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El sangrado incontrolado es una de las principales causas de muerte. Lograr una hemostasia rápida garantiza la supervivencia del sujeto como medida de primeros auxilios durante combates, accidentes de tráfico y operaciones de reducción de mortalidad. El andamio compuesto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS), derivado de una composición formadora de película hemostática simple (HFFC) en fase continua, puede activar y mejorar la hemostasia. El desarrollo del NFRCS se basa en el diseño del ala de la libélula. La estructura del ala de la libélula consta de alas transversales y longitudinales, y las membranas alares están conectadas entre sí para mantener la integridad de la microestructura. El HFFC recubre uniformemente la superficie de la fibra con una película de espesor nanométrico y conecta el espesor de algodón distribuido aleatoriamente (Ct) (fase dispersa) para formar una estructura nanoporosa. La combinación de fases continuas y dispersas reduce el costo del producto diez veces en comparación con los productos comerciales. Los NFRCS modificados (tampones o pulseras) se pueden utilizar en diversas aplicaciones biomédicas. Estudios in vivo han concluido que el Cp NFRCS desarrollado desencadena y mejora el proceso de coagulación en el lugar de aplicación. El NFRCS puede modular el microambiente y actuar a nivel celular gracias a su estructura nanoporosa, lo que resulta en una mejor cicatrización en el modelo de herida por escisión.
Las hemorragias incontroladas durante el combate, las situaciones intraoperatorias y de emergencia pueden representar una grave amenaza para la vida de los heridos1. Estas condiciones provocan además un aumento general de la resistencia vascular periférica, lo que provoca un shock hemorrágico. Las medidas adecuadas para controlar las hemorragias durante y después de la cirugía se consideran potencialmente mortales2,3. El daño a los grandes vasos provoca una pérdida masiva de sangre, con una tasa de mortalidad ≤ 50% en combate y 31% durante la cirugía1. La pérdida masiva de sangre provoca una disminución del volumen corporal, lo que reduce el gasto cardíaco. Un aumento de la resistencia vascular periférica total y un deterioro progresivo de la microcirculación provocan hipoxia en los órganos vitales. Si la afección persiste sin una intervención eficaz, puede producirse un shock hemorrágico1,4,5. Otras complicaciones incluyen la progresión de la hipotermia y la acidosis metabólica, así como un trastorno de la coagulación que dificulta el proceso de coagulación. El shock hemorrágico grave se asocia con un mayor riesgo de muerte6,7,8. En el shock de grado III (progresivo), la transfusión sanguínea es esencial para la supervivencia del paciente durante la morbilidad y mortalidad intraoperatorias y posoperatorias. Para superar todas las situaciones potencialmente mortales mencionadas, hemos desarrollado un andamio compuesto reforzado con fibra nanoporosa (NFRCS) que utiliza una concentración mínima de polímero (0,5 %) mediante una combinación de polímeros hemostáticos hidrosolubles.
Con el uso de refuerzo de fibra, se pueden desarrollar productos rentables. Las fibras, dispuestas aleatoriamente, se asemejan a la estructura del ala de una libélula, equilibrada por las rayas horizontales y verticales. Las venas transversales y longitudinales del ala se comunican con la membrana alar (Fig. 1). El NFRCS consiste en Ct reforzado como sistema de andamiaje con mayor resistencia física y mecánica (Figura 1). Debido a su asequibilidad y su fabricación artesanal, los cirujanos prefieren usar hilos de algodón (Ct) durante las operaciones y los apósitos. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluido > 90% de celulosa cristalina (que contribuye a la mejora de la actividad hemostática), se utilizó Ct como sistema esquelético de NFRCS9,10. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluido > 90% de celulosa cristalina (que contribuye a la mejora de la actividad hemostática), se utilizó Ct como sistema esquelético de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Por lo tanto, dados sus numerosos beneficios, incluido >90% de celulosa cristalina (implicada en una mayor actividad hemostática), se utilizó Ct como sistema esquelético NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Por lo tanto, dados sus numerosos beneficios, incluido más del 90% de celulosa cristalina (ayuda a mejorar la actividad hemostática), se utilizó Ct como andamio para NFRCS9,10.El Ct se recubrió superficialmente (se observó la formación de una película nanoespesa) y se interconectó con una composición hemostática formadora de película (HFFC). La HFFC actúa como un matrigel, manteniendo unidos los Ct colocados aleatoriamente. El diseño desarrollado transmite la tensión dentro de la fase dispersa (fibras de refuerzo). Es difícil obtener estructuras nanoporosas con buena resistencia mecánica utilizando concentraciones mínimas de polímero. Además, no es fácil personalizar diferentes moldes para distintas aplicaciones biomédicas.
La figura muestra un diagrama del diseño del NFRCS basado en la estructura del ala de una libélula (A). Esta imagen muestra una analogía comparativa de la estructura del ala de una libélula (las venas intersecantes y longitudinales del ala están interconectadas) y una fotomicrografía transversal del NFRCS Cp (B). Representación esquemática del NFRCS.
Los NFRC se desarrollaron utilizando HFFC como fase continua para abordar las limitaciones anteriores. El HFFC está compuesto de varios polímeros hemostáticos formadores de película, incluido el quitosano (como polímero hemostático principal) con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) y alcohol polivinílico (PVA) (125 kDa) como polímero de soporte que promueve la formación de trombos. La adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mejoró la capacidad de absorción de humedad del NFRCS. Se añadió polietilenglicol 400 (PEG 400) para mejorar la reticulación del polímero en mezclas de polímeros unidos. Se aplicaron a Ct tres composiciones hemostáticas de HFFC diferentes (HFFC Cm, HFFC Ch y HFFC Cp), a saber, quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) y quitosano con PVA (Cp). Diversos estudios de caracterización in vitro e in vivo han confirmado la actividad hemostática y cicatrizante del NFRCS. Los materiales compuestos que ofrece NFRCS permiten personalizar diversas formas de andamiaje para satisfacer necesidades específicas.
Además, el NFRCS puede modificarse como vendaje o rollo para cubrir toda la zona lesionada de las extremidades inferiores y otras partes del cuerpo. Específicamente para lesiones en extremidades en combate, el diseño del NFRCS puede modificarse para cubrir medio brazo o pierna completa (Figura Suplementaria S11). El NFRCS puede transformarse en una pulsera con adhesivo tisular, que puede usarse para detener hemorragias en lesiones graves de muñeca por suicidio. Nuestro objetivo principal es desarrollar un NFRCS con la menor cantidad de polímero posible, que pueda administrarse a una gran población (por debajo del umbral de pobreza) y que pueda colocarse en un botiquín de primeros auxilios. Con un diseño simple, eficiente y económico, el NFRCS beneficia a las comunidades locales y puede tener un impacto global.
El quitosano (peso molecular 80 kDa) y el amaranto se adquirieron en Merck, India. La hidroxipropilmetilcelulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 y la metilcelulosa se adquirieron en Loba Chemie Pvt. LLC, Bombay. El alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87-90 % hidrolizado) se adquirió en National Chemicals, Gujarat. La polivinilpirrolidina K30 se adquirió en Molychem, Bombay; los hisopos estériles se adquirieron en Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con agua Milli Q (sistema de purificación de agua Direct-Q3, Merck, India) como vehículo.
El NFRCS se desarrolló mediante un método de liofilización11,12. Todas las composiciones de HFFC (Tabla 1) se prepararon con un agitador mecánico. Prepare una solución de quitosano al 0,5 % con ácido acético al 1 % en agua mediante agitación continua a 800 rpm en un agitador mecánico. Se añadió el peso exacto del polímero cargado indicado en la Tabla 1 a la solución de quitosano y se agitó hasta obtener una solución de polímero transparente. Se añadieron PVP K30 y PEG 400 a la mezcla resultante en las cantidades indicadas en la Tabla 1 y se continuó agitando hasta obtener una solución de polímero viscosa transparente. El baño resultante de solución de polímero se sonicó durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la mezcla de polímeros. Como se muestra en la Figura Suplementaria S1(b), el Ct se distribuyó uniformemente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (molde) suplementada con 5 ml de HFFC.
La placa de seis pocillos se sonicó durante 60 minutos para lograr una humectación y distribución uniformes del HFFC en la red de Ct. Posteriormente, se congeló la placa a -20 °C durante 8-12 horas. Las placas congeladas se liofilizaron durante 48 horas para obtener diversas formulaciones de NFRCS. El mismo procedimiento se utiliza para producir diferentes formas y estructuras, como tampones, tampones cilíndricos o cualquier otra forma para diferentes aplicaciones.
Se disuelve quitosano (80 kDa) (3 %) pesado con precisión en ácido acético al 1 % con un agitador magnético. A la solución de quitosano resultante se le añade PEG 400 al 1 % y se agita durante 30 minutos. Se vierte la solución resultante en un recipiente cuadrado o rectangular y se congela a -80 °C durante 12 horas. Las muestras congeladas se liofilizan durante 48 horas para obtener Cs₁₃ poroso.
El NFRCS desarrollado se sometió a experimentos mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japón) para confirmar la compatibilidad química del quitosano con otros polímeros14,15. Los espectros FTIR (ancho del rango espectral de 400 a 4000 cm⁻¹) de todas las muestras analizadas se obtuvieron mediante 32 escaneos.
La tasa de absorción sanguínea (TAS) de todas las formulaciones se evaluó mediante el método descrito por Chen et al. 16 con ligeras modificaciones. Los NFRK desarrollados de todas las composiciones se secaron en un horno de vacío a 105 °C durante la noche para eliminar el disolvente residual. Se colocaron 30 mg de NFRCS (peso inicial de la muestra – W0) y 30 mg de Ct (control positivo) en placas separadas que contenían una premezcla de citrato de sodio al 3,8 %. A intervalos de tiempo predeterminados (5, 10, 20, 30, 40 y 60 segundos), se retiraron los NFRCS y se limpiaron sus superficies de sangre no absorbida colocando las muestras sobre Ct durante 30 segundos. Se calculó el peso final de sangre absorbida por el NFRCS 16 (W1) en cada punto temporal. Calcule el porcentaje de TAS utilizando la siguiente fórmula:
El tiempo de coagulación sanguínea (BCT) se determinó según lo informado por Wang et al. 17 . El tiempo requerido para que la sangre completa (sangre de rata premezclada con citrato de sodio al 3,8%) coagule en presencia de NFRCS se calculó como el BCT de la muestra de prueba. Los diversos componentes de NFRCS (30 mg) se colocaron en viales con tapa de rosca de 10 ml y se incubaron a 37 °C. Se agregó sangre (0,5 ml) al vial y se agregaron 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M para activar la coagulación sanguínea. Finalmente, invierta el vial cada 15 segundos (hasta 180°) hasta que se forme un coágulo firme. El BCT de la muestra se estima por el número de volteretas de los viales17,18. Con base en el BCT, se seleccionaron dos composiciones óptimas de NFRCS Cm, Ch y Cp para estudios de caracterización adicionales.
El BCT de las composiciones de Ch NFRCS y Cp NFRCS se determinó implementando el método descrito por Li et al. 19 . Coloque 15 x 15 mm2 de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (control positivo) en placas de Petri separadas (37 °C). La sangre que contenía citrato de sodio al 3,8 % se mezcló con CaCl2 0,2 ​​M en una proporción de volumen de 10:1 para iniciar el proceso de coagulación sanguínea. Se aplicaron 20 µl de la mezcla de sangre de rata CaCl2 0,2 ​​M a la superficie de la muestra y se colocaron en una placa de Petri vacía. El control fue sangre vertida en placas de Petri vacías sin Ct. A intervalos fijos de 0, 3 y 5 minutos, detenga la coagulación agregando 10 ml de agua desionizada (DI) a la muestra que contiene la placa sin alterar el coágulo. Los eritrocitos no coagulados (eritrocitos) experimentan hemólisis en presencia de agua desionizada y liberan hemoglobina. La hemoglobina en diferentes puntos temporales (HA(t)) se midió a 540 nm (λmáx. de hemoglobina) con un espectrofotómetro UV-Vis. Se tomó como estándar de referencia la absorción absoluta de hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sangre en 10 ml de agua desionizada. La captación relativa de hemoglobina (RHA) de la sangre coagulada se calculó a partir del cociente HA(t)/HA(0) utilizando el mismo lote de sangre.
Utilizando un analizador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EE. UU.), se determinaron las propiedades adhesivas del NFRK al tejido dañado. Se presionó una placa cilíndrica de fondo abierto contra el interior de la piel de cerdo (sin la capa de grasa). Se aplicaron muestras (Ch NFRCS y Cp NFRCS) mediante una cánula en moldes cilíndricos para crear adhesión a la piel del cerdo. Tras una incubación de 3 minutos a temperatura ambiente (25 °C), se registró la fuerza adhesiva del NFRCS a una velocidad constante de 0,5 mm/s.
La característica principal de los selladores quirúrgicos es aumentar la coagulación sanguínea mientras reducen la pérdida de sangre. La coagulación sin pérdida en NFRCS se evaluó utilizando un método publicado previamente con ligeras modificaciones 19 . Haga un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interno de 10 mm) con un orificio de 8 × 5 mm2 en un lado del tubo de centrífuga (que representa una herida abierta). Se utiliza NFRCS para cerrar la abertura y cinta adhesiva para sellar los bordes externos. Agregue 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tubo de microcentrífuga que contiene la premezcla de citrato de sodio al 3,8%. Después de 10 minutos, se retiraron los tubos de microcentrífuga de las placas y se determinó el aumento en la masa de las placas debido a la salida de sangre del NFRK (n = 3). La pérdida de sangre Ch NFRCS y Cp NFRCS se compararon con Cs.
La integridad húmeda del NFRCS se determinó según el método descrito por Mishra y Chaudhary21 con modificaciones menores. Se colocó el NFRCS en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de agua y se agitó durante 60 s sin que se obstruyera. Se realizó una inspección visual y se priorizó la integridad física de las muestras según la recolección.
La fuerza de unión del HFFC al Ct se estudió utilizando métodos previamente publicados con modificaciones menores. La integridad del recubrimiento superficial se evaluó exponiendo el NFRK a ondas acústicas (estímulo externo) en presencia de agua milliQ (Ct). Los NFRCS Ch NFRCS y Cp NFRCS desarrollados se colocaron en un vaso de precipitados lleno de agua y se sonicaron durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 30 min, respectivamente. Después del secado, la diferencia porcentual entre el peso inicial y final del NFRCS se utilizó para calcular el porcentaje de pérdida de material (HFFC). El BCT in vitro respaldó aún más la fuerza de unión o la pérdida de materiales de la superficie. La eficiencia de la unión del HFFC al Ct proporciona coagulación sanguínea y un recubrimiento elástico en la superficie del Ct22.
La homogeneidad del NFRCS desarrollado se determinó mediante la prueba de biotransformación (BCT) de muestras (30 mg) tomadas de ubicaciones generales del NFRCS seleccionadas aleatoriamente. Siga el procedimiento de BCT mencionado anteriormente para determinar la conformidad con el NFRCS. La proximidad entre las cinco muestras garantiza una cobertura superficial uniforme y la deposición de HFFC en la malla Ct.
El área nominal de contacto con la sangre (NBCA) se determinó como se informó previamente con algunas modificaciones. Se coaguló la sangre sujetando 20 µl de sangre entre las superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. Después de una hora, se separaron las dos partes del stent y se midió manualmente el área del coágulo. El valor promedio de tres repeticiones se consideró NBCA NFRCS19.
Se utilizó el análisis de sorción dinámica de vapor (SVD) para evaluar la eficacia del NFRCS para absorber agua del ambiente externo o del punto de lesión responsable del inicio de la coagulación. El SVD evalúa o registra la absorción y pérdida de vapor en una muestra gravimétricamente mediante una balanza ultrasensible con una resolución de masa de ±0,1 µg. Un controlador electrónico de flujo másico genera una presión de vapor parcial (humedad relativa) alrededor de la muestra mezclando gases portadores saturados y secos. Según las pautas de la Farmacopea Europea, en función del porcentaje de absorción de humedad por parte de las muestras, estas se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p no higroscópico, 0,2–2 % p/p ligeramente higroscópico, 2–15 % moderadamente higroscópico y > 15 % muy higroscópico)23. Según las pautas de la Farmacopea Europea, en función del porcentaje de absorción de humedad por parte de las muestras, estas se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p no higroscópico, 0,2–2 % p/p ligeramente higroscópico, 2–15 % moderadamente higroscópico y > 15 % muy higroscópico)23.De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, dependiendo del porcentaje de absorción de humedad por parte de las muestras, las muestras se dividieron en 4 categorías (0–0,012 % p/p – no higroscópico, 0,2–2 % p/p – ligeramente higroscópico, 2– quince %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadamente higroscópico y > 15% muy higroscópico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% p/p- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% p/p 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23.De acuerdo con las recomendaciones de la Farmacopea Europea, las muestras se dividen en 4 clases según el porcentaje de humedad absorbida por la muestra (0-0,012% en peso – no higroscópico, 0,2-2% en peso – ligeramente higroscópico, 2-15% en peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadamente higroscópico, > 15% muy higroscópico) 23.La eficiencia higroscópica de NFCS X NFCS y TsN NFCS se determinó en un analizador DVS TA TGA Q5000 SA. Durante este proceso, se obtuvieron el tiempo de ejecución, la humedad relativa (HR) y el peso de la muestra en tiempo real a 25 °C. El contenido de humedad se calcula mediante un análisis preciso de la masa NFRCS, utilizando la siguiente ecuación:
MC es la humedad NFRCS. m1 – peso seco de los AINE. m2 es la masa NFRCS en tiempo real a una HR determinada.
La superficie total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La superficie total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С en течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La superficie total se estimó utilizando un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de que las muestras se vaciaron a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。a 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). La superficie total se estimó utilizando experimentos de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de que las muestras se vaciaron durante 10 horas a 25 °C (< 7 x 10-3 torr).El área superficial total, el volumen de poro y el tamaño de poro NFRCS se determinaron con un Quantachrome de NOVA 1000e, Austria, utilizando el software RS 232.
Prepare glóbulos rojos al 5 % (diluyente salino) a partir de sangre completa. Luego, transfiera una alícuota de HFFC (0,25 ml) a una placa de 96 pocillos y 5 % de masa de glóbulos rojos (0,1 ml). Incube la mezcla a 37 °C durante 40 minutos. Una mezcla de glóbulos rojos y suero se consideró como control positivo, y una mezcla de solución salina y glóbulos rojos como control negativo. La hemaglutinación se determinó según la escala de Stajitzky. Las escalas propuestas son las siguientes: + + + + agregados granulares densos; + + + almohadillas de fondo liso con bordes curvados; + + almohadillas de fondo liso con bordes rasgados; + anillos rojos estrechos alrededor de los bordes de las almohadillas lisas; – (negativo) botón rojo discreto 12 en el centro del pocillo inferior.
La hemocompatibilidad de NFRCS se estudió según el método de la Organización Internacional de Normalización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. El método gravimétrico descrito por Singh et al. Se realizaron modificaciones menores para evaluar la formación de trombos en presencia o sobre la superficie de NFRCS. 500 mg de Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 24 horas a 37 °C. Después de 24 horas, se eliminó el PBS y el NFRCS se trató con 2 ml de sangre que contenía citrato de sodio al 3,8 %. En la superficie del NFRCS, agregue 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a las muestras incubadas. Después de 45 minutos, se agregaron 5 ml de agua destilada para detener la coagulación. La sangre coagulada en la superficie de NFRK se trató con una solución de formaldehído al 36-38 %. Los coágulos fijados con formaldehído se secaron y pesaron. El porcentaje de trombosis se estimó calculando el peso del vaso sin sangre ni muestra (control negativo) y del vaso con sangre (control positivo).
Como confirmación inicial, las muestras se visualizaron con un microscopio óptico para comprender la capacidad del recubrimiento superficial de HFFC, la interconexión de Ct y la red de Ct para formar poros. Se cortaron secciones delgadas de Ch y Cp de NFRCS con una hoja de bisturí. La sección resultante se colocó en un portaobjetos de vidrio, se cubrió con un cubreobjetos y se fijaron los bordes con pegamento. Los portaobjetos preparados se observaron con un microscopio óptico y se tomaron fotografías a diferentes aumentos.
La deposición de polímeros en redes de Ct se visualizó utilizando microscopía de fluorescencia basada en el método descrito por Rice et al.29. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se prepararon NFRCS (Ch y Cp) según el método mencionado anteriormente. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se prepararon NFRCS (Ch y Cp) según el método mencionado anteriormente.La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y se obtuvo NFRCS (Ch y Cp) de acuerdo con el método mencionado anteriormente.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。La composición de HFFC utilizada en la formulación se mezcló con un colorante fluorescente (amaranto) y recibió NFRCS (Ch y Cp), como se mencionó anteriormente.Se cortaron secciones delgadas de NFRK de las muestras obtenidas, se colocaron en portaobjetos de vidrio y se cubrieron con cubreobjetos. Observe los portaobjetos preparados con un microscopio de fluorescencia y un filtro verde (310-380 nm). Se tomaron imágenes con un aumento de 4x para comprender las relaciones de Ct y la deposición excesiva de polímero en la red de Ct.
La topografía superficial de NFRCS Ch y Cp se determinó mediante un microscopio de fuerza atómica (AFM) con un cantilever TESP ultranítido en modo de golpeteo: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwán. La rugosidad superficial se determinó mediante la raíz cuadrada media (RMS) mediante software (Scanning Probe Image Processor). Se renderizaron diversas ubicaciones de NFRCS en imágenes 3D para comprobar la uniformidad de la superficie. La desviación estándar de la puntuación para un área determinada se define como la rugosidad superficial. La ecuación RMS se utilizó para cuantificar la rugosidad superficial de NFRCS31.
Se realizaron estudios basados ​​en FESEM utilizando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, para comprender la morfología superficial de Ch NFRCS y Cp NFRCS, que mostraron mejor BCT que Cm NFRCS. El estudio FESEM se realizó de acuerdo con el método descrito por Zhao et al. 32 con modificaciones menores. Se premezclaron 20 a 30 mg de NFRCS Ch NFRCS y Cp NFRCS con 20 µl de citrato de sodio al 3,8% premezclado con sangre de rata. Se añadieron 20 µl de CaCl₂ 0,2 M a las muestras tratadas con sangre para iniciar la coagulación y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Además, se eliminó el exceso de eritrocitos de la superficie de NFRCS mediante enjuague con solución salina.
Las muestras subsiguientes se trataron con glutaraldehído al 0,1 % y luego se secaron en un horno de aire caliente a 37 °C para eliminar la humedad. Las muestras secas se recubrieron y analizaron 32 . Otras imágenes obtenidas durante el análisis fueron la formación de coágulos en la superficie de fibras de algodón individuales, la deposición de polímeros entre Ct, la morfología de los eritrocitos (forma), la integridad del coágulo y la morfología de los eritrocitos en presencia de NFRCS. Las áreas de NFRCS sin tratar y las áreas de NFRCS tratadas con Ch y Cp incubadas con sangre se escanearon en busca de iones elementales (sodio, potasio, nitrógeno, calcio, magnesio, zinc, cobre y selenio)33. Compare los porcentajes de iones elementales entre las muestras tratadas y sin tratar para comprender la acumulación de iones elementales durante la formación del coágulo y la homogeneidad del coágulo.
El espesor del recubrimiento superficial de HFFC de Cp sobre la superficie de Ct se determinó mediante FESEM. Se cortaron secciones transversales de NFRCS de Cp de la estructura y se aplicaron recubrimientos por pulverización catódica. Las muestras resultantes del recubrimiento por pulverización catódica se observaron mediante FESEM y se midió el espesor del recubrimiento superficial 34, 35, 36.
La microtomografía computarizada de rayos X proporciona imágenes 3D no destructivas de alta resolución y permite estudiar la estructura interna de NFRK. La microtomografía computarizada utiliza un haz de rayos X que atraviesa la muestra para registrar el coeficiente de atenuación lineal local de los rayos X en la muestra, lo que ayuda a obtener información morfológica. La ubicación interna de Ct en Cp NFRCS y Cp NFRCS tratado con sangre se examinó mediante microtomografía computarizada para comprender la eficiencia de absorción y la coagulación sanguínea en presencia de NFRCS37,38,39. Las estructuras 3D de las muestras de Cp NFRCS tratadas con sangre y sin tratar se reconstruyeron mediante microtomografía computarizada (V|tome|x S240, Phoenix, Alemania). Utilizando el software VG STUDIO-MAX versión 2.2, se tomaron varias imágenes de rayos X desde diferentes ángulos (idealmente con una cobertura de 360°) para desarrollar imágenes 3D para NFRCS. Los datos de proyección recopilados se reconstruyeron en imágenes volumétricas 3D utilizando el software 3D ScanIP Academic.
Además, para comprender la distribución del coágulo, se añadieron 20 µl de sangre citratada premezclada y 20 µl de CaCl₂ 0,2 M al NFRCS para iniciar la coagulación. Las muestras preparadas se dejaron endurecer. La superficie del NFRK se trató con glutaraldehído al 0,5 % y se secó en un horno de aire caliente a 30-40 °C durante 30 min. El coágulo formado en el NFRCS se escaneó, se reconstruyó y se visualizó una imagen 3D.
Se realizaron ensayos antibacterianos en Cp NFRCS (mejor en comparación con Ch NFRCS) utilizando el método descrito previamente con modificaciones menores. La actividad antibacteriana de Cp NFRCS y Cp HFFC se determinó utilizando tres microorganismos de prueba diferentes [S. aureus (bacteria grampositiva), E. coli (bacteria gramnegativa) y Candida blanca (C. albicans)] cultivados en agar en placas de Petri en una incubadora. Inoculen uniformemente 50 ml de la suspensión de cultivo bacteriano diluida a una concentración de 105-106 UFC ml-1 en el medio de agar. Vierta el medio en una placa de Petri y deje que solidifique. Se realizaron pocillos en la superficie de la placa de agar para llenarlos con HFFC (3 pocillos para HFFC y 1 para el control negativo). Añada 200 µl de HFFC a 3 pocillos y 200 µl de PBS pH 7,4 al cuarto pocillo. En el otro lado de la placa de Petri, coloque un disco de Cp NFRCS de 12 mm sobre el agar solidificado y humedézcalo con PBS (pH 7,4). Las tabletas de ciprofloxacino, ampicilina y fluconazol se consideran estándares de referencia para Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans. Mida manualmente la zona de inhibición y tome una imagen digital de la misma.
Tras la aprobación ética institucional, el estudio se llevó a cabo en el Kasturba Medical College of Education and Research de Manipal, Karnataka, al sur de la India. El protocolo experimental de TEG in vitro fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional del Kasturba Medical College de Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Los sujetos fueron reclutados entre donantes de sangre voluntarios (de entre 18 y 55 años) del banco de sangre del hospital. Además, se obtuvo un formulario de consentimiento informado de los voluntarios para la recolección de muestras de sangre. Se utilizó TEG nativo (N-TEG) ​​para estudiar el efecto de la formulación Cp HFFC en sangre completa premezclada con citrato de sodio. El N-TEG es ampliamente reconocido por su papel en la reanimación en el punto de atención, lo que crea problemas para los médicos debido a la posibilidad de un retraso clínicamente significativo en los resultados (pruebas de coagulación de rutina). El análisis de N-TEG se realizó con sangre completa. Se obtuvo el consentimiento informado y el historial médico detallado de todos los participantes. El estudio no incluyó participantes con complicaciones hemostáticas o trombóticas, como embarazo/posparto o enfermedad hepática. Los sujetos que tomaban medicamentos que afectan la cascada de coagulación también fueron excluidos del estudio. Se realizaron pruebas básicas de laboratorio (hemoglobina, tiempo de protrombina, tromboplastina activada y recuento de plaquetas) a todos los participantes de acuerdo con los procedimientos estándar. N-TEG determina la viscoelasticidad del coágulo sanguíneo, la estructura inicial del coágulo, la interacción de partículas, el fortalecimiento del coágulo y la lisis del coágulo. El análisis de N-TEG proporciona datos gráficos y numéricos sobre los efectos colectivos de varios elementos celulares y plasma. El análisis de N-TEG se realizó en dos volúmenes diferentes de Cp HFFC (10 µl y 50 µl). Como resultado, se agregó 1 ml de sangre completa con ácido cítrico a 10 µl de Cp HFFC. Agregue 1 ml (Cp HFFC + sangre citratada), 340 µl de sangre mezclada a 20 µl de 0.2 M CaCl2 que contiene una placa de TEG. Posteriormente, las placas TEG se cargaron en TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% de las muestras de sangre en presencia de Cp HFFC41.
El protocolo del estudio in vivo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Facultad de Medicina Kasturba, Instituto de Educación Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Comité para el Control y la Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA). Todos los estudios NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) se realizaron en ratas Wistar hembra (con un peso de 200 a 250 g). Todos los animales se aclimataron a una temperatura de 24-26 °C, los animales tuvieron libre acceso a comida y agua estándar ad libitum. Todos los animales se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos, cada grupo constaba de tres animales. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con Estudios en Animales: Informe de Experimentos In Vivo 43 . Antes del estudio, los animales fueron anestesiados mediante la administración intraperitoneal (ip) de una mezcla de 20-50 mg de ketamina (por kg de peso corporal) y 2-10 mg de xilazina (por kg de peso corporal). Tras el estudio, se calculó el volumen de sangrado mediante la diferencia entre el peso inicial y el final de las muestras. El valor promedio obtenido en las tres pruebas se consideró como el volumen de sangrado de la muestra.
Se implementó el modelo de amputación de cola de rata para comprender el potencial del NFRCS para modular el sangrado en traumatismos, combates o accidentes de tráfico (modelo de lesión). Se cortó el 50 % de la cola con una hoja de bisturí y se colocó en aire durante 15 s para asegurar un sangrado normal. Además, se colocaron muestras de prueba en la cola de una rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS). Se reportaron el sangrado y la PCT en las muestras de prueba (n = 3)17,45.
La eficacia del control de presión del NFRCS en combate se investigó en un modelo de la arteria femoral superficial. Se expuso la arteria femoral, se puncionó con un trocar de calibre 24 y se obtuvo un sangrado en 15 segundos. Tras observar un sangrado incontrolado, se colocó la muestra de prueba en el sitio de punción y se aplicó presión. Inmediatamente después de la aplicación de la muestra, se registró el tiempo de coagulación y se observó la eficacia hemostática durante los 5 minutos siguientes. El mismo procedimiento se repitió con Cs y Ct46.
Dowling et al. 47 propusieron un modelo de lesión hepática para evaluar el potencial hemostático de los materiales hemostáticos en el contexto del sangrado intraoperatorio. Se registró BCT para muestras de Ct (control negativo), marco de Cs (control positivo), muestras de Ch NFRCS y muestras de Cp NFRCS. La vena cava suprahepática de la rata se expuso realizando una laparotomía media. Después de eso, la parte distal del lóbulo izquierdo se cortó con tijeras. Haga una incisión en el hígado con una hoja de bisturí y deje que sangre durante unos segundos. Las muestras de prueba de Ch NFRCS y Cp NFRCS pesadas con precisión se colocaron sobre la superficie dañada sin ninguna presión positiva y se registró BCT. El grupo de control (Ct) luego aplicó presión seguida de Cs 30 s47 sin romper la lesión.
Se realizaron ensayos de cicatrización in vivo utilizando un modelo de herida por escisión para evaluar las propiedades de cicatrización de los NFRCS basados ​​en polímeros desarrollados. Los modelos de heridas por escisión se seleccionaron y se realizaron según métodos previamente publicados con modificaciones menores19,32,48. Todos los animales fueron anestesiados como se describió previamente. Se utilizó un sacabocados de biopsia (12 mm) para realizar una incisión circular profunda en la piel de la espalda. Las heridas preparadas se vendaron con Cs (control positivo), Ct (teniendo en cuenta que las compresas de algodón interfieren con la cicatrización), Ch NFRCS y Cp NFRCS (grupo experimental) y un control negativo sin ningún tratamiento. Cada día del estudio, se midió el área de la herida en todas las ratas. Se utilizó una cámara digital para tomar una fotografía del área de la herida y aplicar un nuevo vendaje. El porcentaje de cierre de la herida se midió mediante la siguiente fórmula:
Con base en el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio, se extirpó la piel de las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y del grupo control) y se estudió mediante tinción con H&E y tinción tricrómica de Masson. Con base en el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio, se extirpó la piel de las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y del grupo control) y se estudió mediante tinción con H&E y tinción tricrómica de Masson.Con base en el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio, se extirpó la piel de las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y del grupo control) y se examinó mediante tinción con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Las ratas del mejor grupo ((Cp NFRCS) y del grupo de control) fueron extirpadas para realizar tinción con hematoxilina-eosina y tinción tricrómica de Masson según el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio.El procedimiento de tinción se llevó a cabo según los métodos descritos previamente49,50. Brevemente, tras la fijación en formalina al 10%, las muestras se deshidrataron utilizando una serie de alcoholes graduados. Se utilizaron microtomos para obtener secciones delgadas (5 µm de grosor) del tejido extirpado. Secciones seriadas delgadas de controles y Cp NFRCS se trataron con hematoxilina y eosina para estudiar los cambios histopatológicos. Se utilizó la tinción tricrómica de Masson para detectar la formación de fibrillas de colágeno. Los resultados obtenidos fueron analizados a ciegas por patólogos.
Se estudió la estabilidad de las muestras de Cp NFRCS a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60 % HR ± 5 %) durante 12 meses51. Se inspeccionó visualmente el Cp NFRCS (decoloración superficial y crecimiento microbiano) y se evaluó su resistencia al desgaste por pliegues y BCT según los métodos descritos en la sección Materiales y métodos.
Se examinó la escalabilidad y reproducibilidad del Cp NFRCS mediante la preparación de Cp NFRCS con un tamaño de 15 × 15 cm². Además, se extrajeron muestras de 30 mg (n = 5) de diversas fracciones de Cp NFRCS y se evaluó el BCT de las muestras estudiadas como se describió anteriormente en la sección de Métodos.
Hemos intentado desarrollar diversas formas y estructuras utilizando composiciones de Cp NFRCS para diversas aplicaciones biomédicas. Dichas formas o configuraciones incluyen hisopos cónicos para hemorragias nasales, procedimientos dentales e hisopos cilíndricos para hemorragias vaginales.
Todos los conjuntos de datos se expresan como media ± desviación estándar y se analizaron mediante ANOVA utilizando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (*p < 0,05).
Todos los procedimientos realizados en estudios con humanos se ajustaron a las normas del Instituto y del Consejo Nacional de Investigación, así como a la Declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores, o normas éticas similares. Todos los participantes fueron informados sobre las características del estudio y su carácter voluntario. Los datos de los participantes se mantienen confidenciales una vez recopilados. El protocolo experimental de TEG in vitro ha sido revisado y aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Facultad de Medicina de Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Los voluntarios firmaron el consentimiento informado para la recolección de muestras de sangre.
Todos los procedimientos realizados en estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Facultad de Medicina Kastuba, Instituto de Educación Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales diseñados se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Control y la Supervisión de la Experimentación Animal (CPCSEA). Todos los autores siguen las directrices de ARRIVE.
Los espectros FTIR de todos los NFRCS se analizaron y compararon con el espectro de quitosano que se muestra en la Figura 2A. Los picos espectrales característicos del quitosano (registrados) a 3437 cm-1 (estiramiento de OH y NH, superposición), 2945 y 2897 cm-1 (estiramiento de CH), 1660 cm-1 (deformación de NH₂), 1589 cm-1 (flexión de N–H), 1157 cm-1 (estiramiento de puente O-), 1067 cm-1 (estiramiento C–O, hidroxilo secundario), 993 cm-1 (estiramiento CO, Bo-OH) 52,53,54. La Tabla suplementaria S1 muestra los valores del espectro de absorción FTIR NFRCS para el quitosano (reportero), el quitosano puro, Cm, Ch y Cp. Los espectros FTIR de todos los NFRCS (Cm, Ch y Cp) mostraron las mismas bandas de absorción características que el quitosano puro, sin cambios significativos (Fig. 2A). Los resultados de FTIR confirmaron la ausencia de interacciones químicas o físicas entre los polímeros utilizados para desarrollar el NFRCS, lo que indica que son inertes.
Caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. (A) representa los espectros FTIR combinados de las composiciones de quitosano y Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS bajo compresión. (B) a) Tasa de captación de sangre completa de NFRCS Cm, Ch, Cp y Cg (n = 3); Las muestras de Ct mostraron una BAR más alta porque el hisopo de algodón tiene una mayor eficiencia de absorción; b) Sangre después de la absorción de sangre Ilustración de la muestra absorbida. Representación gráfica del BCT de la muestra de prueba C (Cp NFRCS tuvo el mejor BCT (15 s, n = 3)). Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± DE, y las barras de error representan DE, ***p < 0,0001. Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± DE, y las barras de error representan DE, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E and G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p<0,0001. Los datos en C, D, E y G se presentan como media ± desviación estándar, y las barras de error representan la desviación estándar, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Los sonidos en do, re, mi y sol son una configuración estándar, planes predeterminados estándar. отклонение, ***p <0,0001. Los datos en C, D, E y G se muestran como media ± desviación estándar, las barras de error representan la desviación estándar, ***p < 0,0001.