Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Ukontrollert blødning er en av de viktigste dødsårsakene. Å oppnå rask hemostase sikrer forsøkspersonens overlevelse som førstehjelp under kamp, ​​trafikkulykker og operasjoner for å redusere dødsfall. Nanoporøs fiberforsterket komposittstillas (NFRCS) avledet fra en enkel hemostatisk filmdannende sammensetning (HFFC) som en kontinuerlig fase kan utløse og forbedre hemostasen. Utviklingen av NFRCS er basert på utformingen av øyenstikkerens vinge. Øyenstikkerens vingestruktur består av tverrgående og langsgående vinger, og vingemembranene er koblet til hverandre for å opprettholde mikrostrukturens integritet. HFFC dekker fiberoverflaten jevnt med en film med nanometertykkelse og kobler den tilfeldig fordelte bomullstykkelsen (Ct) (dispergert fase) for å danne en nanoporøs struktur. Kombinasjonen av kontinuerlige og dispergerte faser reduserer produktkostnadene med ti ganger sammenlignet med kommersielt tilgjengelige produkter. Modifiserte NFRCS (tamponger eller armbånd) kan brukes i en rekke biomedisinske applikasjoner. In vivo-studier har konkludert med at den utviklede Cp NFRCS utløser og forsterker koagulasjonsprosessen på applikasjonsstedet. NFRCS kan modulere mikromiljøet og virke på cellenivå på grunn av sin nanoporøse struktur, noe som resulterer i bedre sårtilheling i eksisjonssårmodellen.
Ukontrollert blødning under kamp, ​​intraoperative og nødsituasjoner kan utgjøre en alvorlig trussel mot den såredes liv1. Disse tilstandene fører videre til en generell økning i perifer vaskulær motstand, noe som kan føre til hemoragisk sjokk. Passende tiltak for å kontrollere blødning under og etter operasjon anses som potensielt livstruende2,3. Skade på store kar fører til massivt blodtap, noe som resulterer i en dødelighet på ≤ 50 % i kamp og 31 % under operasjon1. Massivt blodtap fører til en reduksjon i kroppsvolum, noe som reduserer hjerteminuttvolum. En økning i total perifer vaskulær motstand og en progressiv svekkelse av mikrosirkulasjonen fører til hypoksi i livsstøttende organer. Hemoragisk sjokk kan oppstå hvis tilstanden fortsetter uten effektiv intervensjon1,4,5. Andre komplikasjoner inkluderer progresjon av hypotermi og metabolsk acidose, samt en koagulasjonsforstyrrelse som hindrer koagulasjonsprosessen. Alvorlig hemoragisk sjokk er assosiert med en høyere risiko for død6,7,8. Ved grad III (progressivt) sjokk er blodtransfusjon avgjørende for pasientens overlevelse under intraoperativ og postoperativ sykelighet og dødelighet. For å overvinne alle de ovennevnte livstruende situasjonene har vi utviklet et nanoporøst fiberforsterket komposittstillas (NFRCS) som benytter en minimal polymerkonsentrasjon (0,5 %) ved hjelp av en kombinasjon av vannløselige hemostatiske polymerer.
Ved bruk av fiberforsterkning kan kostnadseffektive produkter utvikles. De tilfeldig arrangerte fibrene ligner strukturen til en øyenstikkers vinge, balansert av de horisontale og vertikale stripene på vingene. De tverrgående og langsgående venene på vingen kommuniserer med vingemembranen (fig. 1). NFRCS består av forsterket Ct som et stillassystem med bedre fysisk og mekanisk styrke (figur 1). På grunn av overkommeligheten og håndverket foretrekker kirurger å bruke bomullstrådmålere (Ct) under operasjoner og bandasjer. Med tanke på de mange fordelene, inkludert > 90 % krystallinsk cellulose (som bidrar til å forbedre hemostatisk aktivitet), ble Ct derfor brukt som et skjelettsystem i NFRCS9,10. Med tanke på de mange fordelene, inkludert > 90 % krystallinsk cellulose (som bidrar til å forbedre hemostatisk aktivitet), ble Ct derfor brukt som et skjelettsystem i NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюческой целюлозовыш гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Gitt de mange fordelene, inkludert >90 % krystallinsk cellulose (involvert i økt hemostatisk aktivitet), ble Ct derfor brukt som NFRCS-skjelettsystemet9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强歼行ﴻCt被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Gitt de mange fordelene, inkludert over 90 % krystallinsk cellulose (bidrar til å forbedre hemostatisk aktivitet), ble Ct derfor brukt som et stillas for NFRCS9,10.Ct ble overfladisk belagt (nano-tykk filmdannelse ble observert) og sammenkoblet med en hemostatisk filmdannende sammensetning (HFFC). HFFC fungerer som en matrigel, som holder tilfeldig plassert Ct sammen. Den utviklede designen overfører spenninger i den dispergerte fasen (forsterkende fibre). Det er vanskelig å oppnå nanoporøse strukturer med god mekanisk styrke ved bruk av minimale polymerkonsentrasjoner. I tillegg er det ikke lett å tilpasse forskjellige former for forskjellige biomedisinske applikasjoner.
Figuren viser et diagram av NFRCS-designet basert på øyenstikkerens vingestruktur (A). Dette bildet viser en sammenlignende analogi av vingestrukturen til en øyenstikker (vingens kryssende og langsgående vener er sammenkoblet) og et tverrsnittsmikroskopisk foto av Cp NFRCS (B). Skjematisk fremstilling av NFRCS.
NFRC-er ble utviklet ved bruk av HFFC som en kontinuerlig fase for å håndtere de ovennevnte begrensningene. HFFC består av forskjellige filmdannende hemostatiske polymerer, inkludert kitosan (som den viktigste hemostatiske polymeren) med metylcellulose (MC), hydroksypropylmetylcellulose (HPMC 50 cp) og polyvinylalkohol (PVA) (125 kDa) som en støttepolymer som fremmer trombedannelse. Tilsetningen av polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) forbedret fuktighetsabsorpsjonskapasiteten til NFRCS. Polyetylenglykol 400 (PEG 400) ble tilsatt for å forbedre polymertverrbinding i bundne polymerblandinger. Tre forskjellige HFFC hemostatiske sammensetninger (Cm HFFC, Ch HFFC og Cp HFFC), nemlig kitosan med MC (Cm), kitosan med HPMC (Ch) og kitosan med PVA (Cp), ble påført Ct. Ulike in vitro- og in vivo-karakteriseringsstudier har bekreftet den hemostatiske og sårhelende aktiviteten til NFRCS. Komposittmaterialer som tilbys av NFRCS kan brukes til å tilpasse ulike former for stillas for å møte spesifikke behov.
I tillegg kan NFRCS modifiseres som en bandasje eller rull for å dekke hele skadeområdet på underekstremitetene og andre deler av kroppen. Spesielt for lemmerskader i kamp kan den utformede NFRCS-designen endres til en halv arm eller et helt ben (tilleggsfigur S11). NFRCS kan lages til et armbånd med vevslim, som kan brukes til å stoppe blødninger fra alvorlige selvmordsskader på håndleddet. Hovedmålet vårt er å utvikle en NFRCS med så lite polymer som mulig som kan leveres til en stor befolkning (under fattigdomsgrensen) og som kan plasseres i et førstehjelpsskrin. NFRCS er enkel, effektiv og økonomisk i design, og kommer lokalsamfunn til gode og kan ha en global innvirkning.
Kitosan (molekylvekt 80 kDa) og amarant ble kjøpt fra Merck, India. Hydroksypropylmetylcellulose 50 Cp, polyetylenglykol 400 og metylcellulose ble kjøpt fra Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polyvinylalkohol (molekylvekt 125 kDa) (87–90 % hydrolysert) ble kjøpt fra National Chemicals, Gujarat. Polyvinylpyrrolidin K30 ble kjøpt fra Molychem, Mumbai, og sterile prøver ble kjøpt fra Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q-vann (Direct-Q3 vannrensesystem, Merck, India) som bærer.
NFRCS ble utviklet ved hjelp av en frysetørkingsmetode11,12. Alle HFFC-sammensetninger (tabell 1) ble fremstilt ved hjelp av en mekanisk omrører. Fremstill en 0,5 % løsning av kitosan med 1 % eddiksyre i vann ved kontinuerlig omrøring ved 800 o/min på en mekanisk omrører. Den nøyaktige vekten av den ladede polymeren angitt i tabell 1 ble tilsatt kitosanløsningen og omrørt til en klar polymerløsning ble oppnådd. PVP K30 og PEG 400 ble tilsatt den resulterende blandingen i mengdene angitt i tabell 1, og omrøringen ble fortsatt til en klar viskøs polymerløsning ble oppnådd. Det resulterende badet av polymerløsning ble sonikert i 60 minutter for å fjerne fangede luftbobler fra polymerblandingen. Som vist i tilleggsfigur S1(b), var Ct jevnt fordelt i hver brønn i en 6-brønns plate (form) tilsatt 5 ml HFFC.
Platen med seks brønner ble sonikert i 60 minutter for å oppnå jevn fukting og fordeling av HFFC i Ct-nettverket. Deretter ble platen med seks brønner fryst ved -20 °C i 8–12 timer. Fryseplatene ble frysetørket i 48 timer for å oppnå forskjellige formuleringer av NFRCS. Den samme prosedyren brukes til å produsere forskjellige former og strukturer, for eksempel tamponger eller sylindriske tamponger, eller andre former for forskjellige bruksområder.
Nøyaktig veid kitosan (80 kDa) (3 %) løses opp i 1 % eddiksyre ved hjelp av en magnetrører. Til den resulterende kitosanløsningen ble det tilsatt 1 % PEG 400 og rørt i 30 minutter. Hell den resulterende løsningen i en firkantet eller rektangulær beholder og frys ved -80 °C i 12 timer. Frosne prøver ble frysetørket i 48 timer for å oppnå porøs Cs13.
Det utviklede NFRCS-prøven ble utsatt for eksperimenter ved bruk av Fourier-transform infrarødspektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) for å bekrefte den kjemiske kompatibiliteten til kitosan med andre polymerer14,15. FTIR-spektrene (bredden av spektralområdet fra 400 til 4000 cm⁻¹) for alle testede prøver ble oppnådd ved å utføre 32 skanninger.
Blodabsorpsjonshastigheten (BAR) for alle formuleringer ble evaluert ved hjelp av metoden beskrevet av Chen et al. 16 med små modifikasjoner. De utviklede NFRK-ene av alle sammensetninger ble tørket i en vakuumovn ved 105 °C over natten for å fjerne gjenværende løsemiddel. 30 mg NFRCS (startprøvevekt – W0) og 30 mg Ct (positiv kontroll) ble plassert i separate skåler som inneholdt en forblanding av 3,8 % natriumsitrat. Ved forhåndsbestemte tidsintervaller, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 og 60 sekunder, ble NFRCS fjernet og overflatene deres renset for uabsorbert blod ved å plassere prøvene på Ct i 30 sekunder. Den endelige vekten av blod absorbert av NFRCS 16 ble vurdert (W1) på hvert tidspunkt. Beregn BAR-prosenten ved hjelp av følgende formel:
Blodkoagulasjonstid (BCT) ble bestemt som rapportert av Wang et al. 17. Tiden som kreves for at helblod (rotteblod forblandet med 3,8 % natriumsitrat) skal koagulere i nærvær av NFRCS ble beregnet som BCT for testprøven. De forskjellige NFRCS-komponentene (30 mg) ble plassert i 10 ml skrukork-hetteglass og inkubert ved 37 °C. Blod (0,5 ml) ble tilsatt hetteglasset, og 0,3 ml 0,2 M CaCl2 ble tilsatt for å aktivere blodkoagulasjon. Til slutt, snu hetteglasset hvert 15. sekund (opptil 180 °) til det dannes en fast koagulasjon. BCT for prøven estimeres ved antall vippeskåler 17,18. Basert på BCT ble to optimale sammensetninger fra NFRCS Cm, Ch og Cp valgt for videre karakteriseringsstudier.
BCT av Ch NFRCS- og Cp NFRCS-sammensetninger ble bestemt ved å implementere metoden beskrevet av Li et al. 19. Plasser 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs (positiv kontroll) i separate petriskåler (37 °C). Blod som inneholdt 3,8 % natriumsitrat ble blandet med 0,2 M CaCl2 i et volumforhold på 10:1 for å starte blodkoaguleringsprosessen. 20 µl av 0,2 M CaCl2 rotteblodblanding ble påført prøveoverflaten og plassert i en tom petriskål. Kontrollen var blod som ble helt i tomme petriskåler uten Ct. Stopp koaguleringen ved å tilsette 10 ml avionisert (DI) vann til prøven som inneholdt skålen uten å forstyrre koagulen, med faste intervaller på 0, 3 og 5 minutter. Ukoagulerte erytrocytter (erytrocytter) gjennomgår hemolyse i nærvær av avionisert vann og frigjør hemoglobin. Hemoglobin ved forskjellige tidspunkter (HA(t)) ble målt ved 540 nm (λmax hemoglobin) ved bruk av et UV-Vis-spektrofotometer. Den absolutte absorpsjonen av hemoglobin (AH(0)) i 0 min av 20 µl blod i 10 ml avionisert vann ble tatt som referansestandard. Det relative hemoglobinopptaket (RHA) av koagulert blod ble beregnet fra forholdet HA(t)/HA(0) ved bruk av samme blodparti.
Ved hjelp av en teksturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) ble klebeegenskapene til NFRK til skadet vev bestemt. Press en sylindrisk skål med åpen bunn mot innsiden av svineskinnet (uten fettlaget). Prøver (Ch NFRCS og Cp NFRCS) ble påført via kanyle i sylindriske former for å skape adhesjon til grisens hud. Etter 3 minutters inkubasjon ved romtemperatur (RT) (25 °C) ble NFRCS-klebestyrken registrert med en konstant hastighet på 0,5 mm/sek.
Hovedfunksjonen til kirurgiske forseglingsmidler er å øke blodkoagulasjonen samtidig som det reduserer blodtap. Tapsfri koagulasjon i NFRCS ble evaluert ved hjelp av en tidligere publisert metode med små modifikasjoner 19. Lag et mikrosentrifugerør (2 ml) (indre diameter 10 mm) med et 8 × 5 mm2 hull på den ene siden av sentrifugerøret (som representerer et åpent sår). NFRCS brukes til å lukke åpningen, og tape brukes til å forsegle ytterkantene. Tilsett 20 µl 0,2 M CaCl2 til mikrosentrifugerøret som inneholder 3,8 % natriumsitrat-premiksen. Etter 10 minutter ble mikrosentrifugerørene fjernet fra skålene, og økningen i skålenes masse ble bestemt på grunn av blodutstrømningen fra NFRK (n = 3). Blodtap Ch NFRCS og Cp NFRCS ble sammenlignet med Cs.
Våtintegriteten til NFRCS ble bestemt basert på metoden beskrevet av Mishra og Chaudhary21 med mindre modifikasjoner. Plasser NFRCS i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe med 50 ml vann og virvl i 60 sekunder uten at det dannes en topp. Visuell inspeksjon og prioritering av prøver for fysisk integritet basert på innsamling.
Bindingsstyrken til HFFC til Ct ble studert ved hjelp av tidligere publiserte metoder med mindre modifikasjoner. Overflatebeleggets integritet ble vurdert ved å eksponere NFRK for akustiske bølger (ekstern stimulus) i nærvær av milliQ-vann (Ct). De utviklede NFRCS Ch NFRCS og Cp NFRCS ble plassert i et begerglass fylt med vann og sonikert i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 30 minutter. Etter tørking ble prosentforskjellen mellom start- og sluttvekten til NFRCS brukt til å beregne prosentvis materialtap (HFFC). In vitro BCT støttet ytterligere bindingsstyrken eller tapet av overflatematerialer. Effektiviteten av HFFC-binding til Ct gir blodkoagulasjon og et elastisk belegg på overflaten av Ct22.
Homogeniteten til den utviklede NFRCS-en ble bestemt ved hjelp av BCT-en av prøver (30 mg) tatt fra tilfeldig utvalgte generelle steder på NFRCS. Følg den tidligere nevnte BCT-prosedyren for å bestemme NFRCS-samsvar. Nærhet mellom alle fem prøvene sikrer jevn overflatedekning og HFFC-avsetning i Ct-nettet.
Det nominelle blodkontaktområdet (NBCA) ble bestemt som tidligere rapportert med noen modifikasjoner. Blodet koaguleres ved å klemme 20 µl blod mellom de to overflatene av Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs. Etter 1 time ble de to delene av stenten separert, og koagelområdet målt manuelt. Gjennomsnittsverdien av tre repetisjoner ble ansett som NBCA NFRCS19.
Dynamisk dampsorpsjonsanalyse (DVS) ble brukt til å evaluere effektiviteten til NFRCS til å absorbere vann fra det ytre miljøet eller fra skadestedet som er ansvarlig for å starte koagulasjon. DVS evaluerer eller registrerer dampopptaket og -tapet i en prøve gravimetrisk ved hjelp av en ultrafølsom vekt med en masseoppløsning på ±0,1 µg. Et partialdamptrykk (relativ fuktighet) genereres av en elektronisk massestrømningskontroller rundt prøven ved å blande mettede og tørre bærergasser. I henhold til retningslinjene fra Den europeiske farmakopéen ble prøvene kategorisert i fire kategorier (0–0,012 % w/w− ikke-hygroskopiske, 0,2–2 % w/w svakt hygroskopiske, 2–15 % moderat hygroskopiske og > 15 % svært hygroskopiske)23, basert på prosentandelen fuktighetsopptak i prøvene. I henhold til retningslinjene fra Den europeiske farmakopéen ble prøvene kategorisert i fire kategorier (0–0,012 % w/w− ikke-hygroskopisk, 0,2–2 % w/w litt hygroskopisk, 2–15 % moderat hygroskopisk og > 15 % svært hygroskopisk)23, basert på prosentandelen fuktighetsopptak i prøvene.I samsvar med anbefalingene fra Den europeiske farmakopéen ble prøvene delt inn i fire kategorier (0–0,012 % w/w – ikke-hygroskopisk, 0,2–2 % w/w svakt hygroskopisk, 2–femten %), avhengig av prosentandelen fuktighetsabsorpsjon i prøvene.% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat hygroskopisk og > 15 % svært hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w非吸湿性、0,2–2 % w/w 轻微吸湿性、2–15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 刱为 ,0＆为 ,0＆为. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23I samsvar med anbefalingene fra Den europeiske farmakopéen deles prøvene inn i fire klasser avhengig av hvor mye fuktighet som absorberes av prøven (0–0,012 vekt% – ikke-hygroskopisk, 0,2–2 vekt% – litt hygroskopisk, 2–15 vekt%.% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat hygroskopisk, > 15 % svært hygroskopisk) 23.Den hygroskopiske effektiviteten til NFCS X NFCS og TsN NFCS ble bestemt på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA. I løpet av denne prosessen ble kjøretid, relativ fuktighet (RH) og prøvevekt i sanntid ved 25 °C24 målt. Fuktighetsinnholdet beregnes ved nøyaktig NFRCS-masseanalyse ved bruk av følgende ligning:
MC er NFRCS-fuktighet. m1 – tørrvekt av NSAIDs. m2 er NFRCS-massen i sanntid ved en gitt RF.
Det totale overflatearealet ble estimert ved hjelp av et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Det totale overflatearealet ble estimert ved hjelp av et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азозотом образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Det totale overflatearealet ble estimert ved hjelp av et nitrogenadsorpsjonseksperiment med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空 样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计怂觯逢硝25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотро образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Det totale overflatearealet ble estimert ved hjelp av nitrogenadsorpsjonsforsøk med flytende nitrogen etter at prøvene ble tømt i 10 timer ved 25 °C (< 7 x 10⁻³ torr).Totalt overflateareal, porevolum og NFRCS-porestørrelse ble bestemt med en Quantachrome fra NOVA 1000e, Østerrike, ved bruk av RS 232-programvare.
Klargjør 5 % røde blodceller (saltvann som fortynningsmiddel) fra fullblod. Overfør deretter en aliquot av HFFC (0,25 ml) til en 96-brønnsplate og 5 % røde blodceller (0,1 ml). Inkuber blandingen ved 37 °C i 40 minutter. En blanding av røde blodceller og serum ble ansett som en positiv kontroll, og en blanding av saltvann og røde blodceller som en negativ kontroll. Hemagglutinasjon ble bestemt i henhold til Stajitzky-skalaen. De foreslåtte skalaene er som følger: + + + + tette granulære aggregater; + + + glatte bunnputer med buede kanter; + + glatte bunnputer med revnede kanter; + smale røde ringer rundt kantene på de glatte putene; – (negativ) diskret rød knapp 12 i midten av den nedre brønnen.
Hemokompatibiliteten til NFRCS ble studert i henhold til metoden til International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Den gravimetriske metoden beskrevet av Singh et al. Mindre modifikasjoner ble gjort for å vurdere trombedannelse i nærvær av eller på overflaten av NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS ble inkubert i fosfatbufret saltvann (PBS) i 24 timer ved 37 °C. Etter 24 timer ble PBS fjernet, og NFRCS ble behandlet med 2 ml blod som inneholdt 3,8 % natriumsitrat. Tilsett 0,04 ml 0,1 M CaCl2 til de inkuberte prøvene på overflaten av NFRCS. Etter 45 minutter ble 5 ml destillert vann tilsatt for å stoppe koagulasjonen. Koagulert blod på overflaten av NFRK ble behandlet med 36–38 % formaldehydløsning. Klumpene som var fiksert med formaldehyd ble tørket og veid. Prosentandelen trombose ble estimert ved å beregne vekten av glasset uten blod og prøve (negativ kontroll) og glasset med blod (positiv kontroll).
Som en innledende bekreftelse ble prøvene visualisert under et optisk mikroskop for å forstå evnen til HFFC-overflatebelegget, Ct-sammenkoblet og Ct-nettverket til å danne porer. Tynne snitt av Ch og Cp fra NFRCS ble trimmet med et skalpellblad. Den resulterende seksjonen ble plassert på et objektglass, dekket med et dekkglass, og kantene ble festet med lim. De forberedte objektglassene ble sett under et optisk mikroskop, og fotografier ble tatt med forskjellige forstørrelser.
Polymeravsetning i Ct-nettverk ble visualisert ved hjelp av fluorescensmikroskopi basert på metoden beskrevet av Rice et al. 29. HFFC-sammensetningen som ble brukt i formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant), og NFRCS (Ch og Cp) ble fremstilt i henhold til metoden nevnt tidligere. HFFC-sammensetningen som ble brukt i formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant), og NFRCS (Ch og Cp) ble fremstilt i henhold til metoden nevnt tidligere.HFFC-sammensetningen som ble brukt til formulering ble blandet med et fluorescerende fargestoff (amarant), og NFRCS (Ch og Cp) ble oppnådd i henhold til den tidligere nevnte metoden.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方提到的方挈 &NFR Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方提到的方挈 &NFR Cp）.HFFC-sammensetningen som ble brukt i formuleringen ble blandet med et fluorescerende fargestoff (Amaranth) og mottatt NFRCS (Ch og Cp), som nevnt tidligere.Tynne snitt av NFRK ble kuttet fra de innhentede prøvene, plassert på glassplater og dekket med dekkglass. Observer de preparerte preparatene under et fluorescerende mikroskop med et grønt filter (310–380 nm). Bilder ble tatt med 4x forstørrelse for å forstå Ct-forhold og overflødig polymeravsetning i Ct-nettverket.
Overflatetopografien til NFRCS Ch og Cp ble bestemt ved hjelp av et atomkraftmikroskop (AFM) med en ultraskarp TESP-utkragning i gjengemodus: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2–5 nm, Bruker, Taiwan. Overflateruhet ble bestemt ved hjelp av rotmiddelkvadrat (RMS) ved hjelp av programvare (Scanning Probe Image Processor). Ulike NFRCS-plasseringer ble gjengitt på 3D-bilder for å kontrollere overflateuniformitet. Standardavviket for poengsummen for et gitt område er definert som overflateruhet. RMS-ligningen ble brukt til å kvantifisere overflateruheten til NFRCS31.
FESEM-baserte studier ble utført ved bruk av FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, for å forstå overflatemorfologien til Ch NFRCS og Cp NFRCS, som viste bedre BCT enn Cm NFRCS. FESEM-studien ble utført i henhold til metoden beskrevet av Zhao et al. 32 med mindre modifikasjoner. NFRCS 20 til 30 mg Ch NFRCS og Cp NFRCS ble forhåndsblandet med 20 µl 3,8 % natriumsitrat forhåndsblandet med rotteblod. 20 μl 0,2 M CaCl2 ble tilsatt de blodbehandlede prøvene for å starte koagulasjon, og prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. I tillegg ble overflødige erytrocytter fjernet fra NFRCS-overflaten ved skylling med saltvann.
Etterfølgende prøver ble behandlet med 0,1 % glutaraldehyd og deretter tørket i en varmluftsovn ved 37 °C for å fjerne fuktighet. De tørkede prøvene ble belagt og analysert 32. Andre bilder som ble innhentet under analysen var koagulasjonsdannelse på overflaten av individuelle bomullsfibre, polymeravsetning mellom Ct, erytrocyttmorfologi (form), koagulasjonsintegritet og erytrocyttmorfologi i nærvær av NFRCS. Ubehandlede NFRCS-områder og Ch- og Cp-behandlede NFRCS-områder inkubert med blod ble skannet for elementære ioner (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, sink, kobber og selen) 33. Sammenlign elementære ionprosenter mellom behandlede og ubehandlede prøver for å forstå elementære ionakkumulering under koagulasjonsdannelse og koagulasjonshomogenitet.
Tykkelsen på Cp HFFC-overflatebelegget på Ct-overflaten ble bestemt ved hjelp av FESEM. Tverrsnittene av Cp NFRCS ble kuttet fra rammeverket og sputterbelagt. De resulterende sputterbeleggprøvene ble observert ved hjelp av FESEM, og tykkelsen på overflatebelegget ble målt 34, 35, 36.
Røntgen-mikro-CT gir høyoppløselig 3D ikke-destruktiv avbildning og lar deg studere den interne strukturelle ordningen til NFRK. Mikro-CT bruker en røntgenstråle som passerer gjennom prøven for å registrere den lokale lineære dempningskoeffisienten til røntgenstrålene i prøven, noe som bidrar til å innhente morfologisk informasjon. Den interne plasseringen av Ct i Cp NFRCS og blodbehandlet Cp NFRCS ble undersøkt med mikro-CT for å forstå absorpsjonseffektivitet og blodkoagulasjon i nærvær av NFRCS37,38,39. 3D-strukturene til blodbehandlede og ubehandlede Cp NFRCS-prøver ble rekonstruert ved hjelp av mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland). Ved hjelp av VG STUDIO-MAX programvareversjon 2.2 ble flere røntgenbilder tatt fra forskjellige vinkler (ideelt sett 360° dekning) for å utvikle 3D-bilder for NFRCS. De innsamlede projeksjonsdataene ble rekonstruert til 3D volumetriske bilder ved hjelp av den tilsvarende enkle 3D ScanIP Academic-programvaren.
For å forstå fordelingen av koagulen ble i tillegg 20 µl forhåndsblandet sitrert blod og 20 µl 0,2 M CaCl2 tilsatt NFRCS for å starte blodkoagulering. De forberedte prøvene får herde. NFRK-overflaten ble behandlet med 0,5 % glutaraldehyd og tørket i en varmluftsovn ved 30–40 °C i 30 minutter. Blodproppen som ble dannet på NFRCS ble skannet, rekonstruert, og et 3D-bilde av blodproppen ble visualisert.
Antibakterielle analyser ble utført på Cp NFRCS (best sammenlignet med Ch NFRCS) ved bruk av den tidligere beskrevne metoden med mindre modifikasjoner. Den antibakterielle aktiviteten til Cp NFRCS og Cp HFFC ble bestemt ved bruk av tre forskjellige testmikroorganismer [S. aureus (gram-positive bakterier), E. coli (gram-negative bakterier) og hvit Candida (C. albicans)] som vokste på agar i petriskåler i en inkubator. Inokuler 50 ml av den fortynnede bakteriekultursuspensjonen jevnt i en konsentrasjon på 105–106 CFU ml⁻¹ på agarmediet. Hell mediet i en petriskål og la det størkne. Brønner ble laget på overflaten av agarplaten for å fylle med HFFC (3 brønner for HFFC og 1 for negativ kontroll). Tilsett 200 µl HFFC til 3 brønner og 200 µl pH 7,4 PBS til den fjerde brønnen. På den andre siden av petriskålen plasseres en 12 mm Cp NFRCS-disk på den størknede agaren og fuktes med PBS (pH 7,4). Ciprofloksacin-, ampicillin- og flukonazoltabletter regnes som referansestandarder for Staphylococcus aureus, Escherichia coli og Candida albicans. Mål hemmingssonen manuelt og ta et digitalt bilde av hemmingssonen.
Etter institusjonell etisk godkjenning ble studien utført ved Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i Sør-India. In vitro TEG-eksperimentprotokollen har blitt gjennomgått og godkjent av den institusjonelle etikkkomiteen ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Forsøkspersonene ble rekruttert blant frivillige blodgivere (i alderen 18 til 55 år) fra sykehusets blodbank. I tillegg ble det innhentet et informert samtykkeskjema fra de frivillige for innsamling av blodprøver. Naturlig TEG (N-TEG) ​​ble brukt til å studere effekten av Cp HFFC-formuleringen på fullblod blandet med natriumsitrat. N-TEG er allment anerkjent for sin rolle i gjenopplivning på stedet, noe som skaper problemer for klinikere på grunn av potensialet for klinisk signifikant forsinkelse i resultatene (rutinemessige koagulasjonstester). N-TEG-analyse ble utført med fullblod. Informert samtykke og detaljert sykehistorie ble innhentet fra alle deltakerne. Studien inkluderte ikke deltakere med hemostatiske eller trombotiske komplikasjoner som graviditet/fødselstid eller leversykdom. Personer som tok legemidler som påvirker koagulasjonskaskaden ble også ekskludert fra studien. Grunnleggende laboratorietester (hemoglobin, protrombintid, aktivert tromboplastin og blodplatetall) ble utført på alle deltakere i henhold til standardprosedyrer. N-TEG bestemmer blodpropps viskoelastisitet, initial koagelstruktur, partikkelinteraksjon, koagelstyrking og koagellyse. N-TEG-analysen gir grafiske og numeriske data om de samlede effektene av flere cellulære elementer og plasma. N-TEG-analyse ble utført på to forskjellige volumer Cp HFFC (10 µl og 50 µl). Som et resultat ble 1 ml fullblod med sitronsyre tilsatt til 10 µl Cp HFFC. Tilsett 1 ml (Cp HFFC + sitrert blod), 340 µl blandet blod til 20 µl 0,2 M CaCl2-holdig TEG-skål. Deretter ble TEG-skåler lastet inn i TEG® 5000, US for å måle R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % av blodprøvene i nærvær av Cp HFFC41.
Protokollen for in vivo-studien ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med anbefalingene fra Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle in vivo NFRCS-studier (2 × 2 cm2) ble utført på hunnrotter av typen Wistar (som veide 200 til 250 g). Alle dyrene ble akklimatisert ved en temperatur på 24–26 °C, og dyrene hadde fri tilgang til standardfôr og vann ad libitum. Alle dyrene ble tilfeldig delt inn i forskjellige grupper, hver gruppe besto av tre dyr. Alle studiene ble utført i samsvar med Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Før studien ble dyrene bedøvet ved intraperitoneal (ip) administrering av en blanding av 20–50 mg ketamin (per 1 kg kroppsvekt) og 2–10 mg xylazin (per 1 kg kroppsvekt). Etter studien ble blødningsvolumet beregnet ved å evaluere forskjellen mellom start- og sluttvekten til prøvene, og gjennomsnittsverdien fra de tre testene ble tatt som blødningsvolumet til prøven.
Rottehaleamputasjonsmodellen ble implementert for å forstå potensialet til NFRCS for å modulere blødning ved traumer, kamp eller trafikkulykker (skademodell). 50 % av halen ble kuttet av med et skalpellblad og plassert i luft i 15 sekunder for å sikre normal blødning. I tillegg ble testprøver plassert på halen til en rotte ved å påføre trykk (Ct, Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS). Blødning og PCT ble rapportert for testprøver (n = 3)17,45.
Effektiviteten av NFRCS-trykkkontroll i kamp ble undersøkt på en modell av den overfladiske lårbensarterien. Lårbensarterien eksponeres, punkteres med en 24G-trokar og tappes for blødning innen 15 sekunder. Etter at ukontrollert blødning er observert, plasseres testprøven på stikkstedet med trykk påført. Umiddelbart etter påføring av testprøven ble koagulasjonstiden registrert, og hemostatisk effektivitet ble observert i de neste 5 minuttene. Den samme prosedyren ble gjentatt med Cs og Ct46.
Dowling et al. 47 foreslo en leverskademodell for å vurdere det hemostatiske potensialet til hemostatiske materialer i sammenheng med intraoperativ blødning. BCT ble registrert for Ct-prøver (negativ kontroll), Cs-rammeverk (positiv kontroll), Ch NFRCS-prøver og Cp NFRCS-prøver. Rottens suprahepatiske vena cava ble eksponert ved å utføre en median laparotomi. Deretter ble den distale delen av venstre lapp kuttet ut med saks. Lag et snitt i leveren med et skalpellblad og la den blø i noen sekunder. Nøyaktig veide Ch NFRCS- og Cp NFRCS-testprøver ble plassert på den skadede overflaten uten positivt trykk, og BCT ble registrert. Kontrollgruppen (Ct) påførte deretter trykk etterfulgt av Cs 30 s 47 uten å bryte skaden.
In vivo sårhelingsanalyser ble utført ved hjelp av en eksisjonssårmodell for å evaluere sårhelingsegenskapene til de utviklede polymerbaserte NFRCS-ene. Modeller av eksisjonssår ble valgt og utført i henhold til tidligere publiserte metoder med mindre modifikasjoner19,32,48. Alle dyr ble bedøvet som tidligere beskrevet. Bruk en biopsipunch (12 mm) for å lage et sirkulært dypt snitt i huden på ryggen. Forberedte sårsteder ble bandasjert med Cs (positiv kontroll), Ct (med erkjennelse av at bomullsdotter forstyrrer helbredelse), Ch NFRCS og Cp NFRCS (eksperimentell gruppe) og en negativ kontroll uten behandling. På hver dag i studien ble sårområdet målt hos alle rotter. Bruk et digitalkamera til å ta et bilde av sårområdet og sett på en ny bandasje. Prosentandelen sårlukking ble målt ved hjelp av følgende formel:
Basert på prosentandelen sårlukking på studiens 12. dag ble rottehuden fra den beste gruppen fjernet ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) og studert ved H&E-farging og Massons trikromfarging. Basert på prosentandelen sårlukking på studiens 12. dag ble rottehuden fra den beste gruppen fjernet ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) og studert ved H&E-farging og Massons trikromfarging.Basert på prosentandelen sårlukking på studiens 12. dag ble huden til rottene i den beste gruppen ((Cp NFRCS) og kontrollgruppen) fjernet og undersøkt ved farging med hematoksylin-eosin og Massons trikrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Rotter i den beste gruppen ((Cp NFRCS) og kontrollgruppene) ble fjernet for hematoksylin-eosin-farging og Massons trikrom-farging basert på prosentvis sårlukking på dag 12 av studien.Den implementerte fargeprosedyren ble utført i henhold til tidligere beskrevne metoder49,50. Kort fortalt, etter fiksering i 10 % formalin, ble prøvene dehydrert ved hjelp av en serie graderte alkoholer. Bruk en mikrotom for å oppnå tynne snitt (5 µm tykke) av det utskårne vevet. Tynne seriesnitt av kontrollpersoner og Cp NFRCS ble behandlet med hematoksylin og eosin for å studere histopatologiske endringer. Massons trikromfarging ble brukt til å oppdage dannelsen av kollagenfibriller. Resultatene som ble oppnådd, ble blindt studert av patologer.
Stabiliteten til Cp NFRCS-prøvene ble studert ved romtemperatur (25 °C ± 2 °C/60 % RF ± 5 %) i 12 måneder51. Cp NFRCS (overflatemisfarging og mikrobiell vekst) ble visuelt inspisert og testet for foldslitasjemotstand og BCT i henhold til metodene ovenfor som er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Skalerbarheten og reproduserbarheten til Cp NFRCS ble undersøkt ved å fremstille Cp NFRCS med en størrelse på 15 × 15 cm2. I tillegg ble 30 mg prøver (n = 5) fjernet fra forskjellige Cp NFRCS-fraksjoner, og BCT-en til de studerte prøvene ble evaluert som beskrevet tidligere i metodedelen.
Vi har forsøkt å utvikle ulike former og strukturer ved bruk av Cp NFRCS-sammensetninger for ulike biomedisinske anvendelser. Slike former eller konfigurasjoner inkluderer koniske vattpinner for neseblod, tannbehandling og sylindriske vattpinner for vaginal blødning.
Alle datasett er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik og ble analysert ved ANOVA med Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) etterfulgt av Bonferronis multiple sammenligningstest (*p < 0,05).
Alle prosedyrer utført i studier på mennesker var i samsvar med standardene til instituttet og Det nasjonale forskningsrådet, samt Helsingforserklæringen fra 1964 og dens påfølgende endringer, eller lignende etiske standarder. Alle deltakere ble informert om studiens trekk og dens frivillige natur. Deltakerdata forblir konfidensielle etter innsamling. In vitro TEG-eksperimentell protokoll har blitt gjennomgått og godkjent av den institusjonelle etikkkomiteen ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Frivillige signerte informert samtykke til å samle inn blodprøver.
Alle prosedyrer utført i dyrestudier ble utført i samsvar med Kastuba Faculty of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dyreforsøk som ble utformet ble utført i samsvar med retningslinjene fra Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle forfattere følger ARRIVE-retningslinjene.
FTIR-spektrene for alle NFRCS ble analysert og sammenlignet med kitosanspekteret vist i figur 2A. Karakteristiske spektrale topper for kitosan (registrert) ved 3437 cm⁻¹ (OH- og NH-strekking, overlapping), 2945 og 2897 cm⁻¹ (CH-strekking), 1660 cm⁻¹ (NH2-belastning), 1589 cm⁻¹ (N–H-bøying), 1157 cm⁻¹ (brostrekking O-), 1067 cm⁻¹ (strekking C–O, sekundær hydroksyl), 993 cm⁻¹ (strekking CO, Bo-OH) 52, 53, 54. Tilleggstabell S1 viser FTIR NFRCS-absorpsjonsspektrumverdiene for kitosan (reporter), ren kitosan, Cm, Ch og Cp. FTIR-spektrene for alle NFRCS (Cm, Ch og Cp) viste de samme karakteristiske absorpsjonsbåndene som ren kitosan uten noen signifikante endringer (figur 2A). FTIR-resultatene bekreftet fraværet av kjemiske eller fysiske interaksjoner mellom polymerene som ble brukt til å utvikle NFRCS, noe som indikerer at polymerene som ble brukt er inerte.
In vitro-karakterisering av Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs. (A) representerer de kombinerte FTIR-spektrene av sammensetningene av kitosan og Cm NFRCS, Ch NFRCS og Cp NFRCS under kompresjon. (B) a) Opptakshastighet for NFRCS Cm, Ch, Cp og Cg i helblod (n = 3); Ct-prøvene viste en høyere BAR fordi bomullspinnen har en høyere absorpsjonseffektivitet; b) Absorpsjon blod etter blod Illustrasjon av den absorberte prøven. Grafisk fremstilling av BCT for testprøve C (Cp NFRCS hadde den beste BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E og G ble vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​feilfeltene representerer SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E og G ble vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​feilfeltene representerer SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляюю отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E og G presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik, og feilfeltene representerer standardavviket, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предартноставля отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E og G vises som gjennomsnitt ± standardavvik, feilfelt representerer standardavvik, ***p < 0,0001.