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止血不全は主要な死亡原因の一つです。迅速な止血は、戦闘、交通事故、そして救命活動における応急処置として、対象者の生存を確実にします。単純な止血膜形成組成物（HFFC）を連続相として用いたナノ多孔質繊維強化複合スキャフォールド（NFRCS）は、止血を誘発・促進します。NFRCSの開発は、トンボの羽根の設計に基づいています。トンボの羽根構造は、横方向の羽根と縦方向の羽根で構成され、羽根膜は互いに連結することで微細構造の完全性を維持しています。HFFCは、ナノメートル厚の膜で繊維表面を均一にコーティングし、ランダムに分布した綿の厚さ（Ct）（分散相）を連結することで、ナノ多孔質構造を形成します。連続相と分散相の組み合わせにより、市販製品と比較して製品コストを10分の1に削減できます。改良型NFRCS（タンポンやリストバンド）は、様々な生物医学用途に使用できます。生体内試験では、開発されたCp NFRCSが適用部位における凝固プロセスを誘発し、促進することが結論付けられました。NFRCSはナノポーラス構造により微小環境を調節し、細胞レベルで作用することで、切除創モデルにおける創傷治癒を促進します。
戦闘中、術中、緊急事態中の出血が制御不能になると、負傷者の生命に重大な脅威をもたらす可能性があります1。これらの状態はさらに、全体的な末梢血管抵抗の増加につながり、出血性ショックを引き起こします。術中および術後の出血を制御するための適切な措置は、潜在的に生命を脅かすものと考えられています2,3。大血管の損傷は大量出血につながり、戦闘中の死亡率は 50% 以下、手術中の死亡率は 31% になります1。大量出血は体容積の減少につながり、心拍出量を減少させます。全末梢血管抵抗の増加と微小循環の進行性障害は、生命維持臓器の低酸素症につながります。有効な介入なしに状態が続くと、出血性ショックが発生する可能性があります1,4,5。その他の合併症には、低体温と代謝性アシドーシスの進行、および凝固プロセスを妨げる凝固障害などがあります。重度の出血性ショックは死亡リスクの上昇と関連しています6,7,8。グレードIII（進行性）ショックでは、術中および術後の合併症および死亡率において、患者の生存には輸血が不可欠です。上記の生命を脅かす状況をすべて克服するために、我々は水溶性止血ポリマーを組み合わせ、最小限のポリマー濃度（0.5%）でナノ多孔性繊維強化複合スキャフォールド（NFRCS）を開発しました。
繊維強化材を用いることで、コスト効率の高い製品を開発できます。ランダムに配置された繊維はトンボの羽の構造に似ており、羽の横縞と縦縞がバランスをとっています。羽の横縞と縦縞は羽膜と繋がっています（図1）。NFRCSは、強化されたCt糸で構成された足場システムで、物理的および機械的強度が向上しています（図1）。手頃な価格と職人技の巧みさから、外科医は手術やドレッシングの際に綿糸ゲージ（Ct糸）を好んで使用しています。 そのため、90% を超える結晶セルロース（止血作用の増強に寄与する）などのさまざまな利点を考慮して、Ct は NFRCS9,10 の骨格システムとして使用されました。 そのため、90% を超える結晶セルロース（止血作用の増強に寄与する）などのさまざまな利点を考慮して、Ct は NFRCS9,10 の骨格システムとして使用されました。 Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повыbolении гемостатической активности)、Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10。 そのため、90% を超える結晶セルロース（止血作用の増強に関与）など多くの利点を考慮して、Ct は NFRCS 骨格系として使用されました9,10。したがって、Ct は NFRCS9,10 の骨格系として機能しており、90% を超える結晶粒を含み (血栓活性の増強を助ける)、その多面的な利益を考慮しています。したがって、90% を超える多重利益を考慮すると、そのため、90% を超える結晶セルロース（止血作用を高めるのに役立ちます）など多くの利点があることから、Ct は NFRCS9,10 の足場として使用されました。Ctは表面コーティング（ナノ厚膜形成が観察された）され、止血膜形成組成物（HFFC）で相互接続された。HFFCはマトリゲルのように機能し、ランダムに配置されたCtを互いに結合させる。開発された設計は、分散相（強化繊維）内で応力を伝達する。最小限のポリマー濃度で良好な機械的強度を有するナノ多孔構造を得ることは困難である。さらに、異なる生物医学用途向けに異なる金型をカスタマイズすることも容易ではない。
図は、トンボの羽根構造に基づいたNFRCSの設計図（A）。この画像は、トンボの羽根構造（交差する羽根脈と縦方向の羽根脈が相互に繋がっている）とCp NFRCSの断面顕微鏡写真（B）を比較した図です。NFRCSの模式図。
上記の制限に対処するため、HFFC を連続相として使用して NFRC が開発されました。HFFC は、キトサン (主な止血ポリマー) とメチルセルロース (MC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース (HPMC 50 cp)、および血栓形成を促進する支持ポリマーとしてのポリビニルアルコール (PVA) (125 kDa) を含むさまざまなフィルム形成止血ポリマーで構成されています。ポリビニルピロリジン K30 (PVP K30) を追加すると、NFRCS の吸湿能力が向上しました。ポリエチレングリコール 400 (PEG 400) を追加すると、結合ポリマーブレンドのポリマー架橋が向上しました。3 つの異なる HFFC 止血組成物 (Cm HFFC、Ch HFFC、および Cp HFFC)、つまりキトサンと MC (Cm)、キトサンと HPMC (Ch)、およびキトサンと PVA (Cp) を Ct に適用しました。 NFRCSの止血作用および創傷治癒作用は、様々なin vitroおよびin vivo特性評価研究によって確認されています。NFRCSが提供する複合材料は、特定のニーズに合わせて様々な形状のスキャフォールディングをカスタマイズするために使用できます。
さらに、NFRCSは包帯やロールとして変形させることで、下肢や体の他の部位の損傷部位全体を覆うことができます。特に戦闘による四肢損傷の場合、設計されたNFRCSの設計は、半腕または脚全体に変更できます（補足図S11）。NFRCSは組織接着剤を使用してリストバンドにすることができ、重度の自殺願望を伴う手首の損傷による出血を止めるために使用できます。私たちの主な目標は、できるだけポリマーを少なくし、（貧困線以下の）大規模な集団に配布でき、救急箱に入れることができるNFRCSを開発することです。シンプルで効率的、そして経済的な設計のNFRCSは、地域社会に利益をもたらし、世界的な影響を与えることができます。
キトサン（分子量80 kDa）とアマランサスはインドのメルク社から購入しました。ヒドロキシプロピルメチルセルロース50 Cp、ポリエチレングリコール400、メチルセルロースは、ムンバイのロバ・ケミー社から購入しました。ポリビニルアルコール（分子量125 kDa）（87～90%加水分解）は、グジャラート州のナショナル・ケミカルズ社から購入しました。ポリビニルピロリジンK30はムンバイのモリケム社から購入しました。滅菌綿棒はタミル・ナードゥ州のラマラジュ・サージェリー・コットン・ミルズ社から購入しました。キャリアにはミリQ水（Direct-Q3浄水システム、メルク社、インド）を使用しました。
NFRCS は、凍結乾燥法11,12 を使用して開発されました。すべての HFFC 組成物 (表 1) は、機械式スターラーを使用して調製されました。機械式スターラーで 800 rpm で連続撹拌して、水中の 1% 酢酸を使用してキトサンの 0.5% 溶液を調製します。表 1 に示されている負荷ポリマーの正確な重量をキトサン溶液に加え、透明なポリマー溶液が得られるまで撹拌しました。得られた混合物に、表 1 に示されている量の PVP K30 と PEG 400 を加え、透明で粘性のあるポリマー溶液が得られるまで撹拌を続けました。得られたポリマー溶液浴を 60 分間超音波処理して、ポリマー混合物から閉じ込められた気泡を除去しました。補足図 S1(b) に示すように、Ct は 5 ml の HFFC を添加した 6 ウェル プレート (モールド) の各ウェルに均等に分布していました。
6ウェルプレートを60分間超音波処理し、CtネットワークにおけるHFFCの均一な湿潤と分布を実現しました。その後、6ウェルプレートを-20℃で8～12時間凍結しました。凍結プレートを48時間凍結乾燥し、様々なNFRCS製剤を得ました。タンポン型や円筒型タンポン型など、様々な形状や構造、あるいは用途に応じた様々な形状のタンポンを作製する場合にも、同じ手順で作製できます。
キトサン（80 kDa）（3%）を精秤し、マグネティックスターラーを用いて1%酢酸に溶解する。得られたキトサン溶液に1%PEG 400を加え、30分間撹拌する。得られた溶液を正方形または長方形の容器に移し、-80℃で12時間凍結する。凍結サンプルを48時間凍結乾燥し、多孔質Cs13を得る。
開発されたNFRCSは、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）（島津製作所製 8400 s FTIR、東京、日本）を用いた実験に供され、キトサンと他のポリマーとの化学的適合性を確認した14,15。試験したすべてのサンプルのFTIRスペクトル（スペクトル範囲：400～4000 cm-1）は、32回のスキャンを行うことで得られた。
すべての製剤の血液吸収率（BAR）は、Chen et al. 16 によって記載された方法をわずかに改変して使用して評価しました。開発されたすべての組成のNFRKは、残留溶媒を除去するため、真空オーブンで105°Cで一晩乾燥させました。30 mgのNFRCS（初期サンプル重量 - W0）と30 mgのCt（陽性対照）を、3.8%クエン酸ナトリウムのプレミックスを含む別の皿に入れました。所定の時間間隔、つまり5、10、20、30、40、および60秒で、NFRCSを取り出し、サンプルをCtに30秒間置いて表面から吸収されていない血液を取り除きました。各時点でのNFRCS 16 に吸収された血液の最終重量（W1）としました。次の式を使用してBARパーセンテージを計算します。
血液凝固時間（BCT）は、Wang et al. 17 の報告に従って測定した。NFRCS存在下で全血（3.8%クエン酸ナトリウムを予め混合したラットの血液）が凝固するのに要する時間を、試験サンプルのBCTとして算出した。さまざまなNFRCS成分（30 mg）を10 mlスクリューキャップバイアルに入れ、37°C​​でインキュベートした。血液（0.5 ml）をバイアルに加え、0.2 M CaCl2 0.3 mlを加えて血液凝固を活性化した。最後に、硬い凝血が形成されるまで15秒ごとに（最大180°）バイアルを逆さにした。サンプルのBCTは、バイアルが反転する回数で推定した17,18。BCTに基づき、NFRCS Cm、Ch、およびCpから2つの最適組成物を選択し、さらなる特性評価研究に使用した。
Ch NFRCSおよびCp NFRCS組成物のBCTは、Liら19によって記載された方法を実施して決定した。15 x 15 mm2のCh NFRCS、Cp NFRCS、およびCs（陽性対照）を別々のペトリ皿（37°C）に入れた。3.8%クエン酸ナトリウムを含む血液を0.2 M CaCl2と10:1の体積比で混合し、血液凝固プロセスを開始した。20 µlの0.2 M CaCl2ラット血液混合物をサンプル表面に塗布し、空のペトリ皿に入れた。対照は、Ctを含まない空のペトリ皿に注いだ血液であった。0、3、および5分の固定間隔で、凝血を乱さないように、皿を含むサンプルに10 mlの脱イオン（DI）水を加えて凝固を停止した。凝固していない赤血球（赤血球）は、脱イオン水存在下で溶血し、ヘモグロビンを放出します。様々な時点におけるヘモグロビン濃度（HA(t)）は、UV-Vis分光光度計を用いて540 nm（ヘモグロビンλmax）で測定しました。血液20µlを脱イオン水10mlに溶解し、0分後のヘモグロビン絶対吸光度（AH(0)）を標準値として使用しました。凝固した血液の相対ヘモグロビン吸収率（RHA）は、同じバッチの血液を用いて、HA(t)/HA(0)比から算出しました。
テクスチャーアナライザー（Texture Pro CT V1.3 Build 15、米国ブルックフィールド社製）を用いて、NFRKの損傷組織への接着性を測定した。底の開いた円筒形の皿を豚皮の内側（脂肪層を除く）に押し当てた。サンプル（Ch NFRCSおよびCp NFRCS）をカニューラで円筒形の型に塗布し、豚皮への接着を作成した。室温（RT）（25℃）で3分間インキュベーションした後、NFRCSの接着強度を0.5 mm/秒の一定速度で記録した。
手術用シーラントの主な特徴は、失血を減らしながら血液凝固を増やすことです。 NFRCS におけるロスレス凝固は、以前に公開された方法をわずかに変更した方法 19 で評価しました。 片側に 8 × 5 mm2 の穴を開けたマイクロ遠心管 (2 ml) (内径 10 mm) を作成します (開いた傷口を表現)。 NFRCS を使用して開口部を閉じ、テープを使用して外縁を密封します。 3.8% クエン酸ナトリウムプレミックスを含むマイクロ遠心管に 0.2 M CaCl2 を 20 µl 加えます。 10 分後、マイクロ遠心管を皿から取り出し、NFRK からの血液の流出による皿の質量の増加を測定しました (n = 3)。 失血量 Ch NFRCS と Cp NFRCS を Cs と比較しました。
NFRCSの湿潤完全性は、MishraとChaudhary21が報告した方法に若干の修正を加えて測定した。NFRCSを100ml三角フラスコに入れ、水50mlを加え、60秒間撹拌する。試料採取時点に基づいて、目視検査と物理的完全性の優先順位付けを行った。
HFFC の Ct への結合強度は、以前に公開された方法をわずかに修正して使用して研究されました。表面コーティングの完全性は、milliQ 水 (Ct) の存在下で NFRK を音波 (外部刺激) にさらすことによって評価されました。開発された NFRCS Ch NFRCS および Cp NFRCS を水を満たしたビーカーに入れ、それぞれ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、および 30 分間超音波処理しました。乾燥後、NFRCS の初期重量と最終重量のパーセンテージの差を使用して、材料のパーセント損失 (HFFC) を計算しました。in vitro BCT は、表面材料の結合強度または損失をさらに裏付けました。HFFC の Ct への結合効率は、血液凝固と Ct 表面の弾性コーティングを提供します22。
開発されたNFRCSの均一性は、NFRCSのランダムに選択された一般的な位置から採取したサンプル（30mg）のBCTによって決定されました。NFRCSの適合性を判断するには、前述のBCT手順に従ってください。5つのサンプルすべてが近接しているため、均一な表面被覆とCtメッシュにおけるHFFCの沈着が確保されます。
公称血液接触面積（NBCA）は、以前の報告に若干の修正を加えて測定した。Ct、Ch NFRCS、Cp NFRCS、Csの2つの表面の間に20µlの血液を挟み込み、血液を凝固させた。1時間後、ステントの2つの部分を分離し、手動で凝血塊の面積を測定した。3回の繰り返しの平均値をNBCA NFRCS19とした。
動的蒸気吸着（DVS）分析は、NFRCSが外部環境または凝固開始の原因となる損傷部位から水分を吸収する有効性を評価するために用いられました。DVSは、質量分解能±0.1µgの超高感度天秤を用いて、サンプル中の蒸気の吸収と損失を重量測定法で評価または記録します。サンプル周囲には、電子式マスフローコントローラによって飽和キャリアガスと乾燥キャリアガスが混合され、部分蒸気圧（相対湿度）が生成されます。 欧州薬局方のガイドラインに従い、サンプルの水分吸収率に基づいて、サンプルは 4 つのカテゴリー (0–0.012% w/w − 非吸湿性、0.2–2% w/w わずかに吸湿性、2–15% 中程度の吸湿性、および > 15% 非常に吸湿性) に分類されました23。 欧州薬局方のガイドラインに従い、サンプルの水分吸収率に基づいて、サンプルは 4 つのカテゴリー (0–0.012% w/w − 非吸湿性、0.2–2% w/w わずかに吸湿性、2–15 % 中程度の吸湿性、および > 15% 非常に吸湿性) に分類されました23。欧州薬局方の勧告に従い、サンプルの吸湿率に応じて、サンプルは 4 つのカテゴリー (0～0.012% w/w – 非吸湿性、0.2～2% w/w – わずかに吸湿性、2～15%) に分類されました。% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % が中程度の吸湿性、> 15% が非常に吸湿性)23。欧洲薬典南によれば、試料が水分を吸収する割合に応じて、試料の割合は４種類（０〜０．０１２％ｗ／ｗ−非吸湿性、０．２〜２％ｗ／ｗ、微吸湿性、２〜１５％、＞１５％超吸湿性）である２３。欧洲药典指南による、吸湿水分の百分率样品分別 分別类 （（0-0.012% W/w-吸湿性、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微、2-15% 水分吸湿性、> 15 % 非常に吸湿性が高い）23。欧州薬局方の勧告に従い、サンプルは吸収される水分の割合に応じて 4 つのクラスに分類されます (重量の 0 ～ 0.012% – 非吸湿性、重量の 0.2 ～ 2% – わずかに吸湿性、重量の 2 ～ 15%)。% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % 中程度の吸湿性、> 15% 非常に吸湿性) 23.NFCS X NFCSおよびTsN NFCSの吸湿効率は、分析装置DVS TA TGA Q5000 SAを用いて測定しました。この測定では、分析時間、相対湿度（RH）、および25℃におけるリアルタイムサンプル重量24を取得しました。水分含有量は、NFCSの正確な質量分析により、以下の式を用いて算出されます。
MC は NFRCS 湿度です。m1 は NSAID の乾燥重量です。m2 は特定の RH におけるリアルタイムの NFRCS 質量です。
総表面積は、サンプルを 25 °C で 10 時間 (< 7 × 10–3 Torr) 放置した後、液体窒素で窒素吸着実験を行って推定しました。 総表面積は、サンプルを 25 °C で 10 時間 (< 7 × 10–3 Torr) 放置した後、液体窒素で窒素吸着実験を行って推定しました。 Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр)。 総表面積は、サンプルを 25°C で 10 時間 (< 7 × 10–3 Torr) 放置した後、液体窒素で窒素吸着実験を行って推定しました。２５℃の清浄なサンプルを１０時間（＜７×１０−３Ｔｏｒｒ）放置した後、液体窒素を使用して表面全体を観察した。25℃ Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после気温は 10 ℃、25 °C (< 7 × 10-3 торр) です。 総表面積は、サンプルを 25°C (< 7 x 10-3 torr) で 10 時間放置した後、液体窒素による窒素吸着実験を使用して推定されました。総表面積、細孔容積、NFRCS 細孔サイズは、オーストリアの NOVA 1000e 社製 Quantachrome と RS 232 ソフトウェアを使用して測定されました。
全血から5%赤血球（希釈液として生理食塩水を使用）を調製します。次に、HFFC（0.25 ml）を96ウェルプレートに移し、5%赤血球塊（0.1 ml）を加えます。混合物を37℃で40分間インキュベートします。赤血球と血清の混合物を陽性対照、生理食塩水と赤血球の混合物を陰性対照としました。赤血球凝集反応はスタジツキースケールに基づいて判定しました。提案されたスケールは以下のとおりです。+ + + + 密な顆粒凝集体。+ + + 湾曲した縁を持つ滑らかな底のパッド。+ + 破れた縁を持つ滑らかな底のパッド。+ 滑らかなパッドの縁の周りに狭い赤色のリング。-（陰性）下ウェルの中央に赤いボタン12が1つずつ現れます。
NFRCSの血液適合性は、国際標準化機構（ISO）の方法（ISO10993-4、1999）26,27に従って研究されました。Singhらによって記載された重量測定法。NFRCSの存在下または表面での血栓形成を評価するために、若干の修正が行われました。500 mgのCs、Ch NFRCSおよびCp NFRCSをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で24時間、37°C​​でインキュベートしました。24時間後、PBSを除去し、NFRCSを3.8%クエン酸ナトリウムを含む血液2 mlで処理しました。NFRCSの表面に、インキュベートしたサンプルに対して0.1 M CaCl2 0.04 mlを加えます。45分後、5 mlの蒸留水を加えて凝固を停止しました。 NFRK表面の凝固血液を36～38%のホルムアルデヒド溶液で処理した。ホルムアルデヒドで固定した凝血塊を乾燥させ、重量を測定した。血液とサンプルを除いたガラス（ネガティブコントロール）と、血液を含んだガラス（ポジティブコントロール）の重量を計算することで、血栓形成率を推定した。
初期確認として、HFFC表面コーティング、Ct相互連結、およびCtネットワークが細孔を形成する能力を理解するため、サンプルを光学顕微鏡で観察しました。NFRCSからChとCpの薄切片をメスで切り取りました。得られた切片をスライドガラス上に置き、カバーガラスで覆い、端を接着剤で固定しました。作製したスライドガラスを光学顕微鏡で観察し、様々な倍率で写真を撮影しました。
Ct ネットワーク内のポリマー沈着は、Rice ら29 によって記載された方法に基づいて蛍光顕微鏡を使用して視覚化されました。 配合に使用したHFFC組成物は蛍光染料（アマランサス）と混合され、NFRCS（Ch＆Cp）は前述の方法に従って調製された。 配合に使用したHFFC組成物は蛍光染料（アマランサス）と混合され、NFRCS（Ch＆Cp）は前述の方法に従って調製された。配合に使用したHFFC組成物は蛍光染料（アマランサス）と混合され、前述の方法に従ってNFRCS（ChおよびCp）が得られました。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。配合に使用した HFFC 組成物は蛍光染料 (アマランサス) と混合され、前述のように NFRCS (Ch および Cp) が投与されました。得られたサンプルからNFRKの薄切片を切り出し、スライドガラス上に置き、カバーガラスで覆った。作製したスライドを、緑色フィルター（310～380 nm）を用いた蛍光顕微鏡で観察した。Ct値の関係とCtネットワークにおける過剰なポリマー沈着を理解するため、4倍の倍率で画像を撮影した。
NFRCS ChおよびCpの表面トポグラフィーは、超鋭角TESPカンチレバー（Bruker社、台湾製、42 N/m、320 kHz、ROC 2-5 nm）を装着した原子間力顕微鏡（AFM）を用いてタッピングモードで測定しました。表面粗さは、ソフトウェア（Scanning Probe Image Processor）を用いて二乗平均平方根（RMS）で測定しました。表面の均一性を確認するため、NFRCSの様々な箇所を3D画像上にレンダリングしました。所定の領域におけるスコアの標準偏差を表面粗さと定義します。RMS式を用いてNFRCS31の表面粗さを定量化しました。
Cm NFRCSよりも優れたBCTを示したCh NFRCSおよびCp NFRCSの表面形態を理解するために、FESEM、SU8000、HI-0876-0003、日立、東京を使用してFESEMベースの研究が行われました。FESEM研究は、Zhaoら32によって記載された方法に若干の修正を加えて実施しました。NFRCS 20～30 mgのCh NFRCSおよびCp NFRCSを、ラットの血液と混合した20 µlの3.8%クエン酸ナトリウムと事前に混合しました。20 µlの0.2 M CaCl2を血液処理サンプルに加えて凝固を開始し、サンプルを室温で10分間インキュベートしました。さらに、生理食塩水でリンスすることにより、NFRCS表面から過剰な赤血球を除去しました。
その後のサンプルは0.1%グルタルアルデヒドで処理し、37°C​​の熱風オーブンで乾燥させて水分を除去しました。乾燥したサンプルはコーティングして分析しました32。分析中に得られたその他の画像は、個々の綿繊維の表面での凝血形成、Ct間のポリマー沈着、赤血球の形態（形状）、凝血の完全性、およびNFRCS存在下での赤血球の形態でした。血液とともにインキュベートした未処理のNFRCS領域とChおよびCp処理したNFRCS領域は、元素イオン（ナトリウム、カリウム、窒素、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、銅、セレン）についてスキャンされました33。処理済みサンプルと未処理サンプルの元素イオンの割合を比較して、凝血形成中の元素イオンの蓄積と凝血の均一性を理解します。
Ct表面におけるCp HFFC表面コーティングの厚さは、FESEMを用いて測定した。Cp NFRCSの断面をフレームワークから切り出し、スパッタコーティングした。得られたスパッタコーティングサンプルをFESEMで観察し、表面コーティングの厚さを測定した34, 35, 36。
X線マイクロCTは高解像度の3D非破壊画像を提供し、NFRKの内部構造を調べることができます。マイクロCTでは、サンプルを通過するX線ビームを使用して、サンプル内のX線の局所的線形減衰係数を記録します。これにより、形態学的情報が得られます。Cp NFRCSおよび血液処理Cp NFRCS内のCtの内部位置をマイクロCTで調べ、NFRCS存在下での吸収効率と血液凝固について調べました37,38,39。血液処理および未処理のCp NFRCSサンプルの3D構造は、マイクロCT（V|tome|x S240、フェニックス、ドイツ）を使用して再構築されました。VG STUDIO-MAXソフトウェアバージョン2.2を使用して、異なる角度（理想的には360°カバレッジ）から複数のX線画像を撮影し、NFRCSの3D画像を作成しました。収集された投影データは、対応するシンプルな 3D ScanIP Academic ソフトウェアを使用して 3D ボリューム画像に再構築されました。
さらに、凝血塊の分布を把握するため、NFRKにクエン酸添加血液20µlと0.2M CaCl2 20µlを添加し、血液凝固を開始させた。調製したサンプルは硬化するまで放置した。NFRK表面を0.5%グルタルアルデヒドで処理し、熱風オーブンで30～40℃で30分間乾燥させた。NFRK上に形成された血栓をスキャンし、再構成することで、血栓の3D画像を可視化した。
以前に記載された方法に若干の変更を加えて、Cp NFRCS（Ch NFRCS と最もよく比較される）の抗菌アッセイを実施した。Cp NFRCS および Cp HFFC の抗菌活性を、インキュベーター内のペトリ皿内の寒天培地上で増殖させた 3 種類の異なる試験微生物 [S.aureus (グラム陽性細菌)、E.coli (グラム陰性細菌)、白色カンジダ (C.albicans)] を使用して測定した。希釈した細菌培養懸濁液 50 ml を 105-106 CFU ml-1 の濃度で寒天培地に均一に接種する。培地をペトリ皿に注ぎ、固める。寒天プレートの表面に HFFC を満たすウェルを作製した (HFFC 用に 3 つのウェル、ネガティブコントロール用に 1 つ)。ペトリ皿の反対側に、固まった寒天培地の上に直径12mmのCp NFRCSディスクを置き、PBS（pH 7.4）で湿らせます。シプロフロキサシン、アンピシリン、フルコナゾールの錠剤は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンスに対する標準品として認められています。阻止円を手動で測定し、デジタル画像を撮影します。
倫理的承認後、この研究は南インドのカルナタカ州マニパルにあるカストゥルバ医科大学教育研究校で実施されました。in vitro TEG実験プロトコルは、カルナタカ州マニパルのカストゥルバ医科大学の倫理委員会によって審査され、承認されています（IEC：674/2020）。被験者は、病院の血液バンクからボランティアの献血者（18～55歳）から募集されました。さらに、血液サンプルを採取するために、ボランティアからインフォームドコンセントを得ました。ネイティブTEG（N-TEG）を使用して、クエン酸ナトリウムと予め混合した全血に対するCp HFFC製剤の効果を研究しました。N-TEGは、ポイントオブケア蘇生での役割で広く認識されていますが、結果（ルーチンの凝固検査）に臨床的に有意な遅延が生じる可能性があるため、臨床医にとって問題となります。N-TEG分析は全血を使用して実施しました。すべての参加者からインフォームドコンセントと詳細な病歴を得ました。本研究には、妊娠／産後または肝疾患などの止血または血栓合併症のある参加者は含まれていませんでした。また、凝固カスケードに影響を与える薬物を服用している被験者も本研究から除外されました。標準的な手順に従って、すべての参加者に対して基本的な臨床検査（ヘモグロビン、プロトロンビン時間、活性化トロンボプラスチン、血小板数）が実施されました。N-TEGは、血栓の粘弾性、初期の血栓構造、粒子相互作用、血栓強化、および血栓溶解を決定します。N-TEG分析は、いくつかの細胞成分と血漿の集合的な効果に関するグラフと数値データを提供します。N-TEG分析は、2つの異なる量のCp HFFC（10 µlと50 µl）で実施されました。その結果、クエン酸を加えた全血1 mlが10 µlのCp HFFCに添加されました。 1 mL（Cp HFFC + クエン酸血）および340 µLの混合血を、20 µLの0.2 M CaCl2を含むTEGディッシュに加えた。その後、TEGディッシュをTEG® 5000, USにセットし、Cp HFFC41存在下で血液サンプルのR、K、α角、MA、G、CI、TPI、EPL、LYを30%測定した。
生体内研究プロトコルは、マニパル高等教育機関カストゥルバ医学部、マニパルの動物倫理委員会（IAEC）によって審査され、承認されました（IAEC/KMC/69/2020）。すべての動物実験は、動物実験管理監督委員会（CPCSEA）の勧告に従って実施されました。すべての生体内NFRCS研究（2×2 cm2）は、雌のWistarラット（体重200～250 g）で実施されました。すべての動物は24～26°Cの温度で順応させ、標準的な餌と水を自由に摂取させました。すべての動物はランダムに異なるグループに分けられ、各グループは3匹の動物で構成されていました。すべての研究は、「動物研究：生体内実験報告書43」に従って実施されました。試験開始前に、動物はケタミン20～50mg（体重1kgあたり）とキシラジン2～10mg（体重1kgあたり）の混合物を腹腔内（ip）投与して麻酔された。試験終了後、サンプルの初期重量と最終重量の差を評価することで出血量を計算し、3回の試験から得られた平均値をサンプルの出血量とした。
NFRCSが外傷、戦闘、または交通事故（傷害モデル）における出血を調節する可能性を理解するために、ラット尾切断モデルを作製した。メスで尾の50%を切断し、15秒間空気中に放置して正常な出血を確認した。さらに、ラットの尾に圧力をかけて試験サンプル（Ct、Cs、Ch NFRCS、Cp NFRCS）を置いた。試験サンプル（n = 3）で出血とPCTが報告された17,45。
戦闘におけるNFRCSによる圧迫制御の有効性を、浅大腿動脈モデルを用いて調査した。大腿動脈を露出させ、24Gトロカールで穿刺し、15秒以内に出血させた。止血が不十分な出血が観察された後、試験サンプルを穿刺部位に置き、圧迫した。試験サンプルの塗布直後、凝固時間を記録し、その後5分間の止血効果を観察した。同様の手順をCsおよびCt46についても繰り返した。
Dowling ら 47 は、術中出血の状況における止血材料の止血能力を評価するための肝損傷モデルを提案した。Ct サンプル (ネガティブ コントロール)、Cs フレームワーク (ポジティブ コントロール)、Ch NFRCS サンプル、および Cp NFRCS サンプルの BCT を記録した。ラットの上肝大静脈を正中開腹術で露出させた。その後、左葉の遠位部をハサミで切り取った。メスの刃で肝臓を切開し、数秒間出血させた。正確に秤量した Ch NFRCS および Cp NFRCS 試験サンプルを損傷面に正圧をかけずに置き、BCT を記録した。次に、コントロール グループ (Ct) に圧力をかけ、続いて損傷を破壊することなく Cs 30 s47 を適用した。
開発されたポリマーベースのNFRCSの創傷治癒特性を評価するために、切除創モデルを使用してin vivo創傷治癒アッセイを実施しました。切除創モデルは、以前に公開された方法19,32,48に従って選択および実施されました。すべての動物は、前述のように麻酔されました。生検パンチ（12 mm）を使用して、背中の皮膚に円形の深い切開を入れます。準備された創傷部位には、Cs（陽性対照）、Ct（綿パッドが治癒を妨げることを認識）、Ch NFRCSおよびCp NFRCS（実験群）、および無処理の陰性対照が包帯されました。研究の各日に、すべてのラットの創傷面積を測定しました。デジタルカメラを使用して創傷領域の写真を撮影し、新しい包帯を装着しました。創傷閉鎖率は、次の式で測定されました。
研究開始12日目の創傷閉鎖率に基づき、最良群（（Cp NFRCS）および対照群）のラット皮膚を切除し、H&E染色およびマッソントリクローム染色で研究しました。 研究開始12日目の創傷閉鎖率に基づき、最良群（（Cp NFRCS）および対照群）のラット皮膚を切除し、H&E染色およびマッソントリクローム染色で研究しました。研究開始12日目の創傷閉鎖率に基づき、最良群（（Cp NFRCS）および対照群）のラットの皮膚を切除し、ヘマトキシリン・エオシンおよびマッソントリクロームで染色して検査しました。１２日目の経口結合比の研究に基づいて、最適なグループ（（Ｃｐ ＮＦＲＣＳ）および対照グループ）のマウス皮を切除し、Ｈ＆Ｅ染色およびマッソン三色染色研究を行った。12日目の研究に基づいて、最適なグループ（(Cp NFRCS)および対照グループ）のタイツ皮を切除し、H&E染色および組織を実施した。最良グループ（（Cp NFRCS）およびコントロール グループ）のラットは、研究開始から 12 日目に創傷閉鎖率に基づいてヘマトキシリン エオシン染色およびマッソン トリクローム染色を行うために摘出されました。実施した染色手順は、以前に記載された方法49,50に従って実施した。簡単に説明すると、10%ホルマリンで固定した後、サンプルを段階的にアルコール処理して脱水した。ミクロトームを用いて切除組織の薄切片（厚さ5µm）を作製した。対照群およびCp NFRCSの薄切連続切片をヘマトキシリンおよびエオシン処理し、組織病理学的変化を調べた。コラーゲン線維の形成を検出するために、マッソントリクローム染色を用いた。得られた結果は病理医によって盲検化して解析された。
Cp NFRCSサンプルの安定性を室温（25℃±2℃/60%RH±5%）で12ヶ月間調査しました51。Cp NFRCS（表面の変色および微生物の増殖）は、上記の「材料と方法」のセクションに記載されている方法に従って、目視検査および耐折損性とBCT試験を実施しました。
Cp NFRCSの拡張性と再現性は、15×15 cm²のCp NFRCSを調製することにより検証した。さらに、様々なCp NFRCS分画から30 mgのサンプル（n = 5）を切り出し、方法の項で前述したように、研究対象サンプルのBCTを評価した。
私たちは、Cp NFRCS組成物を用いて、様々な生物医学用途向けに様々な形状や構造の開発に取り組んできました。こうした形状や構成には、鼻血や歯科処置用の円錐形綿棒、膣出血用の円筒形綿棒などがあります。
すべてのデータ セットは平均 ± 標準偏差として表され、Prism 5.03 (GraphPad、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して ANOVA で分析され、その後 Bonferroni の多重比較検定 (*p<0.05) が実行されました。
ヒト研究で実施されたすべての手順は、当研究所および国立研究評議会の基準、ならびに1964年のヘルシンキ宣言およびその後の修正、または同様の倫理基準に準拠していました。すべての参加者には、本研究の特徴と自発的な性質について説明しました。参加者のデータは収集後、機密扱いとなります。in vitro TEG実験プロトコルは、カルナータカ州マニパルにあるカストゥルバ医科大学の倫理委員会（IEC: 674/2020）の審査と承認を受けています。参加者は、血液サンプル採取についてインフォームドコンセントに署名しました。
動物実験で実施されたすべての手順は、マニパル高等教育機関カストゥバ医学部（マニパル）のガイドライン（IAEC/KMC/69/2020）に従って実施されました。すべての動物実験は、動物実験管理監督委員会（CPCSEA）のガイドラインに従って実施されました。すべての著者はARRIVEガイドラインに従っています。
すべての NFRCS の FTIR スペクトルを分析し、図 2A に示すキトサン スペクトルと比較しました。キトサン (記録) の特徴的なスペクトル ピークは、3437 cm-1 (OH および NH 伸縮、重なり)、2945 および 2897 cm-1 (CH 伸縮)、1660 cm-1 (NH2 歪み)、1589 cm-1 (N–H 変角)、1157 cm-1 (ブリッジ伸縮 O-)、1067 cm-1 (伸縮 C–O、二次ヒドロキシル)、993 cm-1 (伸縮 CO、Bo-OH) 52、53、54 です。補足表 S1 には、キトサン (レポーター)、純粋なキトサン、Cm、Ch、および Cp の FTIR NFRCS 吸収スペクトル値を示しています。全てのNFRCS（Cm、Ch、Cp）のFTIRスペクトルは、純粋なキトサンと同じ特徴的な吸収帯を示し、大きな変化は見られませんでした（図2A）。FTIRの結果は、NFRCSの開発に使用されたポリマー間に化学的または物理的な相互作用がないことを確認し、使用されたポリマーが不活性であることを示唆しています。
Cm NFRCS、Ch NFRCS、Cp NFRCS、およびCsのin vitro特性評価。(A) は、圧縮下におけるキトサンとCm NFRCS、Ch NFRCS、およびCp NFRCSの複合FTIRスペクトルを示しています。(B) a) NFRCS Cm、Ch、Cp、およびCgの全血吸収率（n = 3）。綿棒の吸収効率が高いため、CtサンプルのBARが高くなっています。b) 血液吸収後の血液。吸収されたサンプルの図解。試験サンプルCのBCTのグラフ表示（Cp NFRCSのBCTが最も良好でした（15秒、n = 3）。 C、D、E、G のデータは平均 ± SD として示され、エラー バーは SD を表します。***p < 0.0001。 C、D、E、G のデータは平均 ± SD として示され、エラー バーは SD を表します。***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрезностей представляют стандартное отклонение、***p <0,0001。 C、D、E、G のデータは平均 ± 標準偏差として示され、エラー バーは標準偏差を表します。***p<0.0001。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрезавляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. C、D、E、G のデータは平均 ± 標準偏差として表示され、エラー バーは標準偏差を表します。***p<0.0001。