Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Sângerarea necontrolată este una dintre principalele cauze de deces. Realizarea unei hemostaze rapide asigură supraviețuirea subiectului ca prim ajutor în timpul luptelor, accidentelor rutiere și operațiunilor de reducere a deceselor. Schela compozită armată cu fibre nanoporoase (NFRCS), derivată dintr-o compoziție hemostatică simplă formatoare de film (HFFC), ca fază continuă, poate declanșa și spori hemostaza. Dezvoltarea NFRCS se bazează pe designul aripii libelulei. Structura aripii libelulei este formată din aripi transversale și longitudinale, iar membranele aripii sunt conectate între ele pentru a menține integritatea microstructurii. HFFC acoperă uniform suprafața fibrei cu o peliculă de grosime nanometrică și conectează grosimea de bumbac (Ct) distribuită aleatoriu (faza dispersată) pentru a forma o structură nanoporoasă. Combinația fazelor continue și dispersate reduce costul produsului de zece ori în comparație cu produsele disponibile comercial. NFRCS modificate (tampoane sau brățări) pot fi utilizate într-o varietate de aplicații biomedicale. Studiile in vivo au concluzionat că NFRCS-ul Cp dezvoltat declanșează și îmbunătățește procesul de coagulare la locul aplicării. NFRCS poate modula micromediul și acționa la nivel celular datorită structurii sale nanoporoase, rezultând o vindecare mai bună a rănilor în modelul de plagă de excizie.
Sângerarea necontrolată în timpul luptei, intraoperatorie și în situațiile de urgență poate reprezenta o amenințare gravă pentru viața răniților1. Aceste afecțiuni duc în continuare la o creștere generală a rezistenței vasculare periferice, ceea ce duce la șoc hemoragic. Măsurile adecvate pentru controlul sângerării în timpul și după intervenția chirurgicală sunt considerate potențial letale2,3. Deteriorarea vaselor mari duce la pierderi masive de sânge, rezultând o rată a mortalității de ≤ 50% în luptă și 31% în timpul intervenției chirurgicale1. Pierderea masivă de sânge duce la o scădere a volumului corporal, ceea ce reduce debitul cardiac. O creștere a rezistenței vasculare periferice totale și o afectare progresivă a microcirculației duc la hipoxie în organele de susținere a vieții. Șocul hemoragic poate apărea dacă afecțiunea continuă fără o intervenție eficientă1,4,5. Alte complicații includ progresia hipotermiei și a acidozei metabolice, precum și o tulburare de coagulare care împiedică procesul de coagulare. Șocul hemoragic sever este asociat cu un risc mai mare de deces6,7,8. În șocul de gradul III (progresiv), transfuzia de sânge este esențială pentru supraviețuirea pacientului în timpul morbidității și mortalității intraoperatorii și postoperatorii. Pentru a depăși toate situațiile menționate mai sus, care pun viața în pericol, am dezvoltat o schelă compozită nanoporoasă armată cu fibre (NFRCS) care utilizează o concentrație minimă de polimeri (0,5%) folosind o combinație de polimeri hemostatici solubili în apă.
Prin utilizarea armăturii cu fibre, se pot dezvolta produse eficiente din punct de vedere al costurilor. Fibrele aranjate aleatoriu seamănă cu structura aripii unei libelule, echilibrate de dungile orizontale și verticale de pe aripi. Venele transversale și longitudinale ale aripii comunică cu membrana aripii (Fig. 1). Sistemul de schelă NFRCS constă din Ct ranforsat ca sistem de schelă cu o rezistență fizică și mecanică mai bună (Figura 1). Datorită prețului accesibil și a măiestriei, chirurgii preferă să utilizeze calibre de fire de bumbac (Ct) în timpul operațiilor și pansamentelor. Prin urmare, având în vedere multiplele sale beneficii, inclusiv > 90% celuloză cristalină (care contribuie la îmbunătățirea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca sistem scheletic al NFRCS9,10. Prin urmare, având în vedere multiplele sale beneficii, inclusiv > 90% celuloză cristalină (care contribuie la îmbunătățirea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca sistem scheletic al NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалличесесклой (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной скелетной сис9CS910 Prin urmare, având în vedere numeroasele sale beneficii, inclusiv celuloză cristalină >90% (implicată în creșterea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca sistem scheletic NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血滴止血滴括，被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Prin urmare, având în vedere numeroasele sale beneficii, inclusiv peste 90% celuloză cristalină (care ajută la îmbunătățirea activității hemostatice), Ct a fost utilizat ca schelă pentru NFRCS9,10.Ct a fost acoperit superficial (s-a observat formarea unei pelicule nano-groase) și interconectat cu o compoziție hemostatică formatoare de peliculă (HFFC). HFFC acționează ca un matrigel, menținând împreună Ct plasat aleatoriu. Designul dezvoltat transmite stresul în cadrul fazei dispersate (fibre de armare). Este dificil să se obțină structuri nanoporoase cu rezistență mecanică bună folosind concentrații minime de polimeri. În plus, nu este ușor să se personalizeze diferite matrițe pentru diferite aplicații biomedicale.
Figura prezintă o diagramă a designului NFRCS bazat pe structura aripii de libelulă (A). Această imagine prezintă o analogie comparativă a structurii aripii unei libelule (venele intersectate și longitudinale ale aripii sunt interconectate) și o microfotografie în secțiune transversală a NFRCS Cp (B). Reprezentare schematică a NFRCS.
NFRC-urile au fost dezvoltate utilizând HFFC ca fază continuă pentru a aborda limitările de mai sus. HFFC este compus din diverși polimeri hemostatici peliculogeni, inclusiv chitosan (ca principal polimer hemostatic) cu metilceluloză (MC), hidroxipropilmetilceluloză (HPMC 50 cp) și alcool polivinilic (PVA) (125 kDa) ca polimer suport care promovează formarea trombilor. Adăugarea de polivinilpirolidină K30 (PVP K30) a îmbunătățit capacitatea de absorbție a umidității a NFRCS. S-a adăugat polietilen glicol 400 (PEG 400) pentru a îmbunătăți reticularea polimerilor în amestecurile de polimeri legați. Trei compoziții hemostatice diferite de HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC și Cp HFFC), și anume chitosan cu MC (Cm), chitosan cu HPMC (Ch) și chitosan cu PVA (Cp), au fost aplicate pe Ct. Diverse studii de caracterizare in vitro și in vivo au confirmat activitatea hemostatică și de vindecare a rănilor a NFRCS. Materialele compozite oferite de NFRCS pot fi utilizate pentru a personaliza diverse forme de schele pentru a satisface nevoi specifice.
În plus, NFRCS-urile pot fi modificate ca bandaj sau rolă pentru a acoperi întreaga zonă afectată a extremităților inferioare și a altor părți ale corpului. În special pentru leziunile membrelor în timpul războiului, designul NFRCS conceput poate fi schimbat la o jumătate de braț sau un picior întreg (Figura suplimentară S11). NFRCS-urile pot fi transformate într-o brățară cu adeziv tisular, care poate fi utilizat pentru a opri sângerarea în cazul leziunilor suicidare severe la încheietura mâinii. Scopul nostru principal este de a dezvolta un NFRCS cu cât mai puțin polimer posibil, care să poată fi livrat unei populații mari (sub pragul sărăciei) și care să poată fi plasat într-o trusă de prim ajutor. Cu un design simplu, eficient și economic, NFRCS aduce beneficii comunităților locale și poate avea un impact global.
Chitosanul (greutate moleculară 80 kDa) și amarantul au fost achiziționate de la Merck, India. Hidroxipropilmetilceluloza 50 Cp, polietilenglicolul 400 și metilceluloza au fost achiziționate de la Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Alcoolul polivinilic (greutate moleculară 125 kDa) (87-90% hidrolizat) a fost achiziționat de la National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidina K30 a fost achiziționată de la Molychem, Mumbai, iar bețișoarele sterile au fost achiziționate de la Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, folosind ca purtător apa Milli Q (sistem de purificare a apei Direct-Q3, Merck, India).
NFRCS a fost dezvoltat folosind o metodă de liofilizare11,12. Toate compozițiile HFFC (Tabelul 1) au fost preparate folosind un agitator mecanic. Preparați o soluție de chitosan 0,5% folosind acid acetic 1% în apă prin agitare continuă la 800 rpm pe un agitator mecanic. Greutatea exactă a polimerului încărcat indicată în Tabelul 1 a fost adăugată la soluția de chitosan și agitată până când s-a obținut o soluție polimerică limpede. PVP K30 și PEG 400 au fost adăugate la amestecul rezultat în cantitățile indicate în Tabelul 1, iar agitarea a fost continuată până când s-a obținut o soluție polimerică vâscoasă limpede. Baia rezultată de soluție polimerică a fost sonicizată timp de 60 de minute pentru a îndepărta bulele de aer prinse din amestecul polimeric. Așa cum se arată în Figura suplimentară S1(b), Ct a fost distribuit uniform în fiecare godeu al unei plăci (matriță) cu 6 godeuri suplimentată cu 5 ml de HFFC.
Placa cu șase godeuri a fost sonicizată timp de 60 de minute pentru a obține o umectare și o distribuție uniformă a HFFC în rețeaua Ct. Apoi, placa cu șase godeuri a fost congelată la -20°C timp de 8-12 ore. Plăcile de congelare au fost liofilizate timp de 48 de ore pentru a obține diverse formulări de NFRCS. Aceeași procedură este utilizată pentru a produce diferite forme și structuri, cum ar fi tampoane sau tampoane cilindrice, sau orice altă formă pentru diferite aplicații.
Chitosanul (80 kDa) (3%) cântărit cu precizie este dizolvat în acid acetic 1% folosind un agitator magnetic. La soluția de chitosan rezultată s-a adăugat PEG 400 1% și s-a agitat timp de 30 de minute. Soluția rezultată se toarnă într-un recipient pătrat sau dreptunghiular și se congelează la -80°C timp de 12 ore. Probele congelate au fost liofilizate timp de 48 de ore pentru a obține Cs13 poros.
Chitosanul NFRCS dezvoltat a fost supus unor experimente utilizând spectroscopia în infraroșu cu transformare Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japonia) pentru a confirma compatibilitatea chimică a chitosanului cu alți polimeri14,15. Spectrele FTIR (lățimea intervalului spectral de la 400 la 4000 cm-1) ale tuturor probelor testate au fost obținute prin efectuarea a 32 de scanări.
Rata de absorbție în sânge (BAR) pentru toate formulările a fost evaluată utilizând metoda descrisă de Chen și colab. 16 cu mici modificări. NFRC-urile dezvoltate din toate compozițiile au fost uscate într-un cuptor cu vid la 105°C peste noapte pentru a îndepărta solventul rezidual. 30 mg de NFRCS (greutatea inițială a probei – W0) și 30 mg de Ct (control pozitiv) au fost plasate în vase separate conținând un premix de citrat de sodiu 3,8%. La intervale de timp predeterminate, adică 5, 10, 20, 30, 40 și 60 de secunde, NFRCS-urile au fost îndepărtate, iar suprafețele lor au fost curățate de sângele neabsorbit prin plasarea probelor pe Ct timp de 30 de secunde. Greutatea finală a sângelui absorbit de NFRCS 16 a fost considerată (W1) la fiecare moment. Calculați procentul de BAR folosind următoarea formulă:
Timpul de coagulare a sângelui (TCS) a fost determinat conform celor raportate de Wang și colab. 17. Timpul necesar pentru coagularea sângelui integral (sânge de șobolan preamestecat cu citrat de sodiu 3,8%) în prezența NFRCS a fost calculat ca TCS al probei de testat. Diversele componente NFRCS (30 mg) au fost plasate în flacoane cu capac filetat de 10 ml și incubate la 37°C. În flacon s-a adăugat sânge (0,5 ml) și s-au adăugat 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M pentru a activa coagularea sângelui. În final, se inversează flaconul la fiecare 15 secunde (până la 180°) până când se formează un cheag ferm. TCS al probei este estimat prin numărul de răsturnări ale flaconilor 17,18. Pe baza TCS, au fost selectate două compoziții optime din NFRCS Cm, Ch și Cp pentru studii suplimentare de caracterizare.
BCT-ul compozițiilor Ch NFRCS și Cp NFRCS a fost determinat prin implementarea metodei descrise de Li și colab. 19. Se plasează 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs (control pozitiv) în plăci Petri separate (37 °C). Sângele conținând 3,8% citrat de sodiu a fost amestecat cu 0,2 M CaCl2 într-un raport de volum de 10:1 pentru a începe procesul de coagulare a sângelui. 20 µl de amestec de sânge de șobolan 0,2 M CaCl2 au fost aplicați pe suprafața probei și plasați într-o placă Petri goală. Controlul a fost sânge turnat în plăci Petri goale, fără Ct. La intervale fixe de 0, 3 și 5 minute, se oprește coagularea prin adăugarea a 10 ml de apă deionizată (DI) la proba care conține placa, fără a deranja cheagul. Eritrocitele necoagulate suferă hemoliză în prezența apei deionizate și eliberează hemoglobină. Hemoglobina la diferite momente de timp (HA(t)) a fost măsurată la 540 nm (λmax hemoglobină) utilizând un spectrofotometru UV-Vis. Absorbția absolută a hemoglobinei (AH(0)) în 0 min a 20 µl de sânge în 10 ml de apă deionizată a fost luată ca standard de referință. Absorbția relativă de hemoglobină (RHA) a sângelui coagulat a fost calculată din raportul HA(t)/HA(0) utilizând același lot de sânge.
Folosind un analizor de textură (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SUA), au fost determinate proprietățile adezive ale NFRC la țesutul deteriorat. Se presează un vas cilindric cu fund deschis pe interiorul pielii de porc (fără stratul de grăsime). Probele (Ch NFRCS și Cp NFRCS) au fost aplicate prin canulă în matrițe cilindrice pentru a crea aderență la pielea porcului. După o incubare de 3 minute la temperatura camerei (RT) (25°C), rezistența adezivului NFRCS a fost înregistrată la o rată constantă de 0,5 mm/sec.
Principala caracteristică a materialelor de etanșare chirurgicale este de a crește coagularea sângelui, reducând în același timp pierderea de sânge. Coagularea fără pierderi în NFRCS a fost evaluată utilizând o metodă publicată anterior, cu mici modificări 19. Realizați un tub de microcentrifugă (2 ml) (diametru interior 10 mm) cu un orificiu de 8 × 5 mm2 pe o parte a tubului de centrifugă (reprezentând o rană deschisă). NFRCS se utilizează pentru a închide deschiderea, iar banda adezivă se utilizează pentru a sigila marginile exterioare. Adăugați 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M în tubul de microcentrifugă care conține premixul de citrat de sodiu 3,8%. După 10 minute, tuburile de microcentrifugă au fost scoase din vase, iar creșterea masei vaselor a fost determinată datorită fluxului de sânge din NFRK (n = 3). Pierderea de sânge în NFRCS cu Ch și NFRCS cu Cp au fost comparate cu Cs.
Integritatea umedă a NFRCS a fost determinată pe baza metodei descrise de Mishra și Chaudhary21 cu modificări minore. Se plasează NFRCS într-un balon Erlenmeyer de 100 ml cu 50 ml de apă și se agită timp de 60 de secunde fără a forma un capac. Inspecție vizuală și prioritizare a probelor pentru integritatea fizică pe baza colectării.
Forța de legare a HFFC la Ct a fost studiată utilizând metode publicate anterior, cu modificări minore. Integritatea acoperirii de suprafață a fost evaluată prin expunerea NFRK la unde acustice (stimul extern) în prezența apei milliQ (Ct). NFRCS Ch, NFRCS și Cp, NFRCS dezvoltate au fost plasate într-un pahar umplut cu apă și sonicate timp de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 și respectiv 30 de minute. După uscare, diferența procentuală dintre greutatea inițială și cea finală a NFRCS a fost utilizată pentru a calcula procentul de pierdere de material (HFFC). BCT in vitro a confirmat în continuare forța de legare sau pierderea materialelor de suprafață. Eficiența legării HFFC la Ct asigură coagularea sângelui și un acoperire elastică pe suprafața Ct22.
Omogenitatea NFRCS dezvoltat a fost determinată prin BCT (Break-To-Control Test) a probelor (30 mg) prelevate din locații generale selectate aleatoriu ale NFRCS. Urmați procedura BCT menționată anterior pentru a determina conformitatea cu NFRCS. Proximitatea dintre toate cele cinci probe asigură o acoperire uniformă a suprafeței și depunerea HFFC în plasa Ct.
Suprafața nominală de contact cu sângele (NBCA) a fost determinată conform celor raportate anterior, cu unele modificări. Coagularea sângelui s-a realizat prin fixarea a 20 µl de sânge între cele două suprafețe Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs. După 1 oră, cele două părți ale stentului au fost separate și s-a măsurat manual suprafața cheagului. Valoarea medie a trei repetiții a fost considerată NBCA NFRCS19.
Analiza sorbției dinamice de vapori (DVS) a fost utilizată pentru a evalua eficacitatea NFRCS de a absorbi apa din mediul extern sau din locul leziunii responsabil pentru inițierea coagulării. DVS evaluează sau înregistrează gravimetric absorbția și pierderea de vapori dintr-o probă, utilizând o balanță ultrasensibilă cu o rezoluție de masă de ±0,1 µg. O presiune parțială de vapori (umiditate relativă) este generată de un regulator electronic de debit masic în jurul probei prin amestecarea gazelor purtătoare saturate și uscate. Conform ghidurilor Farmacopeei Europene, pe baza procentului de absorbție a umidității de către probe, probele au fost clasificate în 4 categorii (0–0,012% g/g− nehigroscopice, 0,2–2% g/g ușor higroscopice, 2–15% moderat higroscopice și > 15% foarte higroscopice)23. Conform ghidurilor Farmacopeei Europene, pe baza procentului de absorbție a umidității de către probe, probele au fost clasificate în 4 categorii (0–0,012% g/g− nehigroscopice, 0,2–2% g/g ușor higroscopice, 2–15% moderat higroscopice și > 15% foarte higroscopice)23.În conformitate cu recomandările Farmacopeei Europene, în funcție de procentul de absorbție a umidității de către probe, acestea au fost împărțite în 4 categorii (0–0,012% g/g – nehigroscopice, 0,2–2% g/g – ușor higroscopice, 2–cincisprezece%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat higroscopic și > 15% foarte higroscopic)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-w非吸湿性、0,2-2% g/g 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分为 （012（ 0. G/g- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% G/g 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23〿）În conformitate cu recomandările Farmacopeei Europene, probele sunt împărțite în 4 clase în funcție de procentul de umiditate absorbit de probă (0-0,012% în greutate – nehigroscopică, 0,2-2% în greutate – ușor higroscopică, 2-15% în greutate).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat higroscopic, > 15% foarte higroscopic) 23.Eficiența higroscopică a NFCS X NFCS și TsN NFCS a fost determinată pe un analizor DVS TA TGA Q5000 SA. În timpul acestui proces, s-au obținut timpul de rulare, umiditatea relativă (RH) și greutatea probei în timp real la 25°C24. Conținutul de umiditate este calculat prin analiza precisă a masei NFRCS folosind următoarea ecuație:
MC este umiditatea NFRCS. m1 – greutatea uscată a AINS. m2 este masa NFRCS în timp real la o anumită umiditate relativă.
Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după golirea probelor la 25 °C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după golirea probelor la 25 °C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азотка помощью опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Suprafața totală a fost estimată utilizând un experiment de adsorbție a azotului cu azot lichid după ce probele au fost golite la 25°C timp de 10 ore (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靡总表。总表。在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцоди бцоди Обцик азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Suprafața totală a fost estimată folosind experimente de adsorbție a azotului cu azot lichid după ce probele au fost golite timp de 10 ore la 25°C (< 7 x 10-3 torr).Suprafața totală, volumul porilor și dimensiunea porilor NFRCS au fost determinate cu un Quantachrome de la NOVA 1000e, Austria, utilizând software-ul RS 232.
Preparați 5% eritrocite (soluție salină ca diluant) din sânge integral. Apoi, transferați o alicotă de HFFC (0,25 ml) pe o placă cu 96 de godeuri și 5% masă de eritrocite (0,1 ml). Incubați amestecul la 37°C timp de 40 de minute. Un amestec de globule roșii și ser a fost considerat control pozitiv, iar un amestec de soluție salină și globule roșii ca control negativ. Hemaglutinarea a fost determinată conform scalei Stajitzky. Scalele propuse sunt următoarele: + + + + agregate granulare dense; + + + plăcuțe cu fund neted, cu margini curbate; + + plăcuțe cu fund neted, cu margini rupte; + inele roșii înguste în jurul marginilor plăcuțelor netede; – (negativ) buton roșu discret 12 în centrul godeului inferior.
Hemocompatibilitatea NFRCS a fost studiată conform metodei Organizației Internaționale de Standardizare (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Metoda gravimetrică descrisă de Singh și colab. au fost făcute modificări minore pentru a evalua formarea trombilor în prezența sau pe suprafața NFRCS. 500 mg de Cs, Ch NFRCS și Cp NFRCS au fost incubate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 24 de ore la 37°C. După 24 de ore, PBS a fost îndepărtat și NFRCS a fost tratat cu 2 ml de sânge conținând 3,8% citrat de sodiu. Pe suprafața NFRCS, se adaugă 0,04 ml de CaCl2 0,1 M la probele incubate. După 45 de minute, se adaugă 5 ml de apă distilată pentru a opri coagularea. Sângele coagulat de pe suprafața NFRC a fost tratat cu soluție de formaldehidă 36-38%. Cheagurile fixate cu formaldehidă au fost uscate și cântărite. Procentul de tromboză a fost estimat prin calcularea greutății paharului fără sânge și probă (control negativ) și a paharului cu sânge (control pozitiv).
Ca o confirmare inițială, probele au fost vizualizate la microscop optic pentru a înțelege capacitatea stratului de acoperire de suprafață HFFC, a interconectării Ct și a rețelei Ct de a forma pori. Secțiunile subțiri de Ch și Cp din NFRCS au fost decupate cu o lamă de bisturiu. Secțiunea rezultată a fost plasată pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamelă, iar marginile au fost fixate cu lipici. Lamelele pregătite au fost vizualizate la microscop optic și au fost făcute fotografii la diferite măriri.
Depunerea de polimeri în rețelele Ct a fost vizualizată utilizând microscopia cu fluorescență bazată pe metoda descrisă de Rice și colab.29. Compoziția HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant), iar NFRCS (Ch și Cp) au fost preparate conform metodei menționate anterior. Compoziția HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant), iar NFRCS (Ch și Cp) au fost preparate conform metodei menționate anterior.Compoziția HFFC utilizată pentru formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (amarant) și s-au obținut NFRCS (Ch și Cp) conform metodei menționate anterior.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNFh Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶法到的斶法CNFh Cp）.Compoziția HFFC utilizată în formulare a fost amestecată cu un colorant fluorescent (Amaranth) și a primit NFRCS (Ch și Cp), așa cum s-a menționat anterior.Secțiuni subțiri de NFRK au fost decupate din probele obținute, plasate pe lame de sticlă și acoperite cu lamele. Lamele preparate au fost observate la microscop fluorescent folosind un filtru verde (310-380 nm). Imaginile au fost realizate la o mărire de 4x pentru a înțelege relațiile Ct și depunerea excesivă de polimer în rețeaua Ct.
Topografia suprafeței structurilor NFRCS Ch și Cp a fost determinată utilizând un microscop cu forță atomică (AFM) cu o consolă TESP ultra-precisă în modul de atingere: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Rugozitatea suprafeței a fost determinată prin metoda medie pătratică (RMS) utilizând un software (Scanning Probe Image Processor). Diverse locații NFRCS au fost redate pe imagini 3D pentru a verifica uniformitatea suprafeței. Abaterea standard a scorului pentru o anumită zonă este definită ca rugozitatea suprafeței. Ecuația RMS a fost utilizată pentru a cuantifica rugozitatea suprafeței structurilor NFRCS31.
Studiile bazate pe FESEM au fost efectuate folosind FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, pentru a înțelege morfologia suprafeței NFRCS cu Ch și NFRCS cu Cp, care au arătat o BCT mai bună decât NFRCS cu Cm. Studiul FESEM a fost efectuat conform metodei descrise de Zhao și colab. 32 cu modificări minore. 20 până la 30 mg de NFRCS cu Ch și NFRCS cu Cp au fost preamestecate cu 20 µl de citrat de sodiu 3,8% preamestecat cu sânge de șobolan. 20 μl de CaCl2 0,2 ​​M au fost adăugați la probele tratate cu sânge pentru a iniția coagularea, iar probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 minute. În plus, excesul de eritrocite a fost îndepărtat de pe suprafața NFRCS prin clătire cu soluție salină.
Probele ulterioare au fost tratate cu glutaraldehidă 0,1% și apoi uscate într-un cuptor cu aer cald la 37°C pentru a îndepărta umezeala. Probele uscate au fost acoperite și analizate32. Alte imagini obținute în timpul analizei au fost formarea cheagurilor pe suprafața fibrelor individuale de bumbac, depunerea de polimer între Ct, morfologia (forma) eritrocitelor, integritatea cheagului și morfologia eritrocitelor în prezența NFRCS. Zonele NFRCS netratate și zonele NFRCS tratate cu Ch și Cp incubate cu sânge au fost scanate pentru ioni elementari (sodiu, potasiu, azot, calciu, magneziu, zinc, cupru și seleniu)33. Comparați procentele de ioni elementari între probele tratate și cele netratate pentru a înțelege acumularea de ioni elementari în timpul formării cheagului și omogenitatea cheagului.
Grosimea stratului de acoperire de suprafață Cp HFFC de pe suprafața Ct a fost determinată utilizând FESEM. Secțiunile transversale ale Cp NFRCS au fost tăiate din cadru și acoperite prin pulverizare catodică. Probele de acoperire prin pulverizare rezultate au fost observate prin FESEM, iar grosimea stratului de acoperire de suprafață a fost măsurată 34, 35, 36.
Micro-CT cu raze X oferă imagistică 3D nedistructivă de înaltă rezoluție și permite studierea aranjamentului structural intern al NFRC. Micro-CT utilizează un fascicul de raze X care trece prin probă pentru a înregistra coeficientul local de atenuare liniară a razelor X din probă, ceea ce ajută la obținerea de informații morfologice. Locația internă a Ct în NFRCS cu Cp și NFRCS cu Cp tratat cu sânge a fost examinată prin micro-CT pentru a înțelege eficiența absorbției și coagularea sângelui în prezența NFRCS37,38,39. Structurile 3D ale probelor NFRCS cu Cp tratate cu sânge și netratate au fost reconstruite folosind micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Germania). Folosind software-ul VG STUDIO-MAX versiunea 2.2, mai multe imagini cu raze X au fost realizate din unghiuri diferite (în mod ideal, acoperire de 360°) pentru a dezvolta imagini 3D pentru NFRCS. Datele de proiecție colectate au fost reconstruite în imagini volumetrice 3D folosind software-ul simplu corespunzător 3D ScanIP Academic.
În plus, pentru a înțelege distribuția cheagului, s-au adăugat în NFRCS 20 µl de sânge citrat premixat și 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M pentru a iniția coagularea sângelui. Probele preparate sunt lăsate să se întărească. Suprafața NFRC a fost tratată cu glutaraldehidă 0,5% și uscată într-un cuptor cu aer cald la 30–40°C timp de 30 de minute. Cheagul de sânge format pe NFRCS a fost scanat, reconstruit și a fost vizualizată o imagine 3D a cheagului de sânge.
Testele antibacteriene au fost efectuate pe Cp NFRCS (cea mai bună comparație cu Ch NFRCS) utilizând metoda descrisă anterior, cu modificări minore. Activitatea antibacteriană a Cp NFRCS și Cp HFFC a fost determinată utilizând trei microorganisme de testare diferite [S.aureus (bacterii gram-pozitive), E.coli (bacterii gram-negative) și Candida albă (C.albicans)] care cresc pe agar în plăci Petri într-un incubator. Se inoculează uniform 50 ml din suspensia diluată de cultură bacteriană la o concentrație de 105-106 UFC ml-1 pe mediul de agar. Se toarnă mediul într-o placă Petri și se lasă să se solidifice. Pe suprafața plăcii de agar s-au format godeuri pentru a fi umplute cu HFFC (3 godeuri pentru HFFC și 1 pentru control negativ). Se adaugă 200 µl de HFFC în 3 godeuri și 200 µl de PBS cu pH 7,4 în al 4-lea godeu. Pe cealaltă parte a vasului Petri, așezați un disc Cp NFRCS de 12 mm pe agarul solidificat și umeziți cu PBS (pH 7,4). Comprimatele de ciprofloxacină, ampicilină și fluconazol sunt considerate standarde de referință pentru Staphylococcus aureus, Escherichia coli și Candida albicans. Măsurați manual zona de inhibiție și realizați o imagine digitală a zonei de inhibiție.
După aprobarea etică instituțională, studiul a fost realizat la Colegiul Medical de Educație și Cercetare Kasturba din Manipal, Karnataka, în sudul Indiei. Protocolul experimental TEG in vitro a fost revizuit și aprobat de Comitetul de Etică Instituțională al Colegiului Medical Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Subiecții au fost recrutați dintre donatorii de sânge voluntari (cu vârste cuprinse între 18 și 55 de ani) de la banca de sânge a spitalului. În plus, a fost obținut un formular de consimțământ informat de la voluntari pentru colectarea probelor de sânge. TEG nativ (N-TEG) ​​a fost utilizat pentru a studia efectul formulării Cp HFFC asupra sângelui integral preamestecat cu citrat de sodiu. N-TEG este recunoscut pe scară largă pentru rolul său în resuscitarea la punctul de îngrijire, ceea ce creează probleme pentru medici din cauza potențialului de întârziere semnificativă clinic a rezultatelor (teste de coagulare de rutină). Analiza N-TEG a fost efectuată folosind sânge integral. Consimțământul informat și istoricul medical detaliat au fost obținute de la toți participanții. Studiul nu a inclus participanți cu complicații hemostatice sau trombotice, cum ar fi sarcină/postpartum sau boli hepatice. Subiecții care au luat medicamente care afectează cascada coagulării au fost, de asemenea, excluși din studiu. Testele de laborator de bază (hemoglobină, timp de protrombină, tromboplastină activată și numărătoarea trombocitelor) au fost efectuate la toți participanții conform procedurilor standard. N-TEG determină vâscoelasticitatea cheagului de sânge, structura inițială a cheagului, interacțiunea particulelor, întărirea cheagului și liza cheagului. Analiza N-TEG oferă date grafice și numerice despre efectele colective ale mai multor elemente celulare și ale plasmei. Analiza N-TEG a fost efectuată pe două volume diferite de Cp HFFC (10 µl și 50 µl). Ca rezultat, s-a adăugat 1 ml de sânge integral cu acid citric la 10 μl de Cp HFFC. Se adaugă 1 ml (Cp HFFC + sânge citrat), 340 µl de sânge mixt, la 20 µl de vas TEG conținând CaCl2 0,2 ​​M. Ulterior, plăcile TEG au fost încărcate în TEG® 5000, US pentru a măsura R, K, unghiul alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY la 30% din probele de sânge în prezența Cp HFFC41.
Protocolul studiului in vivo a fost revizuit și aprobat de Comitetul Instituțional de Etică Animală (IAEC), Școala de Medicină Kasturba, Institutul de Învățământ Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu recomandările Comitetului pentru Controlul și Supravegherea Experimentărilor pe Animale (CPCSEA). Toate studiile NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) au fost efectuate pe șobolani Wistar femele (cu o greutate cuprinsă între 200 și 250 g). Toate animalele au fost aclimatizate la o temperatură de 24-26°C, animalele având acces liber la hrană și apă standard ad libitum. Toate animalele au fost împărțite aleatoriu în grupuri diferite, fiecare grup fiind format din trei animale. Toate studiile au fost efectuate în conformitate cu Studii pe Animale: Raport de Experimente In Vivo 43. Înainte de studiu, animalele au fost anesteziate prin administrare intraperitoneală (ip) a unui amestec de 20-50 mg ketamină (per 1 kg greutate corporală) și 2-10 mg xilazină (per 1 kg greutate corporală). După studiu, volumul de sângerare a fost calculat prin evaluarea diferenței dintre greutatea inițială și cea finală a probelor, valoarea medie obținută din cele trei teste fiind considerată ca volum de sângerare al probei.
Modelul de amputare a cozii de șobolan a fost implementat pentru a înțelege potențialul NFRCS de a modula sângerarea în traume, lupte sau accidente rutiere (modelul leziunilor). Se taie 50% din coadă cu o lamă de bisturiu și se plasează în aer timp de 15 secunde pentru a asigura o sângerare normală. În plus, probele de testare au fost plasate pe coada unui șobolan prin aplicarea de presiune (Ct, Cs, Ch NFRCS și Cp NFRCS). S-au raportat sângerări și PCT pentru probele de testare (n = 3)17,45.
Eficacitatea controlului presiunii prin intermediul NFRCS în luptă a fost investigată pe un model al arterei femurale superficiale. Artera femurală este expusă, puncționată cu un trocar de 24G și sângerată în decurs de 15 secunde. După ce se observă o sângerare necontrolată, proba de testare este plasată la locul puncției sub presiune. Imediat după aplicarea probei de testare, s-a înregistrat timpul de coagulare și s-a observat eficiența hemostatică timp de următoarele 5 minute. Aceeași procedură a fost repetată cu Cs și Ct46.
Dowling și colab.47 au propus un model de leziune hepatică pentru a evalua potențialul hemostatic al materialelor hemostatice în contextul sângerării intraoperatorii. Calculul bazal al leziunii hepatice (BCT) a fost înregistrat pentru probele Ct (control negativ), structura Cs (control pozitiv), probele Ch NFRCS și probele Cp NFRCS. Vena cavă suprahepatică a șobolanului a fost expusă prin efectuarea unei laparotomii mediane. După aceea, partea distală a lobului stâng a fost secționată cu o foarfecă. Se efectuează o incizie în ficat cu o lamă de bisturiu și se lasă sângerare timp de câteva secunde. Probele de testare Ch NFRCS și Cp NFRCS cântărite cu precizie au fost plasate pe suprafața afectată fără nicio presiune pozitivă și s-a înregistrat BCT. Grupul de control (Ct) a aplicat apoi presiune, urmată de Cs 30s47 fără a rupe leziunea.
Testele de vindecare a rănilor in vivo au fost efectuate utilizând un model de plagă excizională pentru a evalua proprietățile de vindecare a rănilor ale NFRCS-urilor pe bază de polimeri dezvoltate. Modelele de plăgi excizionale au fost selectate și efectuate conform metodelor publicate anterior, cu modificări minore19,32,48. Toate animalele au fost anesteziate așa cum s-a descris anterior. S-a utilizat un perforator de biopsie (12 mm) pentru a realiza o incizie circulară profundă în pielea spatelui. Locurile de rană pregătite au fost pansate cu Cs (control pozitiv), Ct (recunoscând că dischetele de bumbac interferează cu vindecarea), Ch NFRCS și Cp NFRCS (grup experimental) și un control negativ, fără niciun tratament. În fiecare zi a studiului, suprafața plăgii a fost măsurată la toți șobolanii. s-a utilizat o cameră digitală pentru a face o fotografie a zonei plăgii și s-a aplicat un pansament nou. Procentul de închidere a plăgii a fost măsurat cu următoarea formulă:
Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea de șobolan din cel mai bun grup a fost excizată ((Cp NFRCS) și grupul de control) și studiată prin colorare H&E și colorare tricrom Masson. Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea de șobolan din cel mai bun grup a fost excizată ((Cp NFRCS) și grupul de control) și studiată prin colorare H&E și colorare tricrom Masson.Pe baza procentului de închidere a plăgii în a 12-a zi a studiului, pielea șobolanilor din cel mai bun grup ((Cp NFRCS) și grupul de control) a fost excizată și examinată prin colorare cu hematoxilină-eozină și tricrom Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Șobolanii din grupul cu cel mai bun rezultat ((Cp NFRCS) și grupurile de control) au fost excizați pentru colorare cu hematoxilină-eozină și colorare cu tricrom Masson, pe baza procentului de închidere a plăgii în ziua 12 a studiului.Procedura de colorare implementată a fost efectuată conform metodelor descrise anterior49,50. Pe scurt, după fixarea în formalină 10%, probele au fost deshidratate folosind o serie de alcooli gradați. Se utilizează un microtom pentru a obține secțiuni subțiri (grosime de 5 µm) din țesutul excizat. Secțiunile seriale subțiri ale controalelor și ale celulelor fibroase nefrogene (NFRC) Cp au fost tratate cu hematoxilină și eozină pentru a studia modificările histopatologice. Colorația tricromă Masson a fost utilizată pentru a detecta formarea fibrilelor de colagen. Rezultatele obținute au fost studiate orb de către patologi.
Stabilitatea probelor Cp NFRCS a fost studiată la temperatura camerei (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) timp de 12 luni51. Cp NFRCS (decolorarea suprafeței și creșterea microbiană) a fost inspectată vizual și testată pentru rezistența la uzură prin pliere și BCT conform metodelor de mai sus, descrise în secțiunea Materiale și metode.
Scalabilitatea și reproductibilitatea Cp NFRCS au fost examinate prin prepararea de Cp NFRCS cu o dimensiune de 15×15 cm2. În plus, probe de 30 mg (n = 5) au fost excizate din diferite fracții Cp NFRCS, iar BCT-ul probelor studiate a fost evaluat așa cum s-a descris anterior în secțiunea Metode.
Am încercat să dezvoltăm diverse forme și structuri folosind compoziții Cp NFRCS pentru diverse aplicații biomedicale. Astfel de forme sau configurații includ bețișoare conice pentru sângerări nazale, proceduri stomatologice și bețișoare cilindrice pentru sângerări vaginale.
Toate seturile de date sunt exprimate ca medie ± deviație standard și au fost analizate prin ANOVA utilizând Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, SUA), urmat de testul de comparații multiple Bonferroni (*p<0,05).
Toate procedurile efectuate în studiile pe oameni au fost în conformitate cu standardele Institutului și ale Consiliului Național de Cercetare, precum și cu Declarația de la Helsinki din 1964 și modificările ulterioare ale acesteia, sau cu standarde etice similare. Toți participanții au fost informați despre caracteristicile studiului și natura sa voluntară. Datele participanților rămân confidențiale odată colectate. Protocolul experimental TEG in vitro a fost revizuit și aprobat de Comitetul de Etică Instituțională al Colegiului Medical Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Voluntarii au semnat consimțământul informat pentru colectarea probelor de sânge.
Toate procedurile efectuate în studiile pe animale au fost realizate în conformitate cu Facultatea de Medicină Kastuba, Institutul de Învățământ Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toate experimentele pe animale concepute au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru Controlul și Supravegherea Experimentărilor pe Animale (CPCSEA). Toți autorii respectă liniile directoare ARRIVE.
Spectrele FTIR ale tuturor NFRCS au fost analizate și comparate cu spectrul chitosanului prezentat în Figura 2A. Vârfurile spectrale caracteristice ale chitosanului (înregistrate) la 3437 cm-1 (întindere OH și NH, suprapunere), 2945 și 2897 cm-1 (întindere CH), 1660 cm-1 (tensiune NH2), 1589 cm-1 (îndoire N–H), 1157 cm-1 (întindere punte O-), 1067 cm-1 (întindere C–O, hidroxil secundar), 993 cm-1 (întindere CO, Bo-OH) 52, 53, 54. Tabelul suplimentar S1 prezintă valorile spectrului de absorbție FTIR NFRCS pentru chitosan (reporter), chitosan pur, Cm, Ch și Cp. Spectrele FTIR ale tuturor NFRCS (Cm, Ch și Cp) au prezentat aceleași benzi de absorbție caracteristice ca și chitosanul pur, fără modificări semnificative (Fig. 2A). Rezultatele FTIR au confirmat absența interacțiunilor chimice sau fizice între polimerii utilizați pentru a dezvolta NFRCS, indicând faptul că polimerii utilizați sunt inerți.
Caracterizarea in vitro a Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS și Cs. (A) reprezintă spectrele FTIR combinate ale compozițiilor de chitosan și Cm NFRCS, Ch NFRCS și Cp NFRCS sub compresie. (B) a) Rata de absorbție în sângele integral a Cm, Ch, Cp și Cg NFRCS (n = 3); Probele Ct au prezentat o BAR mai mare deoarece bețișorul de bumbac are o eficiență de absorbție mai mare; b) Sânge după absorbția în sânge. Ilustrarea probei absorbite. Reprezentare grafică a BCT a probei de testat C (Cp NFRCS a avut cel mai bun BCT (15 s, n = 3)). Datele din C, D, E și G au fost prezentate ca medie ± SD, iar barele de eroare reprezintă SD, ***p < 0,0001. Datele din C, D, E și G au fost prezentate ca medie ± SD, iar barele de eroare reprezintă SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей прешностей отклонение, ***p <0,0001. Datele din C, D, E și G sunt prezentate ca medie ± deviație standard, iar barele de eroare reprezintă deviația standard, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештностедестностей стандартное отклонение, ***p <0,0001. Datele din C, D, E și G sunt prezentate ca medie ± deviație standard, barele de eroare reprezintă deviația standard, ***p < 0,0001.