Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nekontrolirano krvarenje jedan je od vodećih uzroka smrti. Postizanje brze hemostaze osigurava preživljavanje subjekta kao prva pomoć tokom borbe, saobraćajnih nesreća i operacija smanjenja smrtnosti. Nanoporozni kompozitni skelet ojačan vlaknima (NFRCS) izveden iz jednostavnog hemostatičnog sastava koji formira film (HFFC) kao kontinuirane faze može pokrenuti i poboljšati hemostazu. Razvoj NFRCS-a zasniva se na dizajnu krila vilinog konjica. Struktura krila vilinog konjica sastoji se od poprečnih i uzdužnih krila, a membrane krila su međusobno povezane kako bi se održao integritet mikrostrukture. HFFC ravnomjerno prekriva površinu vlakana filmom nanometarske debljine i povezuje nasumično raspoređenu debljinu pamuka (Ct) (disperznu fazu) kako bi formirao nanoporoznu strukturu. Kombinacija kontinuirane i disperzirane faze smanjuje cijenu proizvoda deset puta u poređenju s komercijalno dostupnim proizvodima. Modificirani NFRCS (tamponi ili narukvice) mogu se koristiti u raznim biomedicinskim primjenama. Studije in vivo su zaključile da razvijeni Cp NFRCS pokreće i poboljšava proces koagulacije na mjestu primjene. NFRCS može modulirati mikrookruženje i djelovati na ćelijskom nivou zahvaljujući svojoj nanoporoznoj strukturi, što rezultira boljim zarastanjem rana u modelu ekscizijske rane.
Nekontrolirano krvarenje tokom borbe, intraoperativnih i hitnih situacija može predstavljati ozbiljnu prijetnju životu ranjenika1. Ova stanja dodatno dovode do ukupnog povećanja perifernog vaskularnog otpora, što dovodi do hemoragičnog šoka. Odgovarajuće mjere za kontrolu krvarenja tokom i nakon operacije smatraju se potencijalno opasnim po život2,3. Oštećenje velikih krvnih sudova dovodi do masovnog gubitka krvi, što rezultira stopom smrtnosti od ≤ 50% u borbi i 31% tokom operacije1. Masivni gubitak krvi dovodi do smanjenja tjelesnog volumena, što smanjuje srčani minutni volumen. Povećanje ukupnog perifernog vaskularnog otpora i progresivno oštećenje mikrocirkulacije dovode do hipoksije u organima koji održavaju život. Hemoragični šok se može javiti ako se stanje nastavi bez efikasne intervencije1,4,5. Druge komplikacije uključuju progresiju hipotermije i metaboličke acidoze, kao i poremećaj koagulacije koji ometa proces koagulacije. Teški hemoragični šok povezan je s većim rizikom od smrti6,7,8. Kod šoka III stepena (progresivnog), transfuzija krvi je neophodna za preživljavanje pacijenta tokom intraoperativnog i postoperativnog morbiditeta i mortaliteta. Kako bismo prevazišli sve gore navedene situacije opasne po život, razvili smo nanoporozni kompozitni skelet ojačan vlaknima (NFRCS) koji koristi minimalnu koncentraciju polimera (0,5%) koristeći kombinaciju hemostatskih polimera rastvorljivih u vodi.
Upotrebom vlakana za ojačanje mogu se razviti isplativi proizvodi. Nasumično raspoređena vlakna podsjećaju na strukturu krila vilinog konjica, uravnoteženu horizontalnim i vertikalnim prugama na krilima. Poprečne i uzdužne vene krila komuniciraju s membranom krila (Slika 1). NFRCS se sastoji od ojačanog Ct-a kao sistema skele s boljom fizičkom i mehaničkom čvrstoćom (Slika 1). Zbog pristupačnosti i izrade, hirurzi preferiraju korištenje pamučnih niti (Ct) tokom operacija i previjanja. Stoga, s obzirom na njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skeletni sistem NFRCS9,10. Stoga, s obzirom na njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skeletni sistem NFRCS9,10. Slijedom toga, uzimajući u obzir njegovu brojnu prednost, u tom broju > 90% kristalne celuloze (učestvuje u povećanju hemostatičke aktivnosti), Ct je koristio kvalitetnu skeletnu sistem NFRCS9,10. Stoga, s obzirom na njegove brojne prednosti, uključujući >90% kristalne celuloze (uključene u povećanu hemostatsku aktivnost), Ct je korišten kao skeletni sistem NFRCS-a9,10.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90% 的结晶纤维素 (有助于增强止血漴Ｚ止血漴)被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Stoga, s obzirom na njegove brojne prednosti, uključujući preko 90% kristalne celuloze (pomaže u poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao nosač za NFRCS9,10.Ct je površinski obložen (uočeno je formiranje nano-debelog filma) i međusobno povezan sa hemostatskim sastavom koji formira film (HFFC). HFFC djeluje poput matrigela, držeći nasumično postavljeni Ct zajedno. Razvijeni dizajn prenosi napon unutar dispergovane faze (armirajući vlakna). Teško je dobiti nanoporozne strukture s dobrom mehaničkom čvrstoćom korištenjem minimalnih koncentracija polimera. Osim toga, nije lako prilagoditi različite kalupe za različite biomedicinske primjene.
Slika prikazuje dijagram dizajna NFRCS-a zasnovanog na strukturi krila vilinog konjica (A). Ova slika prikazuje komparativnu analogiju strukture krila vilinog konjica (presjecajuće i uzdužne vene krila su međusobno povezane) i fotomikrografiju poprečnog presjeka Cp NFRCS-a (B). Shematski prikaz NFRCS-a.
NFRC-ovi su razvijeni korištenjem HFFC-a kao kontinuirane faze kako bi se riješila gore navedena ograničenja. HFFC se sastoji od različitih hemostatskih polimera koji formiraju film, uključujući hitosan (kao glavni hemostatski polimer) s metilcelulozom (MC), hidroksipropil metilcelulozom (HPMC 50 cp) i polivinil alkoholom (PVA) (125 kDa) kao potpornim polimerom koji potiče stvaranje tromba. Dodatak polivinilpirolidina K30 (PVP K30) poboljšao je kapacitet apsorpcije vlage NFRCS-a. Polietilen glikol 400 (PEG 400) dodan je kako bi se poboljšalo umrežavanje polimera u vezanim polimernim mješavinama. Tri različita hemostatska sastava HFFC-a (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), i to hitosan s MC (Cm), hitosan s HPMC (Ch) i hitosan s PVA (Cp), primijenjeni su na Ct. Različite in vitro i in vivo studije karakterizacije potvrdile su hemostatsku aktivnost i aktivnost zacjeljivanja rana NFRCS-a. Kompozitni materijali koje nudi NFRCS mogu se koristiti za prilagođavanje različitih oblika skela kako bi se zadovoljile specifične potrebe.
Osim toga, NFRCS se može modificirati kao zavoj ili rolna kako bi se pokrilo cijelo područje ozljede donjih ekstremiteta i drugih dijelova tijela. Posebno za borbene povrede udova, dizajnirani dizajn NFRCS-a može se promijeniti u narukvicu za pola ruke ili cijelu nogu (Dodatna slika S11). NFRCS se može napraviti u narukvicu s ljepilom za tkivo, koja se može koristiti za zaustavljanje krvarenja od teških suicidalnih povreda zgloba. Naš glavni cilj je razviti NFRCS sa što manje polimera koji se može isporučiti velikoj populaciji (ispod granice siromaštva) i koji se može staviti u komplet prve pomoći. Jednostavan, efikasan i ekonomičan u dizajnu, NFRCS koristi lokalnim zajednicama i može imati globalni utjecaj.
Hitosan (molekularne težine 80 kDa) i amarant su nabavljeni od Mercka, Indija. Hidroksipropil metilceluloza 50 Cp, polietilen glikol 400 i metilceluloza su nabavljeni od Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polivinil alkohol (molekularne težine 125 kDa) (87-90% hidroliziran) je nabavljen od National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidin K30 je nabavljen od Molychema, Mumbai, sterilni brisevi su nabavljeni od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s Milli Q vodom (Direct-Q3 sistem za pročišćavanje vode, Merck, Indija) kao nosačem.
NFRCS je razvijen korištenjem metode liofilizacije11,12. Svi sastavi HFFC-a (Tabela 1) pripremljeni su korištenjem mehaničke miješalice. Pripremite 0,5% rastvor hitosana koristeći 1% sirćetne kiseline u vodi kontinuiranim miješanjem pri 800 o/min na mehaničkoj miješalici. Tačna težina napunjenog polimera navedena u Tabeli 1 dodana je u rastvor hitosana i miješana dok se nije dobio bistri rastvor polimera. PVP K30 i PEG 400 dodani su u dobijenu smjesu u količinama navedenim u Tabeli 1, a miješanje je nastavljeno dok se nije dobio bistri viskozni rastvor polimera. Dobivena kupka rastvora polimera sonicirana je 60 minuta kako bi se uklonili zarobljeni mjehurići zraka iz smjese polimera. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici S1(b), Ct je ravnomjerno raspoređen u svakom bunaru ploče (kalupa) sa 6 bunara dopunjene sa 5 ml HFFC-a.
Ploča sa šest jažica je sonicirana 60 minuta kako bi se postiglo ravnomjerno vlaženje i distribucija HFFC-a u Ct mreži. Zatim je ploča sa šest jažica zamrznuta na -20°C tokom 8-12 sati. Zamrznute ploče su liofilizirane 48 sati kako bi se dobile različite formulacije NFRCS-a. Isti postupak se koristi za proizvodnju različitih oblika i struktura, kao što su tamponi ili cilindrični tamponi, ili bilo kojeg drugog oblika za različite primjene.
Precizno izvagani hitosan (80 kDa) (3%) se rastvara u 1% sirćetnoj kiselini pomoću magnetne miješalice. Dobijenom rastvoru hitosana dodat je 1% PEG 400 i miješano 30 minuta. Dobiveni rastvor se sipa u kvadratnu ili pravougaonu posudu i zamrzava na -80°C tokom 12 sati. Zamrznuti uzorci su liofilizirani 48 sati da bi se dobio porozni Cs13.
Razvijeni NFRCS je podvrgnut eksperimentima korištenjem Fourierove transformacijske infracrvene spektroskopije (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) kako bi se potvrdila hemijska kompatibilnost hitosana s drugim polimerima14,15. FTIR spektri (širina spektralnog raspona od 400 do 4000 cm-1) svih testiranih uzoraka dobijeni su izvođenjem 32 skeniranja.
Brzina apsorpcije krvi (BAR) za sve formulacije procijenjena je korištenjem metode koju su opisali Chen i saradnici 16, uz male izmjene. Razvijeni NFRK-ovi svih sastava sušeni su u vakuumskoj peći na 105°C preko noći kako bi se uklonio preostali rastvarač. 30 mg NFRCS (početna težina uzorka – W0) i 30 mg Ct (pozitivna kontrola) stavljeno je u odvojene posude koje sadrže premiks od 3,8% natrijum citrata. U unaprijed određenim vremenskim intervalima, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekundi, NFRCS su uklonjeni, a njihove površine očišćene od neapsorbirane krvi stavljanjem uzoraka na Ct tokom 30 sekundi. Konačna težina krvi apsorbirane pomoću NFRCS 16 uzeta je u obzir (W1) u svakoj vremenskoj tački. Izračunajte BAR procenat koristeći sljedeću formulu:
Vrijeme zgrušavanja krvi (BCT) određeno je prema izvještaju Wanga i suradnika 17. Vrijeme potrebno da se puna krv (krv pacova prethodno pomiješana s 3,8% natrijevog citrata) zgruša u prisustvu NFRCS-a izračunato je kao BCT testnog uzorka. Različite komponente NFRCS-a (30 mg) stavljene su u bočice od 10 ml s navojnim čepom i inkubirane na 37°C. Krv (0,5 ml) dodana je u bočicu i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 dodano je za aktiviranje zgrušavanja krvi. Na kraju, bočicu treba okretati svakih 15 sekundi (do 180°) dok se ne formira čvrsti ugrušak. BCT uzorka procjenjuje se brojem okretanja bočica 17,18. Na osnovu BCT-a, dva optimalna sastava iz NFRCS-a Cm, Ch i Cp odabrana su za daljnje studije karakterizacije.
BCT sastava Ch NFRCS i Cp NFRCS određen je primjenom metode koju su opisali Li i saradnici 19. Stavite 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (pozitivna kontrola) u odvojene Petrijeve zdjelice (37 °C). Krv koja sadrži 3,8% natrijum citrata pomiješana je sa 0,2 M CaCl2 u omjeru volumena 10:1 kako bi se započeo proces zgrušavanja krvi. 20 µl mješavine 0,2 M CaCl2 krvi pacova naneseno je na površinu uzorka i stavljeno u praznu Petrijevu zdjelicu. Kontrola je bila krv sipana u prazne Petrijeve zdjelice bez Ct. U fiksnim intervalima od 0, 3 i 5 minuta, zaustavite zgrušavanje dodavanjem 10 ml deionizirane (DI) vode u uzorak koji sadrži zdjelicu bez ometanja ugruška. Nekoagulirani eritrociti (eritrociti) podliježu hemolizi u prisustvu deionizirane vode i oslobađaju hemoglobin. Hemoglobin u različitim vremenskim tačkama (HA(t)) je mjeren na 540 nm (λmax hemoglobin) korištenjem UV-Vis spektrofotometra. Apsolutna apsorpcija hemoglobina (AH(0)) u 0 minuta od 20 µl krvi u 10 ml deionizirane vode uzeta je kao referentni standard. Relativna apsorpcija hemoglobina (RHA) koagulirane krvi izračunata je iz odnosa HA(t)/HA(0) korištenjem iste serije krvi.
Korištenjem analizatora teksture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SAD), određena su adhezivna svojstva NFRK-a na oštećeno tkivo. Pritisnite cilindričnu posudu s otvorenim dnom na unutrašnju stranu svinjske kože (bez sloja masti). Uzorci (Ch NFRCS i Cp NFRCS) naneseni su putem kanile u cilindrične kalupe kako bi se stvorilo prianjanje na kožu svinje. Nakon 3 minute inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) (25°C), jačina adhezije NFRCS-a zabilježena je konstantnom brzinom od 0,5 mm/sec.
Glavna karakteristika hirurških zaštitnog materijala je povećanje zgrušavanja krvi uz smanjenje gubitka krvi. Koagulacija bez gubitaka u NFRCS-u procijenjena je korištenjem prethodno objavljene metode s malim modifikacijama 19. Napravite mikrocentrifužnu epruvetu (2 ml) (unutrašnji promjer 10 mm) s otvorom 8 × 5 mm2 na jednoj strani centrifugalne epruvete (što predstavlja otvorenu ranu). NFRCS se koristi za zatvaranje otvora, a traka se koristi za zatvaranje vanjskih rubova. Dodajte 20 µl 0,2 M CaCl2 u mikrocentrifužnu epruvetu koja sadrži 3,8% premiks natrijum citrata. Nakon 10 minuta, mikrocentrifužne epruvete su uklonjene iz posuda i utvrđeno je povećanje mase posuda zbog odliva krvi iz NFRK (n = 3). Gubitak krvi Ch NFRCS i Cp NFRCS upoređeni su sa Cs.
Mokri integritet NFRCS-a određen je na osnovu metode koju su opisali Mishra i Chaudhary21, uz manje izmjene. Stavite NFRCS u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 ml sa 50 ml vode i miješajte 60 sekundi bez stvaranja vrha. Vizuelni pregled i određivanje prioriteta uzoraka za fizički integritet na osnovu sakupljanja.
Jačina vezivanja HFFC-a za Ct proučavana je korištenjem prethodno objavljenih metoda s manjim modifikacijama. Integritet površinskog premaza procijenjen je izlaganjem NFRK akustičnim valovima (vanjski stimulus) u prisustvu milliQ vode (Ct). Razvijeni NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS stavljeni su u čašu napunjenu vodom i sonicirani 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minuta, respektivno. Nakon sušenja, procentualna razlika između početne i konačne težine NFRCS-a korištena je za izračunavanje procentualnog gubitka materijala (HFFC). In vitro BCT je dodatno podržao jačinu vezivanja ili gubitak površinskih materijala. Efikasnost vezivanja HFFC-a za Ct omogućava koagulaciju krvi i elastični premaz na površini Ct22.
Homogenost razvijenog NFRCS-a određena je BCT-om uzoraka (30 mg) uzetih sa nasumično odabranih općih lokacija NFRCS-a. Slijedite prethodno spomenuti BCT postupak kako biste utvrdili usklađenost s NFRCS-om. Blizina svih pet uzoraka osigurava ujednačeno pokrivanje površine i taloženje HFFC-a u Ct mreži.
Nominalna površina kontakta s krvlju (NBCA) određena je kao što je prethodno objavljeno, uz neke izmjene. Krv se koagulira stezanjem 20 µl krvi između dvije površine Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. Nakon 1 sata, dva dijela stenta su razdvojena i ručno je izmjerena površina ugruška. Prosječna vrijednost od tri ponavljanja smatrana je NBCA NFRCS19.
Analiza dinamičke sorpcije pare (DVS) korištena je za procjenu učinkovitosti NFRCS-a u apsorpciji vode iz vanjske okoline ili s mjesta ozljede odgovornog za pokretanje koagulacije. DVS procjenjuje ili bilježi unos i gubitak pare u uzorku gravimetrijski koristeći ultra-osjetljivu vagu s rezolucijom mase od ±0,1 µg. Parcijalni tlak pare (relativna vlažnost) generira se elektroničkim regulatorom masenog protoka oko uzorka miješanjem zasićenih i suhih plinova nosača. Prema smjernicama Evropske farmakopeje, na osnovu procenta apsorpcije vlage od strane uzoraka, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012% w/w - nehigroskopni, 0,2–2% w/w blago higroskopni, 2–15% umjereno higroskopni i > 15% vrlo higroskopni)23. Prema smjernicama Evropske farmakopeje, na osnovu procenta apsorpcije vlage od strane uzoraka, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012% w/w - nehigroskopni, 0,2–2% w/w blago higroskopni, 2–15% umjereno higroskopni i > 15% vrlo higroskopni)23.U skladu s preporukama Evropske farmakopeje, ovisno o postotku apsorpcije vlage od strane uzoraka, uzorci su podijeljeni u 4 kategorije (0–0,012% w/w – nehigroskopni, 0,2–2% w/w slabo higroskopni, 2–petnaest %).% umjereno gigroskopski i > 15% vrlo gigroskopski)23. % umjereno higroskopnih i > 15% vrlo higroskopnih)23.根据欧洲药典指南, 根据样品吸收水分的百分比, 样品分为4 类（0-0,012% w/w非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 缻00. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 非常吸湿）U skladu s preporukama Evropske farmakopeje, uzorci su podijeljeni u 4 klase ovisno o postotku vlage koju uzorak apsorbira (0-0,012% težinski - nehigroskopni, 0,2-2% težinski slabo higroskopni, 2-15% težinski).% umjereno gigroskopski, > 15 % vrlo gigroskopski) 23. % umjereno higroskopno, > 15% vrlo higroskopno) 23.Higroskopska efikasnost NFCS X NFCS i TsN NFCS određena je na analizatoru DVS TA TGA Q5000 SA. Tokom ovog procesa, dobijeni su vrijeme rada, relativna vlažnost (RH) i težina uzorka u realnom vremenu na 25°C24. Sadržaj vlage izračunat je preciznom NFRCS analizom mase korištenjem sljedeće jednačine:
MC je vlažnost u NFRCS-u. m1 – suha težina NSAID-a. m2 je masa u NFRCS-u u stvarnom vremenu pri datoj relativnoj vlažnosti.
Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tokom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tokom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Opšta površina površ je ocijenjena uz pomoć eksperimenta na adsorbciji azota židkim azotom nakon oporavljanja obrazova pri 25 °S tokom 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci ispražnjeni na 25°C tokom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr).25°C 10 sati (< 7 × 10-3 Torr)temperatura 25°C Ukupna površina površno se procenjivala korišćenjem eksperimenata na adsorbciji azota židkim azotom posle oporavljanja obrazova u toku 10 časova pri 25°C (< 7 × 10-3 tora). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenata adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci pražnjeni 10 sati na 25°C (< 7 x 10-3 torr).Ukupna površina, volumen pora i veličina pora NFRCS-a određeni su pomoću Quantachrome-a proizvođača NOVA 1000e, Austrija, korištenjem RS 232 softvera.
Pripremite 5% eritrocita (fiziološki rastvor kao razrjeđivač) iz pune krvi. Zatim prebacite alikvot HFFC-a (0,25 ml) na ploču sa 96 jažica i 5% mase eritrocita (0,1 ml). Inkubirajte smjesu na 37°C tokom 40 minuta. Smjesa eritrocita i seruma smatrana je pozitivnom kontrolom, a smjesa fiziološkog rastvora i eritrocita negativnom kontrolom. Hemaglutinacija je određena prema Stajitzky skali. Predložene skale su sljedeće: + + + + gusti granularni agregati; + + + glatka donja jastučića sa zakrivljenim rubovima; + + glatka donja jastučića sa poderanim rubovima; + uski crveni prstenovi oko rubova glatkih jastučića; – (negativno) diskretno crveno dugme 12 u središtu donjeg jažica.
Hemokompatibilnost NFRCS-a proučavana je prema metodi Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Gravimetrijska metoda koju su opisali Singh i saradnici. Napravljene su manje modifikacije kako bi se procijenilo stvaranje tromba u prisustvu ili na površini NFRCS-a. 500 mg Cs, Ch NFRCS-a i Cp NFRCS-a inkubirano je u fosfatno puferiranom fiziološkom rastvoru (PBS) tokom 24 sata na 37°C. Nakon 24 sata, PBS je uklonjen, a NFRCS je tretiran sa 2 ml krvi koja sadrži 3,8% natrijum citrata. Na površinu NFRCS-a, inkubiranim uzorcima dodano je 0,04 ml 0,1 M CaCl2. Nakon 45 minuta, dodano je 5 ml destilovane vode kako bi se zaustavila koagulacija. Zgrušana krv na površini NFRK-a tretirana je 36-38% rastvorom formaldehida. Ugrušci fiksirani formaldehidom osušeni su i izvagani. Procenat tromboze procenjen je izračunavanjem težine čašice bez krvi i uzorka (negativna kontrola) i čašice sa krvlju (pozitivna kontrola).
Kao početna potvrda, uzorci su vizualizirani pod optičkim mikroskopom kako bi se razumjela sposobnost površinskog premaza HFFC-a, međusobno povezanog Ct i Ct mreže da formira pore. Tanki presjeci Ch i Cp iz NFRCS-a su obrezani skalpelom. Dobiveni presjek je postavljen na staklenu pločicu, prekriven pokrovnim staklom, a rubovi su fiksirani ljepilom. Pripremljeni preparati su pregledani pod optičkim mikroskopom i fotografije su snimljene pri različitim uvećanjima.
Taloženje polimera u Ct mrežama vizualizirano je korištenjem fluorescentne mikroskopije na osnovu metode koju su opisali Rice i saradnici29. Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch i Cp) su pripremljeni prema prethodno spomenutoj metodi. Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch i Cp) su pripremljeni prema prethodno spomenutoj metodi.Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch i Cp) dobiven je prema prethodno spomenutoj metodi.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料 (苋菜)）混合, 并按照前面提到的方Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料 (苋菜)）混合, 并按照前面提到的方Cp）.Sastav HFFC-a korišten u formulaciji pomiješan je s fluorescentnom bojom (Amaranth) i primljen je NFRCS (Ch i Cp), kao što je ranije spomenuto.Tanki rezovi NFRK-a su izrezani iz dobijenih uzoraka, postavljeni na staklene pločice i prekriveni pokrovnim pločicama. Pripremljene pločice su posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom koristeći zeleni filter (310-380 nm). Slike su snimljene pri uvećanju od 4x kako bi se razumjeli Ct odnosi i višak taloženja polimera u Ct mreži.
Površinska topografija NFRCS Ch i Cp određena je korištenjem mikroskopa atomskih sila (AFM) s ultra-oštrom TESP konzolom u modu tapkanja: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan. Hrapavost površine određena je pomoću srednjeg kvadratnog korijena (RMS) korištenjem softvera (Scanning Probe Image Processor). Različite lokacije NFRCS prikazane su na 3D slikama kako bi se provjerila ujednačenost površine. Standardna devijacija rezultata za dato područje definirana je kao hrapavost površine. RMS jednadžba korištena je za kvantificiranje hrapavosti površine NFRCS31.
Studije zasnovane na FESEM-u provedene su korištenjem FESEM-a, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, kako bi se razumjela površinska morfologija Ch NFRCS i Cp NFRCS, koji su pokazali bolji BCT od Cm NFRCS. FESEM studija je provedena prema metodi koju su opisali Zhao i sar.32 s manjim modifikacijama. NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS prethodno su pomiješani sa 20 µl 3,8% natrijum citrata prethodno pomiješanog s krvlju pacova. 20 μl 0,2 M CaCl2 dodano je u uzorke tretirane krvi kako bi se pokrenula koagulacija, a uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 10 minuta. Osim toga, višak eritrocita uklonjen je s površine NFRCS ispiranjem fiziološkom otopinom.
Naknadni uzorci su tretirani sa 0,1% glutaraldehida, a zatim sušeni u pećnici na vrući zrak na 37°C radi uklanjanja vlage. Osušeni uzorci su premazani i analizirani 32. Ostale slike dobijene tokom analize bile su formiranje ugruška na površini pojedinačnih pamučnih vlakana, taloženje polimera između Ct, morfologija (oblik) eritrocita, integritet ugruška i morfologija eritrocita u prisustvu NFRCS-a. Netretirana područja NFRCS-a i područja NFRCS-a tretirana Ch i Cp inkubirana s krvlju skenirana su na elementarne ione (natrij, kalij, dušik, kalcij, magnezij, cink, bakar i selen) 33. Uporedite procente elementarnih iona između tretiranih i netretiranih uzoraka kako biste razumjeli akumulaciju elementarnih iona tokom formiranja ugruška i homogenost ugruška.
Debljina površinskog premaza Cp HFFC na Ct površini određena je FESEM-om. Poprečni presjeci Cp NFRCS-a izrezani su iz okvira i naneseni naprašivanjem. Dobiveni uzorci naprašivanja promatrani su FESEM-om, a debljina površinskog premaza izmjerena je 34, 35, 36.
Rendgenski mikro-CT pruža 3D nedestruktivno snimanje visoke rezolucije i omogućava vam proučavanje unutrašnjeg strukturnog rasporeda NFRK. Mikro-CT koristi rendgenski snop koji prolazi kroz uzorak za snimanje lokalnog linearnog koeficijenta slabljenja rendgenskih zraka u uzorku, što pomaže u dobijanju morfoloških informacija. Unutrašnja lokacija Ct u Cp NFRCS i Cp NFRCS tretiranom krvlju ispitana je mikro-CT-om kako bi se razumjela efikasnost apsorpcije i zgrušavanje krvi u prisustvu NFRCS37,38,39. 3D strukture uzoraka Cp NFRCS tretiranih i netretiranih krvlju rekonstruisane su korištenjem mikro-CT-a (V|tome|x S240, Phoenix, Njemačka). Koristeći VG STUDIO-MAX softver verzije 2.2, snimljeno je nekoliko rendgenskih snimaka iz različitih uglova (idealno pokrivenost od 360°) kako bi se razvile 3D slike za NFRCS. Prikupljeni projekcijski podaci rekonstruisani su u 3D volumetrijske slike korištenjem odgovarajućeg jednostavnog 3D ScanIP Academic softvera.
Pored toga, kako bi se razumjela distribucija ugruška, u NFRCS je dodano 20 µl prethodno pomiješane citratne krvi i 20 µl 0,2 M CaCl2 kako bi se pokrenulo zgrušavanje krvi. Pripremljeni uzorci su ostavljeni da se stvrdnu. Površina NFRK je tretirana sa 0,5% glutaraldehida i sušena u pećnici na vrući zrak na 30–40°C tokom 30 minuta. Krvni ugrušak formiran na NFRCS je skeniran, rekonstruisan i vizualizirana je 3D slika krvnog ugruška.
Antibakterijski testovi su provedeni na Cp NFRCS (najbolje upoređen sa Ch NFRCS) korištenjem prethodno opisane metode s manjim modifikacijama. Antibakterijska aktivnost Cp NFRCS i Cp HFFC određena je korištenjem tri različita testna mikroorganizma [S. aureus (gram-pozitivne bakterije), E. coli (gram-negativne bakterije) i bijela Candida (C. albicans)] koji rastu na agaru u Petrijevim zdjelicama u inkubatoru. Ravnomjerno inokulirajte 50 ml razrijeđene suspenzije bakterijske kulture u koncentraciji od 105-106 CFU ml-1 na agarni medij. Sipajte medij u Petrijevu zdjelicu i ostavite da se stvrdne. Na površini agarne ploče napravljene su jažice za punjenje HFFC-om (3 jažice za HFFC i 1 za negativnu kontrolu). Dodajte 200 µl HFFC-a u 3 jažice i 200 µl PBS-a pH 7,4 u 4. jažicu. S druge strane petrijeve zdjelice, stavite 12 mm Cp NFRCS disk na očvrsli agar i navlažite PBS-om (pH 7,4). Tablete ciprofloksacina, ampicilina i flukonazola smatraju se referentnim standardima za Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Ručno izmjerite zonu inhibicije i napravite digitalnu sliku zone inhibicije.
Nakon etičkog odobrenja institucije, studija je provedena na Medicinskom fakultetu za obrazovanje i istraživanje Kasturba u Manipalu, Karnataka, u južnoj Indiji. Protokol eksperimenta in vitro TEG-a pregledan je i odobren od strane Institucionalnog etičkog odbora Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Ispitanici su regrutovani od dobrovoljnih davalaca krvi (u dobi od 18 do 55 godina) iz bolničke banke krvi. Pored toga, od volontera je dobijen obrazac informiranog pristanka za prikupljanje uzoraka krvi. Nativni TEG (N-TEG) ​​korišten je za proučavanje učinka formulacije Cp HFFC-a na punu krv prethodno pomiješanu s natrijum citratom. N-TEG je široko prepoznat po svojoj ulozi u reanimaciji na mjestu pružanja njege, što stvara probleme kliničarima zbog potencijala za klinički značajno kašnjenje rezultata (rutinski testovi koagulacije). N-TEG analiza je provedena korištenjem pune krvi. Informirani pristanak i detaljna medicinska anamneza dobijeni su od svih učesnika. Studija nije uključivala učesnike sa hemostatskim ili trombotičkim komplikacijama kao što su trudnoća/postporođajni period ili bolesti jetre. Ispitanici koji su uzimali lijekove koji utiču na kaskadu koagulacije takođe su isključeni iz studije. Osnovni laboratorijski testovi (hemoglobin, protrombinsko vrijeme, aktivirani tromboplastin i broj trombocita) su obavljeni na svim učesnicima prema standardnim procedurama. N-TEG određuje viskoelastičnost krvnog ugruška, početnu strukturu ugruška, interakciju čestica, jačanje ugruška i lizu ugruška. N-TEG analiza pruža grafičke i numeričke podatke o kolektivnim efektima nekoliko ćelijskih elemenata i plazme. N-TEG analiza je provedena na dva različita volumena Cp HFFC (10 µl i 50 µl). Kao rezultat toga, 1 ml pune krvi sa limunskom kiselinom je dodato u 10 μl Cp HFFC. Dodajte 1 ml (Cp HFFC + citratna krv), 340 µl miješane krvi u 20 µl 0,2 M CaCl2 koja sadrži TEG posudu. Nakon toga, TEG posude su stavljene u TEG® 5000, US kako bi se izmjerili R, K, alfa ugao, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% uzoraka krvi u prisustvu Cp HFFC41.
Protokol in vivo studije pregledao je i odobrio Institucionalni komitet za etiku životinja (IAEC), Medicinskog fakulteta Kasturba, Instituta za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Svi eksperimenti na životinjama provedeni su u skladu s preporukama Komiteta za kontrolu i nadzor eksperimenata na životinjama (CPCSEA). Sve in vivo NFRCS studije (2 × 2 cm2) provedene su na ženkama Wistar pacova (težine 200 do 250 g). Sve životinje su aklimatizirane na temperaturi od 24-26°C, životinje su imale slobodan pristup standardnoj hrani i vodi ad libitum. Sve životinje su nasumično podijeljene u različite grupe, a svaka grupa se sastojala od tri životinje. Sve studije su provedene u skladu sa Studije na životinjama: Izvještaj o in vivo eksperimentima 43. Prije studije, životinje su anestezirane intraperitonealnom (ip) primjenom mješavine od 20-50 mg ketamina (po 1 kg tjelesne težine) i 2-10 mg ksilazina (po 1 kg tjelesne težine). Nakon studije, volumen krvarenja je izračunat procjenom razlike između početne i konačne težine uzoraka, a prosječna vrijednost dobijena iz tri testa uzeta je kao volumen krvarenja uzorka.
Model amputacije repa pacova implementiran je kako bi se razumio potencijal NFRCS-a za modulaciju krvarenja kod traume, borbe ili saobraćajne nesreće (model povrede). Odrežite 50% repa skalpelom i stavite ga na zrak na 15 sekundi kako biste osigurali normalno krvarenje. Osim toga, testni uzorci su postavljeni na rep pacova primjenom pritiska (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS). Krvarenje i PCT su zabilježeni za testne uzorke (n = 3)17,45.
Učinkovitost kontrole pritiska NFRCS-a u borbi istražena je na modelu površinske femoralne arterije. Femoralna arterija je izložena, punktirana trokarom od 24G i iskrvarena u roku od 15 sekundi. Nakon što se uoči nekontrolirano krvarenje, testni uzorak se postavlja na mjesto uboda uz primjenu pritiska. Odmah nakon nanošenja testnog uzorka, zabilježeno je vrijeme zgrušavanja i hemostatska efikasnost je praćena tokom sljedećih 5 minuta. Isti postupak je ponovljen sa Cs i Ct46.
Dowling i saradnici47 predložili su model oštećenja jetre za procjenu hemostatskog potencijala hemostatskih materijala u kontekstu intraoperativnog krvarenja. BCT je zabilježen za Ct uzorke (negativna kontrola), Cs okvir (pozitivna kontrola), Ch NFRCS uzorke i Cp NFRCS uzorke. Suprahepatična šuplja vena pacova je eksponirana izvođenjem medijalne laparotomije. Nakon toga, distalni dio lijevog režnja je izrezan makazama. Napravite rez na jetri skalpelom i pustite da krvari nekoliko sekundi. Precizno izvagani Ch NFRCS i Cp NFRCS test uzorci su postavljeni na oštećenu površinu bez ikakvog pozitivnog pritiska i BCT je zabilježen. Kontrolna grupa (Ct) je zatim primijenila pritisak, a zatim Cs 30 s47 bez pucanja povrede.
In vivo testovi zarastanja rana provedeni su korištenjem modela ekscizijske rane kako bi se procijenila svojstva zarastanja rana razvijenih NFRCS-ova na bazi polimera. Modeli ekscizijskih rana odabrani su i izvedeni prema prethodno objavljenim metodama s manjim modifikacijama19,32,48. Sve životinje su anestezirane kako je prethodno opisano. Korištenjem biopsijskog bušilice (12 mm) napravljen je kružni duboki rez na koži leđa. Pripremljena mjesta rane prekrivena su sa Cs (pozitivna kontrola), Ct (prepoznajući da pamučni jastučići ometaju zarastanje), Ch NFRCS i Cp NFRCS (eksperimentalna grupa) i negativnom kontrolom bez ikakvog tretmana. Svakog dana studije, površina rane mjerena je kod svih pacova. Koristite digitalni fotoaparat da biste fotografirali područje rane i stavili novi zavoj. Procenat zatvaranja rane mjeren je sljedećom formulom:
Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana studije, koža pacova najbolje grupe je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna grupa) i proučavana bojenjem H&E i Massonovim trihromnim bojenjem. Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana studije, koža pacova najbolje grupe je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna grupa) i proučavana bojenjem H&E i Massonovim trihromnim bojenjem.Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana studije, koža pacova najbolje grupe ((Cp NFRCS) i kontrolne grupe) je izrezana i pregledana bojenjem hematoksilin-eozinom i Massonovim trihromom.根据研究第12天的伤口闭合百分比, 切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比, 切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组)Pacovi u najboljoj grupi ((Cp NFRCS) i kontrolnoj grupi) su ekscidirani radi bojenja hematoksilin-eozinom i Massonovog trihromnog bojenja na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana studije.Implementirani postupak bojenja proveden je prema prethodno opisanim metodama49,50. Ukratko, nakon fiksacije u 10% formalinu, uzorci su dehidrirani korištenjem serije graduiranih alkohola. Korištenjem mikrotoma dobiveni su tanki presjeci (debljine 5 µm) izrezanog tkiva. Tanki serijski presjeci kontrolnih i Cp NFRCS uzorka tretirani su hematoksilinom i eozinom radi proučavanja histopatoloških promjena. Massonova trihromna boja korištena je za detekciju stvaranja kolagenih fibrila. Dobijene rezultate su patolozi slijepo proučavali.
Stabilnost uzoraka Cp NFRCS proučavana je na sobnoj temperaturi (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) tokom 12 mjeseci51. Cp NFRCS (promjena boje površine i rast mikroba) vizualno je pregledan i testiran na otpornost na habanje u pregibima i BCT prema gore navedenim metodama opisanim u odjeljku Materijali i metode.
Skalabilnost i reproducibilnost Cp NFRCS ispitana je pripremom Cp NFRCS veličine 15×15 cm2. Pored toga, uzorci od 30 mg (n = 5) su izrezani iz različitih frakcija Cp NFRCS, a BCT proučavanih uzoraka je procijenjen kao što je ranije opisano u odjeljku Metode.
Pokušali smo razviti različite oblike i strukture koristeći Cp NFRCS sastave za različite biomedicinske primjene. Takvi oblici ili konfiguracije uključuju konusne briseve za krvarenje iz nosa, stomatološke zahvate i cilindrične briseve za vaginalno krvarenje.
Svi skupovi podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su ANOVA analizom korištenjem programa Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, SAD), a zatim Bonferronijevim testom višestrukih poređenja (*p<0,05).
Svi postupci provedeni u studijama na ljudima bili su u skladu sa standardima Instituta i Nacionalnog istraživačkog vijeća, kao i Helsinškom deklaracijom iz 1964. godine i njenim naknadnim amandmanima ili sličnim etičkim standardima. Svi učesnici su obaviješteni o karakteristikama studije i njenoj dobrovoljnoj prirodi. Podaci učesnika ostaju povjerljivi nakon prikupljanja. Protokol in vitro TEG eksperimenta pregledao je i odobrio Institucionalni etički komitet Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Volonteri su potpisali informirani pristanak za prikupljanje uzoraka krvi.
Svi postupci provedeni u studijama na životinjama provedeni su u skladu s propisima Medicinskog fakulteta Kastuba, Instituta za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Svi eksperimenti na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama Komiteta za kontrolu i nadzor eksperimenata na životinjama (CPCSEA). Svi autori slijede smjernice ARRIVE.
FTIR spektri svih NFRCS-ova su analizirani i upoređeni sa spektrom hitosana prikazanim na Slici 2A. Karakteristični spektralni vrhovi hitosana (snimljeni) na 3437 cm-1 (istezanje OH i NH, preklapanje), 2945 i 2897 cm-1 (istezanje CH), 1660 cm-1 (naprezanje NH2), 1589 cm-1 (savijanje N-H), 1157 cm-1 (istezanje mosta O-), 1067 cm-1 (istezanje C-O, sekundarni hidroksil), 993 cm-1 (istezanje CO, Bo-OH) 52.53.54. Dodatna Tabela S1 prikazuje vrijednosti apsorpcijskog spektra FTIR NFRCS-a za hitosan (reporter), čisti hitosan, Cm, Ch i Cp. FTIR spektri svih NFRCS-ova (Cm, Ch i Cp) pokazali su iste karakteristične apsorpcijske trake kao i čisti hitosan bez ikakvih značajnih promjena (Slika 2A). Rezultati FTIR-a potvrdili su odsustvo hemijskih ili fizičkih interakcija između polimera korištenih za razvoj NFRCS-a, što ukazuje na to da su korišteni polimeri inertni.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. (A) predstavlja kombinovane FTIR spektre sastava hitosana i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS pod kompresijom. (B) a) Brzina apsorpcije pune krvi NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg (n = 3); Ct uzorci su pokazali veći BAR jer pamučni štapić ima veću efikasnost apsorpcije; b) Krv nakon apsorpcije krvi. Ilustracija apsorbovanog uzorka. Grafički prikaz BCT testnog uzorka C (Cp NFRCS je imao najbolji BCT (15 s, n = 3)). Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci greške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci greške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Dannye u C, D, E i G predstavljaju srednje ± standardno otklone, a plan grešaka predstavlja standardno otklone, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, a stupci greške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD，***p < 0,0001。 Podaci u C, D, E i G pokazuju srednju vrijednost ± standardno otklone, plan grešaka predstavlja standardno otklon, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, stupci greške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001.