Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Perdarahan yang tidak terkontrol merupakan salah satu penyebab utama kematian. Mencapai hemostasis yang cepat memastikan kelangsungan hidup korban sebagai pertolongan pertama selama pertempuran, kecelakaan lalu lintas, dan operasi pengurangan kematian. Perancah komposit bertulang serat nanopori (NFRCS) yang berasal dari komposisi pembentuk film hemostatik sederhana (HFFC) sebagai fase kontinu dapat memicu dan meningkatkan hemostasis. Pengembangan NFRCS didasarkan pada desain sayap capung. Struktur sayap capung terdiri dari sayap melintang dan memanjang, dan membran sayap terhubung satu sama lain untuk menjaga integritas mikrostruktur. HFFC melapisi permukaan serat secara seragam dengan film setebal nanometer dan menghubungkan ketebalan kapas (Ct) yang terdistribusi secara acak (fase terdispersi) untuk membentuk struktur nanopori. Kombinasi fase kontinu dan terdispersi mengurangi biaya produk hingga sepuluh kali lipat dibandingkan dengan produk yang tersedia secara komersial. NFRCS yang dimodifikasi (tampon atau gelang tangan) dapat digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis. Studi in vivo menyimpulkan bahwa Cp NFRCS yang dikembangkan memicu dan meningkatkan proses koagulasi di lokasi aplikasi. NFRCS dapat memodulasi lingkungan mikro dan bertindak pada tingkat seluler karena struktur nanoporinya, sehingga menghasilkan penyembuhan luka yang lebih baik pada model luka eksisi.
Perdarahan yang tidak terkontrol selama pertempuran, intraoperatif, dan situasi darurat dapat menimbulkan ancaman serius bagi nyawa korban luka¹. Kondisi ini selanjutnya menyebabkan peningkatan resistensi vaskular perifer secara keseluruhan, yang mengarah pada syok hemoragik. Tindakan yang tepat untuk mengendalikan perdarahan selama dan setelah operasi dianggap berpotensi mengancam jiwa²,³. Kerusakan pada pembuluh darah besar menyebabkan kehilangan darah yang masif, yang mengakibatkan angka kematian ≤ 50% dalam pertempuran dan 31% selama operasi¹. Kehilangan darah yang masif menyebabkan penurunan volume tubuh, yang mengurangi curah jantung. Peningkatan resistensi vaskular perifer total dan gangguan mikrosirkulasi yang progresif menyebabkan hipoksia pada organ penunjang kehidupan. Syok hemoragik dapat terjadi jika kondisi tersebut berlanjut tanpa intervensi yang efektif¹,⁴,⁵. Komplikasi lain termasuk perkembangan hipotermia dan asidosis metabolik, serta gangguan koagulasi yang menghambat proses koagulasi. Syok hemoragik berat dikaitkan dengan risiko kematian yang lebih tinggi⁶,⁷,⁸. Pada syok derajat III (progresif), transfusi darah sangat penting untuk kelangsungan hidup pasien selama morbiditas dan mortalitas intraoperatif dan pascaoperatif. Untuk mengatasi semua situasi yang mengancam jiwa tersebut, kami telah mengembangkan perancah komposit yang diperkuat serat nanopori (NFRCS) yang menggunakan konsentrasi polimer minimal (0,5%) dengan kombinasi polimer hemostatik yang larut dalam air.
Dengan penggunaan penguatan serat, produk yang hemat biaya dapat dikembangkan. Serat yang tersusun secara acak menyerupai struktur sayap capung, diimbangi oleh garis-garis horizontal dan vertikal pada sayap. Urat melintang dan memanjang pada sayap berhubungan dengan membran sayap (Gambar 1). NFRCS terdiri dari Ct yang diperkuat sebagai sistem perancah dengan kekuatan fisik dan mekanik yang lebih baik (Gambar 1). Karena keterjangkauan dan kemudahan pengerjaannya, ahli bedah lebih memilih menggunakan benang katun (Ct) selama operasi dan pembalutan. Oleh karena itu, dengan mempertimbangkan berbagai manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristalin (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Oleh karena itu, dengan mempertimbangkan berbagai manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristalin (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Tingkat pengembalian yang tinggi, karena tingkat > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk >90% selulosa kristalin (yang berperan dalam peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10.,Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk lebih dari 90% selulosa kristalin (membantu meningkatkan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai perancah untuk NFRCS9,10.Ct dilapisi secara superfisial (teramati pembentukan lapisan nano-tebal) dan dihubungkan dengan komposisi pembentuk lapisan hemostatik (HFFC). HFFC bertindak seperti matrigel, menyatukan Ct yang ditempatkan secara acak. Desain yang dikembangkan mentransmisikan tegangan dalam fase terdispersi (serat penguat). Sulit untuk mendapatkan struktur nanopori dengan kekuatan mekanik yang baik menggunakan konsentrasi polimer minimal. Selain itu, tidak mudah untuk menyesuaikan cetakan yang berbeda untuk aplikasi biomedis yang berbeda.
Gambar tersebut menunjukkan diagram desain NFRCS berdasarkan struktur sayap capung (A). Gambar ini menunjukkan analogi perbandingan struktur sayap capung (urat sayap yang saling berpotongan dan memanjang saling terhubung) dan fotomikrograf penampang melintang Cp NFRCS (B). Representasi skematis NFRCS.
NFRC dikembangkan menggunakan HFFC sebagai fase kontinu untuk mengatasi keterbatasan di atas. HFFC terdiri dari berbagai polimer hemostatik pembentuk film termasuk kitosan (sebagai polimer hemostatik utama) dengan metilselulosa (MC), hidroksipropil metilselulosa (HPMC 50 cp) dan polivinil alkohol (PVA) (125 kDa) sebagai polimer pendukung yang mendorong pembentukan trombus. Penambahan polivinilpirolidin K30 (PVP K30) meningkatkan kapasitas penyerapan kelembapan NFRC. Polietilen glikol 400 (PEG 400) ditambahkan untuk meningkatkan ikatan silang polimer dalam campuran polimer terikat. Tiga komposisi hemostatik HFFC yang berbeda (Cm HFFC, Ch HFFC dan Cp HFFC), yaitu kitosan dengan MC (Cm), kitosan dengan HPMC (Ch), dan kitosan dengan PVA (Cp), diaplikasikan pada Ct. Berbagai studi karakterisasi in vitro dan in vivo telah mengkonfirmasi aktivitas hemostatik dan penyembuhan luka dari NFRCS. Material komposit yang ditawarkan oleh NFRCS dapat digunakan untuk menyesuaikan berbagai bentuk perancah guna memenuhi kebutuhan spesifik.
Selain itu, NFRCS dapat dimodifikasi sebagai perban atau gulungan untuk menutupi seluruh area cedera pada ekstremitas bawah dan bagian tubuh lainnya. Khusus untuk cedera anggota tubuh akibat pertempuran, desain NFRCS yang dirancang dapat diubah menjadi setengah lengan atau seluruh kaki (Gambar Tambahan S11). NFRCS dapat dibuat menjadi gelang pergelangan tangan dengan lem jaringan, yang dapat digunakan untuk menghentikan pendarahan dari cedera pergelangan tangan yang parah akibat bunuh diri. Tujuan utama kami adalah mengembangkan NFRCS dengan polimer sesedikit mungkin yang dapat didistribusikan ke populasi besar (di bawah garis kemiskinan) dan dapat ditempatkan dalam kotak P3K. Sederhana, efisien, dan ekonomis dalam desainnya, NFRCS bermanfaat bagi masyarakat lokal dan dapat memiliki dampak global.
Kitosan (berat molekul 80 kDa) dan amaranth dibeli dari Merck, India. Hidroksipropil metilselulosa 50 Cp, polietilen glikol 400, dan metilselulosa dibeli dari Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polivinil alkohol (berat molekul 125 kDa) (87-90% terhidrolisis) dibeli dari National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidin K30 dibeli dari Molychem, Mumbai, kapas steril dibeli dari Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, dengan air Milli Q (sistem pemurnian air Direct-Q3, Merck, India) sebagai pembawa.
NFRCS dikembangkan menggunakan metode liofilisasi11,12. Semua komposisi HFFC (Tabel 1) disiapkan menggunakan pengaduk mekanik. Siapkan larutan kitosan 0,5% menggunakan asam asetat 1% dalam air dengan pengadukan terus menerus pada 800 rpm menggunakan pengaduk mekanik. Berat tepat polimer yang dimuat seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 ditambahkan ke larutan kitosan dan diaduk hingga diperoleh larutan polimer yang jernih. PVP K30 dan PEG 400 ditambahkan ke campuran yang dihasilkan dalam jumlah yang ditunjukkan pada Tabel 1, dan pengadukan dilanjutkan hingga diperoleh larutan polimer kental yang jernih. Larutan polimer yang dihasilkan disonikasi selama 60 menit untuk menghilangkan gelembung udara yang terperangkap dari campuran polimer. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan S1(b), Ct didistribusikan secara merata di setiap sumur pelat 6 sumur (cetakan) yang dilengkapi dengan 5 ml HFFC.
Pelat enam sumur disonikasi selama 60 menit untuk mencapai pembasahan dan distribusi HFFC yang seragam dalam jaringan Ct. Kemudian bekukan pelat enam sumur pada suhu -20°C selama 8-12 jam. Pelat beku dikeringkan beku selama 48 jam untuk mendapatkan berbagai formulasi NFRCS. Prosedur yang sama digunakan untuk menghasilkan berbagai bentuk dan struktur, seperti tampon atau tampon silindris, atau bentuk lain untuk berbagai aplikasi.
Kitosan (80 kDa) (3%) yang ditimbang secara akurat dilarutkan dalam asam asetat 1% menggunakan pengaduk magnetik. Ke dalam larutan kitosan yang dihasilkan ditambahkan PEG 400 1% dan diaduk selama 30 menit. Tuangkan larutan yang dihasilkan ke dalam wadah persegi atau persegi panjang dan bekukan pada suhu -80°C selama 12 jam. Sampel beku dikeringkan beku selama 48 jam untuk mendapatkan Cs13 berpori.
NFRCS yang dikembangkan kemudian diuji menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Jepang) untuk memastikan kompatibilitas kimia kitosan dengan polimer lain14,15. Spektrum FTIR (lebar rentang spektral dari 400 hingga 4000 cm-1) dari semua sampel yang diuji diperoleh dengan melakukan 32 pemindaian.
Tingkat penyerapan darah (BAR) untuk semua formulasi dievaluasi menggunakan metode yang dijelaskan oleh Chen dkk. 16 dengan sedikit modifikasi. NFRK yang dikembangkan dari semua komposisi dikeringkan dalam oven vakum pada suhu 105°C semalaman untuk menghilangkan sisa pelarut. 30 mg NFRCS (berat sampel awal – W0) dan 30 mg Ct (kontrol positif) ditempatkan dalam wadah terpisah yang berisi premix natrium sitrat 3,8%. Pada interval waktu yang telah ditentukan, yaitu 5, 10, 20, 30, 40 dan 60 detik, NFRCS dikeluarkan dan permukaannya dibersihkan dari darah yang tidak terserap dengan menempatkan sampel pada Ct selama 30 detik. Berat akhir darah yang diserap oleh NFRCS 16 dianggap (W1) pada setiap titik waktu. Hitung persentase BAR menggunakan rumus berikut:
Waktu pembekuan darah (BCT) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Wang dkk. 17. Waktu yang dibutuhkan darah utuh (darah tikus yang dicampur dengan 3,8% natrium sitrat) untuk membeku dengan adanya NFRCS dihitung sebagai BCT dari sampel uji. Berbagai komponen NFRCS (30 mg) ditempatkan dalam vial berpenutup ulir 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C. Darah (0,5 ml) ditambahkan ke dalam vial dan 0,3 ml CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan untuk mengaktifkan koagulasi darah. Terakhir, balikkan vial setiap 15 detik (hingga 180°) sampai terbentuk gumpalan yang padat. BCT sampel diperkirakan berdasarkan jumlah pembalikan vial17,18. Berdasarkan BCT, dua komposisi optimal dari NFRCS Cm, Ch, dan Cp dipilih untuk studi karakterisasi lebih lanjut.
BCT dari komposisi Ch NFRCS dan Cp NFRCS ditentukan dengan menerapkan metode yang dijelaskan oleh Li et al. 19. Tempatkan 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs (kontrol positif) ke dalam cawan Petri terpisah (37 °C). Darah yang mengandung 3,8% natrium sitrat dicampur dengan 0,2 M CaCl2 dengan rasio volume 10:1 untuk memulai proses pembekuan darah. 20 µl campuran darah tikus 0,2 M CaCl2 diaplikasikan ke permukaan sampel dan ditempatkan dalam cawan Petri kosong. Kontrolnya adalah darah yang dituangkan ke dalam cawan Petri kosong tanpa Ct. Pada interval tetap 0, 3, dan 5 menit, hentikan pembekuan dengan menambahkan 10 ml air deionisasi (DI) ke dalam cawan yang berisi sampel tanpa mengganggu gumpalan. Eritrosit yang tidak menggumpal (eritrosit) mengalami hemolisis dengan adanya air deionisasi dan melepaskan hemoglobin. Hemoglobin pada berbagai titik waktu (HA(t)) diukur pada 540 nm (λmax hemoglobin) menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Absorpsi absolut hemoglobin (AH(0)) pada menit ke-0 dari 20 µl darah dalam 10 ml air deionisasi diambil sebagai standar referensi. Penyerapan hemoglobin relatif (RHA) dari darah yang menggumpal dihitung dari rasio HA(t)/HA(0) menggunakan sampel darah yang sama.
Dengan menggunakan alat analisis tekstur (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sifat perekat NFRK terhadap jaringan yang rusak ditentukan. Tekan cawan silinder berdasar terbuka ke bagian dalam kulit babi (tanpa lapisan lemak). Sampel (Ch NFRCS dan Cp NFRCS) diaplikasikan melalui kanula ke dalam cetakan silinder untuk menciptakan daya rekat pada kulit babi. Setelah inkubasi selama 3 menit pada suhu ruang (RT) (25°C), kekuatan perekat NFRCS dicatat pada laju konstan 0,5 mm/detik.
Fitur utama dari bahan perekat bedah adalah untuk meningkatkan pembekuan darah sekaligus mengurangi kehilangan darah. Koagulasi tanpa kehilangan darah pada NFRCS dievaluasi menggunakan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi 19. Buat tabung mikrosentrifuga (2 ml) (diameter dalam 10 mm) dengan lubang 8 × 5 mm2 di satu sisi tabung sentrifuga (mewakili luka terbuka). NFRCS digunakan untuk menutup lubang dan selotip digunakan untuk menutup tepi luar. Tambahkan 20 µl CaCl2 0,2 ​​M ke dalam tabung mikrosentrifuga yang berisi premix natrium sitrat 3,8%. Setelah 10 menit, tabung mikrosentrifuga dikeluarkan dari cawan dan peningkatan massa cawan ditentukan karena aliran darah keluar dari NFRK (n = 3). Kehilangan darah Ch NFRCS dan Cp NFRCS dibandingkan dengan Cs.
Integritas basah NFRCS ditentukan berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Mishra dan Chaudhary21 dengan sedikit modifikasi. Tempatkan NFRCS dalam labu Erlenmeyer 100 ml dengan 50 ml air dan putar selama 60 detik tanpa membentuk tutup. Inspeksi visual dan prioritas sampel untuk integritas fisik berdasarkan pengumpulan.
Kekuatan ikatan HFFC terhadap Ct dipelajari menggunakan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi. Integritas lapisan permukaan dinilai dengan memaparkan NFRK pada gelombang akustik (stimulus eksternal) dengan adanya air milliQ (Ct). NFRCS Ch dan Cp yang dikembangkan ditempatkan dalam gelas kimia berisi air dan disonikasi selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 30 menit, berturut-turut. Setelah pengeringan, perbedaan persentase antara berat awal dan akhir NFRCS digunakan untuk menghitung persentase kehilangan material (HFFC). BCT in vitro lebih lanjut mendukung kekuatan ikatan atau kehilangan material permukaan. Efisiensi pengikatan HFFC ke Ct memberikan koagulasi darah dan lapisan elastis pada permukaan Ct22.
Homogenitas NFRCS yang dikembangkan ditentukan oleh BCT sampel (30 mg) yang diambil dari lokasi umum NFRCS yang dipilih secara acak. Ikuti prosedur BCT yang telah disebutkan sebelumnya untuk menentukan kepatuhan NFRCS. Kedekatan antara kelima sampel memastikan cakupan permukaan yang seragam dan pengendapan HFFC pada jaring Ct.
Luas area kontak darah nominal (NBCA) ditentukan seperti yang dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. Darah digumpalkan dengan menjepit 20 µl darah di antara dua permukaan Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs. Setelah 1 jam, kedua bagian stent dipisahkan dan luas area gumpalan diukur secara manual. Nilai rata-rata dari tiga pengulangan dianggap sebagai NBCA NFRCS19.
Analisis Dynamic Vapor Sorption (DVS) digunakan untuk mengevaluasi efektivitas NFRCS dalam menyerap air dari lingkungan eksternal atau dari lokasi cedera yang bertanggung jawab untuk memulai koagulasi. DVS mengevaluasi atau mencatat penyerapan dan kehilangan uap dalam sampel secara gravimetri menggunakan timbangan ultra-sensitif dengan resolusi massa ±0,1 µg. Tekanan uap parsial (kelembaban relatif) dihasilkan oleh pengontrol aliran massa elektronik di sekitar sampel dengan mencampur gas pembawa jenuh dan kering. Sesuai dengan pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan kelembapan oleh sampel, sampel dikategorikan menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b − tidak higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23. Sesuai dengan pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan kelembapan oleh sampel, sampel dikategorikan menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b − tidak higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23.Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, tergantung pada persentase penyerapan kelembapan oleh sampel, sampel dibagi menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b – tidak higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15%).% умеренно гигроскопичен dan > 15% очень гигроскопичен)23. % higroskopis sedang dan > 15% sangat higroskopis)23.tingkat suku bunga 0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% B/b 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ,> 15 %非常吸湿）23。Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, sampel dibagi menjadi 4 kelas tergantung pada persentase kelembapan yang diserap oleh sampel (0-0,012% berat – tidak higroskopis, 0,2-2% berat sedikit higroskopis, 2-15% berat).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % higroskopis sedang, > 15% sangat higroskopis) 23.Efisiensi higroskopis NFCS X NFCS dan TsN NFCS ditentukan pada analyzer DVS TA TGA Q5000 SA. Selama proses ini, waktu pengoperasian, kelembaban relatif (RH), dan berat sampel secara real-time pada suhu 25°C24 diperoleh. Kadar air dihitung dengan analisis massa NFRCS yang akurat menggunakan persamaan berikut:
MC adalah kelembapan NFRCS. m1 – berat kering NSAID. m2 adalah massa NFRCS waktu nyata pada RH tertentu.
Luas permukaan total diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada suhu 25 °C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr). Layanan Pelanggan yang Dapat Dipakai untuk Mendapatkan Bantuan yang Dapat Diperoleh азотом после опорожнения образцов при 25 °С в waktu 10 jam (< 7 × 10–3 Торр). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan pada suhu 25°C selama 10 jam (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后,使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。dan 25°C Layanan Pelanggan yang Dapat Dipakai untuk Membantu Anda Mendapatkan Bantuan жидким азотом после опорожнения образцов в в suhu 10 derajat hingga 25°C (< 7 × 10-3 торр). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan selama 10 jam pada suhu 25°C (< 7 x 10-3 torr).Luas permukaan total, volume pori, dan ukuran pori NFRCS ditentukan dengan Quantachrome dari NOVA 1000e, Austria menggunakan perangkat lunak RS 232.
Siapkan 5% sel darah merah (saline sebagai pengencer) dari darah utuh. Kemudian pindahkan alikuot HFFC (0,25 ml) ke pelat 96 sumur dan massa 5% sel darah merah (0,1 ml). Inkubasi campuran pada suhu 37°C selama 40 menit. Campuran sel darah merah dan serum dianggap sebagai kontrol positif, dan campuran saline dan sel darah merah sebagai kontrol negatif. Hemaglutinasi ditentukan menurut skala Stajitzky. Skala yang diusulkan adalah sebagai berikut: + + + + agregat granular padat; + + + bantalan dasar halus dengan tepi melengkung; + + bantalan dasar halus dengan tepi robek; + cincin merah sempit di sekitar tepi bantalan halus; – (negatif) tombol merah diskrit 12 di tengah sumur bawah.
Kompatibilitas darah NFRCS dipelajari menurut metode Organisasi Internasional untuk Standardisasi (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Metode gravimetri yang dijelaskan oleh Singh dkk. Modifikasi kecil dilakukan untuk menilai pembentukan trombus dengan adanya atau di permukaan NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS diinkubasi dalam larutan garam fosfat (PBS) selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah 24 jam, PBS dihilangkan dan NFRCS diberi perlakuan dengan 2 ml darah yang mengandung 3,8% natrium sitrat. Di permukaan NFRCS, tambahkan 0,04 ml CaCl2 0,1 M ke sampel yang diinkubasi. Setelah 45 menit, 5 ml air suling ditambahkan untuk menghentikan koagulasi. Darah yang menggumpal di permukaan NFRK diberi perlakuan dengan larutan formaldehida 36-38%. Gumpalan yang difiksasi dengan formaldehida dikeringkan dan ditimbang. Persentase trombosis diperkirakan dengan menghitung berat gelas tanpa darah dan sampel (kontrol negatif) serta gelas dengan darah (kontrol positif).
Sebagai konfirmasi awal, sampel divisualisasikan di bawah mikroskop optik untuk memahami kemampuan lapisan permukaan HFFC, Ct yang saling terhubung, dan jaringan Ct dalam membentuk pori-pori. Sayatan tipis Ch dan Cp dari NFRCS dipotong dengan pisau bedah. Sayatan yang dihasilkan diletakkan pada kaca preparat, ditutup dengan kaca penutup, dan tepinya direkatkan dengan lem. Preparat yang telah disiapkan diamati di bawah mikroskop optik dan foto diambil pada perbesaran yang berbeda.
Deposisi polimer dalam jaringan Ct divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Rice et al.29. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disiapkan sesuai dengan metode yang telah disebutkan sebelumnya. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (amaranth), dan NFRCS (Ch & Cp) disiapkan sesuai dengan metode yang telah disebutkan sebelumnya.Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (amaranth) dan NFRCS (Ch dan Cp) diperoleh sesuai dengan metode yang telah disebutkan sebelumnya.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Komposisi HFFC yang digunakan dalam formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (Amaranth) dan menerima NFRCS (Ch dan Cp), seperti yang disebutkan sebelumnya.Sayatan tipis NFRK dipotong dari sampel yang diperoleh, diletakkan pada kaca preparat, dan ditutup dengan kaca penutup. Amati preparat yang telah disiapkan di bawah mikroskop fluoresensi menggunakan filter hijau (310-380 nm). Gambar diambil pada perbesaran 4x untuk memahami hubungan Ct dan pengendapan polimer berlebih dalam jaringan Ct.
Topografi permukaan NFRCS Ch dan Cp ditentukan menggunakan mikroskop gaya atom (AFM) dengan cantilever TESP ultra-tajam dalam mode tapping: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Kekasaran permukaan ditentukan dengan root mean square (RMS) menggunakan perangkat lunak (Scanning Probe Image Processor). Berbagai lokasi NFRCS dirender pada gambar 3D untuk memeriksa keseragaman permukaan. Deviasi standar dari skor untuk area tertentu didefinisikan sebagai kekasaran permukaan. Persamaan RMS digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan NFRCS31.
Studi berbasis FESEM dilakukan menggunakan FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, untuk memahami morfologi permukaan Ch NFRCS dan Cp NFRCS, yang menunjukkan BCT yang lebih baik daripada Cm NFRCS. Studi FESEM dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Zhao dkk. 32 dengan sedikit modifikasi. 20 hingga 30 mg Ch NFRCS dan Cp NFRCS dicampur terlebih dahulu dengan 20 µl natrium sitrat 3,8% yang dicampur dengan darah tikus. 20 μl CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan ke sampel yang telah diberi perlakuan darah untuk memulai koagulasi dan sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Selain itu, eritrosit berlebih dihilangkan dari permukaan NFRCS dengan membilas menggunakan larutan garam.
Sampel selanjutnya diolah dengan glutaraldehida 0,1% dan kemudian dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 37°C untuk menghilangkan kelembapan. Sampel yang telah dikeringkan dilapisi dan dianalisis 32. Gambar lain yang diperoleh selama analisis adalah pembentukan gumpalan pada permukaan serat kapas individual, pengendapan polimer antara Ct, morfologi eritrosit (bentuk), integritas gumpalan, dan morfologi eritrosit dengan adanya NFRCS. Area NFRCS yang tidak diolah dan area NFRCS yang diolah dengan Ch dan Cp yang diinkubasi dengan darah dipindai untuk ion unsur (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, seng, tembaga, dan selenium)33. Bandingkan persentase ion unsur antara sampel yang diolah dan tidak diolah untuk memahami akumulasi ion unsur selama pembentukan gumpalan dan homogenitas gumpalan.
Ketebalan lapisan permukaan Cp HFFC pada permukaan Ct ditentukan menggunakan FESEM. Penampang Cp NFRCS dipotong dari kerangka dan dilapisi dengan sputtering. Sampel lapisan sputtering yang dihasilkan diamati dengan FESEM dan ketebalan lapisan permukaan diukur 34, 35, 36.
Mikro-CT sinar-X memberikan pencitraan 3D non-destruktif beresolusi tinggi dan memungkinkan Anda untuk mempelajari susunan struktur internal NFRK. Mikro-CT menggunakan berkas sinar-X yang melewati sampel untuk merekam koefisien atenuasi linier lokal sinar-X dalam sampel, yang membantu memperoleh informasi morfologi. Lokasi internal Ct dalam Cp NFRCS dan Cp NFRCS yang diberi perlakuan darah diperiksa dengan mikro-CT untuk memahami efisiensi penyerapan dan pembekuan darah dengan adanya NFRCS37,38,39. Struktur 3D sampel Cp NFRCS yang diberi perlakuan darah dan yang tidak diberi perlakuan direkonstruksi menggunakan mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Jerman). Menggunakan perangkat lunak VG STUDIO-MAX versi 2.2, beberapa gambar sinar-X diambil dari sudut yang berbeda (idealnya cakupan 360°) untuk mengembangkan gambar 3D untuk NFRCS. Data proyeksi yang dikumpulkan direkonstruksi menjadi citra volumetrik 3D menggunakan perangkat lunak 3D ScanIP Academic yang sederhana.
Selain itu, untuk memahami distribusi gumpalan, 20 µl darah sitrat yang telah dicampur sebelumnya dan 20 µl CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan ke NFRCS untuk memulai pembekuan darah. Sampel yang telah disiapkan dibiarkan mengeras. Permukaan NFRK diberi perlakuan dengan glutaraldehida 0,5% dan dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 30–40°C selama 30 menit. Gumpalan darah yang terbentuk pada NFRCS dipindai, direkonstruksi, dan citra 3D gumpalan darah divisualisasikan.
Pengujian antibakteri dilakukan pada Cp NFRCS (paling baik dibandingkan dengan Ch NFRCS) menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi. Aktivitas antibakteri Cp NFRCS dan Cp HFFC ditentukan menggunakan tiga mikroorganisme uji yang berbeda [S.aureus (bakteri gram-positif), E.coli (bakteri gram-negatif) dan Candida putih (C.albicans)] yang tumbuh pada agar dalam cawan Petri di dalam inkubator. Inokulasikan secara merata 50 ml suspensi kultur bakteri yang diencerkan dengan konsentrasi 105-106 CFU ml-1 ke media agar. Tuangkan media ke dalam cawan Petri dan biarkan mengeras. Lubang dibuat di permukaan cawan agar untuk diisi dengan HFFC (3 lubang untuk HFFC dan 1 untuk kontrol negatif). Tambahkan 200 µl HFFC ke 3 lubang dan 200 µl PBS pH 7,4 ke lubang ke-4. Di sisi lain cawan petri, letakkan cakram Cp NFRCS 12 mm di atas agar yang telah mengeras dan basahi dengan PBS (pH 7,4). Tablet siprofloksasin, ampisilin, dan flukonazol dianggap sebagai standar referensi untuk Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Candida albicans. Ukur zona inhibisi secara manual dan ambil gambar digital zona inhibisi tersebut.
Setelah mendapat persetujuan etik institusional, penelitian ini dilakukan di Kasturba Medical College of Education and Research di Manipal, Karnataka, India selatan. Protokol eksperimen TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etik Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Subjek direkrut dari donor darah sukarelawan (berusia 18 hingga 55 tahun) dari bank darah rumah sakit. Selain itu, formulir persetujuan informed consent diperoleh dari para sukarelawan untuk pengambilan sampel darah. TEG asli (N-TEG) ​​digunakan untuk mempelajari efek formulasi Cp HFFC pada darah utuh yang telah dicampur dengan natrium sitrat. N-TEG secara luas dikenal karena perannya dalam resusitasi di tempat perawatan, yang menimbulkan masalah bagi dokter karena potensi penundaan hasil yang signifikan secara klinis (tes koagulasi rutin). Analisis N-TEG dilakukan menggunakan darah utuh. Persetujuan informed consent dan riwayat medis terperinci diperoleh dari semua peserta. Studi ini tidak menyertakan peserta dengan komplikasi hemostatik atau trombotik seperti kehamilan/pasca persalinan atau penyakit hati. Subjek yang mengonsumsi obat-obatan yang memengaruhi kaskade koagulasi juga dikeluarkan dari penelitian. Tes laboratorium dasar (hemoglobin, waktu protrombin, tromboplastin aktif, dan jumlah trombosit) dilakukan pada semua peserta sesuai dengan prosedur standar. N-TEG menentukan viskoelastisitas bekuan darah, struktur bekuan awal, interaksi partikel, penguatan bekuan, dan lisis bekuan. Analisis N-TEG memberikan data grafis dan numerik tentang efek kolektif dari beberapa elemen seluler dan plasma. Analisis N-TEG dilakukan pada dua volume Cp HFFC yang berbeda (10 µl dan 50 µl). Hasilnya, 1 ml darah utuh dengan asam sitrat ditambahkan ke 10 µl Cp HFFC. Tambahkan 1 ml (Cp HFFC + darah sitrat), 340 µl darah campuran ke dalam cawan TEG yang berisi 20 µl 0,2 M CaCl2. Setelah itu, cawan TEG dimasukkan ke dalam TEG® 5000, US untuk mengukur R, K, sudut alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% dari sampel darah dengan adanya Cp HFFC41.
Protokol studi in vivo ditinjau dan disetujui oleh Komite Etika Hewan Institusional (IAEC), Sekolah Kedokteran Kasturba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan rekomendasi Komite Pengendalian dan Pengawasan Eksperimen Hewan (CPCSEA). Semua studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) dilakukan pada tikus Wistar betina (berat 200 hingga 250 g). Semua hewan diaklimatisasi pada suhu 24-26°C, hewan-hewan tersebut memiliki akses bebas ke makanan standar dan air ad libitum. Semua hewan dibagi secara acak ke dalam kelompok yang berbeda, setiap kelompok terdiri dari tiga hewan. Semua studi dilakukan sesuai dengan Studi Hewan: Laporan Eksperimen In Vivo 43. Sebelum penelitian, hewan-hewan tersebut dibius dengan pemberian intraperitoneal (ip) campuran 20-50 mg ketamin (per 1 kg berat badan) dan 2-10 mg xilazin (per 1 kg berat badan). Setelah penelitian, volume perdarahan dihitung dengan mengevaluasi perbedaan antara berat awal dan berat akhir sampel, nilai rata-rata yang diperoleh dari tiga pengujian diambil sebagai volume perdarahan sampel.
Model amputasi ekor tikus diimplementasikan untuk memahami potensi NFRCS dalam memodulasi perdarahan pada trauma, pertempuran, atau kecelakaan lalu lintas (model cedera). Ekor dipotong 50% dengan pisau bedah dan diletakkan di udara selama 15 detik untuk memastikan perdarahan normal. Selain itu, sampel uji ditempatkan pada ekor tikus dengan memberikan tekanan (Ct, Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS). Perdarahan dan PCT dilaporkan untuk spesimen uji (n = 3)17,45.
Efektivitas kontrol tekanan NFRCS dalam pertempuran diselidiki pada model arteri femoralis superfisial. Arteri femoralis diekspos, ditusuk dengan trokar 24G, dan dibiarkan berdarah dalam waktu 15 detik. Setelah perdarahan tak terkontrol diamati, spesimen uji ditempatkan di lokasi tusukan dengan tekanan yang diberikan. Segera setelah pemberian sampel uji, waktu pembekuan dicatat dan efisiensi hemostatik diamati selama 5 menit berikutnya. Prosedur yang sama diulangi dengan Cs dan Ct46.
Dowling dkk. 47 mengusulkan model cedera hati untuk menilai potensi hemostatik bahan hemostatik dalam konteks perdarahan intraoperatif. BCT dicatat untuk sampel Ct (kontrol negatif), kerangka Cs (kontrol positif), sampel Ch NFRCS, dan sampel Cp NFRCS. Vena cava suprahepatik tikus diekspos dengan melakukan laparotomi median. Setelah itu, bagian distal lobus kiri dipotong dengan gunting. Buat sayatan di hati dengan pisau bedah dan biarkan berdarah selama beberapa detik. Sampel uji Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang ditimbang secara akurat ditempatkan pada permukaan yang rusak tanpa tekanan positif dan BCT dicatat. Kelompok kontrol (Ct) kemudian diberi tekanan diikuti oleh Cs 30 s47 tanpa merusak cedera.
Pengujian penyembuhan luka in vivo dilakukan menggunakan model luka eksisi untuk mengevaluasi sifat penyembuhan luka dari NFRCS berbasis polimer yang dikembangkan. Model luka eksisi dipilih dan dilakukan sesuai dengan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi19,32,48. Semua hewan dibius seperti yang dijelaskan sebelumnya. Gunakan alat biopsi (12 mm) untuk membuat sayatan melingkar yang dalam pada kulit punggung. Lokasi luka yang telah disiapkan dibalut dengan Cs (kontrol positif), Ct (dengan mempertimbangkan bahwa kapas mengganggu penyembuhan), Ch NFRCS dan Cp NFRCS (kelompok eksperimen) dan kontrol negatif tanpa perawatan apa pun. Pada setiap hari penelitian, luas luka diukur pada semua tikus. Gunakan kamera digital untuk mengambil gambar area luka dan pasang perban baru. Persentase penutupan luka diukur dengan rumus berikut:
Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus dari kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson. Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus dari kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan trikrom Masson.Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus dari kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi dan diperiksa dengan pewarnaan hematoksilin-eosin dan trikrom Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Tikus pada kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi untuk pewarnaan hematoksilin-eosin dan pewarnaan trikrom Masson berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian.Prosedur pewarnaan yang diterapkan dilakukan sesuai dengan metode yang telah dijelaskan sebelumnya49,50. Singkatnya, setelah fiksasi dalam formalin 10%, sampel didehidrasi menggunakan serangkaian alkohol bertingkat. Mikrotom digunakan untuk mendapatkan potongan tipis (ketebalan 5 µm) dari jaringan yang dieksisi. Potongan serial tipis dari kontrol dan Cp NFRCS diberi perlakuan dengan hematoksilin dan eosin untuk mempelajari perubahan histopatologis. Pewarnaan trikrom Masson digunakan untuk mendeteksi pembentukan fibril kolagen. Hasil yang diperoleh dipelajari secara buta oleh ahli patologi.
Stabilitas sampel Cp NFRCS dipelajari pada suhu ruang (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) selama 12 bulan51. Cp NFRCS (perubahan warna permukaan dan pertumbuhan mikroba) diperiksa secara visual dan diuji ketahanan aus lipatannya dan BCT sesuai dengan metode yang diuraikan di bagian Bahan dan Metode di atas.
Skalabilitas dan reproduktivitas Cp NFRCS diperiksa dengan menyiapkan Cp NFRCS berukuran 15×15 cm2. Selain itu, sampel 30 mg (n = 5) dieksisi dari berbagai fraksi Cp NFRCS dan BCT dari sampel yang diteliti dievaluasi seperti yang dijelaskan sebelumnya di bagian Metode.
Kami telah berupaya mengembangkan berbagai bentuk dan struktur menggunakan komposisi Cp NFRCS untuk berbagai aplikasi biomedis. Bentuk atau konfigurasi tersebut meliputi kapas berbentuk kerucut untuk mimisan, prosedur gigi, dan kapas berbentuk silinder untuk pendarahan vagina.
Semua kumpulan data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dan dianalisis dengan ANOVA menggunakan Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) diikuti oleh uji perbandingan berganda Bonferroni (*p<0,05).
Semua prosedur yang dilakukan dalam studi pada manusia sesuai dengan standar Institut dan Dewan Riset Nasional, serta Deklarasi Helsinki 1964 dan amandemen selanjutnya, atau standar etika serupa. Semua peserta diinformasikan tentang fitur studi dan sifat sukarelanya. Data peserta tetap dirahasiakan setelah dikumpulkan. Protokol eksperimen TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etika Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Para sukarelawan menandatangani informed consent untuk pengambilan sampel darah.
Semua prosedur yang dilakukan dalam penelitian hewan dilaksanakan sesuai dengan Fakultas Kedokteran Kastuba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Semua percobaan hewan yang dirancang dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Pengendalian dan Pengawasan Eksperimen Hewan (CPCSEA). Semua penulis mengikuti pedoman ARRIVE.
Spektrum FTIR dari semua NFRCS dianalisis dan dibandingkan dengan spektrum kitosan yang ditunjukkan pada Gambar 2A. Puncak spektral karakteristik kitosan (tercatat) pada 3437 cm-1 (regangan OH dan NH, tumpang tindih), 2945 dan 2897 cm-1 (regangan CH), 1660 cm-1 (regangan NH2), 1589 cm-1 (tekukan N–H), 1157 cm-1 (regangan jembatan O-), 1067 cm-1 (regangan C–O, hidroksil sekunder), 993 cm-1 (regangan CO, Bo-OH) 52,53,54. Tabel Tambahan S1 menunjukkan nilai spektrum serapan FTIR NFRCS untuk kitosan (reporter), kitosan murni, Cm, Ch, dan Cp. Spektrum FTIR dari semua NFRCS (Cm, Ch dan Cp) menunjukkan pita serapan karakteristik yang sama seperti kitosan murni tanpa perubahan signifikan (Gambar 2A). Hasil FTIR mengkonfirmasi tidak adanya interaksi kimia atau fisik antara polimer yang digunakan untuk mengembangkan NFRCS, menunjukkan bahwa polimer yang digunakan bersifat inert.
Karakterisasi in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs. (A) mewakili spektrum FTIR gabungan dari komposisi kitosan dan Cm NFRCS, Ch NFRCS dan Cp NFRCS di bawah kompresi. (B) a) Tingkat penyerapan darah utuh NFRCS Cm, Ch, Cp, dan Cg (n = 3); Sampel Ct menunjukkan BAR yang lebih tinggi karena kapas memiliki efisiensi penyerapan yang lebih tinggi; b) Ilustrasi sampel yang terserap setelah penyerapan darah. Representasi grafis BCT sampel uji C (Cp NFRCS memiliki BCT terbaik (15 s, n = 3)). Data pada C, D, E, dan G ditampilkan sebagai mean ± SD, dan error bar mewakili SD, ***p < 0,0001. Data pada C, D, E, dan G ditampilkan sebagai mean ± SD, dan error bar mewakili SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют отклонение, ***p <0,0001. Data pada C, D, E, dan G disajikan sebagai nilai rata-rata ± simpangan baku, dan garis kesalahan menunjukkan simpangan baku, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表 SD,***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表 SD,***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Data pada C, D, E, dan G ditampilkan sebagai nilai rata-rata ± simpangan baku, batang kesalahan menunjukkan simpangan baku, ***p<0,0001.