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制御不能な出血は、主要な死因の一つです。迅速な止血は、戦闘、交通事故、死亡率低減作戦における応急処置として、対象者の生存を確保します。単純な止血フィルム形成組成物（HFFC）を連続相として用いたナノ多孔質繊維強化複合足場（NFRCS）は、止血を誘発・促進することができます。NFRCSの開発は、トンボの翅の構造に基づいています。トンボの翅の構造は、横翅と縦翅から成り、翅膜は互いに連結して微細構造の完全性を維持しています。HFFCは、繊維表面をナノメートル厚のフィルムで均一にコーティングし、ランダムに分布した綿厚（Ct）（分散相）を連結してナノ多孔質構造を形成します。連続相と分散相の組み合わせにより、市販製品と比較して製品コストを10分の1に削減できます。改良されたNFRCS（タンポンやリストバンドなど）は、様々な生物医学用途に使用できます。生体内試験の結果、開発されたCp NFRCSは適用部位における凝固プロセスを誘発・促進することが明らかになった。NFRCSはナノ多孔質構造により微小環境を調節し、細胞レベルで作用することで、切除創モデルにおける創傷治癒を促進する。
戦闘中、手術中、および緊急時の制御不能な出血は、負傷者の生命に深刻な脅威をもたらす可能性があります1。これらの状況はさらに末梢血管抵抗の全体的な増加につながり、出血性ショックを引き起こします。手術中および手術後の出血を制御するための適切な措置は、生命を脅かす可能性があると考えられています2,3。大血管の損傷は大量出血につながり、戦闘では50%以下、手術中は31%の死亡率をもたらします1。大量出血は体積の減少につながり、心拍出量を低下させます。総末梢血管抵抗の増加と微小循環の進行性障害は、生命維持器官の低酸素症につながります。効果的な介入なしにこの状態が続くと、出血性ショックが発生する可能性があります1,4,5。その他の合併症には、低体温症と代謝性アシドーシスの進行、および凝固過程を阻害する凝固障害が含まれます。重度の出血性ショックは、死亡リスクの上昇と関連しています6,7,8。グレードIII（進行性）ショックでは、術中および術後の合併症や死亡率の上昇を防ぐため、輸血が患者の生存に不可欠です。上記のような生命を脅かす状況をすべて克服するために、水溶性止血ポリマーの組み合わせを用いて、最小限のポリマー濃度（0.5%）でナノ多孔質繊維強化複合足場（NFRCS）を開発しました。
繊維強化材を使用することで、費用対効果の高い製品を開発できます。ランダムに配置された繊維はトンボの羽の構造に似ており、羽の水平方向と垂直方向の縞模様によってバランスが取られています。羽の横脈と縦脈は羽膜とつながっています（図1）。NFRCSは、より優れた物理的および機械的強度を持つ足場システムとして強化Ctで構成されています（図1）。手頃な価格と職人技のため、外科医は手術やドレッシングの際に綿糸ゲージ（Ct）を使用することを好みます。 したがって、90%以上の結晶性セルロース（止血活性の向上に貢献する）を含む複数の利点を考慮して、CtはNFRCS9,10の骨格系として使用されました。 したがって、90%以上の結晶性セルロース（止血活性の向上に貢献する）を含む複数の利点を考慮して、CtはNFRCS9,10の骨格系として使用されました。 Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повыbolении гемостатической активности)、Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10。 そのため、90%以上の結晶性セルロース（止血活性の向上に関与）を含む多くの利点があることから、CtはNFRCS骨格系として使用されました9,10。したがって、Ct は NFRCS9,10 の骨格系として機能しており、90% を超える結晶粒を含み (血栓活性の増強を助ける)、その多面的な利益を考慮しています。したがって、90% を超える多重利益を考慮すると、したがって、90%以上の結晶性セルロース（止血活性を高めるのに役立つ）を含む多くの利点があることから、CtはNFRCS9,10の足場として使用されました。Ctは表面にコーティングされ（ナノ厚膜の形成が観察された）、止血膜形成組成物（HFFC）と相互接続された。HFFCはマトリゲルのように働き、ランダムに配置されたCtを結合する。開発された設計は、分散相（強化繊維）内で応力を伝達する。最小限のポリマー濃度で良好な機械的強度を持つナノ多孔質構造を得ることは困難である。さらに、さまざまな生物医学用途に合わせて異なる金型をカスタマイズすることも容易ではない。
図は、トンボの翅の構造に基づいたNFRCS設計の図を示しています（A）。この画像は、トンボの翅の構造（翅の交差する縦脈が相互に連結している）とCp NFRCSの断面顕微鏡写真との比較類似性を示しています（B）。NFRCSの模式図。
NFRCは、上記の制限に対処するためにHFFCを連続相として使用して開発されました。HFFCは、キトサン（主止血ポリマーとして）とメチルセルロース（MC）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC 50 cp）、および血栓形成を促進するサポートポリマーとしてのポリビニルアルコール（PVA）（125 kDa）を含むさまざまなフィルム形成止血ポリマーで構成されています。ポリビニルピロリジンK30（PVP K30）の添加により、NFRCの吸湿能力が向上しました。ポリエチレングリコール400（PEG 400）は、結合ポリマーブレンドのポリマー架橋を改善するために添加されました。3つの異なるHFFC止血組成物（Cm HFFC、Ch HFFC、およびCp HFFC）、すなわちMCを含むキトサン（Cm）、HPMCを含むキトサン（Ch）、およびPVAを含むキトサン（Cp）がCtに適用されました。 NFRCSの止血作用および創傷治癒作用は、様々なin vitroおよびin vivo特性評価研究によって確認されています。NFRCSが提供する複合材料は、特定のニーズに合わせて様々な形態の足場をカスタマイズするために使用できます。
さらに、NFRCSは包帯やロール状に加工することで、下肢や体の他の部位の負傷部位全体を覆うことができます。特に戦闘による四肢の負傷の場合、NFRCSのデザインを半腕または全脚に変更することも可能です（補足図S11）。NFRCSは組織接着剤でリストバンドに加工でき、自殺行為による重度の手首の負傷からの出血を止めるのに使用できます。私たちの主な目標は、できるだけポリマーの使用量を抑え、貧困層を含む多くの人々に提供でき、救急箱に収納できるNFRCSを開発することです。シンプルで効率的かつ経済的な設計のNFRCSは、地域社会に利益をもたらし、世界的な影響を与える可能性があります。
キトサン（分子量80 kDa）とアマランスは、インドのメルク社から購入した。ヒドロキシプロピルメチルセルロース50 Cp、ポリエチレングリコール400、メチルセルロースは、ムンバイのLoba Chemie Pvt. LLCから購入した。ポリビニルアルコール（分子量125 kDa）（加水分解度87～90%）は、グジャラート州のNational Chemicalsから購入した。ポリビニルピロリジンK30は、ムンバイのMolychemから購入した。滅菌綿棒は、タミル・ナードゥ州のRamaraju Surgery Cotton Mills Ltd.から購入し、キャリアとしてMilli Q水（インドのメルク社製Direct-Q3浄水システム）を使用した。
NFRCSは凍結乾燥法11,12を用いて開発された。HFFC組成物（表1）はすべて機械式撹拌機を用いて調製した。キトサン0.5%溶液を、1%酢酸水溶液を用いて機械式撹拌機で800rpmで連続撹拌して調製した。表1に示す充填ポリマーの正確な重量をキトサン溶液に加え、透明なポリマー溶液が得られるまで撹拌した。得られた混合物に、表1に示す量のPVP K30とPEG 400を加え、透明で粘性のあるポリマー溶液が得られるまで撹拌を続けた。得られたポリマー溶液の浴を60分間超音波処理して、ポリマー混合物から捕捉された気泡を除去した。補足図S1(b)に示すように、Ctは5 mlのHFFCを添加した6ウェルプレート（モールド）の各ウェルに均等に分布した。
6ウェルプレートを60分間超音波処理して、HFFCがCtネットワーク全体に均一に湿潤・分布するようにした。次に、6ウェルプレートを-20℃で8～12時間凍結した。凍結プレートを48時間凍結乾燥して、さまざまなNFRCS製剤を得た。同じ手順で、タンポンや円筒形タンポンなど、さまざまな形状や構造の製品、または用途に応じたその他の形状の製品を製造する。
正確に秤量したキトサン（80 kDa）（3%）を、マグネチックスターラーを用いて1%酢酸に溶解する。得られたキトサン溶液に1% PEG 400を加え、30分間攪拌する。得られた溶液を正方形または長方形の容器に注ぎ、-80℃で12時間凍結する。凍結したサンプルを48時間凍結乾燥して多孔質Cs13を得る。
開発されたNFRCSは、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）（島津製作所製8400 s FTIR、東京、日本）を用いた実験に供され、キトサンと他のポリマー14,15との化学的適合性が確認された。試験したすべてのサンプルのFTIRスペクトル（スペクトル範囲の幅は400～4000 cm-1）は、32回のスキャンを実行することによって得られた。
すべての製剤の血液吸収率（BAR）は、Chenら¹⁶が記載した方法を若干修正して評価した。開発されたすべての組成のNFRKは、残留溶媒を除去するために、105℃の真空オーブンで一晩乾燥させた。30 mgのNFRCS（初期サンプル重量 – W0）と30 mgのCt（陽性対照）を、3.8%クエン酸ナトリウムのプレミックスを含む別々の皿に入れた。所定の時間間隔、すなわち5、10、20、30、40、および60秒で、NFRCSを取り出し、サンプルをCt上に30秒間置いて、吸収されなかった血液を表面から除去した。各時点におけるNFRCS¹⁶によって吸収された血液の最終重量を（W1）とした。次の式を使用してBARパーセンテージを計算する。
血液凝固時間（BCT）は、Wangら17の報告に従って測定した。NFRCS存在下で全血（3.8%クエン酸ナトリウムを予め混合したラット血液）が凝固するのに要する時間を、試験サンプルのBCTとして算出した。各種NFRCS成分（30 mg）を10 mlスクリューキャップバイアルに入れ、37℃でインキュベートした。バイアルに血液（0.5 ml）を加え、血液凝固を活性化するために0.2 M CaCl2を0.3 ml加えた。最後に、しっかりとした凝固物が形成されるまで、15秒ごとにバイアルを反転（最大180°）した。サンプルのBCTは、反転回数で推定した17,18。BCTに基づいて、NFRCS Cm、Ch、Cpから2つの最適な組成を選択し、さらに特性評価研究を行った。
Ch NFRCS および Cp NFRCS 組成物の BCT は、Li ら 19 によって記載された方法を実施して決定した。15 x 15 mm2 の Ch NFRCS、Cp NFRCS、および Cs (陽性対照) を別々のペトリ皿 (37 °C) に置く。3.8% クエン酸ナトリウムを含む血液を 0.2 M CaCl2 と 10:1 の体積比で混合し、血液凝固プロセスを開始した。20 µl の 0.2 M CaCl2 ラット血液混合物をサンプル表面に塗布し、空のペトリ皿に置いた。対照は、Ct を含まない空のペトリ皿に注いだ血液である。0、3、および 5 分の一定間隔で、凝固を乱さずに、サンプルを含む皿に 10 ml の脱イオン (DI) 水を加えて凝固を停止する。異なる時点におけるヘモグロビン濃度（HA(t)）を、UV-Vis分光光度計を用いて540 nm（ヘモグロビンの最大吸収波長）で測定した。基準値として、脱イオン水10 mlに溶解した血液20 µlの0分時点におけるヘモグロビンの絶対吸光度（AH(0)）を用いた。凝固血液の相対ヘモグロビン吸収率（RHA）は、同一バッチの血液を用いてHA(t)/HA(0)の比率から算出した。
テクスチャーアナライザー（Texture Pro CT V1.3 Build 15、Brookfield、USA）を使用して、NFRKの損傷組織への接着特性を測定した。底が開いた円筒形の皿を豚皮の内側（脂肪層を除く）に押し当てた。サンプル（Ch NFRCSおよびCp NFRCS）をカニューレを介して円筒形の型に塗布し、豚の皮膚に接着させた。室温（RT）（25°C）で3分間インキュベートした後、NFRCSの接着強度を0.5 mm/秒の一定速度で記録した。
外科用シーラントの主な特徴は、出血を減らしながら血液凝固を促進することです。NFRCS の無損失凝固は、以前に発表された方法を少し変更して評価しました 19。遠心チューブの片側に 8 × 5 mm2 の穴 (開いた傷を表す) があるマイクロ遠心チューブ (2 ml) (内径 10 mm) を作成します。NFRCS を使用して開口部を閉じ、テープを使用して外縁を密封します。3.8% クエン酸ナトリウムプレミックスを含むマイクロ遠心チューブに 0.2 M CaCl2 を 20 µl 加えます。10 分後、マイクロ遠心チューブをシャーレから取り外し、NFRK (n = 3) からの血液の流出によりシャーレの質量の増加を測定しました。Ch NFRCS と Cp NFRCS の出血量を Cs と比較しました。
NFRCSの湿潤状態は、MishraとChaudhary21によって記述された方法に若干の変更を加えて決定した。NFRCSを50 mlの水を入れた100 mlの三角フラスコに入れ、蓋を作らずに60秒間振とうする。採取に基づいてサンプルの物理的完全性を目視で検査し、優先順位を付ける。
HFFC と Ct の結合強度は、以前に発表された方法を少し変更して研究した。表面コーティングの完全性は、ミリQ 水 (Ct) の存在下で NFRK を音波 (外部刺激) にさらすことによって評価した。開発した NFRCS Ch NFRCS と Cp NFRCS を水で満たしたビーカーに入れ、それぞれ 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、30 分超音波処理した。乾燥後、NFRCS の初期重量と最終重量のパーセント差を使用して、材料 (HFFC) の損失率を計算した。in vitro BCT は、結合強度または表面材料の損失をさらに裏付けた。HFFC の Ct への結合効率は、血液凝固と Ct22 表面の弾性コーティングを提供する。
開発されたNFRCSの均一性は、NFRCSのランダムに選択された一般的な場所から採取したサンプル（30 mg）のBCTによって決定されました。NFRCSの適合性を確認するには、前述のBCT手順に従ってください。5つのサンプルすべてが近接しているため、Ctメッシュ内の表面被覆とHFFCの沈着が均一になります。
公称血液接触面積（NBCA）は、以前に報告された方法に若干の変更を加えて決定した。Ct、Ch NFRCS、Cp NFRCS、Csの2つの表面の間に20 µlの血液を挟んで血液を凝固させた。1時間後、ステントの2つの部分を分離し、血栓の面積を手動で測定した。3回の繰り返し測定の平均値をNBCA NFRCS19とした。
動的蒸気吸着（DVS）分析を用いて、NFRCSが外部環境または凝固開始の原因となる損傷部位から水分を吸収する効果を評価した。DVSは、質量分解能±0.1µgの超高感度天秤を用いて、試料中の蒸気の吸収と損失を重量測定により評価または記録する。試料周囲の電子式質量流量コントローラーにより、飽和キャリアガスと乾燥キャリアガスを混合することで、部分蒸気圧（相対湿度）が生成される。 欧州薬局方のガイドラインに従い、サンプルの吸湿率に基づいて、サンプルは4つのカテゴリー（0～0.012% w/w：非吸湿性、0.2～2% w/w：やや吸湿性、2～15%：中程度の吸湿性、15%超：非常に吸湿性）に分類された23。 欧州薬局方のガイドラインに従い、サンプルの吸湿率に基づいて、サンプルは4つのカテゴリー（0～0.012% w/w：非吸湿性、0.2～2% w/w：やや吸湿性、2～15%：中程度の吸湿性、15%超：非常に吸湿性）に分類された23。欧州薬局方の勧告に従い、試料の吸湿率に応じて、試料は4つのカテゴリー（0～0.012% w/w - 非吸湿性、0.2～2% w/w - わずかに吸湿性、2～15%）に分類されました。% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. 中程度の吸湿性を持つものの割合は%、非常に吸湿性の高いものは15%以上)23。欧洲薬典南によれば、試料が水分を吸収する割合に応じて、試料の割合は４種類（０〜０．０１２％ｗ／ｗ−非吸湿性、０．２〜２％ｗ／ｗ、微吸湿性、２〜１５％、＞１５％超吸湿性）である２３。欧州洲药典指南による、吸湿水分の百分率样品分別 分別类 （（0-0.012% W/w-吸湿性、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微、2-15% 水分吸湿性、> 15 % 非常に吸湿性が高い）23。欧州薬局方の勧告に従い、試料は試料が吸収する水分の割合に応じて4つのクラスに分類されます（重量比0～0.012％：非吸湿性、重量比0.2～2％：やや吸湿性、重量比2～15％）。% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % 中程度の吸湿性、> 15% 非常に吸湿性）23.NFCS X NFCSおよびTsN NFCSの吸湿効率は、分析装置DVS TA TGA Q5000 SAで測定した。この過程で、実行時間、相対湿度（RH）、および25℃でのリアルタイムサンプル重量が得られた。水分含有量は、以下の式を用いてNFRCSの正確な質量分析によって計算される。
MCはNFRCSの湿度です。m1はNSAIDの乾燥重量です。m2は特定の相対湿度におけるNFRCSのリアルタイム質量です。
試料を25℃で10時間（< 7 × 10–3 Torr）放置した後、液体窒素を用いた窒素吸着実験により全表面積を推定した。 試料を25℃で10時間（< 7 × 10–3 Torr）放置した後、液体窒素を用いた窒素吸着実験により全表面積を推定した。 Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после Топорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр)。 サンプルを25℃で10時間（< 7 × 10–3 Torr）放置した後、液体窒素を用いた窒素吸着実験により総表面積を推定した。２５℃の清浄なサンプルを１０時間（＜７×１０−３Ｔｏｒｒ）放置した後、液体窒素を使用して表面全体を観察した。25℃で Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после気温は 10 ℃、25 °C (< 7 × 10-3 торр) です。 試料を25℃（7×10⁻³トル未満）で10時間空にした後、液体窒素を用いた窒素吸着実験により全表面積を推定した。全表面積、細孔容積、およびNFRCS細孔径は、オーストリアのNOVA 1000e社製Quantachrome装置を用い、RS 232ソフトウェアを使用して測定した。
全血から 5% RBC (希釈剤として生理食塩水) を調製します。次に、HFFC (0.25 ml) のアリコートを 96 ウェル プレートに移し、5% RBC の質量 (0.1 ml) を加えます。混合物を 37 °C で 40 分間インキュベートします。赤血球と血清の混合物を陽性対照とし、生理食塩水と赤血球の混合物を陰性対照としました。赤血球凝集は Stajitzky スケールに従って判定しました。提案されたスケールは次のとおりです。 + + + + 密な顆粒状凝集体; + + + 湾曲した縁を持つ滑らかな底パッド; + + 裂けた縁を持つ滑らかな底パッド; + 滑らかなパッドの縁の周りに狭い赤いリング; – (陰性) 下部ウェルの中央に離散的な赤いボタン 12。
NFRCS の血液適合性は、国際標準化機構 (ISO) (ISO10993-4、1999)26,27 の方法に従って研究された。Singh らによって記述された重量法。NFRCS の存在下または表面での血栓形成を評価するために、若干の変更が加えられた。500 mg の Cs、Ch NFRCS および Cp NFRCS をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中で 37 °C で 24 時間インキュベートした。24 時間後、PBS を除去し、NFRCS を 3.8% クエン酸ナトリウムを含む 2 ml の血液で処理した。NFRCS の表面に、インキュベートしたサンプルに 0.04 ml の 0.1 M CaCl2 を加えた。45 分後、凝固を止めるために 5 ml の蒸留水を加えた。 NFRK表面の凝固血液を36～38%ホルムアルデヒド溶液で処理した。ホルムアルデヒドで固定した血栓を乾燥させ、重量を測定した。血液とサンプルを含まないガラス（ネガティブコントロール）と血液を含むガラス（ポジティブコントロール）の重量を計算することで、血栓形成率を推定した。
初期確認として、HFFC表面コーティング、相互接続されたCt、およびCtネットワークが細孔を形成する能力を理解するために、サンプルを光学顕微鏡で観察した。NFRCSのChとCpの薄切片をメスで切り出した。得られた切片をスライドガラスに載せ、カバーガラスで覆い、端を接着剤で固定した。準備したスライドを光学顕微鏡で観察し、異なる倍率で写真を撮影した。
Ctネットワークにおけるポリマーの堆積は、Riceら²⁹によって記述された方法に基づいて蛍光顕微鏡を用いて可視化された。 製剤に使用したHFFC組成物に蛍光色素（アマランス）を混合し、前述の方法に従ってNFRCS（ChおよびCp）を調製した。 製剤に使用したHFFC組成物に蛍光色素（アマランス）を混合し、前述の方法に従ってNFRCS（ChおよびCp）を調製した。製剤に使用したHFFC組成物を蛍光色素（アマランス）と混合し、前述の方法に従ってNFRCS（ChおよびCp）を得た。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。配合に使用したＨＦＦＣ組成物を蛍光色素（菜）と混合し、前述の方法に従ってＮＦＲＣＳ（Ｃｈ＆Ｃｐ）を調製した。製剤に使用されたHFFC組成物は、前述のように蛍光色素（アマランス）と混合され、NFRCS（ChおよびCp）を投与された。得られたサンプルからNFRKの薄切片を切り出し、スライドガラスに載せ、カバーガラスで覆った。作製したスライドを蛍光顕微鏡で緑色フィルター（310～380 nm）を用いて観察した。Ctの関係性やCtネットワークにおける過剰なポリマー沈着を理解するため、4倍の倍率で画像を撮影した。
NFRCS Ch および Cp の表面形状は、タッピングモードの超鋭利な TESP カンチレバーを備えた原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して決定されました: 42 N/m、320 kHz、ROC 2-5 nm、Bruker、台湾。表面粗さは、ソフトウェア (Scanning Probe Image Processor) を使用して二乗平均平方根 (RMS) によって決定されました。さまざまな NFRCS の位置が 3D 画像にレンダリングされ、表面の均一性が確認されました。特定の領域のスコアの標準偏差が表面粗さとして定義されます。RMS 方程式を使用して、NFRCS31 の表面粗さを定量化しました。
FESEMベースの研究は、Cm NFRCSよりも優れたBCTを示したCh NFRCSとCp NFRCSの表面形態を理解するために、FESEM、SU8000、HI-0876-0003、日立、東京を使用して実施されました。FESEM研究は、Zhaoら32によって記載された方法に従って、若干の変更を加えて実施されました。NFRCS 20～30 mgのCh NFRCSとCp NFRCSを、ラット血液と混合した3.8%クエン酸ナトリウム20 µlと事前に混合しました。血液処理したサンプルに0.2 M CaCl2 20 µlを加えて凝固を開始し、サンプルを室温で10分間インキュベートしました。さらに、生理食塩水で洗浄することにより、NFRCS表面から過剰な赤血球を除去しました。
その後のサンプルは、0.1% グルタルアルデヒドで処理し、水分を除去するために 37°C の熱風オーブンで乾燥させた。乾燥させたサンプルはコーティングされ、分析された 32。分析中に得られたその他の画像は、個々の綿繊維の表面での凝血塊の形成、Ct 間のポリマー沈着、赤血球の形態 (形状)、凝血塊の完全性、および NFRCS の存在下での赤血球の形態であった。未処理の NFRCS 領域と、血液とともにインキュベートされた Ch および Cp で処理された NFRCS 領域は、元素イオン (ナトリウム、カリウム、窒素、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、銅、セレン) についてスキャンされた 33。処理済みサンプルと未処理サンプルの元素イオンの割合を比較して、凝血塊形成中の元素イオンの蓄積と凝血塊の均一性を理解する。
Ct表面上のCp HFFC表面コーティングの厚さはFESEMを用いて測定した。Cp NFRCSの断面をフレームワークから切り出し、スパッタコーティングした。得られたスパッタコーティングサンプルをFESEMで観察し、表面コーティングの厚さを測定した34、35、36。
X線マイクロCTは高解像度の3D非破壊イメージングを提供し、NFRKの内部構造配置を研究することを可能にします。マイクロCTは、サンプルを通過するX線ビームを使用して、サンプル内のX線の局所的な線減衰係数を記録し、形態学的情報を取得するのに役立ちます。Cp NFRCSおよび血液処理されたCp NFRCSにおけるCtの内部位置は、NFRCS37,38,39の存在下での吸収効率と血液凝固を理解するために、マイクロCTによって調べられました。血液処理されたCp NFRCSサンプルと未処理のCp NFRCSサンプルの3D構造は、マイクロCT（V|tome|x S240、Phoenix、ドイツ）を使用して再構築されました。VG STUDIO-MAXソフトウェアバージョン2.2を使用して、NFRCSの3D画像を作成するために、さまざまな角度（理想的には360°カバー）から複数のX線画像が撮影されました。収集された投影データは、対応するシンプルな3D ScanIP Academicソフトウェアを使用して3Dボリューム画像に再構築されました。
さらに、血栓の分布を理解するために、NFRCSに20 µlのクエン酸添加血液と20 µlの0.2 M CaCl2を添加して血液凝固を開始させた。準備したサンプルは硬化するまで放置した。NFRK表面を0.5%グルタルアルデヒドで処理し、30～40℃の熱風オーブンで30分間乾燥させた。NFRCS上に形成された血栓をスキャン、再構成し、血栓の3D画像を可視化した。
抗菌アッセイは、以前に記載された方法に若干の変更を加えて、Cp NFRCS (Ch NFRCS と比較するのが最適) に対して実施した。Cp NFRCS および Cp HFFC の抗菌活性は、インキュベーター内のペトリ皿の寒天培地で培養した 3 種類の試験微生物 [S.aureus (グラム陽性菌)、E.coli (グラム陰性菌)、および白色カンジダ (C.albicans)] を使用して測定した。105-106 CFU ml-1 の濃度に希釈した細菌培養懸濁液 50 ml を寒天培地に均一に接種する。培地をペトリ皿に注ぎ、固化させる。寒天プレートの表面に HFFC を満たすためのウェルを作成した (HFFC 用に 3 ウェル、ネガティブコントロール用に 1 ウェル)。3 つのウェルに 200 µl の HFFC を加え、4 番目のウェルに 200 µl pH 7.4 PBS を加える。ペトリ皿の反対側に、固まった寒天の上に 12 mm Cp NFRCS ディスクを置き、PBS (pH 7.4) で湿らせます。シプロフロキサシン、アンピシリン、フルコナゾール錠は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンスの標準物質とみなされます。阻止円を手動で測定し、阻止円のデジタル画像を撮影します。
倫理委員会の承認後、この研究は南インドのカルナタカ州マニパルにあるカストゥルバ医科大学教育研究センターで実施されました。in vitro TEG 実験プロトコルは、カルナタカ州マニパルのカストゥルバ医科大学の倫理委員会 (IEC: 674/2020) によって審査され、承認されました。被験者は、病院の血液バンクからボランティアの献血者 (18 ～ 55 歳) から募集されました。さらに、血液サンプルの収集についてボランティアからインフォームド コンセントフォームを取得しました。ネイティブ TEG (N-TEG) は、クエン酸ナトリウムと混合した全血に対する Cp HFFC 製剤の影響を調べるために使用されました。N-TEG は、臨床的に重要な結果の遅延の可能性 (ルーチンの凝固検査) により臨床医にとって問題となるポイント オブ ケア蘇生での役割が広く認識されています。N-TEG 分析は全血を使用して実施されました。すべての参加者からインフォームド コンセントと詳細な病歴を取得しました。この研究には、妊娠/産後や肝疾患などの止血または血栓性合併症のある参加者は含まれていませんでした。凝固カスケードに影響を与える薬剤を服用している被験者も研究から除外されました。すべての参加者に対して、標準的な手順に従って基本的な臨床検査（ヘモグロビン、プロトロンビン時間、活性化トロンボプラスチン、血小板数）が実施されました。N-TEGは、血栓の粘弾性、初期血栓構造、粒子相互作用、血栓強化、および血栓溶解を決定します。N-TEG分析は、いくつかの細胞要素と血漿の集合的効果に関するグラフおよび数値データを提供します。N-TEG分析は、2つの異なる容量のCp HFFC（10 µlと50 µl）で実施されました。その結果、1 mlの全血とクエン酸が10 μlのCp HFFCに添加されました。 1 ml (Cp HFFC + クエン酸血液)、340 µl の混合血液を 20 µl の 0.2 M CaCl2 を含む TEG ディッシュに加えます。その後、TEG ディッシュを TEG® 5000、US にロードし、Cp HFFC41 の存在下で血液サンプルの 30% の R、K、アルファ角、MA、G、CI、TPI、EPL、LY を測定します。
生体内研究プロトコルは、マニパル高等教育機関カストゥルバ医科大学の機関動物倫理委員会（IAEC）（IAEC/KMC/69/2020）によって審査され承認されました。すべての動物実験は、動物実験管理監督委員会（CPCSEA）の勧告に従って実施されました。すべての生体内NFRCS研究（2 × 2 cm2）は、雌のWistarラット（体重200～250 g）で実施されました。すべての動物は24～26℃の温度に順応し、動物は標準飼料と水を自由に摂取できました。すべての動物はランダムに異なるグループに分けられ、各グループは3匹の動物で構成されました。すべての研究は、動物研究：生体内実験の報告43に従って実施されました。実験開始前に、動物にはケタミン20～50mg（体重1kgあたり）とキシラジン2～10mg（体重1kgあたり）の混合液を腹腔内投与して麻酔を施した。実験終了後、サンプルの初期重量と最終重量の差を評価して出血量を算出し、3回の測定で得られた平均値をサンプルの出血量とした。
ラットの尾切断モデルは、外傷、戦闘、または交通事故（傷害モデル）における出血を調節するNFRCSの可能性を理解するために実施されました。メス刃で尾の50%を切断し、15秒間空気中に置いて正常な出血を確認します。さらに、圧力を加えることにより、試験サンプルをラットの尾に置きました（Ct、Cs、Ch NFRCSおよびCp NFRCS）。試験サンプル（n ​​= 3）17、45について出血とPCTが報告されました。
戦闘時におけるNFRCSの圧迫制御の有効性を、浅大腿動脈モデルを用いて検討した。大腿動脈を露出させ、24Gトロカールで穿刺し、15秒以内に出血させた。出血が制御不能になった後、穿刺部位に試験試料を置き、圧迫を加えた。試験試料の適用直後に凝固時間を記録し、その後5分間の止血効果を観察した。同様の手順をCsおよびCt46を用いて繰り返した。
Dowling ら 47 は、術中出血の状況下で止血材料の止血能を評価するために肝損傷モデルを提案した。Ct サンプル (陰性対照)、Cs フレームワーク (陽性対照)、Ch NFRCS サンプル、および Cp NFRCS サンプルの BCT を記録した。正中開腹術を行い、ラットの上肝静脈を露出させた。その後、左葉の遠位部をハサミで切り取った。メスで肝臓に切開を加え、数秒間出血させた。正確に秤量した Ch NFRCS および Cp NFRCS 試験サンプルを、陽圧をかけずに損傷面に置き、BCT を記録した。次に、対照群 (Ct) に圧力を加え、続いて Cs 30 s47 を損傷を破らずに置いた。
開発したポリマーベースのNFRCSの創傷治癒特性を評価するために、切除創モデルを使用して生体内創傷治癒アッセイを実施した。切除創モデルは、以前に発表された方法に若干の変更を加えて選択および実施した19,32,48。すべての動物は、以前に記載したように麻酔した。生検パンチ（12 mm）を使用して、背部の皮膚に円形の深い切開を行った。準備した創傷部位には、Cs（陽性対照）、Ct（綿パッドが治癒を妨げることを認識）、Ch NFRCSおよびCp NFRCS（実験群）、および何も処理しない陰性対照を貼付した。研究の各日に、すべてのラットの創傷面積を測定した。デジタルカメラを使用して創傷部位の写真を撮影し、新しいドレッシングを貼付した。創傷閉鎖率は、次の式で測定した。
研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良群（Cp NFRCS群と対照群）のラットの皮膚を切除し、H&E染色とマッソントリクローム染色で調べた。 研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良群（Cp NFRCS群と対照群）のラットの皮膚を切除し、H&E染色とマッソントリクローム染色で調べた。研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、最良群（Cp NFRCS）および対照群のラットの皮膚を切除し、ヘマトキシリン・エオジン染色およびマッソントリクローム染色で検査した。１２日目の経口結合比の研究に基づいて、最適なグループ（（Ｃｐ ＮＦＲＣＳ）および対照グループ）のマウス皮を切除し、Ｈ＆Ｅ染色およびマッソン三色染色研究を行った。12日目の研究に基づいて、最適なグループ（(Cp NFRCS)および対照グループ）のタイツ皮を切除し、H&E染色および組織を実施した。最良のグループ（Cp NFRCSグループと対照グループ）のラットは、研究12日目の創傷閉鎖率に基づいて、ヘマトキシリン・エオジン染色とマッソントリクローム染色のために切除された。実施した染色手順は、既述の方法49,50に従って実施した。簡単に説明すると、10%ホルマリンで固定した後、サンプルを段階的に濃度を上げたアルコールで脱水した。切除した組織の薄切片（厚さ5 µm）を得るためにミクロトームを使用した。コントロールとCp NFRCSの薄切連続切片をヘマトキシリンとエオシンで処理し、組織病理学的変化を調べた。コラーゲン線維の形成を検出するためにマッソントリクローム染色を使用した。得られた結果は、病理医によって盲検的に検討された。
Cp NFRCS サンプルの安定性は、室温 (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) で 12 か月にわたって研究されました 51。Cp NFRCS (表面の変色と微生物の増殖) は目視検査され、材料と方法のセクションで概説した上記の方法に従って折り目摩耗耐性と BCT がテストされました。
Cp NFRCSの拡張性と再現性を調べるため、15×15 cm2サイズのCp NFRCSを調製した。さらに、様々なCp NFRCS分画から30 mgのサンプル（n = 5）を切り出し、前述の方法の項で説明したように、これらのサンプルのBCTを評価した。
我々は、様々な生物医学的用途向けに、Cp NFRCS組成物を用いた多様な形状や構造の開発を試みてきた。こうした形状や構造には、鼻血や歯科処置用の円錐形綿棒、膣出血用の円筒形綿棒などが含まれる。
すべてのデータセットは平均値±標準偏差として表され、Prism 5.03（GraphPad、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いたANOVAにより分析され、その後ボンフェローニの多重比較検定（*p<0.05）が行われた。
ヒトを対象とした研究で実施されたすべての手順は、研究所および国立研究評議会の基準、ならびに1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改訂版、または同様の倫理基準に準拠しています。すべての参加者は、研究の特徴と参加が任意であることについて説明を受けました。参加者のデータは、収集後も機密情報として扱われます。体外TEG実験プロトコルは、カルナータカ州マニパルのカストゥルバ医科大学の倫理委員会（IEC: 674/2020）によって審査され、承認されています。ボランティアは、血液サンプルを採取するためのインフォームドコンセントに署名しました。
動物実験で実施されたすべての手順は、マニパル高等教育機関カストゥバ医学部（IAEC/KMC/69/2020）の規定に従って行われました。計画されたすべての動物実験は、動物実験管理監督委員会（CPCSEA）のガイドラインに従って実施されました。すべての著者はARRIVEガイドラインを遵守しています。
すべての NFRCS の FTIR スペクトルを分析し、図 2A に示すキトサン スペクトルと比較した。キトサン (記録) の特徴的なスペクトル ピークは、3437 cm-1 (OH および NH 伸縮、重なり)、2945 および 2897 cm-1 (CH 伸縮)、1660 cm-1 (NH2 歪み)、1589 cm-1 (N–H 曲げ)、1157 cm-1 (ブリッジ伸縮 O-)、1067 cm-1 (伸縮 C–O、二次ヒドロキシル)、993 cm-1 (伸縮 CO、Bo-OH) 52.53.54 である。補足表 S1 には、キトサン (レポーター)、純粋キトサン、Cm、Ch、および Cp の FTIR NFRCS 吸収スペクトル値を示す。すべてのNFRCS（Cm、Ch、Cp）のFTIRスペクトルは、純粋なキトサンと同じ特徴的な吸収帯を示し、大きな変化は見られなかった（図2A）。FTIRの結果は、NFRCSの開発に使用されたポリマー間に化学的または物理的な相互作用がないことを確認し、使用されたポリマーが不活性であることを示している。
Cm NFRCS、Ch NFRCS、Cp NFRCS、Csのin vitro特性評価。(A)は、圧縮されたキトサンとCm NFRCS、Ch NFRCS、Cp NFRCSの組成物の複合FTIRスペクトルを表します。(B) a) NFRCS Cm、Ch、Cp、Cgの全血吸収率(n = 3)。綿棒の吸収効率が高いため、Ctサンプルはより高いBARを示しました。b) 血液吸収後の血液 吸収されたサンプルの図。試験サンプルCのBCTのグラフ表示(Cp NFRCSは最高のBCT(15秒、n = 3)を示しました)。 C、D、E、Gのデータは平均値±標準偏差として示されており、エラーバーは標準偏差を表している。***p < 0.0001。 C、D、E、Gのデータは平均値±標準偏差として示されており、エラーバーは標準偏差を表している。***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрезностей представляют стандартное отклонение、***p <0,0001。 C、D、E、Gのデータは平均値±標準偏差として示されており、エラーバーは標準偏差を表します。***p<0.0001。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ中のデータは、平均値±ＳＤを示し、差線はＳＤを表し、***ｐ＜０．０００１である。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрезавляют стандартное отклонение, ***p <0,0001。 C、D、E、Gのデータは平均値±標準偏差で示されており、エラーバーは標準偏差を表します。***p<0.0001。