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El sangrado incontrolado es una de las principales causas de muerte. Lograr una hemostasia rápida garantiza la supervivencia del paciente como medida de primeros auxilios durante el combate, accidentes de tráfico y operaciones de reducción de mortalidad. El andamio compuesto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS), derivado de una composición hemostática formadora de película simple (HFFC) como fase continua, puede desencadenar y mejorar la hemostasia. El desarrollo del NFRCS se basa en el diseño del ala de la libélula. La estructura del ala de la libélula consta de alas transversales y longitudinales, y las membranas de las alas están conectadas entre sí para mantener la integridad de la microestructura. La HFFC recubre uniformemente la superficie de la fibra con una película de espesor nanométrico y conecta el espesor de algodón (Ct) distribuido aleatoriamente (fase dispersa) para formar una estructura nanoporosa. La combinación de fases continua y dispersa reduce el costo del producto diez veces en comparación con los productos disponibles comercialmente. Los NFRCS modificados (tampones o pulseras) pueden utilizarse en diversas aplicaciones biomédicas. Estudios in vivo han concluido que el Cp NFRCS desarrollado activa y potencia el proceso de coagulación en el sitio de aplicación. Gracias a su estructura nanoporosa, el NFRCS puede modular el microambiente y actuar a nivel celular, lo que resulta en una mejor cicatrización de heridas en el modelo de herida por escisión.
El sangrado incontrolado durante el combate, las intervenciones quirúrgicas y las situaciones de emergencia puede representar una grave amenaza para la vida de los heridos¹. Estas condiciones, además, provocan un aumento general de la resistencia vascular periférica, lo que conduce a un choque hemorrágico. Las medidas adecuadas para controlar el sangrado durante y después de la cirugía se consideran potencialmente mortales^2,3. El daño a los grandes vasos produce una pérdida masiva de sangre, lo que resulta en una tasa de mortalidad de ≤ 50 % en combate y del 31 % durante la cirugía¹. La pérdida masiva de sangre produce una disminución del volumen corporal, lo que reduce el gasto cardíaco. Un aumento de la resistencia vascular periférica total y un deterioro progresivo de la microcirculación provocan hipoxia en los órganos vitales. Puede producirse un choque hemorrágico si la condición persiste sin una intervención eficaz^1,4,5. Otras complicaciones incluyen la progresión de la hipotermia y la acidosis metabólica, así como un trastorno de la coagulación que impide el proceso de coagulación. El choque hemorrágico grave se asocia con un mayor riesgo de muerte^6,7,8. En casos de shock de grado III (progresivo), la transfusión sanguínea es esencial para la supervivencia del paciente durante la morbilidad y mortalidad intraoperatoria y postoperatoria. Para superar todas estas situaciones de riesgo vital, hemos desarrollado un andamio compuesto reforzado con fibras nanoporosas (NFRCS) que utiliza una concentración mínima de polímero (0,5 %) mediante una combinación de polímeros hemostáticos solubles en agua.
Mediante el uso de refuerzo de fibra, se pueden desarrollar productos rentables. Las fibras dispuestas aleatoriamente se asemejan a la estructura del ala de una libélula, equilibrada por las franjas horizontales y verticales de las alas. Las venas transversales y longitudinales del ala se comunican con la membrana alar (Fig. 1). El NFRCS consiste en Ct reforzado como un sistema de andamiaje con mayor resistencia física y mecánica (Figura 1). Debido a su asequibilidad y facilidad de fabricación, los cirujanos prefieren utilizar calibres de hilo de algodón (Ct) durante las operaciones y los apósitos. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluyendo > 90% de celulosa cristalina (que contribuye a la mejora de la actividad hemostática), Ct se utilizó como sistema esquelético de NFRCS9,10. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluyendo > 90% de celulosa cristalina (que contribuye a la mejora de la actividad hemostática), Ct se utilizó como sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Por lo tanto, dados sus muchos beneficios, incluido >90% de celulosa cristalina (que participa en una mayor actividad hemostática), Ct se utilizó como el sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Por lo tanto, dados sus muchos beneficios, incluyendo más del 90% de celulosa cristalina (que ayuda a mejorar la actividad hemostática), Ct se utilizó como andamio para NFRCS9,10.El Ct se recubrió superficialmente (se observó la formación de una película nanoespesa) y se interconectó con una composición hemostática formadora de película (HFFC). La HFFC actúa como un Matrigel, manteniendo unidas las partículas de Ct dispuestas aleatoriamente. El diseño desarrollado transmite la tensión dentro de la fase dispersa (fibras de refuerzo). Es difícil obtener estructuras nanoporosas con buena resistencia mecánica utilizando concentraciones mínimas de polímero. Además, no es fácil personalizar diferentes moldes para distintas aplicaciones biomédicas.
La figura muestra un diagrama del diseño del NFRCS basado en la estructura del ala de la libélula (A). Esta imagen muestra una analogía comparativa de la estructura del ala de una libélula (las venas longitudinales y transversales del ala están interconectadas) y una fotomicrografía de sección transversal del NFRCS de Cp (B). Representación esquemática del NFRCS.
Los NFRC se desarrollaron utilizando HFFC como fase continua para abordar las limitaciones anteriores. El HFFC está compuesto por varios polímeros hemostáticos formadores de película, incluido el quitosano (como polímero hemostático principal) con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) y alcohol polivinílico (PVA) (125 kDa) como polímero de soporte que promueve la formación de trombos. La adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mejoró la capacidad de absorción de humedad de los NFRCS. Se agregó polietilenglicol 400 (PEG 400) para mejorar la reticulación del polímero en mezclas de polímeros unidos. Se aplicaron tres composiciones hemostáticas diferentes de HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC y Cp HFFC), a saber, quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) y quitosano con PVA (Cp), a Ct. Varios estudios de caracterización in vitro e in vivo han confirmado la actividad hemostática y de cicatrización de heridas de los NFRCS. Los materiales compuestos que ofrece NFRCS pueden utilizarse para personalizar diversos tipos de andamios y adaptarlos a necesidades específicas.
Además, el NFRCS puede modificarse para usarse como vendaje o rollo y cubrir toda la zona lesionada de las extremidades inferiores y otras partes del cuerpo. Específicamente para lesiones de extremidades en combate, el diseño del NFRCS puede adaptarse para cubrir medio brazo o pierna completa (Figura complementaria S11). El NFRCS puede transformarse en una muñequera con adhesivo tisular, que puede utilizarse para detener el sangrado en casos de lesiones graves de muñeca. Nuestro principal objetivo es desarrollar un NFRCS con la menor cantidad de polímero posible, accesible a una gran población (por debajo del umbral de pobreza) y que pueda incluirse en un botiquín de primeros auxilios. De diseño sencillo, eficiente y económico, el NFRCS beneficia a las comunidades locales y puede tener un impacto global.
El quitosano (peso molecular 80 kDa) y el amaranto se adquirieron de Merck, India. La hidroxipropilmetilcelulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 y la metilcelulosa se adquirieron de Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. El alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90% hidrolizado) se adquirió de National Chemicals, Gujarat. La polivinilpirrolidina K30 se adquirió de Molychem, Mumbai, y los hisopos estériles se adquirieron de Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con agua Milli Q (sistema de purificación de agua Direct-Q3, Merck, India) como portador.
NFRCS se desarrolló utilizando un método de liofilización11,12. Todas las composiciones de HFFC (Tabla 1) se prepararon utilizando un agitador mecánico. Prepare una solución de quitosano al 0,5% utilizando ácido acético al 1% en agua mediante agitación continua a 800 rpm en un agitador mecánico. El peso exacto del polímero cargado indicado en la Tabla 1 se añadió a la solución de quitosano y se agitó hasta obtener una solución de polímero transparente. PVP K30 y PEG 400 se añadieron a la mezcla resultante en las cantidades indicadas en la Tabla 1, y se continuó agitando hasta obtener una solución de polímero viscosa transparente. El baño resultante de solución de polímero se sonicó durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la mezcla de polímero. Como se muestra en la Figura suplementaria S1(b), Ct se distribuyó uniformemente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (molde) suplementada con 5 ml de HFFC.
La placa de seis pocillos se sonicó durante 60 minutos para lograr una humectación y distribución uniformes del HFFC en la red de Ct. A continuación, se congeló a -20 °C durante 8-12 horas. Las placas congeladas se liofilizaron durante 48 horas para obtener diversas formulaciones de NFRCS. Este mismo procedimiento se utiliza para producir diferentes formas y estructuras, como tampones o tampones cilíndricos, o cualquier otra forma para distintas aplicaciones.
Se disolvió quitosano (80 kDa) (3%), pesado con precisión, en ácido acético al 1% utilizando un agitador magnético. A la solución resultante se le añadió PEG 400 al 1% y se agitó durante 30 minutos. La solución se vertió en un recipiente cuadrado o rectangular y se congeló a -80 °C durante 12 horas. Las muestras congeladas se liofilizaron durante 48 horas para obtener Cs13 poroso.
El NFRCS desarrollado fue sometido a experimentos utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japón) para confirmar la compatibilidad química del quitosano con otros polímeros14,15. Los espectros FTIR (ancho del rango espectral de 400 a 4000 cm-1) de todas las muestras analizadas se obtuvieron realizando 32 barridos.
La tasa de absorción sanguínea (TAS) para todas las formulaciones se evaluó utilizando el método descrito por Chen et al. 16 con ligeras modificaciones. Los NFRK desarrollados de todas las composiciones se secaron en un horno de vacío a 105 °C durante toda la noche para eliminar el disolvente residual. Se colocaron 30 mg de NFRCS (peso inicial de la muestra – W0) y 30 mg de Ct (control positivo) en recipientes separados que contenían una premezcla de citrato de sodio al 3,8 %. A intervalos de tiempo predeterminados, es decir, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 segundos, se retiraron los NFRCS y se limpiaron sus superficies de sangre no absorbida colocando las muestras sobre Ct durante 30 segundos. El peso final de sangre absorbida por NFRCS 16 se consideró (W1) en cada punto de tiempo. Calcule el porcentaje de TAS utilizando la siguiente fórmula:
El tiempo de coagulación sanguínea (TCS) se determinó según lo informado por Wang et al. 17. El tiempo requerido para que la sangre entera (sangre de rata premezclada con citrato de sodio al 3,8 %) coagulara en presencia de NFRCS se calculó como el TCS de la muestra de prueba. Los diversos componentes de NFRCS (30 mg) se colocaron en viales de 10 ml con tapón de rosca y se incubaron a 37 °C. Se agregó sangre (0,5 ml) al vial y se agregaron 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M para activar la coagulación sanguínea. Finalmente, se invirtió el vial cada 15 segundos (hasta 180°) hasta que se formó un coágulo firme. El TCS de la muestra se estima por el número de giros de los viales17,18. Con base en el TCS, se seleccionaron dos composiciones óptimas de NFRCS Cm, Ch y Cp para estudios de caracterización adicionales.
El BCT de las composiciones de Ch NFRCS y Cp NFRCS se determinó implementando el método descrito por Li et al. 19. Coloque 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (control positivo) en placas de Petri separadas (37 °C). Se mezcló sangre que contenía 3,8% de citrato de sodio con 0,2 M de CaCl2 en una proporción de volumen de 10:1 para iniciar el proceso de coagulación sanguínea. Se aplicaron 20 µl de la mezcla de sangre de rata 0,2 M de CaCl2 a la superficie de la muestra y se colocó en una placa de Petri vacía. El control fue sangre vertida en placas de Petri vacías sin Ct. A intervalos fijos de 0, 3 y 5 minutos, detenga la coagulación agregando 10 ml de agua desionizada (DI) a la muestra que contenía la placa sin perturbar el coágulo. Los eritrocitos no coagulados (eritrocitos) sufren hemólisis en presencia de agua desionizada y liberan hemoglobina. La hemoglobina en diferentes momentos (HA(t)) se midió a 540 nm (λmax hemoglobina) mediante un espectrofotómetro UV-Vis. La absorbancia absoluta de la hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sangre en 10 ml de agua desionizada se tomó como referencia. La captación relativa de hemoglobina (RHA) de la sangre coagulada se calculó a partir de la relación HA(t)/HA(0) utilizando el mismo lote de sangre.
Utilizando un analizador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EE. UU.), se determinaron las propiedades adhesivas de NFRK al tejido dañado. Presione un plato cilíndrico de fondo abierto contra el interior de la piel de cerdo (sin la capa de grasa). Las muestras (Ch NFRCS y Cp NFRCS) se aplicaron mediante cánula en moldes cilíndricos para crear adhesión a la piel del cerdo. Después de una incubación de 3 minutos a temperatura ambiente (TA) (25 °C), la fuerza adhesiva de NFRCS se registró a una velocidad constante de 0,5 mm/seg.
La característica principal de los selladores quirúrgicos es aumentar la coagulación sanguínea mientras se reduce la pérdida de sangre. La coagulación sin pérdida en NFRCS se evaluó utilizando un método publicado previamente con ligeras modificaciones 19. Haga un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interno 10 mm) con un orificio de 8 × 5 mm2 en un lado del tubo de centrífuga (que representa una herida abierta). Se utiliza NFRCS para cerrar la abertura y cinta adhesiva para sellar los bordes externos. Agregue 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tubo de microcentrífuga que contiene la premezcla de citrato de sodio al 3,8 %. Después de 10 minutos, los tubos de microcentrífuga se retiraron de las placas y se determinó el aumento en la masa de las placas debido al flujo de sangre de la NFRK (n = 3). La pérdida de sangre Ch NFRCS y Cp NFRCS se compararon con Cs.
La integridad en húmedo de NFRCS se determinó según el método descrito por Mishra y Chaudhary21 con modificaciones menores. Coloque el NFRCS en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de agua y agite durante 60 s sin que se forme una capa superior. Inspección visual y priorización de muestras para la integridad física según el orden de recolección.
Se estudió la fuerza de unión de HFFC a Ct utilizando métodos previamente publicados con modificaciones menores. La integridad del recubrimiento superficial se evaluó exponiendo NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) en presencia de agua milliQ (Ct). Los NFRCS Ch y Cp desarrollados se colocaron en un vaso de precipitados lleno de agua y se sonicaron durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 30 min, respectivamente. Después del secado, la diferencia porcentual entre el peso inicial y final de los NFRCS se utilizó para calcular el porcentaje de pérdida de material (HFFC). La prueba BCT in vitro respaldó aún más la fuerza de unión o la pérdida de materiales superficiales. La eficiencia de la unión de HFFC a Ct proporciona coagulación sanguínea y un recubrimiento elástico en la superficie de Ct22.
La homogeneidad del NFRCS desarrollado se determinó mediante la prueba de conformidad biológica (BCT) de muestras (30 mg) tomadas de ubicaciones generales seleccionadas aleatoriamente del NFRCS. Siga el procedimiento BCT mencionado anteriormente para determinar el cumplimiento del NFRCS. La proximidad entre las cinco muestras garantiza una cobertura superficial uniforme y la deposición de HFFC en la malla Ct.
El área nominal de contacto con la sangre (NBCA) se determinó según lo descrito previamente, con algunas modificaciones. Se coaguló la sangre mediante la oclusión de 20 µl de sangre entre las superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. Tras una hora, se separaron las dos partes del stent y se midió manualmente el área del coágulo. El valor promedio de tres repeticiones se consideró como NBCA NFRCS19.
Se utilizó el análisis de sorción dinámica de vapor (DVS) para evaluar la eficacia del NFRCS en la absorción de agua del entorno externo o del sitio de la lesión responsable del inicio de la coagulación. El DVS evalúa o registra la absorción y la pérdida de vapor en una muestra gravimétricamente mediante una balanza ultrasensible con una resolución de masa de ±0,1 µg. Un controlador electrónico de flujo másico genera una presión parcial de vapor (humedad relativa) alrededor de la muestra mediante la mezcla de gases portadores saturados y secos. Según las directrices de la Farmacopea Europea, en función del porcentaje de absorción de humedad de las muestras, estas se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p: no higroscópicas, 0,2–2 % p/p: ligeramente higroscópicas, 2–15 %: moderadamente higroscópicas y > 15 %: muy higroscópicas)23. Según las directrices de la Farmacopea Europea, en función del porcentaje de absorción de humedad de las muestras, estas se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p: no higroscópicas, 0,2–2 % p/p: ligeramente higroscópicas, 2–15 %: moderadamente higroscópicas y > 15 %: muy higroscópicas)23.De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de absorción de humedad de las muestras, estas se dividieron en 4 categorías (0–0,012 % p/p – no higroscópicas, 0,2–2 % p/p ligeramente higroscópicas, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico y > 15 % muy higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% p/p- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% p/p 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23.De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, las muestras se dividen en 4 clases según el porcentaje de humedad absorbida (0-0,012 % en peso: no higroscópica; 0,2-2 % en peso: ligeramente higroscópica; 2-15 % en peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15 % muy higroscópico) 23.La eficiencia higroscópica de NFCS X NFCS y TsN NFCS se determinó en un analizador DVS TA TGA Q5000 SA. Durante este proceso, se obtuvieron el tiempo de ejecución, la humedad relativa (HR) y el peso de la muestra en tiempo real a 25 °C. El contenido de humedad se calcula mediante un análisis de masa preciso de NFCS utilizando la siguiente ecuación:
MC es la humedad del NFRCS. m1 – peso seco de los AINE. m2 es la masa del NFRCS en tiempo real a una HR determinada.
El área superficial total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). El área superficial total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С en течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). El área superficial total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。a 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). El área superficial total se estimó utilizando experimentos de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras durante 10 horas a 25 °C (< 7 x 10⁻³ torr).La superficie total, el volumen de poros y el tamaño de poro según la norma NFRCS se determinaron con un Quantachrome de NOVA 1000e, Austria, utilizando el software RS 232.
Prepare un 5% de glóbulos rojos (solución salina como diluyente) a partir de sangre total. Luego transfiera una alícuota de HFFC (0,25 ml) a una placa de 96 pocillos y una masa de glóbulos rojos al 5% (0,1 ml). Incube la mezcla a 37 °C durante 40 minutos. Una mezcla de glóbulos rojos y suero se consideró como control positivo, y una mezcla de solución salina y glóbulos rojos como control negativo. La hemaglutinación se determinó según la escala de Stajitzky. Las escalas propuestas son las siguientes: + + + + agregados granulares densos; + + + almohadillas de fondo liso con bordes curvos; + + almohadillas de fondo liso con bordes rasgados; + anillos rojos estrechos alrededor de los bordes de las almohadillas lisas; – (negativo) botón rojo discreto 12 en el centro del pocillo inferior.
La hemocompatibilidad de NFRCS se estudió según el método de la Organización Internacional de Normalización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. El método gravimétrico descrito por Singh et al. Se hicieron modificaciones menores para evaluar la formación de trombos en presencia de o en la superficie de NFRCS. 500 mg de Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 37 °C. Después de 24 horas, se retiró el PBS y NFRCS se trató con 2 ml de sangre que contenía 3,8 % de citrato de sodio. En la superficie de NFRCS, se agregaron 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a las muestras incubadas. Después de 45 minutos, se agregaron 5 ml de agua destilada para detener la coagulación. La sangre coagulada en la superficie de NFRK se trató con una solución de formaldehído al 36-38 %. Los coágulos fijados con formaldehído se secaron y pesaron. El porcentaje de trombosis se estimó calculando el peso del vaso sin sangre ni muestra (control negativo) y del vaso con sangre (control positivo).
Como confirmación inicial, las muestras se observaron bajo un microscopio óptico para comprender la capacidad del recubrimiento superficial HFFC, la interconexión Ct y la red Ct para formar poros. Se cortaron secciones delgadas de Ch y Cp de NFRCS con una hoja de bisturí. La sección resultante se colocó sobre un portaobjetos, se cubrió con un cubreobjetos y se fijaron los bordes con pegamento. Los portaobjetos preparados se observaron bajo un microscopio óptico y se tomaron fotografías a diferentes aumentos.
La deposición de polímeros en redes de Ct se visualizó utilizando microscopía de fluorescencia basada en el método descrito por Rice et al.29. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto), y los NFRCS (Ch y Cp) se prepararon según el método mencionado anteriormente. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto), y los NFRCS (Ch y Cp) se prepararon según el método mencionado anteriormente.La composición HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se obtuvo NFRCS (Ch y Cp) según el método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。La composición de HFFC utilizada en la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y recibió NFRCS (Ch y Cp), como se mencionó anteriormente.Se cortaron secciones delgadas de NFRK de las muestras obtenidas, se colocaron en portaobjetos de vidrio y se cubrieron con cubreobjetos. Las preparaciones se observaron bajo un microscopio de fluorescencia con un filtro verde (310-380 nm). Se tomaron imágenes con un aumento de 4x para comprender las relaciones de Ct y la deposición excesiva de polímero en la red de Ct.
La topografía superficial de NFRCS Ch y Cp se determinó mediante un microscopio de fuerza atómica (AFM) con una punta TESP ultraafilada en modo de contacto intermitente: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwán. La rugosidad superficial se determinó mediante la raíz cuadrática media (RMS) utilizando un software (Scanning Probe Image Processor). Se representaron varias ubicaciones de NFRCS en imágenes 3D para comprobar la uniformidad de la superficie. La desviación estándar de la puntuación para un área determinada se define como la rugosidad superficial. La ecuación RMS se utilizó para cuantificar la rugosidad superficial de NFRCS31.
Se realizaron estudios basados ​​en FESEM utilizando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, para comprender la morfología de la superficie de Ch NFRCS y Cp NFRCS, que mostraron mejor BCT que Cm NFRCS. El estudio FESEM se realizó de acuerdo con el método descrito por Zhao et al. 32 con modificaciones menores. NFRCS 20 a 30 mg Ch NFRCS y Cp NFRCS se premezclaron con 20 µl de citrato de sodio al 3,8% premezclado con sangre de rata. Se agregaron 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M a las muestras tratadas con sangre para iniciar la coagulación y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Además, se eliminaron los eritrocitos en exceso de la superficie de NFRCS mediante lavado con solución salina.
Las muestras subsiguientes se trataron con glutaraldehído al 0,1 % y luego se secaron en un horno de aire caliente a 37 °C para eliminar la humedad. Las muestras secas se recubrieron y analizaron 32. Otras imágenes obtenidas durante el análisis fueron la formación de coágulos en la superficie de fibras de algodón individuales, la deposición de polímero entre Ct, la morfología de los eritrocitos (forma), la integridad del coágulo y la morfología de los eritrocitos en presencia de NFRCS. Las áreas de NFRCS no tratadas y las áreas de NFRCS tratadas con Ch y Cp incubadas con sangre se escanearon para iones elementales (sodio, potasio, nitrógeno, calcio, magnesio, zinc, cobre y selenio)33. Compare los porcentajes de iones elementales entre las muestras tratadas y no tratadas para comprender la acumulación de iones elementales durante la formación del coágulo y la homogeneidad del coágulo.
El espesor del recubrimiento superficial de Cp HFFC sobre la superficie de Ct se determinó mediante FESEM. Las secciones transversales de Cp NFRCS se cortaron de la estructura y se recubrieron por pulverización catódica. Las muestras de recubrimiento resultantes se observaron mediante FESEM y se midió el espesor del recubrimiento superficial 34, 35, 36.
La micro-CT de rayos X proporciona imágenes 3D no destructivas de alta resolución y permite estudiar la disposición estructural interna de NFRK. La micro-CT utiliza un haz de rayos X que atraviesa la muestra para registrar el coeficiente de atenuación lineal local de los rayos X en la muestra, lo que ayuda a obtener información morfológica. La ubicación interna de Ct en Cp NFRCS y Cp NFRCS tratadas con sangre se examinó mediante micro-CT para comprender la eficiencia de absorción y la coagulación sanguínea en presencia de NFRCS37,38,39. Las estructuras 3D de las muestras de Cp NFRCS tratadas y no tratadas con sangre se reconstruyeron utilizando micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Alemania). Utilizando el software VG STUDIO-MAX versión 2.2, se tomaron varias imágenes de rayos X desde diferentes ángulos (idealmente una cobertura de 360°) para desarrollar imágenes 3D para NFRCS. Los datos de proyección recopilados se reconstruyeron en imágenes volumétricas 3D utilizando el software 3D ScanIP Academic correspondiente.
Además, para comprender la distribución del coágulo, se añadieron 20 µl de sangre citratada premezclada y 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al NFRCS para iniciar la coagulación sanguínea. Las muestras preparadas se dejaron endurecer. La superficie de NFRK se trató con glutaraldehído al 0,5 % y se secó en un horno de aire caliente a 30–40 °C durante 30 minutos. El coágulo sanguíneo formado en el NFRCS se escaneó, se reconstruyó y se visualizó una imagen 3D del mismo.
Se realizaron ensayos antibacterianos en Cp NFRCS (mejor comparado con Ch NFRCS) utilizando el método descrito previamente con modificaciones menores. La actividad antibacteriana de Cp NFRCS y Cp HFFC se determinó utilizando tres microorganismos de prueba diferentes [S. aureus (bacteria grampositiva), E. coli (bacteria gramnegativa) y Candida blanca (C. albicans)] que crecían en agar en placas de Petri en una incubadora. Inocular uniformemente 50 ml de la suspensión de cultivo bacteriano diluida a una concentración de 105-106 UFC ml-1 en el medio de agar. Verter el medio en una placa de Petri y dejar que se solidifique. Se hicieron pozos en la superficie de la placa de agar para llenar con HFFC (3 pozos para HFFC y 1 para control negativo). Agregar 200 µl de HFFC a 3 pozos y 200 µl de PBS pH 7.4 al cuarto pozo. En el otro lado de la placa de Petri, coloque un disco de Cp NFRCS de 12 mm sobre el agar solidificado y humedezca con PBS (pH 7,4). Los comprimidos de ciprofloxacino, ampicilina y fluconazol se consideran estándares de referencia para Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans. Mida manualmente la zona de inhibición y tome una fotografía digital de la misma.
Tras la aprobación ética institucional, el estudio se llevó a cabo en el Kasturba Medical College of Education and Research en Manipal, Karnataka, en el sur de la India. El protocolo experimental de TEG in vitro fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Los sujetos fueron reclutados entre donantes de sangre voluntarios (de 18 a 55 años) del banco de sangre del hospital. Además, se obtuvo un formulario de consentimiento informado de los voluntarios para la recolección de muestras de sangre. Se utilizó TEG nativo (N-TEG) ​​para estudiar el efecto de la formulación Cp HFFC en sangre total premezclada con citrato de sodio. El N-TEG es ampliamente reconocido por su papel en la reanimación en el punto de atención, lo que genera problemas para los clínicos debido al potencial retraso clínicamente significativo en los resultados (pruebas de coagulación de rutina). El análisis de N-TEG se realizó utilizando sangre total. Se obtuvo el consentimiento informado y el historial médico detallado de todos los participantes. El estudio no incluyó participantes con complicaciones hemostáticas o trombóticas como embarazo/posparto o enfermedad hepática. Los sujetos que tomaban medicamentos que afectan la cascada de coagulación también fueron excluidos del estudio. Se realizaron pruebas de laboratorio básicas (hemoglobina, tiempo de protrombina, tromboplastina activada y recuento de plaquetas) a todos los participantes de acuerdo con los procedimientos estándar. N-TEG determina la viscoelasticidad del coágulo sanguíneo, la estructura inicial del coágulo, la interacción de partículas, el fortalecimiento del coágulo y la lisis del coágulo. El análisis N-TEG proporciona datos gráficos y numéricos sobre los efectos colectivos de varios elementos celulares y plasma. El análisis N-TEG se realizó en dos volúmenes diferentes de Cp HFFC (10 µl y 50 µl). Como resultado, se agregó 1 ml de sangre entera con ácido cítrico a 10 µl de Cp HFFC. Agregar 1 ml (Cp HFFC + sangre citratada), 340 µl de sangre mixta a 20 µl de placa TEG que contenía CaCl2 0,2 ​​M. Posteriormente, las placas TEG se cargaron en el TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% de muestras de sangre en presencia de Cp HFFC41.
El protocolo del estudio in vivo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (CAIA), Facultad de Medicina Kasturba, Instituto Manipal de Educación Superior, Manipal (CAIA/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Comité para el Control y la Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA). Todos los estudios NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) se realizaron en ratas Wistar hembras (con un peso de 200 a 250 g). Todos los animales fueron aclimatados a una temperatura de 24-26 °C, y tuvieron libre acceso a alimento estándar y agua ad libitum. Todos los animales fueron divididos aleatoriamente en diferentes grupos, cada grupo constaba de tres animales. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con Estudios con animales: Informe de experimentos in vivo 43. Antes del estudio, los animales fueron anestesiados mediante la administración intraperitoneal (ip) de una mezcla de 20-50 mg de ketamina (por kg de peso corporal) y 2-10 mg de xilacina (por kg de peso corporal). Tras el estudio, se calculó el volumen de sangrado evaluando la diferencia entre el peso inicial y final de las muestras; el valor promedio obtenido de las tres pruebas se consideró como el volumen de sangrado de la muestra.
Se implementó el modelo de amputación de cola de rata para comprender el potencial de NFRCS para modular el sangrado en traumatismos, combate o accidentes de tráfico (modelo de lesión). Se cortó el 50% de la cola con una hoja de bisturí y se colocó en el aire durante 15 s para asegurar un sangrado normal. Además, se colocaron muestras de prueba en la cola de una rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS). Se informó el sangrado y el PCT para las muestras de prueba (n ​​= 3)17,45.
Se investigó la eficacia del control de presión del NFRCS en combate mediante un modelo de la arteria femoral superficial. Se expuso la arteria femoral, se puncionó con un trocar de 24G y se desangró en 15 segundos. Tras observar un sangrado incontrolado, se colocó la muestra de prueba en el punto de punción, aplicando presión. Inmediatamente después de la aplicación de la muestra, se registró el tiempo de coagulación y se observó la eficacia hemostática durante los siguientes 5 minutos. El mismo procedimiento se repitió con Cs y Ct46.
Dowling et al. 47 propusieron un modelo de lesión hepática para evaluar el potencial hemostático de los materiales hemostáticos en el contexto de sangrado intraoperatorio. Se registró el BCT para muestras de Ct (control negativo), marco de Cs (control positivo), muestras de Ch NFRCS y muestras de Cp NFRCS. La vena cava suprahepática de la rata se expuso mediante una laparotomía mediana. Después, se cortó la parte distal del lóbulo izquierdo con tijeras. Se hizo una incisión en el hígado con una hoja de bisturí y se dejó sangrar durante unos segundos. Las muestras de prueba de Ch NFRCS y Cp NFRCS pesadas con precisión se colocaron sobre la superficie dañada sin ninguna presión positiva y se registró el BCT. Al grupo control (Ct) se le aplicó presión seguida de Cs 30 s47 sin romper la lesión.
Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas in vivo utilizando un modelo de herida por escisión para evaluar las propiedades de cicatrización de las NFRCS basadas en polímeros desarrolladas. Los modelos de heridas por escisión se seleccionaron y realizaron de acuerdo con métodos publicados previamente con modificaciones menores19,32,48. Todos los animales fueron anestesiados como se describió anteriormente. Se utilizó un punzón de biopsia (12 mm) para hacer una incisión circular profunda en la piel del dorso. Los sitios de la herida preparados se cubrieron con Cs (control positivo), Ct (reconociendo que las almohadillas de algodón interfieren con la cicatrización), Ch NFRCS y Cp NFRCS (grupo experimental) y un control negativo sin ningún tratamiento. En cada día del estudio, se midió el área de la herida en todas las ratas. Se utilizó una cámara digital para tomar una fotografía del área de la herida y se colocó un nuevo apósito. El porcentaje de cierre de la herida se midió mediante la siguiente fórmula:
Basándose en el porcentaje de cierre de la herida al duodécimo día del estudio, se extirpó la piel de la rata del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se estudió mediante tinción con H&E y tinción tricrómica de Masson. Basándose en el porcentaje de cierre de la herida al duodécimo día del estudio, se extirpó la piel de la rata del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se estudió mediante tinción con H&E y tinción tricrómica de Masson.Basándose en el porcentaje de cierre de la herida al duodécimo día del estudio, se extirpó la piel de las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se examinó mediante tinción con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y los grupos de control) fueron extirpadas para tinción con hematoxilina-eosina y tinción tricrómica de Masson según el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio.El procedimiento de tinción se llevó a cabo según métodos previamente descritos49,50. Brevemente, tras la fijación en formalina al 10%, las muestras se deshidrataron mediante una serie de alcoholes de concentración creciente. Se utilizaron microtomos para obtener cortes finos (5 µm de espesor) del tejido extirpado. Los cortes seriados finos de los controles y de los Cp NFRCS se tiñeron con hematoxilina y eosina para estudiar los cambios histopatológicos. La tinción tricrómica de Masson se utilizó para detectar la formación de fibrillas de colágeno. Los resultados obtenidos fueron estudiados a ciegas por patólogos.
La estabilidad de las muestras de Cp NFRCS se estudió a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60 % HR ± 5 %) durante 12 meses51. El Cp NFRCS (decoloración de la superficie y crecimiento microbiano) se inspeccionó visualmente y se probó para la resistencia al desgaste por plegado y BCT de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en la sección de Materiales y Métodos.
Se examinó la escalabilidad y la reproducibilidad de Cp NFRCS preparando Cp NFRCS con un tamaño de 15×15 cm2. Además, se extrajeron muestras de 30 mg (n = 5) de varias fracciones de Cp NFRCS y se evaluó el BCT de las muestras estudiadas como se describió anteriormente en la sección de Métodos.
Hemos intentado desarrollar diversas formas y estructuras utilizando composiciones de Cp NFRCS para diversas aplicaciones biomédicas. Dichas formas o configuraciones incluyen hisopos cónicos para hemorragias nasales y procedimientos dentales, e hisopos cilíndricos para sangrado vaginal.
Todos los conjuntos de datos se expresan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante ANOVA utilizando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (*p<0,05).
Todos los procedimientos realizados en los estudios con seres humanos se ajustaron a las normas del Instituto y del Consejo Nacional de Investigación, así como a la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores, o a normas éticas similares. Todos los participantes fueron informados sobre las características del estudio y su carácter voluntario. Los datos de los participantes se mantienen confidenciales una vez recopilados. El protocolo experimental de TEG in vitro fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Los voluntarios firmaron un consentimiento informado para la toma de muestras de sangre.
Todos los procedimientos realizados en los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Facultad de Medicina Kastuba del Instituto Manipal de Educación Superior (IAEC/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales se diseñaron y realizaron de acuerdo con las directrices del Comité para el Control y la Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA). Todos los autores siguen las directrices ARRIVE.
Los espectros FTIR de todos los NFRCS se analizaron y compararon con el espectro de quitosano que se muestra en la Figura 2A. Picos espectrales característicos del quitosano (registrados) en 3437 cm-1 (estiramiento OH y NH, superposición), 2945 y 2897 cm-1 (estiramiento CH), 1660 cm-1 (tensión NH2), 1589 cm-1 (flexión N–H), 1157 cm-1 (estiramiento puente O-), 1067 cm-1 (estiramiento C–O, hidroxilo secundario), 993 cm-1 (estiramiento CO, Bo-OH) 52.53.54. La Tabla suplementaria S1 muestra los valores del espectro de absorción FTIR NFRCS para quitosano (reportero), quitosano puro, Cm, Ch y Cp. Los espectros FTIR de todos los NFRCS (Cm, Ch y Cp) mostraron las mismas bandas de absorción características que el quitosano puro, sin cambios significativos (Fig. 2A). Los resultados de FTIR confirmaron la ausencia de interacciones químicas o físicas entre los polímeros utilizados para desarrollar los NFRCS, lo que indica que dichos polímeros son inertes.
Caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. (A) representa los espectros FTIR combinados de las composiciones de quitosano y Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS bajo compresión. (B) a) Tasa de absorción de sangre total de NFRCS Cm, Ch, Cp y Cg (n = 3); Las muestras Ct mostraron un BAR más alto porque el hisopo de algodón tiene una mayor eficiencia de absorción; b) Sangre después de la absorción de sangre Ilustración de la muestra absorbida. Representación gráfica del BCT de la muestra de prueba C (Cp NFRCS tuvo el mejor BCT (15 s, n = 3)). Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± DE, y las barras de error representan la DE, ***p < 0,0001. Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± DE, y las barras de error representan la DE, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E and G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p<0,0001. Los datos en C, D, E y G se presentan como media ± desviación estándar, y las barras de error representan la desviación estándar, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Los sonidos en do, re, mi y sol son una configuración estándar, planes predeterminados estándar. отклонение, ***p <0,0001. Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± desviación estándar, las barras de error representan la desviación estándar, ***p<0,0001.