Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Неконтрольована кровотеча є однією з провідних причин смерті. Досягнення швидкого гемостазу забезпечує виживання потерпілого як перша допомога під час бойових дій, дорожньо-транспортних пригод та операцій зі зменшення смертності. Нанопористий волокнистий композитний каркас (NFRCS), отриманий з простого гемостатичного плівкоутворюючого складу (HFFC) як безперервної фази, може запускати та посилювати гемостаз. Розробка NFRCS базується на конструкції крила бабки. Структура крила бабки складається з поперечних та поздовжніх крил, а мембрани крила з'єднані одна з одною для збереження цілісності мікроструктури. HFFC рівномірно покриває поверхню волокна плівкою нанометрової товщини та з'єднує випадково розподілену товщину бавовни (Ct) (дисперсна фаза), утворюючи нанопористу структуру. Поєднання безперервної та дисперсної фаз знижує вартість продукту в десять разів порівняно з комерційно доступними продуктами. Модифіковані NFRCS (тампони або браслети) можуть використовуватися в різних біомедичних застосуваннях. Дослідження in vivo показали, що розроблений Cp NFRCS запускає та посилює процес коагуляції в місці застосування. NFRCS може модулювати мікросередовище та діяти на клітинному рівні завдяки своїй нанопористій структурі, що призводить до кращого загоєння ран у моделі ексцизійної рани.
Неконтрольована кровотеча під час бою, інтраопераційних та надзвичайних ситуацій може становити серйозну загрозу для життя поранених1. Ці стани додатково призводять до загального підвищення периферичного судинного опору, що спричиняє геморагічний шок. Відповідні заходи щодо контролю кровотечі під час та після операції вважаються потенційно небезпечними для життя2,3. Пошкодження великих судин призводить до масивної крововтрати, що призводить до рівня смертності ≤ 50% у бою та 31% під час операції1. Масивна крововтрата призводить до зменшення об'єму тіла, що знижує серцевий викид. Збільшення загального периферичного судинного опору та прогресуюче порушення мікроциркуляції призводять до гіпоксії в органах життєзабезпечення. Геморагічний шок може виникнути, якщо стан продовжується без ефективного втручання1,4,5. Інші ускладнення включають прогресування гіпотермії та метаболічного ацидозу, а також порушення згортання крові, яке перешкоджає процесу згортання. Тяжкий геморагічний шок пов'язаний з вищим ризиком смерті6,7,8. При шоці III ступеня (прогресуючому) переливання крові є важливим для виживання пацієнта під час інтраопераційної та післяопераційної захворюваності та смертності. Щоб подолати всі вищезазначені ситуації, що загрожують життю, ми розробили нанопористий композитний каркас, армований волокнами (NFRCS), який використовує мінімальну концентрацію полімеру (0,5%) з використанням комбінації водорозчинних гемостатичних полімерів.
Завдяки використанню волокнистого армування можна розробляти економічно ефективні продукти. Хаотично розташовані волокна нагадують структуру крила бабки, збалансовану горизонтальними та вертикальними смугами на крилах. Поперечні та поздовжні жилки крила сполучаються з мембраною крила (рис. 1). NFRCS складається з армованого Ct як каркасної системи з кращою фізичною та механічною міцністю (рис. 1). Завдяки доступності та майстерності виготовлення, хірурги віддають перевагу використанню бавовняних ниткових калібрів (Ct) під час операцій та перев'язок. Отже, враховуючи його численні переваги, включаючи > 90% кристалічної целюлози (що сприяє посиленню гемостатичної активності), Ct був використаний як скелетна система NFRCS9,10. Отже, враховуючи його численні переваги, включаючи > 90% кристалічної целюлози (що сприяє посиленню гемостатичної активності), Ct був використаний як скелетна система NFRCS9,10. Таким чином, враховуючи його численні переваги, в тому числі > 90% кристалічної целюлози (бере участь у підвищенні гемостатичної активності), Ct використовували в якості скелетної системи NFRCS9,10. Тому, враховуючи його численні переваги, включаючи >90% кристалічної целюлози (що бере участь у підвищенні гемостатичної активності), Ct був використаний як скелетна система NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Тому, враховуючи його численні переваги, включаючи понад 90% кристалічної целюлози (що допомагає посилити гемостатичну активність), Ct був використаний як каркас для NFRCS9,10.Ct був поверхнево покритий (спостерігалося утворення нанотовстої плівки) та з'єднаний з гемостатичним плівкоутворюючим складом (HFFC). HFFC діє як матригель, утримуючи хаотично розміщений Ct разом. Розроблена конструкція передає напруження в межах дисперсної фази (армуючих волокон). Важко отримати нанопористі структури з хорошою механічною міцністю, використовуючи мінімальні концентрації полімерів. Крім того, непросто налаштувати різні форми для різних біомедичних застосувань.
На рисунку показано схему конструкції NFRCS на основі структури крила бабки (A). Це зображення показує порівняльну аналогію структури крила бабки (пересічні та поздовжні жилки крила з'єднані між собою) та поперечний переріз фотомікрографії Cp NFRCS (B). Схематичне зображення NFRCS.
Для усунення вищезазначених обмежень були розроблені плівкоутворювальні гемостатичні композиції (NFRC) з використанням високочастотного флюїду (HFFC) як безперервної фази. HFFC складається з різних плівкоутворюючих гемостатичних полімерів, включаючи хітозан (як основний гемостатичний полімер) з метилцелюлозою (MC), гідроксипропілметилцелюлозою (HPMC 50 cp) та полівініловим спиртом (PVA) (125 kDa) як опорним полімером, що сприяє утворенню тромбів. Додавання полівінілпіролідину K30 (PVP K30) покращило здатність NFRCS до поглинання вологи. Поліетиленгліколь 400 (PEG 400) був доданий для покращення зшивання полімерів у зв'язаних полімерних сумішах. Три різні гемостатичні склади HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC та Cp HFFC), а саме хітозан з MC (Cm), хітозан з HPMC (Ch) та хітозан з PVA (Cp), були застосовані до Ct. Різні дослідження характеристики in vitro та in vivo підтвердили гемостатичну та ранозагоювальну активність NFRCS. Композитні матеріали, що пропонуються NFRCS, можна використовувати для налаштування різних форм риштувань відповідно до конкретних потреб.
Крім того, НФРС можна модифікувати як пов'язку або рулон, щоб покрити всю площу пошкодження нижніх кінцівок та інших частин тіла. Спеціально для бойових травм кінцівок розроблену конструкцію НФРС можна змінити на половину руки або всю ногу (Додатковий малюнок S11). НФРС можна перетворити на браслет з тканинним клеєм, який можна використовувати для зупинки кровотечі від важких суїцидальних травм зап'ястя. Наша головна мета — розробити НФРС з якомога меншою кількістю полімеру, який можна буде доставляти великій групі населення (нижче межі бідності) і який можна буде помістити в аптечку першої допомоги. Простий, ефективний та економічний за конструкцією, НФРС приносить користь місцевим громадам і може мати глобальний вплив.
Хітозан (молекулярна маса 80 кДа) та амарант були придбані у Merck, Індія. Гідроксипропілметилцелюлоза 50 Cp, поліетиленгліколь 400 та метилцелюлоза були придбані у Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбаї. Полівініловий спирт (молекулярна маса 125 кДа) (гідролізований на 87-90%) був придбаний у National Chemicals, Гуджарат. Полівінілпіролідин K30 був придбаний у Molychem, Мумбаї, стерильні тампони були придбані у Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамілнад, з водою Milli Q (система очищення води Direct-Q3, Merck, Індія) як носієм.
NFRCS було розроблено методом ліофілізації11,12. Усі склади HFFC (Таблиця 1) були отримані за допомогою механічної мішалки. Приготували 0,5% розчин хітозану, використовуючи 1% оцтову кислоту у воді, шляхом безперервного перемішування зі швидкістю 800 об/хв на механічній мішалці. Точну вагу завантаженого полімеру, зазначену в Таблиці 1, додали до розчину хітозану та перемішували до отримання прозорого розчину полімеру. PVP K30 та PEG 400 додали до отриманої суміші в кількостях, зазначених у Таблиці 1, та продовжували перемішування до отримання прозорого в'язкого розчину полімеру. Отриману ванну з розчином полімеру обробляли ультразвуком протягом 60 хвилин для видалення захоплених бульбашок повітря з полімерної суміші. Як показано на Додатковому рисунку S1(b), Ct рівномірно розподілили в кожній лунці 6-лункового планшета (форми), доповненого 5 мл HFFC.
Шестилунковий планшет обробляли ультразвуком протягом 60 хвилин для досягнення рівномірного зволоження та розподілу HFFC у мережі Ct. Потім шестилунковий планшет заморожували при температурі -20°C протягом 8-12 годин. Заморожені планшети ліофілізували протягом 48 годин для отримання різних рецептур NFRCS. Така ж процедура використовується для отримання різних форм та структур, таких як тампони або циліндричні тампони, або будь-якої іншої форми для різних застосувань.
Точно зважений хітозан (80 кДа) (3%) розчиняють у 1% оцтовій кислоті за допомогою магнітної мішалки. До отриманого розчину хітозану додають 1% ПЕГ 400 та перемішують протягом 30 хвилин. Отриманий розчин виливають у квадратний або прямокутний контейнер та заморожують при температурі -80°C протягом 12 годин. Заморожені зразки ліофілізують протягом 48 годин для отримання пористого Cs13.
Розроблений NFRCS був підданий експериментам з використанням інфрачервоної спектроскопії з перетворенням Фур'є (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токіо, Японія) для підтвердження хімічної сумісності хітозану з іншими полімерами14,15. FTIR-спектри (ширина спектрального діапазону від 400 до 4000 см-1) усіх протестованих зразків були отримані шляхом виконання 32 сканувань.
Швидкість поглинання кров’ю (ШКК) для всіх рецептур оцінювали за методом, описаним Ченом та ін. 16, з незначними модифікаціями. Розроблені НФРК усіх складів сушили у вакуумній печі при температурі 105°C протягом ночі для видалення залишків розчинника. 30 мг НФРКС (початкова вага зразка – W0) та 30 мг Ct (позитивний контроль) поміщали в окремі чашки, що містили премікс 3,8% цитрату натрію. Через заздалегідь визначені інтервали часу, тобто 5, 10, 20, 30, 40 та 60 секунд, НФРКС видаляли, а їх поверхні очищали від неабсорбованої крові, поміщаючи зразки на Ct на 30 секунд. Кінцеву вагу крові, поглиненої НФРКС 16, вважали (W1) у кожній часовій точці. Розрахуйте відсоток ШКК за такою формулою:
Час згортання крові (ЧЗК) визначали, як повідомляли Ван та ін.17. Час, необхідний для згортання цільної крові (кров щурів, попередньо змішана з 3,8% цитратом натрію) у присутності NFRCS, розраховували як ЧЗК тестового зразка. Різні компоненти NFRCS (30 мг) поміщали у 10-мл флакони з загвинчуваною кришкою та інкубували при 37°C. Кров (0,5 мл) додавали до флакона та 0,3 мл 0,2 М CaCl2 для активації згортання крові. Нарешті, перевертайте флакон кожні 15 секунд (до 180°), доки не утвориться щільний згусток. ЧЗК зразка оцінювали за кількістю перевернутих флаконів17,18. На основі ЧЗК було обрано два оптимальні склади з NFRCS Cm, Ch та Cp для подальших досліджень характеристики.
BCT композицій Ch NFRCS та Cp NFRCS визначали за допомогою методу, описаного Лі та ін. 19. Помістіть 15 x 15 мм2 Ch NFRCS, Cp NFRCS та Cs (позитивний контроль) в окремі чашки Петрі (37 °C). Кров, що містить 3,8% цитрату натрію, змішували з 0,2 M CaCl2 у об'ємному співвідношенні 10:1 для початку процесу згортання крові. 20 мкл суміші крові щурів з 0,2 M CaCl2 наносили на поверхню зразка та поміщали в порожню чашку Петрі. Контролем служила кров, налита в порожні чашки Петрі без Ct. Через фіксовані інтервали 0, 3 та 5 хвилин зупиняйте згортання, додаючи 10 мл деіонізованої (DI) води до зразка, що містить чашку, не порушуючи згусток. Некоагуляні еритроцити (еритроцити) піддаються гемолізу в присутності деіонізованої води та вивільняють гемоглобін. Гемоглобін у різні моменти часу (HA(t)) вимірювали при 540 нм (λmax гемоглобін) за допомогою УФ-Візуального спектрофотометра. Абсолютне поглинання гемоглобіну (AH(0)) за 0 хв 20 мкл крові в 10 мл деіонізованої води було взято за еталонний стандарт. Відносне поглинання гемоглобіну (RHA) згорнутої крові розраховували за співвідношенням HA(t)/HA(0) з використанням тієї ж партії крові.
За допомогою аналізатора текстури (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, США) визначали адгезійні властивості NFRK до пошкодженої тканини. Притиснули циліндричну чашку з відкритим дном до внутрішньої сторони шкіри свині (без шару жиру). Зразки (Ch NFRCS та Cp NFRCS) наносили за допомогою канюлі в циліндричні форми для створення адгезії до шкіри свині. Після 3-хвилинної інкубації при кімнатній температурі (RT) (25°C) фіксували адгезійну міцність NFRCS з постійною швидкістю 0,5 мм/с.
Головною особливістю хірургічних герметиків є підвищення згортання крові при одночасному зменшенні крововтрати. Коагуляцію без втрат при NFRCS оцінювали за допомогою раніше опублікованого методу з незначними модифікаціями 19. Виготовляють мікроцентрифужну пробірку (2 мл) (внутрішній діаметр 10 мм) з отвором 8 × 5 мм2 з одного боку центрифужної пробірки (що представляє відкриту рану). NFRCS використовується для закриття отвору, а стрічка використовується для герметизації зовнішніх країв. Додають 20 мкл 0,2 М CaCl2 до мікроцентрифужної пробірки, що містить 3,8% премікс цитрату натрію. Через 10 хвилин мікроцентрифужні пробірки виймають з чашок, і визначають збільшення маси чашок через відтік крові з NFRK (n = 3). Крововтрату Ch NFRCS та Cp NFRCS порівнюють з Cs.
Вологу цілісність NFRCS визначали на основі методу, описаного Мішрою та Чаудхарі21, з незначними модифікаціями. Помістіть NFRCS у колбу Ерленмейєра об'ємом 100 мл з 50 мл води та перемішуйте протягом 60 секунд, не утворюючи верхньої частини. Візуальний огляд та визначення пріоритетності зразків на фізичну цілісність на основі збору.
Міцність зв'язування HFFC з Ct досліджували за допомогою раніше опублікованих методів з незначними модифікаціями. Цілісність поверхневого покриття оцінювали, піддаючи NFRK впливу акустичних хвиль (зовнішній подразник) у присутності води milliQ (Ct). Розроблені NFRCS Ch NFRCS та Cp NFRCS поміщали в склянку, заповнену водою, та обробляли ультразвуком протягом 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 та 30 хвилин відповідно. Після сушіння відсоткову різницю між початковою та кінцевою вагою NFRCS використовували для розрахунку відсотка втрати матеріалу (HFFC). BCT in vitro додатково підтверджував міцність зв'язування або втрату поверхневих матеріалів. Ефективність зв'язування HFFC з Ct забезпечує коагуляцію крові та еластичне покриття на поверхні Ct22.
Однорідність розробленої структури NFRCS визначалася за допомогою біокорекційного аналізу (BCT) зразків (30 мг), взятих з випадково вибраних загальних місць розташування NFRCS. Дотримуйтесь раніше згаданої процедури BCT, щоб визначити відповідність NFRCS. Близькість між усіма п'ятьма зразками забезпечує рівномірне покриття поверхні та осадження HFFC у сітці Ct.
Номінальну площу контакту з кров'ю (NBCA) визначали, як повідомлялося раніше, з деякими модифікаціями. Кров коагулювали, затискаючи 20 мкл крові між двома поверхнями Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS та Cs. Через 1 годину дві частини стента розділяли та вручну вимірювали площу згустку. Середнє значення трьох повторень вважали NBCA NFRCS19.
Для оцінки ефективності NFRCS (нейтрофічно-компонентної сорбції пари) поглинання води із зовнішнього середовища або з місця пошкодження, що відповідає за ініціювання коагуляції, було використано аналіз динамічної сорбції пари (DVS). DVS оцінює або реєструє поглинання та втрату пари у зразку гравіметрично за допомогою надчутливих ваг з роздільною здатністю за масою ±0,1 мкг. Парціальний тиск пари (відносна вологість) генерується електронним контролером масового потоку навколо зразка шляхом змішування насичених та сухих газів-носіїв. Згідно з рекомендаціями Європейської фармакопеї, на основі відсотка поглинання вологи зразками, зразки були розділені на 4 категорії (0–0,012% w/w – негігроскопічні, 0,2–2% w/w слабогігроскопічні, 2–15% помірно гігроскопічні та > 15% дуже гігроскопічні)23. Згідно з рекомендаціями Європейської фармакопеї, на основі відсотка поглинання вологи зразками, зразки були розділені на 4 категорії (0–0,012% w/w – негігроскопічні, 0,2–2% w/w слабогігроскопічні, 2–15% помірно гігроскопічні та > 15% дуже гігроскопічні)23.Відповідно до рекомендацій Європейської Фармакопеї, залежно від відсотка поглинання вологи зразками, зразки були розділені на 4 категорії (0–0,012% w/w – негігроскопічні, 0,2–2% w/w слабогігроскопічні, 2–п'ятнадцять %).% помірно гігроскопічний і > 15% дуже гігроскопічний)23. % помірно гігроскопічних та > 15% дуже гігроскопічних)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性、0,2-2% мас./мас. 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% В/в- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % в/в 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Відповідно до рекомендацій Європейської Фармакопеї, зразки поділяються на 4 класи залежно від відсотка вологи, що поглинається зразком (0-0,012% за масою – негігроскопічні, 0,2-2% за масою слабогігроскопічні, 2-15% за масою).% помірно гігроскопічний, > 15 % дуже гігроскопічний) 23. % помірно гігроскопічних, > 15% дуже гігроскопічних) 23.Гігроскопічну ефективність NFCS X NFCS та TsN NFCS визначали на аналізаторі DVS TA TGA Q5000 SA. Під час цього процесу визначали час роботи, відносну вологість (RH) та вагу зразка в режимі реального часу при 25°C24. Вміст вологи розраховували за допомогою точного масового аналізу NFRCS за наступним рівнянням:
MC – вологість за даними NFRCS. m1 – суха вага НПЗП. m2 – маса за даними NFRCS у реальному часі за заданої відносної вологості.
Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після спорожнення зразків при 25 °C протягом 10 годин (< 7 × 10–3 Торр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після спорожнення зразків при 25 °C протягом 10 годин (< 7 × 10–3 Торр). Загальна площа поверхні оцінювалася за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідинним азотом після опорожнення зразків при 25 °С протягом 10 годин (< 7 × 10–3 Торр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після того, як зразки спорожняли при 25°C протягом 10 годин (< 7 × 10–3 Торр).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Торр）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Температура 25°C Загальна площа поверхні оцінювалася з використанням експериментів з адсорбції азоту рідинним азотом після опорожнення зразків протягом 10 годин при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експериментів з адсорбції азоту рідким азотом після того, як зразки спорожняли протягом 10 годин при 25°C (< 7 x 10⁻³ торр).Загальну площу поверхні, об'єм пор та розмір пор NFRCS визначали за допомогою Quantachrome від NOVA 1000e, Австрія, з використанням програмного забезпечення RS 232.
Приготуйте 5% еритроцитів (з фізіологічним розчином як розріджувачем) з цільної крові. Потім перенесіть аліквоту HFFC (0,25 мл) у 96-лунковий планшет та 5% масу еритроцитів (0,1 мл). Інкубуйте суміш при 37°C протягом 40 хвилин. Суміш еритроцитів та сироватки вважалася позитивним контролем, а суміш фізіологічного розчину та еритроцитів – негативним контролем. Гемаглютинацію визначали за шкалою Стаїцького. Запропоновані шкали такі: + + + + щільні зернисті агрегати; + + + гладкі нижні подушечки з вигнутими краями; + + гладкі нижні подушечки з рваними краями; + вузькі червоні кільця навколо країв гладких подушечок; – (негативна) дискретна червона кнопка 12 у центрі нижньої лунки.
Гемосумісність НФРС досліджували відповідно до методу Міжнародної організації зі стандартизації (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Гравіметричний метод описано Сінгхом та ін. Були внесені незначні модифікації для оцінки утворення тромбів у присутності або на поверхні НФРС. 500 мг НФРС з Cs, Ch та Cp інкубували у фосфатно-сольовому буфері (PBS) протягом 24 годин при 37°C. Через 24 години PBS видаляли, а НФРС обробляли 2 мл крові, що містить 3,8% цитрату натрію. На поверхню НФРС до інкубованих зразків додавали 0,04 мл 0,1 М CaCl2. Через 45 хвилин додавали 5 мл дистильованої води для зупинки коагуляції. Згорнуту кров на поверхні НФРС обробляли 36-38% розчином формальдегіду. Згустки, зафіксовані формальдегідом, висушували та зважували. Відсоток тромбозу оцінювали, обчислюючи вагу склянки без крові та зразка (негативний контроль) та склянки з кров'ю (позитивний контроль).
Для попереднього підтвердження зразки візуалізували під оптичним мікроскопом, щоб зрозуміти здатність поверхневого покриття HFFC, взаємопов'язаного Ct та мережі Ct утворювати пори. Тонкі зрізи Ch та Cp з NFRCS обрізали лезом скальпеля. Отриманий зріз поміщали на предметне скло, накривали покривним склом, а краї фіксували клеєм. Підготовлені препарати розглядали під оптичним мікроскопом, і фотографували при різному збільшенні.
Відкладення полімерів у мережах Ct візуалізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії на основі методу, описаного Райсом та ін.29. Композицію HFFC, яка використовувалася для рецептури, змішували з флуоресцентним барвником (амарантом), а NFRCS (Ch та Cp) готували згідно з методом, згаданим раніше. Композицію HFFC, яка використовувалася для рецептури, змішували з флуоресцентним барвником (амарантом), а NFRCS (Ch та Cp) готували згідно з методом, згаданим раніше.Композицію HFFC, яка використовувалася для рецептури, змішували з флуоресцентним барвником (амарантом), а NFRCS (Ch та Cp) отримували згідно з раніше згаданим методом.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Композицію HFFC, яка використовувалася у рецептурі, змішували з флуоресцентним барвником (амарант) та отримували NFRCS (Ch та Cp), як згадувалося раніше.З отриманих зразків вирізали тонкі зрізи NFRK, помістили на скляні слайди та накрили покривними скельцями. Розгляньте підготовлені слайди під флуоресцентним мікроскопом, використовуючи зелений фільтр (310-380 нм). Зображення були зроблені при 4-кратному збільшенні, щоб зрозуміти взаємозв'язки Ct та надлишкове відкладення полімерів у мережі Ct.
Топографію поверхні NFRCS Ch та Cp визначали за допомогою атомно-силового мікроскопа (АСМ) з надгострою консоллю TESP у режимі постукування: 42 Н/м, 320 кГц, ROC 2-5 нм, Bruker, Тайвань. Шорсткість поверхні визначали середньоквадратичним відхиленням (RMS) за допомогою програмного забезпечення (Scanning Probe Image Processor). Різні місця розташування NFRCS були відображені на 3D-зображеннях для перевірки однорідності поверхні. Стандартне відхилення оцінки для заданої області визначається як шорсткість поверхні. Рівняння RMS було використано для кількісної оцінки шорсткості поверхні NFRCS31.
Дослідження на основі FESEM були проведені з використанням FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токіо, для розуміння морфології поверхні Ch NFRCS та Cp NFRCS, які показали кращу BCT, ніж Cm NFRCS. Дослідження FESEM було проведено згідно з методом, описаним Zhao et al.32, з незначними модифікаціями. NFRCS. 20-30 мг Ch NFRCS та Cp NFRCS попередньо змішували з 20 мкл 3,8% цитрату натрію, попередньо змішаного з кров'ю щурів. 20 мкл 0,2 M CaCl2 додавали до зразків, оброблених кров'ю, для ініціації коагуляції, та зразки інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Крім того, надлишок еритроцитів видаляли з поверхні NFRCS шляхом промивання фізіологічним розчином.
Наступні зразки обробляли 0,1% глутаральдегідом, а потім сушили в печі з гарячим повітрям при температурі 37°C для видалення вологи. Висушені зразки покривали та аналізували 32. Інші зображення, отримані під час аналізу, включали утворення згустку на поверхні окремих бавовняних волокон, відкладення полімеру між Ct, морфологію (форму) еритроцитів, цілісність згустку та морфологію еритроцитів у присутності NFRCS. Необроблені ділянки NFRCS та ділянки NFRCS, оброблені Ch та Cp, інкубовані з кров'ю, сканували на наявність елементарних іонів (натрій, калій, азот, кальцій, магній, цинк, мідь та селен) 33. Порівняйте відсотки елементарних іонів між обробленими та необробленими зразками, щоб зрозуміти накопичення елементарних іонів під час утворення згустку та його однорідність.
Товщину поверхневого покриття Cp HFFC на поверхні Ct визначали за допомогою FESEM. Поперечні перерізи Cp NFRCS вирізали з каркаса та наносили напилення. Отримані зразки напилення досліджували за допомогою FESEM, а товщину поверхневого покриття вимірювали 34, 35, 36.
Рентгенівська мікро-КТ забезпечує високороздільну 3D-візуалізацію з неруйнівним ефектом та дозволяє вивчати внутрішню структурну організацію NFRK. Мікро-КТ використовує рентгенівський промінь, що проходить через зразок, для реєстрації локального лінійного коефіцієнта ослаблення рентгенівських променів у зразку, що допомагає отримати морфологічну інформацію. Внутрішнє розташування Ct у Cp NFRCS та оброблених кров'ю Cp NFRCS було досліджено за допомогою мікро-КТ, щоб зрозуміти ефективність поглинання та згортання крові у присутності NFRCS37,38,39. 3D-структури зразків оброблених та необроблених кров'ю Cp NFRCS були реконструйовані за допомогою мікро-КТ (V|tome|x S240, Фенікс, Німеччина). Використовуючи програмне забезпечення VG STUDIO-MAX версії 2.2, було зроблено кілька рентгенівських знімків з різних ракурсів (в ідеалі з охопленням 360°) для створення 3D-зображень для NFRCS. Зібрані дані проекцій були реконструйовані в 3D-об'ємні зображення за допомогою відповідного простого програмного забезпечення 3D ScanIP Academic.
Крім того, щоб зрозуміти розподіл згустку, до NFRCS було додано 20 мкл попередньо змішаної цитратної крові та 20 мкл 0,2 М CaCl2 для ініціювання згортання крові. Підготовлені зразки залишили тверднути. Поверхню NFRK обробляли 0,5% глутаральдегідом та сушили в печі з гарячим повітрям при температурі 30–40°C протягом 30 хвилин. Згусток крові, що утворився на NFRCS, сканували, реконструювали та візуалізували його 3D-зображення.
Антибактеріальні аналізи проводили на Cp NFRCS (найкраще порівнювати з Ch NFRCS) за допомогою раніше описаного методу з незначними модифікаціями. Антибактеріальну активність Cp NFRCS та Cp HFFC визначали за допомогою трьох різних тестових мікроорганізмів [S. aureus (грампозитивні бактерії), E. coli (грамнегативні бактерії) та біла Candida (C. albicans)], що ростуть на агарі в чашках Петрі в інкубаторі. Рівномірно інокулюйте 50 мл розведеної суспензії бактеріальної культури в концентрації 105-106 КУО/мл на агарове середовище. Вилийте середовище в чашку Петрі та дайте йому затвердіти. На поверхні агарової чашки зробили лунки для заповнення HFFC (3 лунки для HFFC та 1 для негативного контролю). Додайте 200 мкл HFFC у 3 лунки та 200 мкл PBS з pH 7,4 у 4-ту лунку. З іншого боку чашки Петрі помістіть 12-міліметровий диск Cp NFRCS на затверділий агар та зволожте PBS (pH 7,4). Таблетки ципрофлоксацину, ампіциліну та флуконазолу вважаються еталонними стандартами для Staphylococcus aureus, Escherichia coli та Candida albicans. Виміряйте зону гальмування вручну та зробіть цифрове зображення зони гальмування.
Після схвалення інституційної етики дослідження було проведено в Медичному коледжі освіти та досліджень Кастурби в Маніпалі, Карнатака, на півдні Індії. Протокол експерименту in vitro TEG був розглянутий та схвалений Комітетом з етики Інституційного медичного коледжу Кастурби, Маніпал, Карнатака (IEC: 674/2020). Суб'єкти дослідження були набрані з числа добровольців-донорів крові (віком від 18 до 55 років) з лікарняного банку крові. Крім того, від добровольців було отримано форму інформованої згоди на забір зразків крові. Нативний TEG (N-TEG) ​​був використаний для вивчення впливу рецептури Cp HFFC на цільну кров, попередньо змішану з цитратом натрію. N-TEG широко визнаний за свою роль у реанімації в місцях надання медичної допомоги, що створює проблеми для клініцистів через потенційну клінічно значущу затримку результатів (рутинні тести на коагуляцію). Аналіз N-TEG проводився з використанням цільної крові. Інформовану згоду та детальний анамнез хвороби було отримано від усіх учасників. У дослідженні не брали участі учасники з гемостатичними або тромботичними ускладненнями, такими як вагітність/післяпологовий період або захворювання печінки. Суб'єкти, які приймали препарати, що впливають на каскад згортання крові, також були виключені з дослідження. Усім учасникам було проведено базові лабораторні аналізи (гемоглобін, протромбіновий час, активований тромбопластин та кількість тромбоцитів) відповідно до стандартних процедур. N-TEG визначає в'язкопружність згустку крові, початкову структуру згустку, взаємодію частинок, зміцнення згустку та лізис згустку. N-TEG-аналіз надає графічні та числові дані про сукупний вплив кількох клітинних елементів та плазми. N-TEG-аналіз проводили на двох різних об'ємах Cp HFFC (10 мкл та 50 мкл). В результаті до 10 мкл Cp HFFC було додано 1 мл цільної крові з лимонною кислотою. Додайте 1 мл (Cp HFFC + цитратна кров), 340 мкл змішаної крові до 20 мкл чашки з 0,2 M CaCl2, що містить TEG. Після цього, чашки TEG були завантажені в TEG® 5000, US для вимірювання R, K, кута альфа, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% зразків крові у присутності Cp HFFC41.
Протокол дослідження in vivo був переглянутий та схвалений Інституційним комітетом з етики тварин (IAEC), Медичною школою Кастурби, Вищим інститутом освіти Маніпала, Маніпал (IAEC/KMC/69/2020). Всі експерименти на тваринах проводилися відповідно до рекомендацій Комітету з контролю та нагляду за експериментами на тваринах (CPCSEA). Всі дослідження NFRCS in vivo (2 × 2 см2) проводилися на самках щурів Вістар (вагою від 200 до 250 г). Всіх тварин акліматизували за температури 24-26°C, тварини мали вільний доступ до стандартної їжі та води ad libitum. Всіх тварин випадковим чином розділили на різні групи, кожна група складалася з трьох тварин. Всі дослідження проводилися відповідно до Дослідження на тваринах: Звіт про експерименти in vivo 43. Перед дослідженням тварин анестезували шляхом внутрішньоочеревинного (в/б) введення суміші 20-50 мг кетаміну (на 1 кг маси тіла) та 2-10 мг ксилазину (на 1 кг маси тіла). Після дослідження об'єм кровотечі розраховували, оцінюючи різницю між початковою та кінцевою вагою зразків, за об'єм кровотечі зразка приймали середнє значення, отримане з трьох тестів.
Модель ампутації хвоста щура була застосована для розуміння потенціалу NFRCS для модуляції кровотечі при травмі, бойових діях або дорожньо-транспортних пригодах (модель травми). Відріжте 50% хвоста лезом скальпеля та помістіть його на повітря на 15 секунд, щоб забезпечити нормальну кровотечу. Крім того, тестові зразки розміщували на хвості щура шляхом натискання (Ct, Cs, Ch NFRCS та Cp NFRCS). Кровотеча та PCT були зареєстровані для тестових зразків (n ​​= 3)17,45.
Ефективність контролю тиску за допомогою NFRCS у бою досліджували на моделі поверхневої стегнової артерії. Стегнову артерію оголюють, проколюють троакаром 24G та знекровлюють протягом 15 секунд. Після виявлення неконтрольованої кровотечі досліджуваний зразок поміщають на місце проколу з застосуванням тиску. Відразу після нанесення досліджуваного зразка реєструють час згортання крові та спостерігають за гемостатичною ефективністю протягом наступних 5 хвилин. Таку ж процедуру повторюють з Cs та Ct46.
Доулінг та ін.47 запропонували модель пошкодження печінки для оцінки гемостатичного потенціалу гемостатичних матеріалів у контексті інтраопераційної кровотечі. BCT реєстрували для зразків Ct (негативний контроль), Cs каркасу (позитивний контроль), зразків Ch NFRCS та Cp NFRCS. Надпечінкову порожнисту вену щура оголювали шляхом проведення серединної лапаротомії. Після цього дистальну частину лівої частки вирізали ножицями. Зробіть розріз на печінці лезом скальпеля та дайте їй кровоточити протягом кількох секунд. Точно зважені тестові зразки Ch NFRCS та Cp NFRCS поміщали на пошкоджену поверхню без будь-якого позитивного тиску, і BCT реєстрували. Потім контрольна група (Ct) застосовувала тиск, а потім Cs 30 s47, не порушуючи пошкодження.
Дослідження загоєння ран in vivo проводили з використанням моделі ексцизійної рани для оцінки властивостей загоєння ран розроблених полімерних NFRCS. Моделі ексцизійних ран були відібрані та виконані відповідно до раніше опублікованих методів з незначними модифікаціями19,32,48. Всіх тварин анестезували, як описано раніше. Використовуючи біопсійний пробійник (12 мм), зробили круговий глибокий розріз на шкірі спини. Підготовлені ділянки ран перев'язували Cs (позитивний контроль), Ct (враховуючи, що ватні диски перешкоджають загоєнню), Ch NFRCS та Cp NFRCS (експериментальна група) та негативним контролем без будь-якого лікування. Щодня дослідження у всіх щурів вимірювали площу рани. Використовували цифрову камеру, щоб сфотографувати ділянку рани, та накладали нову пов'язку. Відсоток закриття рани вимірювали за такою формулою:
Виходячи з відсотка закриття рани на 12-й день дослідження, шкіру щурів найкращої групи ((Cp NFRCS) та контрольної групи) було вирізано та досліджено за допомогою фарбування H&E та трихромного фарбування за Массоном. Виходячи з відсотка закриття рани на 12-й день дослідження, шкіру щурів найкращої групи ((Cp NFRCS) та контрольної групи) було вирізано та досліджено за допомогою фарбування H&E та трихромного фарбування за Массоном.Виходячи з відсотка закриття рани на 12-й день дослідження, шкіру щурів найкращої групи ((Cp NFRCS) та контрольної групи) вирізали та досліджували шляхом фарбування гематоксилін-еозином та трихромом Массона.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组＄)Щурів у найкращій групі ((Cp NFRCS) та контрольній групі) видаляли для фарбування гематоксилін-еозином та трихромного фарбування за Массоном на основі відсотка закриття рани на 12-й день дослідження.Запроваджену процедуру фарбування проводили відповідно до раніше описаних методів49,50. Коротко кажучи, після фіксації у 10% формаліні зразки зневоднювали за допомогою серії градуйованих спиртів. Використовували мікротом для отримання тонких зрізів (товщиною 5 мкм) видаленої тканини. Тонкі серійні зрізи контрольних зразків та Cp NFRCS обробляли гематоксиліном та еозином для вивчення гістопатологічних змін. Для виявлення утворення колагенових фібрил використовували трихромне забарвлення за Массоном. Отримані результати були сліпо вивчені патологоанатомами.
Стабільність зразків Cp NFRCS досліджували за кімнатної температури (25°C ± 2°C/60% відносної вологості ± 5%) протягом 12 місяців51. Cp NFRCS (зміна кольору поверхні та ріст мікробів) візуально перевіряли та тестували на стійкість до зносу в складках та BCT відповідно до вищезазначених методів, описаних у розділі «Матеріали та методи».
Масштабованість та відтворюваність Cp NFRCS досліджували шляхом приготування Cp NFRCS розміром 15×15 см2. Крім того, з різних фракцій Cp NFRCS вирізали зразки масою 30 мг (n = 5), а BCT досліджуваних зразків оцінювали, як описано раніше в розділі «Методи».
Ми спробували розробити різні форми та структури з використанням композицій Cp NFRCS для різних біомедичних застосувань. Такі форми або конфігурації включають конічні тампони для носових кровотеч, стоматологічних процедур та циліндричні тампони для вагінальних кровотеч.
Усі набори даних виражені як середнє значення ± стандартне відхилення та були проаналізовані за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA) з використанням Prism 5.03 (GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) з подальшим використанням тесту множинних порівнянь Бонферроні (*p<0,05).
Усі процедури, виконані в дослідженнях на людях, відповідали стандартам Інституту та Національної дослідницької ради, а також Гельсінській декларації 1964 року та її наступним поправкам або аналогічним етичним стандартам. Усіх учасників було поінформовано про особливості дослідження та його добровільний характер. Дані учасників залишаються конфіденційними після збору. Протокол експерименту in vitro TEG був переглянутий та схвалений Комітетом з етики Інституційного медичного коледжу Кастурба, Маніпал, Карнатака (IEC: 674/2020). Волонтери підписали інформовану згоду на збір зразків крові.
Усі процедури, виконані в дослідженнях на тваринах, були виконані відповідно до рекомендацій медичного факультету Кастуби, Інституту вищої освіти Маніпала, Маніпал (IAEC/KMC/69/2020). Усі розроблені експерименти на тваринах були проведені відповідно до рекомендацій Комітету з контролю та нагляду за експериментами на тваринах (CPCSEA). Усі автори дотримуються рекомендацій ARRIVE.
Спектри FTIR усіх NFRCS були проаналізовані та порівняні зі спектром хітозану, показаним на рисунку 2A. Характерні спектральні піки хітозану (записані) при 3437 см-1 (розтяг OH та NH, перекриття), 2945 та 2897 см-1 (розтяг CH), 1660 см-1 (деформація NH2), 1589 см-1 (згинання N–H), 1157 см-1 (розтяг містка O-), 1067 см-1 (розтяг C–O, вторинний гідроксил), 993 см-1 (розтяг CO, Bo-OH) 52.53.54. Додаткова таблиця S1 показує значення спектру поглинання FTIR NFRCS для хітозану (репортер), чистого хітозану, Cm, Ch та Cp. Спектри FTIR усіх NFRCS (Cm, Ch та Cp) показали ті ж характерні смуги поглинання, що й чистий хітозан, без будь-яких суттєвих змін (рис. 2A). Результати ІЧ-спектроскопії з перетворенням Фур'є підтвердили відсутність хімічної або фізичної взаємодії між полімерами, що використовувалися для розробки NFRCS, що свідчить про інертність використаних полімерів.
Характеристика in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS та Cs. (A) представляє комбіновані ІЧ-спектри з перетворенням Фур'є для композицій хітозану та Cm NFRCS, Ch NFRCS та Cp NFRCS під стиском. (B) a) Швидкість поглинання NFRCS Cm, Ch, Cp та Cg у цільній крові (n = 3); Зразки Ct показали вищий рівень BAR, оскільки ватний тампон має вищу ефективність поглинання; b) Кров після поглинання кров'ю. Ілюстрація поглиненого зразка. Графічне представлення BCT тестового зразка C (Cp NFRCS мав найкращий BCT (15 с, n = 3)). Дані в C, D, E та G показані як середнє значення ± стандартне відхилення, а смуги похибок представляють стандартне відхилення, ***p < 0,0001. Дані в C, D, E та G показані як середнє значення ± стандартне відхилення, а смуги похибок представляють стандартне відхилення, ***p < 0,0001. Дані в C, D, E і G представлені як середнє ± стандартне відхилення, а планки погрішностей представляють стандартне відхилення, ***p <0,0001. Дані в C, D, E та G представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, а смуги похибок представляють стандартне відхилення, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Дані в C, D, E і G показані як середнє значення ± стандартне відхилення, планки погрішностей представляють стандартне відхилення, ***p <0,0001. Дані в C, D, E та G показані як середнє значення ± стандартне відхилення, смуги похибок представляють стандартне відхилення, ***p<0,0001.