen Ct. A intervalos fixos de 0, 3 e 5 minutos, deter a coagulación engadindo 10 ml de auga desionizada (DI) á mostra que contiña a placa sen perturbar o coágulo. Os eritrocitos non coagulados (eritrocitos) sofren hemólise en presenza de auga desionizada e liberan hemoglobina. A hemoglobina en diferentes puntos de tempo (HA(t)) medíuse a 540 nm (λmax hemoglobina) usando un espectrofotómetro UV-Vis. Tomouse como estándar de referencia a absorción absoluta de hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sangue en 10 ml de auga desionizada. A captación relativa de hemoglobina (RHA) do sangue coagulado calculouse a partir da proporción HA(t)/HA(0) usando o mesmo lote de sangue.
Usando un analizador de texturas (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), determináronse as propiedades adhesivas dos NFRC ao tecido danado. Presionouse unha placa cilíndrica de fondo aberto contra o interior da pel do porco (sen a capa de graxa). As mostras (Ch NFRCS e Cp NFRCS) aplicáronse mediante unha cánula en moldes cilíndricos para crear adhesión á pel do porco. Despois dunha incubación de 3 minutos a temperatura ambiente (RT) (25 °C), rexistrouse a forza adhesiva dos NFRCS a unha velocidade constante de 0,5 mm/s.
A principal característica dos selantes cirúrxicos é aumentar a coagulación do sangue e reducir a perda de sangue. A coagulación sen perda en NFRCS avaliouse empregando un método publicado previamente con lixeiras modificacións 19. Prepare un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interior 10 mm) cun orificio de 8 × 5 mm2 nun lado do tubo de centrífuga (que representa unha ferida aberta). Úsase NFRCS para pechar a abertura e úsase cinta adhesiva para selar os bordos exteriores. Engada 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ao tubo de microcentrífuga que contén a premestura de citrato de sodio ao 3,8 %. Despois de 10 minutos, retiráronse os tubos de microcentrífuga das placas e determinouse o aumento da masa das placas debido á saída de sangue do NFRK (n = 3). Perda de sangue. Os NFRCS con Ch e os NFRCS con Cp comparáronse cos con Cs.
A integridade húmida dos NFRCS determinouse segundo o método descrito por Mishra e Chaudhary21 con pequenas modificacións. Colocar os NFRCS nun matraz Erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de auga e axitar durante 60 s sen formar unha tapa. Inspección visual e priorización das mostras para a súa integridade física segundo a recollida.
A forza de unión do HFFC ao Ct estudouse empregando métodos publicados previamente con pequenas modificacións. A integridade do revestimento superficial avaliouse expoñendo o NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) en presenza de auga milliQ (Ct). Os NFRCS Ch, NFRCS e Cp, NFRCS desenvolvidos colocáronse nun vaso de precipitados cheo de auga e sonicáronse durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 minutos, respectivamente. Despois do secado, a diferenza porcentual entre o peso inicial e o final do NFRCS utilizouse para calcular a porcentaxe de perda de material (HFFC). A BCT in vitro confirmou aínda máis a forza de unión ou a perda de materiais superficiais. A eficiencia da unión do HFFC ao Ct proporciona coagulación do sangue e un revestimento elástico na superficie do Ct22.
A homoxeneidade do NFRCS desenvolvido determinouse mediante a BCT de mostras (30 mg) tomadas de localizacións xerais seleccionadas aleatoriamente do NFRCS. Siga o procedemento BCT mencionado anteriormente para determinar o cumprimento do NFRCS. A proximidade entre as cinco mostras garante unha cobertura superficial uniforme e a deposición de HFFC na malla Ct.
A área nominal de contacto co sangue (NBCA) determinouse como se informou anteriormente con algunhas modificacións. Coagulouse o sangue fixando 20 µl de sangue entre as dúas superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. Despois dunha hora, separáronse as dúas partes do stent e mediuse manualmente a área do coágulo. O valor medio de tres repeticións considerouse NBCA NFRCS19.
A análise de sorción dinámica de vapor (DVS) empregouse para avaliar a eficacia dos NFRCS para absorber auga do ambiente externo ou do lugar da lesión responsable do inicio da coagulación. O DVS avalía ou rexistra a absorción e a perda de vapor nunha mostra gravimetricamente usando unha balanza ultrasensible cunha resolución de masa de ±0,1 µg. Un controlador electrónico de fluxo de masa xera unha presión parcial de vapor (humidade relativa) arredor da mostra mesturando gases portadores saturados e secos. Segundo as directrices da Farmacopea Europea, en función da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, estas clasificáronse en 4 categorías (0–0,012 % p/p− non higroscópicas, 0,2–2 % p/p lixeiramente higroscópicas, 2–15 % moderadamente higroscópicas e > 15 % moi higroscópicas)23. Segundo as directrices da Farmacopea Europea, en función da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, estas clasificáronse en 4 categorías (0–0,012 % p/p− non higroscópicas, 0,2–2 % p/p lixeiramente higroscópicas, 2–15 % moderadamente higroscópicas e > 15 % moi higroscópicas)23.De acordo coas recomendacións da Farmacopea Europea, dependendo da porcentaxe de absorción de humidade polas mostras, estas dividíronse en 4 categorías (0–0,012 % p/p – non higroscópica, 0,2–2 % p/p lixeiramente higroscópica, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópicos e > 15 % moi higroscópicos)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% p/p非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 （01%（0. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23〿）De acordo coas recomendacións da Farmacopea Europea, as mostras divídense en 4 clases dependendo da porcentaxe de humidade absorbida pola mostra (0-0,012 % en peso – non higroscópica, 0,2-2 % en peso lixeiramente higroscópica, 2-15 % en peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15 % moi higroscópico) 23.A eficiencia higroscópica de NFCS X NFCS e TsN NFCS determinouse nun analizador DVS TA TGA Q5000 SA. Durante este proceso, obtivéronse o tempo de execución, a humidade relativa (HR) e o peso da mostra en tempo real a 25 °C24. O contido de humidade calcúlase mediante unha análise de masa de NFRCS precisa usando a seguinte ecuación:
MC é a humidade dos NFRCS. m1: peso seco dos AINE. m2 é a masa dos NFRCS en tempo real a unha HR determinada.
A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азотка помощью опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A superficie total estimouse mediante un experimento de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靂总表。✨ 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцоди мазодик азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 °C (< 7 × 10-3 торр). A área superficial total estimouse mediante experimentos de adsorción de nitróxeno con nitróxeno líquido despois de baleirar as mostras durante 10 horas a 25 °C (< 7 x 10-3 torr).A área superficial total, o volume dos poros e o tamaño dos poros do NFRCS determináronse cun Quantachrome de NOVA 1000e, Austria, empregando o software RS 232.
Preparar glóbulos vermellos ao 5 % (solución salina como diluínte) de sangue enteiro. Despois, transferir unha alícuota de HFFC (0,25 ml) a unha placa de 96 pozos e unha masa de glóbulos vermellos ao 5 % (0,1 ml). Incubar a mestura a 37 °C durante 40 minutos. Unha mestura de glóbulos vermellos e soro considerouse como control positivo e unha mestura de solución salina e glóbulos vermellos como control negativo. A hemaglutinación determinouse segundo a escala de Stajitzky. As escalas propostas son as seguintes: + + + + agregados granulares densos; + + + almofadas de fondo liso con bordos curvos; + + almofadas de fondo liso con bordos rasgados; + aneis vermellos estreitos arredor dos bordos das almofadas lisas; – botón vermello discreto (negativo) 12 no centro do pozo inferior.
A hemocompatibilidade dos NFRCS estudouse segundo o método da Organización Internacional para a Normalización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Empregouse o método gravimétrico descrito por Singh et al. Realizáronse pequenas modificacións para avaliar a formación de trombos en presenza ou na superficie dos NFRCS. Incubáronse 500 mg de NFRCS con Cs, Ch e Cp en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 37 °C. Despois de 24 horas, retirouse o PBS e os NFRCS tratáronse con 2 ml de sangue que contiña citrato de sodio ao 3,8 %. Na superficie dos NFRCS, engádense 0,04 ml de CaCl2 0,1 M ás mostras incubadas. Despois de 45 minutos, engadíronse 5 ml de auga destilada para deter a coagulación. O sangue coagulado na superficie dos NFRCS tratouse cunha solución de formaldehido ao 36-38 %. Os coágulos fixados con formaldehido secáronse e pesáronse. A porcentaxe de trombose estimouse calculando o peso do vaso sen sangue e mostra (control negativo) e do vaso con sangue (control positivo).
Como confirmación inicial, as mostras visualizáronse cun microscopio óptico para comprender a capacidade do revestimento superficial de HFFC, a interconexión de Ct e a rede de Ct para formar poros. Recortáronse seccións finas de Ch e Cp de NFRCS cunha lámina de bisturí. A sección resultante colocouse nun portaobxectivos de vidro, cubriuse cun cubreobxectivos e os bordos fixáronse con cola. Os portaobxectivos preparados observáronse cun microscopio óptico e tomáronse fotografías con diferentes aumentos.
A deposición de polímeros en redes de Ct visualizouse mediante microscopía de fluorescencia baseada no método descrito por Rice et al.29. A composición de HFFC empregada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e os NFRCS (Ch e Cp) preparáronse segundo o método mencionado anteriormente. A composición de HFFC empregada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e os NFRCS (Ch e Cp) preparáronse segundo o método mencionado anteriormente.A composición de HFFC empregada para a formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e obtivéronse NFRCS (Ch e Cp) segundo o método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料法CNF &CNF Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料法CNF &CNF Cp).A composición de HFFC empregada na formulación mesturouse cun colorante fluorescente (amaranto) e recibiu NFRCS (Ch e Cp), como se mencionou anteriormente.Cortáronse seccións finas de NFRK das mostras obtidas, colocáronse en láminas de vidro e cubríronse con cubreobxectivos. Observáronse as láminas preparadas cun microscopio fluorescente cun filtro verde (310-380 nm). Tomáronse imaxes cun aumento de 4x para comprender as relacións de Ct e o exceso de deposición de polímeros na rede de Ct.
A topografía superficial dos materiais NFRCS Ch e Cp determinouse empregando un microscopio de forza atómica (AFM) cunha ménsula TESP ultrafina en modo de rosca: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwán. A rugosidade superficial determinouse mediante a raíz cuadrática media (RMS) empregando software (Scanning Probe Image Processor). Representáronse varias localizacións dos materiais NFRCS en imaxes 3D para comprobar a uniformidade da superficie. A desviación estándar da puntuación para unha área determinada defínese como a rugosidade superficial. A ecuación RMS utilizouse para cuantificar a rugosidade superficial do material NFRCS31.
Realizáronse estudos baseados en FESEM empregando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Toquio, para comprender a morfoloxía superficial dos NFRCS de Ch e dos NFRCS de Cp, que mostraron unha mellor BCT que os NFRCS de Cm. O estudo FESEM realizouse segundo o método descrito por Zhao et al. 32 con pequenas modificacións. De 20 a 30 mg de NFRCS de Ch e NFRCS de Cp mesturáronse previamente con 20 µl de citrato de sodio ao 3,8 % premezclado con sangue de rata. Engadíronse 20 μl de CaCl2 0,2 ​​M ás mostras tratadas con sangue para iniciar a coagulación e as mostras incubáronse a temperatura ambiente durante 10 minutos. Ademais, eliminouse o exceso de eritrocitos da superficie dos NFRCS enxaugándoos con solución salina.
As mostras posteriores tratáronse con glutaraldehído ao 0,1 % e logo secáronse nun forno de aire quente a 37 °C para eliminar a humidade. As mostras secas foron revestidas e analizadas 32. Outras imaxes obtidas durante a análise foron a formación de coágulos na superficie de fibras de algodón individuais, a deposición de polímeros entre Ct, a morfoloxía dos eritrocitos (forma), a integridade do coágulo e a morfoloxía dos eritrocitos en presenza de NFRCS. As áreas de NFRCS non tratadas e as áreas de NFRCS tratadas con Ch e Cp incubadas con sangue foron analizadas para detectar ións elementais (sodio, potasio, nitróxeno, calcio, magnesio, zinc, cobre e selenio) 33. Compare as porcentaxes de ións elementais entre as mostras tratadas e as non tratadas para comprender a acumulación de ións elementais durante a formación do coágulo e a homoxeneidade do coágulo.
O grosor do revestimento superficial de Cp HFFC na superficie de Ct determinouse mediante FESEM. As seccións transversais dos Cp NFRCS cortáronse da estrutura e revestíronse por pulverización catódica. As mostras de revestimento por pulverización catódica resultantes observáronse mediante FESEM e mediuse o grosor do revestimento superficial 34 , 35 , 36 .
A microTC de raios X proporciona imaxes non destrutivas en 3D de alta resolución e permite estudar a disposición estrutural interna dos NFRC. A microTC usa un feixe de raios X que pasa a través da mostra para rexistrar o coeficiente de atenuación lineal local dos raios X na mostra, o que axuda a obter información morfolóxica. A localización interna de Ct en NFRCS con Cp e NFRCS con Cp tratados con sangue examinouse mediante microTC para comprender a eficiencia de absorción e a coagulación do sangue en presenza de NFRCS37,38,39. As estruturas 3D das mostras de NFRCS con Cp tratadas con e sen tratar reconstruíronse mediante microTC (V|tome|x S240, Phoenix, Alemaña). Usando o software VG STUDIO-MAX versión 2.2, tomáronse varias imaxes de raios X desde diferentes ángulos (idealmente unha cobertura de 360°) para desenvolver imaxes 3D para NFRCS. Os datos de proxección recollidos reconstruíronse en imaxes volumétricas en 3D usando o software 3D ScanIP Academic sinxelo correspondente.
Ademais, para comprender a distribución do coágulo, engadíronse 20 µl de sangue citratado premesturado e 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M ao NFRCS para iniciar a coagulación do sangue. As mostras preparadas déixanse endurecer. A superficie do NFRC tratouse con glutaraldehído ao 0,5 % e secouse nun forno de aire quente a 30–40 °C durante 30 minutos. O coágulo de sangue formado no NFRCS foi escaneado, reconstruído e visualizado unha imaxe en 3D do coágulo de sangue.
Realizáronse ensaios antibacterianos en Cp NFRCS (mellor comparado con Ch NFRCS) empregando o método descrito anteriormente con pequenas modificacións. A actividade antibacteriana de Cp NFRCS e Cp HFFC determinouse empregando tres microorganismos de proba diferentes [S. aureus (bacterias grampositivas), E. coli (bacterias gramnegativas) e Candida branca (C. albicans)] que medraban en ágar en placas de Petri nunha incubadora. Inocular uniformemente 50 ml da suspensión de cultivo bacteriano diluída a unha concentración de 105-106 UFC ml-1 no medio ágar. Verter o medio nunha placa de Petri e deixar solidificar. Fixéronse pozos na superficie da placa de ágar para encher con HFFC (3 pozos para HFFC e 1 para control negativo). Engadir 200 µl de HFFC a 3 pozos e 200 µl de PBS a pH 7,4 ao 4º pozo. No outro lado da placa de Petri, coloque un disco Cp NFRCS de 12 mm sobre o ágar solidificado e humedeza con PBS (pH 7,4). Os comprimidos de ciprofloxacina, ampicilina e fluconazol considéranse estándares de referencia para Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Mida a zona de inhibición manualmente e tome unha imaxe dixital da zona de inhibición.
Tras a aprobación ética institucional, o estudo realizouse no Kasturba Medical College of Education and Research en Manipal, Karnataka, no sur da India. O protocolo experimental in vitro TEG foi revisado e aprobado polo Comité de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Os suxeitos foron recrutados de doadores de sangue voluntarios (de 18 a 55 anos) do banco de sangue do hospital. Ademais, obtívose un formulario de consentimento informado dos voluntarios para a recollida de mostras de sangue. Utilizouse TEG nativo (N-TEG) ​​para estudar o efecto da formulación de Cp HFFC en sangue enteiro premesturado con citrato de sodio. O N-TEG é amplamente recoñecido polo seu papel na reanimación no punto de atención, o que crea problemas para os médicos debido á posibilidade de atraso clinicamente significativo nos resultados (probas de coagulación de rutina). A análise de N-TEG realizouse con sangue enteiro. Obtivéronse o consentimento informado e o historial médico detallado de todos os participantes. O estudo non incluíu participantes con complicacións hemostáticas ou trombóticas, como embarazo/posparto ou enfermidades hepáticas. Os suxeitos que tomaban fármacos que afectan á cascada de coagulación tamén foron excluídos do estudo. Realizáronse probas de laboratorio básicas (hemoglobina, tempo de protrombina, tromboplastina activada e reconto de plaquetas) en todos os participantes segundo os procedementos estándar. A N-TEG determina a viscoelasticidade do coágulo sanguíneo, a estrutura inicial do coágulo, a interacción das partículas, o fortalecemento do coágulo e a lise do coágulo. A análise de N-TEG proporciona datos gráficos e numéricos sobre os efectos colectivos de varios elementos celulares e plasma. A análise de N-TEG realizouse en dous volumes diferentes de Cp HFFC (10 µl e 50 µl). Como resultado, engadiuse 1 ml de sangue enteiro con ácido cítrico a 10 μl de Cp HFFC. Engadir 1 ml (Cp HFFC + sangue citratado) e 340 µl de sangue mesturado a 20 µl dunha placa de TEG que contén CaCl2 0,2 ​​M. Despois, as placas de TEG cargáronse en TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY no 30 % das mostras de sangue en presenza de Cp HFFC41.
O protocolo do estudo in vivo foi revisado e aprobado polo Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Facultade de Medicina Kasturba, Instituto de Educación Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos os experimentos con animais realizáronse de acordo coas recomendacións do Comité para o Control e a Supervisión da Experimentación Animal (CPCSEA). Todos os estudos NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) realizáronse en ratas Wistar femias (cun ​​peso de 200 a 250 g). Todos os animais aclimatáronse a unha temperatura de 24-26 °C e tiveron acceso libre a alimento e auga estándar ad libitum. Todos os animais dividíronse aleatoriamente en diferentes grupos, cada grupo estaba composto por tres animais. Todos os estudos realizáronse de acordo co Informe de Estudos en Animais 43. Antes do estudo, os animais foron anestesiados mediante a administración intraperitoneal (ip) dunha mestura de 20-50 mg de ketamina (por 1 kg de peso corporal) e 2-10 mg de xilazina (por 1 kg de peso corporal). Despois do estudo, calculouse o volume de sangramento avaliando a diferenza entre o peso inicial e o final das mostras, e o valor medio obtido das tres probas tomouse como volume de sangramento da mostra.
Implementouse o modelo de amputación de cola de rata para comprender o potencial das NFRCS para modular a hemorraxia en traumatismos, combates ou accidentes de tráfico (modelo de lesións). Cortar o 50 % da cola cunha lámina de bisturí e colocala no aire durante 15 s para garantir unha hemorraxia normal. Ademais, colocáronse mostras de proba na cola dunha rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS). Informouse de hemorraxia e PCT para as mostras de proba (n = 3)17,45.
Investigouse a eficacia do control da presión do NFRCS en combate nun modelo da arteria femoral superficial. A arteria femoral expúxose, punkouse cun trócar de 24G e sangrouse en 15 segundos. Despois de observar unha hemorraxia incontrolada, a mostra de proba colócase no lugar da punción aplicando presión. Inmediatamente despois da aplicación da mostra de proba, rexistrouse o tempo de coagulación e observouse a eficiencia hemostática durante os seguintes 5 minutos. O mesmo procedemento repetiuse con Cs e Ct46.
Dowling et al.47 propuxeron un modelo de lesión hepática para avaliar o potencial hemostático dos materiais hemostáticos no contexto da hemorraxia intraoperatoria. A BCT rexistrouse para mostras de Ct (control negativo), estrutura de Cs (control positivo), mostras de Ch NFRCS e mostras de Cp NFRCS. A vea cava suprahepática da rata expúxose realizando unha laparotomía mediana. Despois diso, cortouse a parte distal do lóbulo esquerdo con tesoiras. Facíase unha incisión no fígado cunha lámina de bisturí e deixábase sangrar durante uns segundos. As mostras de proba de Ch NFRCS e Cp NFRCS pesadas con precisión colocáronse sobre a superficie danada sen ningunha presión positiva e rexistrouse a BCT. O grupo de control (Ct) aplicou entón presión seguida de Cs 30 s47 sen romper a lesión.
Realizáronse ensaios de cicatrización de feridas in vivo empregando un modelo de ferida por escisión para avaliar as propiedades de cicatrización das NFRCS baseadas en polímeros desenvolvidas. Seleccionáronse e realizáronse modelos de feridas por escisión segundo métodos publicados previamente con pequenas modificacións19,32,48. Todos os animais foron anestesiados como se describiu anteriormente. Empregouse un punzón de biopsia (12 mm) para facer unha incisión circular profunda na pel das costas. As zonas de ferida preparadas foron cubertas con Cs (control positivo), Ct (recoñecendo que as almofadas de algodón interfiren coa cicatrización), Ch NFRCS e Cp NFRCS (grupo experimental) e un control negativo sen ningún tratamento. Cada día do estudo, mediuse a área da ferida en todas as ratas. Empregouse unha cámara dixital para sacar unha foto da área da ferida e colocar un novo apósito. A porcentaxe de peche da ferida mediuse mediante a seguinte fórmula:
En base á porcentaxe de peche da ferida no 12.º día do estudo, excisouse a pel de rata do mellor grupo ((Cp NFRCS) e o grupo de control) e estudouse mediante tinguidura de H&E e tinguidura de tricromo de Masson. En base á porcentaxe de peche da ferida no 12.º día do estudo, excisouse a pel de rata do mellor grupo ((Cp NFRCS) e o grupo de control) e estudouse mediante tinguidura de H&E e tinguidura de tricromo de Masson.En base á porcentaxe de peche da ferida no día 12 do estudo, excisouse a pel das ratas do mellor grupo ((Cp NFRCS) e o grupo de control) e examinouse mediante tinguidura con hematoxilina-eosina e tricrómico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）As ratas do mellor grupo ((Cp NFRCS) e grupos de control) foron excisadas para a tinción de hematoxilina-eosina e tinción de tricromo de Masson baseada na porcentaxe de peche da ferida o día 12 do estudo.O procedemento de tinción implementado levouse a cabo segundo os métodos descritos previamente49,50. En resumo, despois da fixación en formalina ao 10 %, as mostras deshidratáronse empregando unha serie de alcohois graduados. Empregouse un micrótomo para obter seccións finas (5 µm de grosor) do tecido extirpado. As seccións seriadas finas de controis e células non infecciosas con células Cp tratáronse con hematoxilina e eosina para estudar os cambios histopatolóxicos. A tinguidura tricrómica de Masson utilizouse para detectar a formación de fibrilas de coláxeno. Os resultados obtidos foron estudados cegamente por patólogos.
A estabilidade das mostras de Cp NFRCS estudouse a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60 % de HR ± 5 %) durante 12 meses51. Os Cp NFRCS (decoloración superficial e crecemento microbiano) inspeccionáronse visualmente e probáronse a resistencia ao desgaste por pregamento e a BCT segundo os métodos descritos na sección de Materiais e Métodos.
A escalabilidade e reproducibilidade dos NFRCS de Cp examináronse preparando NFRCS de Cp cun tamaño de 15 × 15 cm2. Ademais, excisáronse mostras de 30 mg (n = 5) de varias fraccións de NFRCS de Cp e avaliouse a BCT das mostras estudadas como se describiu anteriormente na sección Métodos.
Tentamos desenvolver varias formas e estruturas empregando composicións de Cp NFRCS para diversas aplicacións biomédicas. Estas formas ou configuracións inclúen hisopos cónicos para hemorraxias nasais, procedementos dentais e hisopos cilíndricos para hemorraxias vaxinais.
Todos os conxuntos de datos exprésanse como media ± desviación estándar e analizáronse mediante ANOVA empregando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) seguido da proba de comparacións múltiples de Bonferroni (*p < 0,05).
Todos os procedementos realizados nos estudos con humanos estiveron de acordo coas normas do Instituto e do Consello Nacional de Investigación, así como coa Declaración de Helsinqui de 1964 e as súas modificacións posteriores, ou normas éticas similares. Todos os participantes foron informados sobre as características do estudo e a súa natureza voluntaria. Os datos dos participantes permanecen confidenciais unha vez recollidos. O protocolo experimental in vitro TEG foi revisado e aprobado polo Comité de Ética Institucional do Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Os voluntarios asinaron o seu consentimento informado para recoller mostras de sangue.
Todos os procedementos realizados nos estudos con animais leváronse a cabo de acordo coa Facultade de Medicina Kastuba, Instituto de Educación Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos os experimentos con animais deseñados realizáronse de acordo coas directrices do Comité para o Control e a Supervisión da Experimentación Animal (CPCSEA). Todos os autores seguen as directrices de ARRIVE.
Analizáronse os espectros FTIR de todos os NFRCS e comparáronse co espectro de quitosano mostrado na Figura 2A. Picos espectrais característicos da quitosano (rexistrados) a 3437 cm-1 (estiramento de OH e NH, superposición), 2945 e 2897 cm-1 (estiramento CH), 1660 cm-1 (tensión NH2), 1589 cm-1 (flexión N–H), 1157 cm-1 (estiramento da ponte O–), 1067 cm-1 (estiramento C–O, hidroxilo secundario), 993 cm-1 (estiramento CO, Bo-OH) 52,53,54. A Táboa Suplementaria S1 mostra os valores do espectro de absorción FTIR dos NFRCS para a quitosano (informador), a quitosano puro, Cm, Ch e Cp. Os espectros FTIR de todos os NFRCS (Cm, Ch e Cp) mostraron as mesmas bandas de absorción características que a quitosano puro sen cambios significativos (Fig. 2A). Os resultados do FTIR confirmaron a ausencia de interaccións químicas ou físicas entre os polímeros empregados para desenvolver os NFRCS, o que indica que os polímeros empregados son inertes.
Caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. (A) representa os espectros FTIR combinados das composicións de quitosano e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS baixo compresión. (B) a) Taxa de absorción en sangue completo de Cm, Ch, Cp e Cg NFRCS (n = 3); as mostras de Ct mostraron unha BAR máis alta porque o hisopo de algodón ten unha maior eficiencia de absorción; b) Sangue despois da absorción en sangue. Ilustración da mostra absorbida. Representación gráfica da BCT da mostra de proba C (Cp NFRCS tivo a mellor BCT (15 s, n = 3)). Os datos en C, D, E e G mostráronse como media ± desviación estándar, e as barras de erro representan a desviación estándar, ***p < 0,0001. Os datos en C, D, E e G mostráronse como media ± desviación estándar, e as barras de erro representan a desviación estándar, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей отклонение, ***p <0,0001. Os datos en C, D, E e G preséntanse como media ± desviación estándar, e as barras de erro representan a desviación estándar, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештностедютностей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Os datos en C, D, E e G móstranse como media ± desviación estándar, as barras de erro representan a desviación estándar, ***p < 0,0001.