Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Perdarahan yang tidak terkontrol merupakan salah satu penyebab utama kematian. Mencapai hemostasis yang cepat memastikan kelangsungan hidup subjek sebagai pertolongan pertama selama pertempuran, kecelakaan lalu lintas, dan operasi pengurangan kematian. Perancah komposit yang diperkuat serat nanopori (NFRCS) yang berasal dari komposisi pembentuk film hemostatik sederhana (HFFC) sebagai fase kontinyu dapat memicu dan meningkatkan hemostasis. Pengembangan NFRCS didasarkan pada desain sayap capung. Struktur sayap capung terdiri dari sayap melintang dan membujur, dan membran sayap saling terhubung untuk menjaga integritas struktur mikro. HFFC melapisi permukaan serat secara merata dengan film setebal nanometer dan menghubungkan ketebalan kapas yang terdistribusi secara acak (Ct) (fase terdispersi) untuk membentuk struktur nanopori. Kombinasi fase kontinyu dan terdispersi mengurangi biaya produk hingga sepuluh kali lipat dibandingkan dengan produk yang tersedia secara komersial. NFRCS yang dimodifikasi (tampon atau gelang) dapat digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis. Studi in vivo telah menyimpulkan bahwa Cp NFRCS yang dikembangkan memicu dan meningkatkan proses koagulasi di lokasi aplikasi. NFRCS dapat memodulasi lingkungan mikro dan bekerja pada tingkat sel karena struktur nanoporinya sehingga menghasilkan penyembuhan luka yang lebih baik dalam model luka eksisi.
Perdarahan yang tidak terkontrol selama pertempuran, intraoperatif, dan situasi darurat dapat menimbulkan ancaman serius terhadap nyawa yang terluka1. Kondisi ini selanjutnya menyebabkan peningkatan keseluruhan resistensi pembuluh darah perifer, yang menyebabkan syok hemoragik. Tindakan yang tepat untuk mengendalikan perdarahan selama dan setelah operasi dianggap berpotensi mengancam jiwa2,3. Kerusakan pada pembuluh darah besar menyebabkan kehilangan banyak darah, yang mengakibatkan tingkat kematian ≤ 50% dalam pertempuran dan 31% selama operasi1. Kehilangan banyak darah menyebabkan penurunan volume tubuh, yang mengurangi curah jantung. Peningkatan resistensi pembuluh darah perifer total dan gangguan progresif mikrosirkulasi menyebabkan hipoksia pada organ pendukung kehidupan. Syok hemoragik dapat terjadi jika kondisi ini berlanjut tanpa intervensi yang efektif1,4,5. Komplikasi lain termasuk perkembangan hipotermia dan asidosis metabolik, serta gangguan koagulasi yang menghambat proses koagulasi. Syok hemoragik yang parah dikaitkan dengan risiko kematian yang lebih tinggi6,7,8. Pada syok tingkat III (progresif), transfusi darah sangat penting untuk kelangsungan hidup pasien selama morbiditas dan mortalitas intraoperatif dan pascaoperatif. Untuk mengatasi semua situasi yang mengancam jiwa di atas, kami telah mengembangkan perancah komposit yang diperkuat serat nanopori (NFRCS) yang memanfaatkan konsentrasi polimer minimal (0,5%) menggunakan kombinasi polimer hemostatik yang larut dalam air.
Dengan penggunaan penguat serat, produk yang hemat biaya dapat dikembangkan. Serat yang tersusun secara acak menyerupai struktur sayap capung, diimbangi oleh garis-garis horizontal dan vertikal pada sayap. Vena melintang dan membujur pada sayap berkomunikasi dengan membran sayap (Gbr. 1). NFRCS terdiri dari Ct yang diperkuat sebagai sistem perancah dengan kekuatan fisik dan mekanis yang lebih baik (Gambar 1). Karena keterjangkauan dan pengerjaannya, dokter bedah lebih suka menggunakan pengukur benang katun (Ct) selama operasi dan pembalutan. Oleh karena itu, mengingat banyaknya manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Oleh karena itu, mengingat banyaknya manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Tingkat pengembalian yang tinggi, karena tingkat > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Oleh karena itu, mengingat banyaknya manfaatnya, termasuk >90% selulosa kristal (terlibat dalam peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10.,Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Oleh karena itu, mengingat banyaknya manfaatnya, termasuk lebih dari 90% selulosa kristal (membantu meningkatkan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai perancah untuk NFRCS9,10.Ct dilapisi secara superfisial (pembentukan lapisan film setebal nano diamati) dan dihubungkan dengan komposisi pembentuk lapisan hemostatik (HFFC). HFFC bertindak seperti matrigel, yang menyatukan Ct yang ditempatkan secara acak. Desain yang dikembangkan mentransmisikan tekanan dalam fase terdispersi (serat penguat). Sulit untuk mendapatkan struktur berpori nano dengan kekuatan mekanis yang baik menggunakan konsentrasi polimer minimal. Selain itu, tidak mudah untuk menyesuaikan cetakan yang berbeda untuk aplikasi biomedis yang berbeda.
Gambar tersebut menunjukkan diagram desain NFRCS berdasarkan struktur sayap capung (A). Gambar ini menunjukkan analogi komparatif struktur sayap capung (urat sayap yang berpotongan dan membujur saling terhubung) dan fotomikrograf penampang melintang dari Cp NFRCS (B). Representasi skematis NFRCS.
NFRC dikembangkan menggunakan HFFC sebagai fase kontinyu untuk mengatasi keterbatasan di atas. HFFC terdiri dari berbagai polimer hemostatik pembentuk film termasuk kitosan (sebagai polimer hemostatik utama) dengan metilselulosa (MC), hidroksipropil metilselulosa (HPMC 50 cp) dan polivinil alkohol (PVA) (125 kDa) sebagai polimer pendukung yang mendorong pembentukan trombus. Penambahan polivinilpirolidina K30 (PVP K30) meningkatkan kapasitas penyerapan air dari NFRCS. Polietilen glikol 400 (PEG 400) ditambahkan untuk meningkatkan ikatan silang polimer dalam campuran polimer terikat. Tiga komposisi hemostatik HFFC yang berbeda (Cm HFFC, Ch HFFC dan Cp HFFC), yaitu kitosan dengan MC (Cm), kitosan dengan HPMC (Ch), dan kitosan dengan PVA (Cp), diaplikasikan pada Ct. Berbagai studi karakterisasi in vitro dan in vivo telah mengonfirmasi aktivitas hemostatik dan penyembuhan luka dari NFRCS. Material komposit yang ditawarkan oleh NFRCS dapat digunakan untuk menyesuaikan berbagai bentuk perancah untuk memenuhi kebutuhan spesifik.
Selain itu, NFRCS dapat dimodifikasi sebagai perban atau gulungan untuk menutupi seluruh area cedera ekstremitas bawah dan bagian tubuh lainnya. Khusus untuk cedera anggota tubuh akibat pertempuran, desain NFRCS yang dirancang dapat diubah menjadi setengah lengan atau seluruh tungkai (Gambar Tambahan S11). NFRCS dapat dibuat menjadi gelang tangan dengan lem tisu, yang dapat digunakan untuk menghentikan pendarahan dari cedera pergelangan tangan yang parah dan berujung pada bunuh diri. Tujuan utama kami adalah mengembangkan NFRCS dengan polimer sesedikit mungkin yang dapat dikirimkan ke populasi besar (di bawah garis kemiskinan) dan yang dapat ditempatkan di kotak pertolongan pertama. Sederhana, efisien, dan ekonomis dalam desain, NFRCS bermanfaat bagi masyarakat lokal dan dapat memberikan dampak global.
Kitosan (berat molekul 80 kDa) dan amaranth dibeli dari Merck, India. Hidroksipropil metilselulosa 50 Cp, polietilena glikol 400 dan metilselulosa dibeli dari Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polivinil alkohol (berat molekul 125 kDa) (terhidrolisis 87-90%) dibeli dari National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidina K30 dibeli dari Molychem, Mumbai, kapas steril dibeli dari Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, dengan air Milli Q (sistem pemurnian air Direct-Q3, Merck, India) sebagai pembawa.
NFRCS dikembangkan menggunakan metode liofilisasi11,12. Semua komposisi HFFC (Tabel 1) disiapkan menggunakan pengaduk mekanis. Siapkan larutan kitosan 0,5% menggunakan asam asetat 1% dalam air dengan pengadukan terus-menerus pada 800 rpm pada pengaduk mekanis. Berat pasti polimer yang dimuat yang ditunjukkan pada Tabel 1 ditambahkan ke larutan kitosan dan diaduk hingga diperoleh larutan polimer bening. PVP K30 dan PEG 400 ditambahkan ke campuran yang dihasilkan dalam jumlah yang ditunjukkan pada Tabel 1, dan pengadukan dilanjutkan hingga diperoleh larutan polimer kental yang bening. Bak larutan polimer yang dihasilkan disonikasi selama 60 menit untuk menghilangkan gelembung udara yang terperangkap dari campuran polimer. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan S1(b), Ct didistribusikan secara merata di setiap sumur pelat 6 sumur (cetakan) yang dilengkapi dengan 5 ml HFFC.
Pelat enam sumur disonikasi selama 60 menit untuk mencapai pembasahan dan distribusi HFFC yang seragam dalam jaringan Ct. Kemudian, pelat enam sumur dibekukan pada suhu -20°C selama 8-12 jam. Pelat beku dikeringkan dalam suhu beku selama 48 jam untuk memperoleh berbagai formulasi NFRCS. Prosedur yang sama digunakan untuk menghasilkan berbagai bentuk dan struktur, seperti tampon atau tampon silinder, atau bentuk lain untuk berbagai aplikasi.
Kitosan (80 kDa) (3%) yang ditimbang dengan teliti dilarutkan dalam asam asetat 1% menggunakan pengaduk magnet. Pada larutan kitosan yang dihasilkan ditambahkan PEG 400 1% dan diaduk selama 30 menit. Tuang larutan yang dihasilkan ke dalam wadah persegi atau persegi panjang dan bekukan pada suhu -80°C selama 12 jam. Sampel beku dikeringkan dalam suhu beku selama 48 jam untuk memperoleh Cs13 yang berpori.
NFRCS yang dikembangkan menjadi sasaran eksperimen menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Jepang) untuk mengonfirmasi kompatibilitas kimia kitosan dengan polimer lain14,15. Spektrum FTIR (lebar rentang spektral dari 400 hingga 4000 cm-1) dari semua sampel yang diuji diperoleh dengan melakukan 32 pemindaian.
Laju penyerapan darah (BAR) untuk semua formulasi dievaluasi menggunakan metode yang dijelaskan oleh Chen et al. 16 dengan sedikit modifikasi. NFRK yang dikembangkan dari semua komposisi dikeringkan dalam oven vakum pada suhu 105°C semalaman untuk menghilangkan sisa pelarut. 30 mg NFRCS (berat sampel awal – W0) dan 30 mg Ct (kontrol positif) ditempatkan dalam cawan terpisah yang berisi campuran awal natrium sitrat 3,8%. Pada interval waktu yang telah ditentukan, yaitu 5, 10, 20, 30, 40 dan 60 detik, NFRCS dikeluarkan dan permukaannya dibersihkan dari darah yang tidak diserap dengan menempatkan sampel pada Ct selama 30 detik. Berat akhir darah yang diserap oleh NFRCS 16 dipertimbangkan (W1) pada setiap titik waktu. Hitung persentase BAR menggunakan rumus berikut:
Waktu pembekuan darah (BCT) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Wang et al. 17 . Waktu yang diperlukan untuk darah utuh (darah tikus yang dicampur dengan 3,8% natrium sitrat) untuk membeku dengan adanya NFRCS dihitung sebagai BCT dari sampel uji. Berbagai komponen NFRCS (30 mg) ditempatkan dalam botol tutup ulir 10 ml dan diinkubasi pada 37°C. Darah (0,5 ml) ditambahkan ke dalam botol dan 0,3 ml CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan untuk mengaktifkan pembekuan darah. Akhirnya, balikkan botol setiap 15 detik (hingga 180°) hingga terbentuk gumpalan yang kuat. BCT dari sampel diperkirakan dengan jumlah flips vails17,18. Berdasarkan BCT, dua komposisi optimal dari NFRCS Cm, Ch dan Cp dipilih untuk studi karakterisasi lebih lanjut.
BCT dari komposisi Ch NFRCS dan Cp NFRCS ditentukan dengan menerapkan metode yang dijelaskan oleh Li et al. 19 . Tempatkan 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs (kontrol positif) ke dalam cawan Petri terpisah (37 °C). Darah yang mengandung 3,8% natrium sitrat dicampur dengan 0,2 M CaCl2 dalam rasio volume 10:1 untuk memulai proses pembekuan darah. 20 µl campuran darah tikus 0,2 M CaCl2 dioleskan ke permukaan sampel dan ditempatkan di cawan Petri kosong. Kontrolnya adalah darah yang dituangkan ke dalam cawan Petri kosong tanpa Ct. Pada interval tetap 0, 3, dan 5 menit, hentikan pembekuan dengan menambahkan 10 ml air deionisasi (DI) ke sampel yang berisi cawan tanpa mengganggu bekuan. Eritrosit yang tidak terkoagulasi (eritrosit) mengalami hemolisis dengan adanya air deionisasi dan melepaskan hemoglobin. Hemoglobin pada titik waktu yang berbeda (HA(t)) diukur pada 540 nm (λmax hemoglobin) menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Penyerapan absolut hemoglobin (AH(0)) dalam 0 menit dari 20 µl darah dalam 10 ml air deionisasi diambil sebagai standar referensi. Penyerapan hemoglobin relatif (RHA) dari darah yang menggumpal dihitung dari rasio HA(t)/HA(0) menggunakan kelompok darah yang sama.
Menggunakan penganalisis tekstur (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, AS), sifat perekat NFRK pada jaringan yang rusak ditentukan. Tekan cawan silinder beralas terbuka pada bagian dalam kulit babi (tanpa lapisan lemak). Sampel (Ch NFRCS dan Cp NFRCS) diaplikasikan melalui kanula ke dalam cetakan silinder untuk menciptakan daya rekat pada kulit babi. Setelah inkubasi selama 3 menit pada suhu ruangan (RT) (25° C.), kekuatan perekat NFRCS direkam pada laju konstan 0,5 mm/detik.
Fitur utama dari sealant bedah adalah untuk meningkatkan pembekuan darah sambil mengurangi kehilangan darah. Koagulasi tanpa kehilangan dalam NFRCS dievaluasi menggunakan metode yang diterbitkan sebelumnya dengan sedikit modifikasi 19 . Buat tabung mikrocentrifuge (2 ml) (diameter dalam 10 mm) dengan lubang 8 × 5 mm2 di satu sisi tabung centrifuge (mewakili luka terbuka). NFRCS digunakan untuk menutup lubang dan selotip digunakan untuk menyegel tepi luar. Tambahkan 20 µl CaCl2 0,2 ​​M ke tabung mikrocentrifuge yang berisi premix natrium sitrat 3,8%. Setelah 10 menit, tabung mikrocentrifuge dikeluarkan dari cawan dan peningkatan massa cawan ditentukan karena aliran darah keluar dari NFRK (n = 3). Kehilangan darah Ch NFRCS dan Cp NFRCS dibandingkan dengan Cs.
Integritas basah NFRCS ditentukan berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Mishra dan Chaudhary21 dengan sedikit modifikasi. Tempatkan NFRCS dalam labu Erlenmeyer 100 ml dengan 50 ml air dan aduk selama 60 detik tanpa membentuk bagian atas. Inspeksi visual dan prioritas sampel untuk integritas fisik berdasarkan pengumpulan.
Kekuatan pengikatan HFFC ke Ct dipelajari menggunakan metode yang dipublikasikan sebelumnya dengan modifikasi minor. Integritas lapisan permukaan dinilai dengan memaparkan NFRK ke gelombang akustik (stimulus eksternal) dengan adanya air milliQ (Ct). NFRCS Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang dikembangkan ditempatkan dalam gelas kimia yang diisi dengan air dan disonikasi selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 30 menit, berturut-turut. Setelah pengeringan, persentase perbedaan antara berat awal dan akhir NFRCS digunakan untuk menghitung persentase kehilangan material (HFFC). BCT in vitro selanjutnya mendukung kekuatan pengikatan atau kehilangan material permukaan. Efisiensi pengikatan HFFC ke Ct memberikan pembekuan darah dan lapisan elastis pada permukaan Ct22.
Homogenitas NFRCS yang dikembangkan ditentukan oleh BCT sampel (30 mg) yang diambil dari lokasi umum NFRCS yang dipilih secara acak. Ikuti prosedur BCT yang disebutkan sebelumnya untuk menentukan kepatuhan NFRCS. Kedekatan antara kelima sampel memastikan cakupan permukaan yang seragam dan pengendapan HFFC dalam jaring Ct.
Luas kontak darah nominal (NBCA) ditentukan seperti yang dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. Darah dikoagulasikan dengan menjepit 20 µl darah di antara dua permukaan Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs. Setelah 1 jam, kedua bagian stent dipisahkan dan luas bekuan diukur secara manual. Nilai rata-rata dari tiga kali pengulangan dianggap NBCA NFRCS19.
Analisis Dynamic Vapor Sorption (DVS) digunakan untuk mengevaluasi efektivitas NFRCS dalam menyerap air dari lingkungan eksternal atau dari lokasi cedera yang bertanggung jawab untuk memulai koagulasi. DVS mengevaluasi atau mencatat penyerapan dan kehilangan uap dalam sampel secara gravimetrik menggunakan neraca yang sangat sensitif dengan resolusi massa ±0,1 µg. Tekanan uap parsial (kelembapan relatif) dihasilkan oleh pengontrol aliran massa elektronik di sekitar sampel dengan mencampur gas pembawa jenuh dan kering. Sesuai dengan pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dikategorikan menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b− non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23. Sesuai dengan pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dikategorikan menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23.Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, tergantung pada persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dibagi menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b – non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2– lima belas%).% умеренно гигроскопичен dan > 15% очень гигроскопичен)23. % agak higroskopis dan > 15% sangat higroskopis)23.tingkat suku bunga 0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% B/b 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ,> 15 %非常吸湿）23。Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, sampel dibagi menjadi 4 kelas tergantung pada persentase kelembaban yang diserap oleh sampel (0-0,012% berat – non-higroskopis, 0,2-2% berat sedikit higroskopis, 2-15% berat).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % agak higroskopis, > 15% sangat higroskopis) 23.Efisiensi higroskopis NFCS X NFCS dan TsN NFCS ditentukan pada alat analisis DVS TA TGA Q5000 SA. Selama proses ini, waktu proses, kelembaban relatif (RH), dan berat sampel waktu nyata pada suhu 25°C24 diperoleh. Kadar air dihitung dengan analisis massa NFRCS yang akurat menggunakan persamaan berikut:
MC adalah kelembaban NFRCS. m1 – berat kering NSAID. m2 adalah massa NFRCS waktu nyata pada RH tertentu.
Luas permukaan total diperkirakan menggunakan eksperimen penyerapan nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan eksperimen penyerapan nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Layanan Pelanggan yang Dapat Dipakai untuk Mendapatkan Bantuan yang Dapat Diperoleh suhu tinggi yang ditentukan selama 25 °С dalam waktu 10 jam (< 7 × 10–3 Торр). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan eksperimen penyerapan nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan pada suhu 25°C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后,使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。dan 25°C Layanan Pelanggan yang Dapat Dipakai untuk Membantu Anda Mendapatkan Bantuan жидким азотом после опорожнения образцов dalam waktu 10 jam hingga 25°C (< 7 × 10-3 торр). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan eksperimen penyerapan nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan selama 10 jam pada suhu 25°C (< 7 x 10-3 torr).Luas permukaan total, volume pori dan ukuran pori NFRCS ditentukan dengan Quantachrome dari NOVA 1000e, Austria menggunakan perangkat lunak RS 232.
Siapkan 5% sel darah merah (larutan garam sebagai pengencer) dari darah utuh. Kemudian pindahkan sebagian kecil HFFC (0,25 ml) ke dalam pelat 96-sumur dan massa sel darah merah 5% (0,1 ml). Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 40 menit. Campuran sel darah merah dan serum dianggap sebagai kontrol positif, dan campuran larutan garam dan sel darah merah sebagai kontrol negatif. Hemaglutinasi ditentukan menurut skala Stajitzky. Skala yang diusulkan adalah sebagai berikut: + + + + agregat granular padat; + + + bantalan dasar halus dengan tepi melengkung; + + bantalan dasar halus dengan tepi robek; + cincin merah sempit di sekitar tepi bantalan halus; – (negatif) tombol merah diskret 12 di tengah sumur bawah.
Hemokompatibilitas NFRCS dipelajari menurut metode International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Metode gravimetri yang dijelaskan oleh Singh et al. Modifikasi minor dilakukan untuk menilai pembentukan trombus dengan adanya atau pada permukaan NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS diinkubasi dalam larutan penyangga fosfat (PBS) selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah 24 jam, PBS dihilangkan dan NFRCS diobati dengan 2 ml darah yang mengandung 3,8% natrium sitrat. Pada permukaan NFRCS, tambahkan 0,04 ml CaCl2 0,1 M ke sampel yang diinkubasi. Setelah 45 menit, 5 ml air suling ditambahkan untuk menghentikan koagulasi. Darah yang menggumpal pada permukaan NFRK diobati dengan larutan formaldehida 36-38%. Gumpalan darah yang difiksasi dengan formaldehid dikeringkan dan ditimbang. Persentase trombosis diperkirakan dengan menghitung berat gelas tanpa darah dan sampel (kontrol negatif) dan gelas dengan darah (kontrol positif).
Sebagai konfirmasi awal, sampel divisualisasikan di bawah mikroskop optik untuk memahami kemampuan lapisan permukaan HFFC, Ct yang saling terhubung, dan jaringan Ct untuk membentuk pori-pori. Irisan tipis Ch dan Cp dari NFRCS dipangkas dengan pisau bedah. Irisan yang dihasilkan ditempatkan pada slide kaca, ditutup dengan penutup kaca, dan tepinya direkatkan dengan lem. Slide yang telah disiapkan dilihat di bawah mikroskop optik dan foto diambil pada perbesaran yang berbeda.
Deposisi polimer dalam jaringan Ct divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Rice et al.29. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresensi (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disiapkan sesuai metode yang disebutkan sebelumnya. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresensi (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disiapkan sesuai metode yang disebutkan sebelumnya.Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresensi (amaranth) dan NFRCS (Ch dan Cp) diperoleh menurut metode yang disebutkan sebelumnya.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Komposisi HFFC yang digunakan dalam formulasi dicampur dengan pewarna fluoresensi (Amaranth) dan menerima NFRCS (Ch dan Cp), seperti yang disebutkan sebelumnya.Potongan tipis NFRK dipotong dari sampel yang diperoleh, diletakkan pada slide kaca, dan ditutup dengan kaca penutup. Amati slide yang telah disiapkan di bawah mikroskop fluoresensi menggunakan filter hijau (310-380 nm). Gambar diambil pada perbesaran 4x untuk memahami hubungan Ct dan pengendapan polimer berlebih dalam jaringan Ct.
Topografi permukaan NFRCS Ch dan Cp ditentukan menggunakan mikroskop gaya atom (AFM) dengan kantilever TESP ultra-tajam dalam mode penyadapan: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Kekasaran permukaan ditentukan dengan root mean square (RMS) menggunakan perangkat lunak (Scanning Probe Image Processor). Berbagai lokasi NFRCS ditampilkan pada gambar 3D untuk memeriksa keseragaman permukaan. Simpangan baku skor untuk area tertentu didefinisikan sebagai kekasaran permukaan. Persamaan RMS digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan NFRCS31.
Studi berbasis FESEM dilakukan dengan menggunakan FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, untuk memahami morfologi permukaan Ch NFRCS dan Cp NFRCS, yang menunjukkan BCT yang lebih baik daripada Cm NFRCS. Studi FESEM dilakukan menurut metode yang dijelaskan oleh Zhao et al. 32 dengan sedikit modifikasi. NFRCS 20 hingga 30 mg Ch NFRCS dan Cp NFRCS dicampur terlebih dahulu dengan 20 µl natrium sitrat 3,8% yang dicampur terlebih dahulu dengan darah tikus. 20 μl CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan ke sampel yang diolah dengan darah untuk memulai koagulasi dan sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Selain itu, eritrosit berlebih dihilangkan dari permukaan NFRCS dengan membilasnya dengan garam.
Sampel-sampel berikutnya diperlakukan dengan 0,1% glutaraldehida dan kemudian dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 37°C untuk menghilangkan kelembapan. Sampel-sampel yang dikeringkan dilapisi dan dianalisis 32 . Gambar-gambar lain yang diperoleh selama analisis adalah pembentukan gumpalan pada permukaan serat kapas individual, pengendapan polimer antara Ct, morfologi eritrosit (bentuk), integritas gumpalan, dan morfologi eritrosit dengan adanya NFRCS. Area NFRCS yang tidak diobati dan area NFRCS yang diobati Ch dan Cp yang diinkubasi dengan darah dipindai untuk ion-ion unsur (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, seng, tembaga, dan selenium) 33 . Bandingkan persentase ion unsur antara sampel yang diobati dan tidak diobati untuk memahami akumulasi ion unsur selama pembentukan gumpalan dan homogenitas gumpalan.
Ketebalan lapisan permukaan Cp HFFC pada permukaan Ct ditentukan menggunakan FESEM. Potongan melintang Cp NFRCS dipotong dari rangka dan dilapisi sputter. Sampel lapisan sputter yang dihasilkan diamati dengan FESEM dan ketebalan lapisan permukaan diukur 34 , 35 , 36 .
Mikro-CT sinar-X memberikan pencitraan non-destruktif 3D beresolusi tinggi dan memungkinkan Anda mempelajari susunan struktural internal NFRK. Mikro-CT menggunakan berkas sinar-X yang melewati sampel untuk merekam koefisien atenuasi linier lokal sinar-X dalam sampel, yang membantu memperoleh informasi morfologi. Lokasi internal Ct dalam Cp NFRCS dan Cp NFRCS yang diobati dengan darah diperiksa dengan mikro-CT untuk memahami efisiensi penyerapan dan pembekuan darah dengan adanya NFRCS37,38,39. Struktur 3D sampel Cp NFRCS yang diobati dengan darah dan yang tidak diobati direkonstruksi menggunakan mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Jerman). Menggunakan perangkat lunak VG STUDIO-MAX versi 2.2, beberapa gambar sinar-X diambil dari sudut yang berbeda (idealnya cakupan 360°) untuk mengembangkan gambar 3D untuk NFRCS. Data proyeksi yang dikumpulkan direkonstruksi menjadi gambar volumetrik 3D menggunakan perangkat lunak 3D ScanIP Academic sederhana yang sesuai.
Selain itu, untuk memahami distribusi bekuan, 20 µl darah sitrat yang telah dicampur sebelumnya dan 20 µl CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan ke NFRCS untuk memulai pembekuan darah. Sampel yang telah disiapkan dibiarkan mengeras. Permukaan NFRK diperlakukan dengan 0,5% glutaraldehida dan dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 30–40°C selama 30 menit. Bekuan darah yang terbentuk pada NFRCS dipindai, direkonstruksi, dan gambar 3D bekuan darah divisualisasikan.
Uji antibakteri dilakukan pada Cp NFRCS (terbaik dibandingkan dengan Ch NFRCS) menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi. Aktivitas antibakteri Cp NFRCS dan Cp HFFC ditentukan menggunakan tiga mikroorganisme uji yang berbeda [S.aureus (bakteri gram positif), E.coli (bakteri gram negatif) dan Candida putih (C.albicans)] yang tumbuh pada agar dalam cawan Petri dalam inkubator. Inokulasikan secara seragam 50 ml suspensi kultur bakteri yang diencerkan pada konsentrasi 105-106 CFU ml-1 ke dalam media agar. Tuang media ke dalam cawan Petri dan biarkan memadat. Sumur dibuat pada permukaan pelat agar untuk diisi dengan HFFC (3 sumur untuk HFFC dan 1 untuk kontrol negatif). Tambahkan 200 µl HFFC ke 3 sumur dan 200 µl pH 7,4 PBS ke sumur ke-4. Di sisi lain cawan petri, letakkan cakram NFRCS Cp 12 mm pada agar yang telah dipadatkan dan basahi dengan PBS (pH 7,4). Tablet siprofloksasin, ampisilin, dan flukonazol dianggap sebagai standar referensi untuk Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Candida albicans. Ukur zona penghambatan secara manual dan ambil gambar digital dari zona penghambatan tersebut.
Setelah mendapat persetujuan etika institusional, penelitian ini dilakukan di Kasturba Medical College of Education and Research di Manipal, Karnataka, di India selatan. Protokol percobaan TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etik Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Subjek direkrut dari donor darah sukarela (berusia 18 hingga 55 tahun) dari bank darah rumah sakit. Selain itu, formulir persetujuan yang diinformasikan diperoleh dari para sukarelawan untuk pengambilan sampel darah. TEG asli (N-TEG) ​​digunakan untuk mempelajari efek formulasi Cp HFFC pada darah utuh yang telah dicampur dengan natrium sitrat. N-TEG dikenal luas karena perannya dalam resusitasi point-of-care, yang menimbulkan masalah bagi dokter karena potensi keterlambatan hasil yang signifikan secara klinis (tes koagulasi rutin). Analisis N-TEG dilakukan dengan menggunakan darah utuh. Persetujuan yang diinformasikan dan riwayat medis terperinci diperoleh dari semua peserta. Studi ini tidak menyertakan peserta dengan komplikasi hemostatik atau trombotik seperti kehamilan/pascapersalinan atau penyakit hati. Subjek yang mengonsumsi obat yang memengaruhi kaskade koagulasi juga dikecualikan dari penelitian. Tes laboratorium dasar (hemoglobin, waktu protrombin, tromboplastin teraktivasi, dan jumlah trombosit) dilakukan pada semua peserta sesuai dengan prosedur standar. N-TEG menentukan viskoelastisitas bekuan darah, struktur bekuan awal, interaksi partikel, penguatan bekuan, dan lisis bekuan. Analisis N-TEG memberikan data grafis dan numerik tentang efek kolektif beberapa elemen seluler dan plasma. Analisis N-TEG dilakukan pada dua volume Cp HFFC yang berbeda (10 µl dan 50 µl). Hasilnya, 1 ml darah lengkap dengan asam sitrat ditambahkan ke 10 μl Cp HFFC. Tambahkan 1 ml (Cp HFFC + darah sitrat), 340 µl darah campuran ke dalam cawan TEG berisi 20 µl 0,2 M CaCl2. Selanjutnya, cawan TEG dimasukkan ke dalam TEG® 5000, US untuk mengukur R, K, sudut alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% sampel darah dengan adanya Cp HFFC41.
Protokol studi in vivo ditinjau dan disetujui oleh Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan rekomendasi dari Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Semua studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) dilakukan pada tikus Wistar betina (berat 200 hingga 250 g). Semua hewan diaklimatisasi pada suhu 24-26°C, hewan memiliki akses bebas ke makanan standar dan air sepuasnya. Semua hewan dibagi secara acak ke dalam kelompok yang berbeda, setiap kelompok terdiri dari tiga hewan. Semua studi dilakukan sesuai dengan Studi Hewan: Laporan Eksperimen In Vivo 43 . Sebelum penelitian, hewan dibius dengan pemberian campuran ketamin 20-50 mg (per 1 kg berat badan) dan xylazine 2-10 mg (per 1 kg berat badan) secara intraperitoneal (ip). Setelah penelitian, volume perdarahan dihitung dengan mengevaluasi selisih antara berat awal dan akhir sampel, nilai rata-rata yang diperoleh dari ketiga pengujian diambil sebagai volume perdarahan sampel.
Model amputasi ekor tikus diterapkan untuk memahami potensi NFRCS dalam memodulasi perdarahan akibat trauma, pertempuran, atau kecelakaan lalu lintas (model cedera). Potong 50% ekor dengan pisau bedah dan letakkan di udara selama 15 detik untuk memastikan perdarahan normal. Selain itu, sampel uji diletakkan pada ekor tikus dengan memberikan tekanan (Ct, Cs, Ch NFRCS, dan Cp NFRCS). Perdarahan dan PCT dilaporkan untuk spesimen uji (n = 3)17,45.
Efektivitas pengendalian tekanan NFRCS dalam pertempuran diteliti pada model arteri femoralis superfisial. Arteri femoralis diekspos, ditusuk dengan trokar 24G, dan berdarah dalam waktu 15 detik. Setelah perdarahan yang tidak terkendali diamati, spesimen uji ditempatkan di lokasi tusukan dengan tekanan yang diberikan. Segera setelah penerapan sampel uji, waktu pembekuan dicatat dan efisiensi hemostatik diamati selama 5 menit berikutnya. Prosedur yang sama diulang dengan Cs dan Ct46.
Dowling et al. 47 mengusulkan model cedera hati untuk menilai potensi hemostatik bahan hemostatik dalam konteks perdarahan intraoperatif. BCT direkam untuk sampel Ct (kontrol negatif), kerangka Cs (kontrol positif), sampel Ch NFRCS, dan sampel Cp NFRCS. Vena cava suprahepatik tikus diekspos dengan melakukan laparotomi median. Setelah itu, bagian distal lobus kiri dipotong dengan gunting. Buat sayatan di hati dengan pisau bedah dan biarkan berdarah selama beberapa detik. Sampel uji Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang ditimbang secara akurat ditempatkan pada permukaan yang rusak tanpa tekanan positif dan BCT direkam. Kelompok kontrol (Ct) kemudian menerapkan tekanan diikuti oleh Cs 30 s47 tanpa merusak cedera.
Pengujian penyembuhan luka in vivo dilakukan dengan menggunakan model luka eksisi untuk mengevaluasi sifat penyembuhan luka dari NFRCS berbasis polimer yang dikembangkan. Model luka eksisi dipilih dan dilakukan sesuai dengan metode yang dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi19,32,48. Semua hewan dibius seperti yang dijelaskan sebelumnya. Gunakan tusuk biopsi (12 mm) untuk membuat sayatan melingkar dalam pada kulit punggung. Lokasi luka yang telah disiapkan dibalut dengan Cs (kontrol positif), Ct (mengetahui bahwa bantalan kapas mengganggu penyembuhan), Ch NFRCS dan Cp NFRCS (kelompok eksperimen) dan kontrol negatif tanpa perawatan apa pun. Pada setiap hari penelitian, luas luka diukur pada semua tikus. Gunakan kamera digital untuk mengambil gambar area luka dan kenakan balutan baru. Persentase penutupan luka diukur dengan rumus berikut:
Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik dieksisi ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson. Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik dieksisi ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson.Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi dan diperiksa dengan pewarnaan hematoxylin-eosin dan Masson's trichrome.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Tikus dalam kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi untuk pewarnaan hematoxylin-eosin dan pewarnaan trikrom Masson berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian.Prosedur pewarnaan yang diterapkan dilakukan menurut metode yang dijelaskan sebelumnya49,50. Singkatnya, setelah fiksasi dalam formalin 10%, sampel didehidrasi menggunakan serangkaian alkohol bergradasi. Gunakan mikrotom untuk memperoleh irisan tipis (ketebalan 5 µm) dari jaringan yang dieksisi. Irisan tipis serial dari kontrol dan Cp NFRCS diperlakukan dengan hematoksilin dan eosin untuk mempelajari perubahan histopatologis. Pewarnaan trikrom Masson digunakan untuk mendeteksi pembentukan fibril kolagen. Hasil yang diperoleh dipelajari secara membabi buta oleh ahli patologi.
Stabilitas sampel Cp NFRCS dipelajari pada suhu ruangan (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) selama 12 bulan51. Cp NFRCS (perubahan warna permukaan dan pertumbuhan mikroba) diperiksa secara visual dan diuji untuk ketahanan terhadap lipatan dan BCT sesuai dengan metode yang diuraikan di atas pada bagian Bahan dan Metode.
Skalabilitas dan reproduktifitas Cp NFRCS diperiksa dengan menyiapkan Cp NFRCS berukuran 15×15 cm2. Selain itu, 30 mg sampel (n = 5) diambil dari berbagai fraksi Cp NFRCS dan BCT dari sampel yang diteliti dievaluasi seperti yang dijelaskan sebelumnya di bagian Metode.
Kami telah berupaya mengembangkan berbagai bentuk dan struktur menggunakan komposisi Cp NFRCS untuk berbagai aplikasi biomedis. Bentuk atau konfigurasi tersebut meliputi usapan berbentuk kerucut untuk mimisan, prosedur perawatan gigi, dan usapan berbentuk silinder untuk pendarahan vagina.
Semua kumpulan data dinyatakan sebagai rata-rata ± simpangan baku dan dianalisis dengan ANOVA menggunakan Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, AS) diikuti oleh uji perbandingan berganda Bonferroni (*p<0,05).
Semua prosedur yang dilakukan dalam penelitian pada manusia sesuai dengan standar Institut dan Dewan Riset Nasional, serta Deklarasi Helsinki 1964 dan amandemen selanjutnya, atau standar etika serupa. Semua partisipan diberi tahu tentang fitur penelitian dan sifatnya yang sukarela. Data partisipan tetap rahasia setelah dikumpulkan. Protokol eksperimen TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etik Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Relawan menandatangani persetujuan untuk mengumpulkan sampel darah.
Semua prosedur yang dilakukan dalam penelitian hewan dilakukan sesuai dengan Fakultas Kedokteran Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua percobaan hewan yang dirancang dilakukan sesuai dengan pedoman dari Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Semua penulis mengikuti pedoman ARRIVE.
Spektrum FTIR semua NFRCS dianalisis dan dibandingkan dengan spektrum kitosan yang ditunjukkan pada Gambar 2A. Puncak spektrum karakteristik kitosan (terekam) pada 3437 cm-1 (peregangan OH dan NH, tumpang tindih), 2945 dan 2897 cm-1 (peregangan CH), 1660 cm-1 (regangan NH2), 1589 cm-1 (tekuk N–H), 1157 cm-1 (jembatan peregangan O-), 1067 cm-1 (peregangan C–O, hidroksil sekunder), 993 cm-1 (peregangan CO, Bo-OH) 52,53,54. Tabel tambahan S1 menunjukkan nilai spektrum serapan FTIR NFRCS untuk kitosan (reporter), kitosan murni, Cm, Ch, dan Cp. Spektrum FTIR dari semua NFRCS (Cm, Ch, dan Cp) menunjukkan pita serapan karakteristik yang sama seperti kitosan murni tanpa perubahan signifikan (Gbr. 2A). Hasil FTIR mengonfirmasi tidak adanya interaksi kimia atau fisika antara polimer yang digunakan untuk mengembangkan NFRCS, yang menunjukkan bahwa polimer yang digunakan bersifat inert.
Karakterisasi in vitro dari Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs. (A) menggambarkan spektrum FTIR gabungan dari komposisi kitosan dan Cm NFRCS, Ch NFRCS dan Cp NFRCS di bawah kompresi. (B) a) Laju penyerapan darah utuh dari NFRCS Cm, Ch, Cp, dan Cg (n = 3); Sampel Ct menunjukkan BAR yang lebih tinggi karena kapas penyeka memiliki efisiensi penyerapan yang lebih tinggi; b) Darah setelah penyerapan darah Ilustrasi sampel yang diserap. Representasi grafis dari BCT sampel uji C (Cp NFRCS memiliki BCT terbaik (15 d, n = 3)). Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai mean ± SD, dan batang kesalahan menunjukkan SD, ***p < 0,0001. Data dalam C, D, E, dan G ditunjukkan sebagai mean ± SD, dan batang kesalahan menunjukkan SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют отклонение, ***p <0,0001. Data dalam C, D, E, dan G disajikan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan batang kesalahan mewakili deviasi standar, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表 SD,***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表 SD,***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Data dalam C, D, E, dan G ditampilkan sebagai rata-rata ± deviasi standar, batang kesalahan menunjukkan deviasi standar, ***p<0,0001.