Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Неконтролираното кървене е една от водещите причини за смърт. Постигането на бърза хемостаза гарантира оцеляването на субекта като първа помощ по време на бой, пътнотранспортни произшествия и операции за намаляване на смъртността. Нанопорестият влакнесто-армиран композитен скелет (NFRCS), получен от прост хемостатичен филмообразуващ състав (HFFC) като непрекъсната фаза, може да задейства и засили хемостазата. Разработването на NFRCS се основава на дизайна на крилото на водното конче. Структурата на крилото на водното конче се състои от напречни и надлъжни крила, а мембраните на крилата са свързани помежду си, за да се запази целостта на микроструктурата. HFFC равномерно покрива повърхността на влакното с филм с нанометрова дебелина и свързва произволно разпределената дебелина на памука (Ct) (дисперсна фаза), за да образува нанопореста структура. Комбинацията от непрекъснати и дисперсни фази намалява цената на продукта десет пъти в сравнение с предлаганите на пазара продукти. Модифицираните NFRCS (тампони или гривни) могат да се използват в различни биомедицински приложения. Проучванията in vivo са заключили, че разработеният Cp NFRCS задейства и засилва процеса на коагулация на мястото на приложение. NFRCS може да модулира микросредата и да действа на клетъчно ниво благодарение на своята нанопореста структура, което води до по-добро заздравяване на рани в модела на ексцизионна рана.
Неконтролираното кървене по време на бой, интраоперативни и спешни ситуации може да представлява сериозна заплаха за живота на ранените1. Тези състояния допълнително водят до общо повишаване на периферното съдово съпротивление, което води до хеморагичен шок. Подходящите мерки за контрол на кървенето по време и след операцията се считат за потенциално животозастрашаващи2,3. Увреждането на големи съдове води до масивна кръвозагуба, което води до смъртност ≤ 50% в бой и 31% по време на операцията1. Масивната кръвозагуба води до намаляване на телесния обем, което намалява сърдечния дебит. Увеличаването на общото периферно съдово съпротивление и прогресивното нарушаване на микроциркулацията водят до хипоксия в животоподдържащите органи. Хеморагичен шок може да възникне, ако състоянието продължи без ефективна намеса1,4,5. Други усложнения включват прогресията на хипотермия и метаболитна ацидоза, както и коагулационно разстройство, което възпрепятства процеса на коагулация. Тежкият хеморагичен шок е свързан с по-висок риск от смърт6,7,8. При шок от степен III (прогресиращ) кръвопреливането е от съществено значение за оцеляването на пациента по време на интраоперативна и следоперативна заболеваемост и смъртност. За да преодолеем всички горепосочени животозастрашаващи ситуации, разработихме нанопорест, подсилен с влакна композитен скелет (NFRCS), който използва минимална концентрация на полимер (0,5%), използвайки комбинация от водоразтворими хемостатични полимери.
С използването на влакнеста армировка могат да се разработят рентабилни продукти. Случайно разположените влакна наподобяват структурата на крило на водно конче, балансирана от хоризонталните и вертикалните ивици по крилата. Напречните и надлъжните вени на крилото комуникират с мембраната на крилото (фиг. 1). NFRCS се състои от подсилен Ct като скелетна система с по-добра физическа и механична якост (фиг. 1). Поради достъпността и изработката, хирурзите предпочитат да използват памучни конци (Ct) по време на операции и превръзки. Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително > 90% кристална целулоза (допринася за засилване на хемостатичната активност), Ct е използван като скелетна система на NFRCS9,10. Следователно, като се имат предвид многобройните му предимства, включително > 90% кристална целулоза (допринася за засилване на хемостатичната активност), Ct е използван като скелетна система на NFRCS9,10. След това, като се вземат предвид неговите многобройни предимства, в това число > 90% кристална целулоза (участва в повишена гемостатична активност), Ct се използва в качеството на скелетната система NFRCS9,10. Следователно, предвид многобройните му предимства, включително >90% кристална целулоза (участваща в повишена хемостатична активност), Ct е използван като скелетна система на NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Следователно, предвид многобройните му предимства, включително над 90% кристална целулоза (която спомага за засилване на хемостатичната активност), Ct е използван като скеле за NFRCS9,10.Ct беше повърхностно покрит (наблюдава се образуване на нано-дебел филм) и свързан с хемостатичен филмообразуващ състав (HFFC). HFFC действа като матригел, като държи произволно разположен Ct заедно. Разработеният дизайн предава напрежението в рамките на диспергираната фаза (подсилващи влакна). Трудно е да се получат нанопорести структури с добра механична якост, използвайки минимални концентрации на полимери. Освен това не е лесно да се персонализират различни форми за различни биомедицински приложения.
Фигурата показва диаграма на дизайна на NFRCS, базирана на структурата на крилото на водно конче (A). Това изображение показва сравнителна аналогия на структурата на крилото на водно конче (пресичащите се и надлъжните жилки на крилото са взаимосвързани) и фотомикрография на напречно сечение на Cp NFRCS (B). Схематично представяне на NFRCS.
NFRCs бяха разработени с използване на HFFC като непрекъсната фаза, за да се справят с гореспоменатите ограничения. HFFC е съставен от различни филмообразуващи хемостатични полимери, включително хитозан (като основен хемостатичен полимер) с метилцелулоза (MC), хидроксипропилметилцелулоза (HPMC 50 cp) и поливинилов алкохол (PVA) (125 kDa) като поддържащ полимер, който насърчава образуването на тромби. Добавянето на поливинилпиролидин K30 (PVP K30) подобри капацитета за абсорбиране на влага на NFRCS. Полиетиленгликол 400 (PEG 400) беше добавен за подобряване на омрежването на полимерите в свързани полимерни смеси. Три различни хемостатични състава на HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), а именно хитозан с MC (Cm), хитозан с HPMC (Ch) и хитозан с PVA (Cp), бяха приложени към Ct. Различни in vitro и in vivo характеризиращи проучвания потвърдиха хемостатичната и заздравяваща активност на NFRCS. Композитните материали, предлагани от NFRCS, могат да се използват за персонализиране на различни форми на скеле, за да отговорят на специфичните нужди.
Освен това, NFRCS може да се модифицира като превръзка или ролка, за да покрие цялата зона на нараняване на долните крайници и други части на тялото. Специално за бойни наранявания на крайниците, проектираният дизайн на NFRCS може да се промени на половин ръка или цял крак (Допълнителна фигура S11). NFRCS може да се превърне в гривна с тъканно лепило, която може да се използва за спиране на кървене от тежки суицидни наранявания на китката. Нашата основна цел е да разработим NFRCS с възможно най-малко полимер, която да може да се доставя на голямо население (под прага на бедността) и която да може да се постави в аптечка. С опростен, ефикасен и икономичен дизайн, NFRCS е от полза за местните общности и може да има глобално въздействие.
Хитозан (молекулно тегло 80 kDa) и амарант са закупени от Merck, Индия. Хидроксипропил метилцелулоза 50 Cp, полиетилен гликол 400 и метилцелулоза са закупени от Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбай. Поливинилов алкохол (молекулно тегло 125 kDa) (87-90% хидролизиран) е закупен от National Chemicals, Гуджарат. Поливинилпиролидин K30 е закупен от Molychem, Мумбай, стерилни тампони са закупени от Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, с вода Milli Q (система за пречистване на вода Direct-Q3, Merck, Индия) като носител.
NFRCS е разработен с помощта на метод на лиофилизация11,12. Всички състави на HFFC (Таблица 1) са приготвени с помощта на механична бъркалка. Пригответе 0,5% разтвор на хитозан, използвайки 1% оцетна киселина във вода, чрез непрекъснато разбъркване при 800 rpm на механична бъркалка. Точното тегло на заредения полимер, посочено в Таблица 1, е добавено към разтвора на хитозана и е разбърквано до получаване на бистър полимерен разтвор. PVP K30 и PEG 400 са добавени към получената смес в количествата, посочени в Таблица 1, и разбъркването продължава до получаване на бистър вискозен полимерен разтвор. Получената баня от полимерен разтвор е обработена с ултразвук в продължение на 60 минути, за да се отстранят задържаните въздушни мехурчета от полимерната смес. Както е показано на Допълнителна Фигура S1(b), Ct е равномерно разпределен във всяка ямка на 6-ямкова плака (форма), допълнена с 5 ml HFFC.
Шестямковата плака беше обработена със соникация в продължение на 60 минути, за да се постигне равномерно омокряне и разпределение на HFFC в Ct мрежата. След това шестямковата плака беше замразена при -20°C за 8-12 часа. Замразените плаки бяха лиофилизирани в продължение на 48 часа, за да се получат различни формулировки на NFRCS. Същата процедура се използва за производство на различни форми и структури, като тампони или цилиндрични тампони, или всяка друга форма за различни приложения.
Точно претеглен хитозан (80 kDa) (3%) се разтваря в 1% оцетна киселина с помощта на магнитна бъркалка. Към получения разтвор на хитозана се добавя 1% PEG 400 и се разбърква в продължение на 30 минути. Полученият разтвор се излива в квадратен или правоъгълен контейнер и се замразява при -80°C за 12 часа. Замразените проби се лиофилизират за 48 часа, за да се получи порест Cs13.
Разработената NFRCS беше подложена на експерименти с помощта на инфрачервена спектроскопия с Фурие трансформация (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Япония), за да се потвърди химическата съвместимост на хитозана с други полимери14,15. FTIR спектрите (ширина на спектралния диапазон от 400 до 4000 cm-1) на всички тествани проби бяха получени чрез извършване на 32 сканирания.
Скоростта на абсорбция от кръв (BAR) за всички формулировки беше оценена по метода, описан от Chen et al. 16 с леки модификации. Разработените NFRK от всички състави бяха изсушени във вакуумна фурна при 105°C за една нощ, за да се отстрани остатъчният разтворител. 30 mg NFRCS (начално тегло на пробата – W0) и 30 mg Ct (положителен контрол) бяха поставени в отделни блюда, съдържащи предварително смес от 3,8% натриев цитрат. На предварително определени интервали от време, т.е. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунди, NFRCS бяха отстранени и повърхностите им бяха почистени от неабсорбираната кръв чрез поставяне на пробите върху Ct за 30 секунди. Крайното тегло на кръвта, абсорбирана от NFRCS 16, беше взето предвид (W1) във всяка времева точка. Изчислете процента BAR, като използвате следната формула:
Времето за съсирване на кръвта (BCT) е определено, както е съобщено от Wang et al.17. Времето, необходимо за съсирване на пълна кръв (кръв от плъх, предварително смесена с 3,8% натриев цитрат) в присъствието на NFRCS, е изчислено като BCT на тестваната проба. Различните компоненти на NFRCS (30 mg) са поставени в 10 ml флакони с винтова капачка и инкубирани при 37°C. Кръв (0,5 ml) е добавена към флакона и са добавени 0,3 ml 0,2 M CaCl2 за активиране на коагулацията на кръвта. Накрая, обръщайте флакона на всеки 15 секунди (до 180°), докато се образува твърд съсирек. BCT на пробата се оценява чрез броя на обръщанията на флаконите17,18. Въз основа на BCT са избрани два оптимални състава от NFRCS Cm, Ch и Cp за по-нататъшни характеризиращи изследвания.
BCT на съставите Ch NFRCS и Cp NFRCS беше определен чрез прилагане на метода, описан от Li et al. 19. Поставете 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (положителен контрол) в отделни петриеви панички (37 °C). Кръв, съдържаща 3,8% натриев цитрат, беше смесена с 0,2 M CaCl2 в обемно съотношение 10:1, за да се започне процесът на кръвосъсирване. 20 µl 0,2 M CaCl2 кръвна смес от плъхове беше нанесена върху повърхността на пробата и поставена в празна петриева паничка. Контролата беше кръв, излята в празни петриеви панички без Ct. На фиксирани интервали от 0, 3 и 5 минути, съсирването се спира чрез добавяне на 10 ml дейонизирана (DI) вода към пробата, съдържаща паничката, без да се нарушава съсирекът. Некоагулираните еритроцити (еритроцити) претърпяват хемолиза в присъствието на дейонизирана вода и освобождават хемоглобин. Хемоглобинът в различни времеви точки (HA(t)) беше измерен при 540 nm (λmax хемоглобин) с помощта на UV-Vis спектрофотометър. Абсолютната абсорбция на хемоглобин (AH(0)) в 0 min от 20 µl кръв в 10 ml дейонизирана вода беше взета като референтен стандарт. Относителното поемане на хемоглобин (RHA) на коагулирана кръв беше изчислено от съотношението HA(t)/HA(0), използвайки същата партида кръв.
С помощта на текстурен анализатор (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, САЩ) бяха определени адхезивните свойства на NFRK към увредена тъкан. Притиснете цилиндрична чиния с отворено дъно към вътрешната страна на свинската кожа (без слоя мазнина). Проби (Ch NFRCS и Cp NFRCS) бяха нанесени чрез канюла в цилиндрични форми, за да се създаде адхезия към кожата на прасето. След 3-минутна инкубация при стайна температура (RT) (25°C), адхезивната сила на NFRCS беше регистрирана с постоянна скорост от 0,5 mm/sec.
Основната характеристика на хирургическите силанти е да увеличат съсирването на кръвта, като същевременно намаляват загубата на кръв. Коагулацията без загуби при NFRCS беше оценена с помощта на публикуван преди това метод с леки модификации 19. Направете микроцентрифужна епруветка (2 ml) (вътрешен диаметър 10 mm) с отвор 8 × 5 mm2 от едната страна на центрифужната епруветка (представляващ отворена рана). NFRCS се използва за затваряне на отвора, а лента се използва за запечатване на външните ръбове. Добавете 20 µl 0,2 M CaCl2 към микроцентрифужната епруветка, съдържаща 3,8% премикс от натриев цитрат. След 10 минути микроцентрифужните епруветки бяха извадени от паничките и беше определено увеличението на масата на паничките поради изтичането на кръв от NFRK (n = 3). Загубата на кръв Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха сравнени с Cs.
Мократа цялост на NFRCS беше определена въз основа на метода, описан от Mishra и Chaudhary21 с малки модификации. NFRCS се поставя в 100 ml Ерленмайерова колба с 50 ml вода и се разбърква в продължение на 60 секунди, без да се образува капак. Визуална проверка и приоритизиране на пробите за физическа цялост въз основа на събирането.
Силата на свързване на HFFC с Ct беше изследвана с помощта на публикувани по-рано методи с малки модификации. Целостта на повърхностното покритие беше оценена чрез излагане на NFRK на акустични вълни (външен стимул) в присъствието на milliQ вода (Ct). Разработените NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха поставени в чаша, напълнена с вода, и обработени с ултразвук съответно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минути. След изсушаване, процентната разлика между началното и крайното тегло на NFRCS беше използвана за изчисляване на процента загуба на материал (HFFC). In vitro BCT допълнително подкрепи силата на свързване или загубата на повърхностни материали. Ефективността на свързването на HFFC с Ct осигурява коагулация на кръвта и еластично покритие върху повърхността на Ct22.
Хомогенността на разработената NFRCS беше определена чрез BCT на проби (30 mg), взети от произволно избрани общи местоположения на NFRCS. Следвайте гореспоменатата BCT процедура, за да определите съответствието с NFRCS. Близостта между всичките пет проби осигурява равномерно покритие на повърхността и отлагане на HFFC в Ct мрежата.
Номиналната площ на контакт с кръвта (NBCA) беше определена както е съобщено по-рано с някои модификации. Кръвта се коагулира чрез затягане на 20 µl кръв между двете повърхности на Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. След 1 час двете части на стента бяха разделени и ръчно измерена площта на съсирека. Средната стойност от три повторения беше взета под внимание като NBCA NFRCS19.
За оценка на ефективността на NFRCS (нейронфлационните сорбционни системи) за абсорбиране на вода от външната среда или от мястото на увреждане, отговорно за инициирането на коагулация, беше използван анализ с динамична сорбция на пари (DVS). DVS оценява или записва поглъщането и загубата на пари в пробата гравиметрично, използвайки ултрачувствителен баланс с масова резолюция от ±0,1 µg. Парциално налягане на парите (относителна влажност) се генерира от електронен контролер на масовия поток около пробата чрез смесване на наситени и сухи носещи газове. Съгласно указанията на Европейската фармакопея, въз основа на процента на поемане на влага от пробите, те са категоризирани в 4 категории (0–0,012% w/w - нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2–15% умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23. Съгласно указанията на Европейската фармакопея, въз основа на процента на поемане на влага от пробите, те са категоризирани в 4 категории (0–0,012% w/w - нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2–15% умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23.В съответствие с препоръките на Европейската фармакопея, в зависимост от процента на абсорбция на влага от пробите, те бяха разделени на 4 категории (0–0,012% w/w – нехигроскопични, 0,2–2% w/w леко хигроскопични, 2–15%).% умерено гигроскопичен и > 15% много гигроскопичен)23. % умерено хигроскопични и > 15% много хигроскопични)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。В съответствие с препоръките на Европейската фармакопея, пробите се разделят на 4 класа в зависимост от процента на абсорбирана от пробата влага (0-0,012% тегловни – нехигроскопични, 0,2-2% тегловни – леко хигроскопични, 2-15% тегловни).% умерено гигроскопичен, > 15 % много гигроскопичен) 23. % умерено хигроскопични, > 15% много хигроскопични) 23.Хигроскопичната ефективност на NFCS X NFCS и TsN NFCS беше определена на анализатор DVS TA TGA Q5000 SA. По време на този процес бяха получени време на изпълнение, относителна влажност (RH) и тегло на пробата в реално време при 25°C24. Съдържанието на влага се изчислява чрез точен NFRCS масов анализ, като се използва следното уравнение:
MC е влажността в NFRCS. m1 – сухо тегло на НСПВС. m2 е масата в NFRCS в реално време при дадена относителна влажност.
Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот след изпразване на пробите при 25 °C в продължение на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот след изпразване на пробите при 25 °C в продължение на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Общата площ на повърхността беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азотен жидък азот след опорожняване на образци при 25 °C в продължение на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Общата повърхностна площ беше оценена с помощта на експеримент за адсорбция на азот с течен азот, след като пробите бяха изпразнени при 25°C в продължение на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Температура 25°C Общата площ на повърхността беше оценена с използване на експерименти по адсорбция на азотен жидък азот след изпаряване на проби в продължение на 10 часа при 25°C (< 7 × 10-3 тора). Общата повърхностна площ беше оценена чрез експерименти за адсорбция на азот с течен азот, след като пробите бяха изпразнени в продължение на 10 часа при 25°C (< 7 x 10-3 torr).Общата повърхност, обемът на порите и размерът на порите по NFRCS бяха определени с Quantachrome от NOVA 1000e, Австрия, използвайки софтуер RS 232.
Пригответе 5% еритроцити (RBCs) (с физиологичен разтвор като разредител) от пълна кръв. След това прехвърлете аликвотна част от HFFC (0,25 ml) в 96-ямкова плака и 5% маса на RBC (0,1 ml). Инкубирайте сместа при 37°C в продължение на 40 минути. Смес от червени кръвни клетки и серум се счита за положителен контрол, а смес от физиологичен разтвор и червени кръвни клетки - за отрицателен контрол. Хемаглутинацията се определя съгласно скалата на Стажицки. Предложените скали са следните: + + + + плътни гранулирани агрегати; + + + гладки дънни подложки с извити ръбове; + + гладки дънни подложки с накъсани ръбове; + тесни червени пръстени около краищата на гладките подложки; – (отрицателно) дискретно червено копче 12 в центъра на долната ямка.
Хемосъвместимостта на NFRCS е изследвана съгласно метода на Международната организация по стандартизация (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Използва се гравиметричният метод, описан от Singh et al. Направени са малки модификации за оценка на образуването на тромби в присъствието на или върху повърхността на NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS са инкубирани във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) в продължение на 24 часа при 37°C. След 24 часа PBS е отстранен и NFRCS е третиран с 2 ml кръв, съдържаща 3,8% натриев цитрат. Върху повърхността на NFRCS към инкубираните проби се добавят 0,04 ml 0,1 M CaCl2. След 45 минути се добавят 5 ml дестилирана вода, за да се спре коагулацията. Коагулираната кръв върху повърхността на NFRK е третирана с 36-38% разтвор на формалдехид. Съсиреците, фиксирани с формалдехид, са изсушени и претеглени. Процентът на тромбоза беше оценен чрез изчисляване на теглото на чашата без кръв и проба (отрицателна контрола) и чашата с кръв (положителна контрола).
Като първоначално потвърждение, пробите бяха визуализирани под оптичен микроскоп, за да се разбере способността на повърхностното покритие на HFFC, взаимосвързания Ct и Ct мрежата да образуват пори. Тънки срези от Ch и Cp от NFRCS бяха отрязани с острие на скалпел. Полученият срез беше поставен върху предметно стъкло, покрито с покривно стъкло, а краищата му бяха фиксирани с лепило. Приготвените препарати бяха разгледани под оптичен микроскоп и бяха направени снимки при различни увеличения.
Отлагането на полимери в Ct мрежи беше визуализирано с помощта на флуоресцентна микроскопия, базирана на метода, описан от Rice et al.29. Съставът на HFFC, използван за формулировката, беше смесен с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch & Cp) бяха приготвени съгласно метода, споменат по-горе. Съставът на HFFC, използван за формулировката, беше смесен с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch & Cp) бяха приготвени съгласно метода, споменат по-горе.Съставът на HFFC, използван за формулирането, беше смесен с флуоресцентно багрило (амарант) и NFRCS (Ch и Cp) беше получен съгласно гореспоменатия метод.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Съставът на HFFC, използван във формулировката, беше смесен с флуоресцентно багрило (Amaranth) и получи NFRCS (Ch и Cp), както беше споменато по-рано.От получените проби бяха изрязани тънки срези от NFRK, поставени върху стъклени слайдове и покрити с покривни стъкла. Наблюдавайте приготвените слайдове под флуоресцентен микроскоп, използвайки зелен филтър (310-380 nm). Изображенията бяха направени при 4x увеличение, за да се разберат Ct връзките и излишното отлагане на полимери в Ct мрежата.
Повърхностната топография на NFRCS Ch и Cp беше определена с помощта на атомно-силов микроскоп (AFM) с ултра-остър TESP конзолен елемент в режим на потупване: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Тайван. Грапавостта на повърхността беше определена чрез средноквадратична аритметична стойност (RMS) с помощта на софтуер (Scanning Probe Image Processor). Различни местоположения на NFRCS бяха визуализирани върху 3D изображения, за да се провери еднородността на повърхността. Стандартното отклонение на резултата за дадена област се определя като грапавост на повърхността. Уравнението RMS беше използвано за количествено определяне на грапавостта на повърхността на NFRCS31.
FESEM-базирани изследвания бяха проведени с помощта на FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токио, за да се разбере повърхностната морфология на Ch NFRCS и Cp NFRCS, които показаха по-добър BCT от Cm NFRCS. FESEM изследването беше проведено съгласно метода, описан от Zhao et al.32 с малки модификации. NFRCS 20 до 30 mg Ch NFRCS и Cp NFRCS бяха предварително смесени с 20 µl 3,8% натриев цитрат, предварително смесен с кръв от плъх. 20 μl 0,2 M CaCl2 бяха добавени към третираните с кръв проби, за да се инициира коагулация, и пробите бяха инкубирани при стайна температура в продължение на 10 минути. Освен това, излишните еритроцити бяха отстранени от повърхността на NFRCS чрез изплакване с физиологичен разтвор.
Последващите проби бяха третирани с 0,1% глутаралдехид и след това изсушени в пещ с горещ въздух при 37°C за отстраняване на влагата. Изсушените проби бяха покрити и анализирани 32. Други изображения, получени по време на анализа, бяха образуване на съсиреци по повърхността на отделни памучни влакна, отлагане на полимер между Ct, морфология (форма) на еритроцитите, целостност на съсирека и морфология на еритроцитите в присъствието на NFRCS. Нетретираните NFRCS области и третираните с Ch и Cp NFRCS области, инкубирани с кръв, бяха сканирани за елементарни йони (натрий, калий, азот, калций, магнезий, цинк, мед и селен) 33. Сравнете процентите на елементарните йони между третираните и нетретираните проби, за да разберете натрупването на елементарни йони по време на образуването на съсирек и хомогенността на съсирека.
Дебелината на повърхностното покритие Cp HFFC върху Ct повърхността беше определена с помощта на FESEM. Напречните сечения на Cp NFRCS бяха изрязани от рамката и покрити с разпрашително покритие. Получените проби с разпрашително покритие бяха наблюдавани с FESEM и дебелината на повърхностното покритие беше измерена 34, 35, 36.
Рентгеновата микро-КТ осигурява 3D неразрушително изобразяване с висока резолюция и ви позволява да изучавате вътрешната структурна подредба на NFRK. Микро-КТ използва рентгенов лъч, преминаващ през пробата, за да запише локалния коефициент на линейно затихване на рентгеновите лъчи в пробата, което помага за получаване на морфологична информация. Вътрешното местоположение на Ct в Cp NFRCS и Cp NFRCS, третирани с кръв, беше изследвано чрез микро-КТ, за да се разбере ефективността на абсорбция и съсирването на кръвта в присъствието на NFRCS37,38,39. 3D структурите на третирани и нетретирани Cp NFRCS проби от кръв бяха реконструирани с помощта на микро-КТ (V|tome|x S240, Phoenix, Германия). С помощта на софтуера VG STUDIO-MAX версия 2.2 бяха направени няколко рентгенови изображения от различни ъгли (в идеалния случай 360° покритие), за да се разработят 3D изображения за NFRCS. Събраните проекционни данни бяха реконструирани в 3D обемни изображения с помощта на съответния прост 3D ScanIP Academic софтуер.
Освен това, за да се разбере разпределението на съсирека, към NFRCS бяха добавени 20 µl предварително смесена цитратна кръв и 20 µl 0.2 M CaCl2, за да се инициира кръвосъсирването. Приготвените проби се оставят да се втвърдят. Повърхността на NFRK беше обработена с 0.5% глутаралдехид и изсушена в пещ с горещ въздух при 30–40°C в продължение на 30 минути. Образуваният кръвен съсирек върху NFRCS беше сканиран, реконструиран и беше визуализирано 3D изображение на кръвния съсирек.
Антибактериалните анализи бяха проведени върху Cp NFRCS (най-добре сравнен с Ch NFRCS), използвайки описания по-рано метод с малки модификации. Антибактериалната активност на Cp NFRCS и Cp HFFC беше определена с помощта на три различни тестови микроорганизма [S. aureus (грам-положителни бактерии), E. coli (грам-отрицателни бактерии) и бяла Candida (C. albicans)], растящи върху агар в петриеви панички в инкубатор. Равномерно инокулирайте 50 ml от разредената суспензия от бактериална култура с концентрация 105-106 CFU ml-1 върху агаровата среда. Изсипете средата в петриева паничка и я оставете да се втвърди. На повърхността на агаровата плака бяха направени ямки, за да се напълнят с HFFC (3 ямки за HFFC и 1 за отрицателен контрол). Добавете 200 µl HFFC към 3 ямки и 200 µl PBS с pH 7,4 към 4-та ямка. От другата страна на петриевата паничка, поставете 12 mm Cp NFRCS диск върху втвърдения агар и навлажнете с PBS (pH 7,4). Таблетките ципрофлоксацин, ампицилин и флуконазол се считат за референтни стандарти за Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Измерете зоната на инхибиране ръчно и направете дигитално изображение на зоната на инхибиране.
След институционално етично одобрение, проучването е проведено в Медицинския колеж за образование и изследвания „Кастурбa“ в Манипал, Карнатака, в Южна Индия. Експерименталният протокол in vitro TEG е прегледан и одобрен от Комитета по институционална етика на Медицинския колеж „Кастурбa“, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Участниците са били набрани от доброволци кръводарители (на възраст от 18 до 55 години) от болничната кръвна банка. Освен това е получен формуляр за информирано съгласие от доброволците за събиране на кръвни проби. Нативен TEG (N-TEG) ​​е използван за изследване на ефекта на формулировката Cp HFFC върху пълна кръв, предварително смесена с натриев цитрат. N-TEG е широко признат за ролята си в реанимацията на място, което създава проблеми за клиницистите поради потенциала за клинично значимо забавяне на резултатите (рутинни коагулационни тестове). N-TEG анализът е извършен с използване на пълна кръв. От всички участници са получени информирано съгласие и подробна медицинска история. Проучването не включва участници с хемостатични или тромботични усложнения, като бременност/след раждане или чернодробно заболяване. Субекти, приемащи лекарства, които повлияват коагулационната каскада, също бяха изключени от проучването. Основни лабораторни изследвания (хемоглобин, протромбиново време, активиран тромбопластин и брой на тромбоцитите) бяха проведени на всички участници съгласно стандартните процедури. N-TEG определя вискоеластичността на кръвния съсирек, началната структура на съсирека, взаимодействието на частиците, укрепването на съсирека и лизиса на съсирека. N-TEG анализът предоставя графични и числени данни за колективните ефекти на няколко клетъчни елемента и плазма. N-TEG анализът беше извършен върху два различни обема Cp HFFC (10 µl и 50 µl). В резултат на това, 1 ml пълна кръв с лимонена киселина беше добавена към 10 μl Cp HFFC. Добавете 1 ml (Cp HFFC + цитратна кръв), 340 µl смесена кръв към 20 µl 0.2 M CaCl2, съдържаща TEG паничка. След това, TEG паничките бяха заредени в TEG® 5000, US, за да се измерят R, K, алфа ъгъл, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% от кръвните проби в присъствието на Cp HFFC41.
Протоколът на in vivo изследването беше прегледан и одобрен от Институционалния комитет по етика на животните (IAEC), Медицинско училище „Кастурбa“, Висше образование в Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Всички експерименти с животни бяха проведени в съответствие с препоръките на Комитета за контрол и надзор на експериментите с животни (CPCSEA). Всички in vivo NFRCS изследвания (2 × 2 cm2) бяха проведени върху женски плъхове Wistar (с тегло от 200 до 250 g). Всички животни бяха аклиматизирани при температура 24-26°C, животните имаха свободен достъп до стандартна храна и вода ad libitum. Всички животни бяха разделени на случаен принцип в различни групи, като всяка група се състоеше от три животни. Всички изследвания бяха проведени в съответствие с Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Преди изследването животните са анестезирани чрез интраперитонеално (ip) приложение на смес от 20-50 mg кетамин (на 1 kg телесно тегло) и 2-10 mg ксилазин (на 1 kg телесно тегло). След изследването обемът на кървене е изчислен чрез оценка на разликата между началното и крайното тегло на пробите, като средната стойност, получена от трите теста, е взета за обем на кървене на пробата.
Моделът на ампутация на опашката на плъх беше реализиран, за да се разбере потенциалът на NFRCS (нейронализирана косвена терапия) да модулира кървенето при травма, бой или пътнотранспортно произшествие (модел на нараняване). Отрежете 50% от опашката с острие на скалпел и я поставете на въздух за 15 секунди, за да се осигури нормално кървене. Освен това, тестови проби бяха поставени върху опашката на плъх чрез прилагане на натиск (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS). Кървене и PCT бяха докладвани за тестовите проби (n = 3)17,45.
Ефективността на контрола на налягането с NFRCS в бойни условия беше изследвана върху модел на повърхностната бедрена артерия. Бедрената артерия се оголва, пунктира се с троакар 24G и се обезкървява в рамките на 15 секунди. След като се наблюдава неконтролирано кървене, тестовата проба се поставя на мястото на пункцията с прилагане на натиск. Веднага след прилагането на тестовата проба се записва времето на съсирване и се наблюдава хемостатичната ефективност през следващите 5 минути. Същата процедура се повтаря с Cs и Ct46.
Даулинг и др.47 предлагат модел на увреждане на черния дроб, за да се оцени хемостатичният потенциал на хемостатичните материали в контекста на интраоперативно кървене. BCT е регистриран за Ct проби (отрицателна контрола), Cs рамка (положителна контрола), Ch NFRCS проби и Cp NFRCS проби. Супрахепаталната вена кава на плъха е открита чрез извършване на средна лапаротомия. След това дисталната част на левия лоб е изрязана с ножица. Направен е разрез в черния дроб с острие на скалпел и е оставен да кърви няколко секунди. Точно претеглени тестови проби Ch NFRCS и Cp NFRCS са поставени върху увредената повърхност без никакво положително налягане и е регистриран BCT. След това контролната група (Ct) прилага натиск, последван от Cs 30 s47, без да нарушава нараняването.
In vivo анализи на заздравяване на рани бяха проведени с помощта на модел на ексцизионна рана, за да се оценят свойствата на разработените полимерни NFRCS (нефритирани сулфатни превръзки) за заздравяване на рани. Модели на ексцизионни рани бяха избрани и изпълнени съгласно публикувани по-рано методи с малки модификации19,32,48. Всички животни бяха анестезирани, както е описано по-рано. Използва се биопсичен перфоратор (12 mm), за да се направи кръгъл дълбок разрез в кожата на гърба. Подготвените места на раните бяха превързани с Cs (положителна контрола), Ct (като се има предвид, че памучните тампони пречат на заздравяването), Ch NFRCS и Cp NFRCS (експериментална група) и отрицателна контрола без никакво лечение. На всеки ден от изследването площта на раната беше измерена при всички плъхове. Използвайте цифров фотоапарат, за да направите снимка на областта на раната и да поставите нова превръзка. Процентът на затваряне на раната беше измерен по следната формула:
Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъховете от най-добрата група беше изрязана ((Cp NFRCS) и контролната група) и изследвана чрез оцветяване с H&E и трихромно оцветяване на Masson. Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъховете от най-добрата група беше изрязана ((Cp NFRCS) и контролната група) и изследвана чрез оцветяване с H&E и трихромно оцветяване на Masson.Въз основа на процента на затваряне на раната на 12-ия ден от изследването, кожата на плъховете от най-добрата група ((Cp NFRCS) и контролната група) беше изрязана и изследвана чрез оцветяване с хематоксилин-еозин и трихром на Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组＄)Плъховете в най-добрата група ((Cp NFRCS) и контролните групи) бяха изрязани за оцветяване с хематоксилин-еозин и оцветяване с трихром на Masson въз основа на процента затваряне на раната на 12-ия ден от изследването.Приложената процедура за оцветяване беше проведена съгласно предварително описаните методи49,50. Накратко, след фиксиране в 10% формалин, пробите бяха дехидратирани с помощта на серия от градуирани алкохоли. Използва се микротом за получаване на тънки срези (с дебелина 5 µm) от изрязаната тъкан. Тънки серийни срези от контролни проби и Cp NFRCS бяха третирани с хематоксилин и еозин за изследване на хистопатологичните промени. За откриване на образуването на колагенови фибрили беше използвано трихромно оцветяване на Masson. Получените резултати бяха сляпо проучени от патолози.
Стабилността на Cp NFRCS пробите е изследвана при стайна температура (25°C ± 2°C/60% относителна влажност ± 5%) в продължение на 12 месеца51. Cp NFRCS (повърхностно обезцветяване и микробен растеж) е визуално проверена и тествана за устойчивост на износване при сгъване и BCT съгласно горните методи, описани в раздела „Материали и методи“.
Мащабируемостта и възпроизводимостта на Cp NFRCS бяха изследвани чрез приготвяне на Cp NFRCS с размер 15×15 cm2. Освен това, проби от 30 mg (n = 5) бяха изрязани от различни фракции на Cp NFRCS и BCT на изследваните проби беше оценен, както е описано по-рано в раздела „Методи“.
Опитахме се да разработим различни форми и структури, използвайки Cp NFRCS състави за различни биомедицински приложения. Такива форми или конфигурации включват конусовидни тампони за кървене от носа, стоматологични процедури и цилиндрични тампони за вагинално кървене.
Всички набори от данни са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение и са анализирани чрез ANOVA, използвайки Prism 5.03 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ), последвано от тест за множествени сравнения на Bonferroni (*p<0.05).
Всички процедури, извършени в изследвания върху хора, бяха в съответствие със стандартите на Института и Националния изследователски съвет, както и с Декларацията от Хелзинки от 1964 г. и последващите ѝ изменения или подобни етични стандарти. Всички участници бяха информирани за характеристиките на изследването и неговия доброволен характер. Данните за участниците остават поверителни след събирането им. Експерименталният протокол in vitro TEG е прегледан и одобрен от Институционалната етична комисия на Медицинския колеж Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Доброволците подписаха информирано съгласие за събиране на кръвни проби.
Всички процедури, проведени в проучвания върху животни, са проведени в съответствие с изискванията на Медицинския факултет „Кастуба“, Висше образование в Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Всички планирани експерименти с животни са проведени в съответствие с насоките на Комитета за контрол и надзор на експериментите с животни (CPCSEA). Всички автори следват насоките на ARRIVE.
FTIR спектрите на всички NFRCS бяха анализирани и сравнени със спектъра на хитозана, показан на Фигура 2А. Характерни спектрални пикове на хитозана (записани) при 3437 cm-1 (разтягане на OH и NH, припокриване), 2945 и 2897 cm-1 (разтягане на CH), 1660 cm-1 (NH2 деформация), 1589 cm-1 (N–H огъване), 1157 cm-1 (разтягане на моста O-), 1067 cm-1 (разтягане C–O, вторична хидроксилна група), 993 cm-1 (разтягане CO, Bo-OH) 52.53.54. Допълнителна Таблица S1 показва стойностите на FTIR NFRCS абсорбционния спектър за хитозан (репортер), чист хитозан, Cm, Ch и Cp. FTIR спектрите на всички NFRCS (Cm, Ch и Cp) показаха същите характерни абсорбционни ленти като чистия хитозан без значителни промени (Фиг. 2А). Резултатите от FTIR потвърдиха липсата на химични или физични взаимодействия между полимерите, използвани за разработване на NFRCS, което показва, че използваните полимери са инертни.
In vitro характеризиране на Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. (A) представлява комбинираните FTIR спектри на съставите на хитозана и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS под компресия. (B) a) Скорост на поглъщане на Cm, Ch, Cp и Cg от пълна кръв на NFRCS (n = 3); Ct пробите показват по-висок BAR, тъй като памучният тампон има по-висока ефективност на абсорбция; b) Кръв след абсорбция от кръв. Илюстрация на абсорбираната проба. Графично представяне на BCT на тестовата проба C (Cp NFRCS има най-добър BCT (15 s, n = 3)). Данните в C, D, E и G са показани като средна стойност ± SD, а границите на грешките представляват SD, ***p < 0,0001. Данните в C, D, E и G са показани като средна стойност ± SD, а границите на грешките представляват SD, ***p < 0,0001. Данните в C, D, E и G са представени като средно ± стандартно отклонение, а планките с погрешности представляват стандартно отклонение, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G са представени като средна стойност ± стандартно отклонение, а границите на грешките представляват стандартното отклонение, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данните в C, D, E и G са показани като средно значение ± стандартно отклонение, планките погрешности представляват стандартно отклонение, ***p <0,0001. Данните в C, D, E и G са показани като средна стойност ± стандартно отклонение, границите на грешката представляват стандартното отклонение, ***p<0,0001.