Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Niekontrolowane krwawienie jest jedną z głównych przyczyn zgonów. Osiągnięcie szybkiej hemostazy zapewnia przeżycie poszkodowanego, jako pierwszej pomocy podczas walki, wypadków drogowych i operacji redukcji zgonów. Nanoporowate rusztowanie kompozytowe wzmocnione włóknami (NFRCS), pochodzące z prostej hemostatycznej kompozycji filmotwórczej (HFFC), jako faza ciągła, może wywołać i wzmocnić hemostazę. Rozwój NFRCS opiera się na konstrukcji skrzydła ważki. Struktura skrzydła ważki składa się z poprzecznych i podłużnych skrzydeł, a błony skrzydeł są połączone ze sobą, aby zachować integralność mikrostruktury. HFFC równomiernie pokrywa powierzchnię włókna warstwą o grubości nanometrów i łączy losowo rozłożoną grubość bawełny (Ct) (faza rozproszona), tworząc strukturę nanoporowatą. Połączenie fazy ciągłej i rozproszonej obniża koszt produktu dziesięciokrotnie w porównaniu z produktami dostępnymi na rynku. Zmodyfikowane NFRCS (tampony lub opaski na nadgarstek) mogą być stosowane w wielu zastosowaniach biomedycznych. Badania in vivo wykazały, że opracowany Cp NFRCS stymuluje i wzmacnia proces krzepnięcia w miejscu aplikacji. NFRCS może modulować mikrośrodowisko i działać na poziomie komórkowym dzięki swojej nanoporowatej strukturze, co skutkuje lepszym gojeniem się rany w modelu rany wyciętej.
Niekontrolowane krwawienie podczas walki, w trakcie operacji i w nagłych wypadkach może stanowić poważne zagrożenie dla życia rannych1. Stany te dodatkowo prowadzą do ogólnego wzrostu obwodowego oporu naczyniowego, co prowadzi do wstrząsu krwotocznego. Odpowiednie środki kontroli krwawienia w trakcie i po operacji są uważane za potencjalnie zagrażające życiu2,3. Uszkodzenie dużych naczyń prowadzi do masywnej utraty krwi, co skutkuje śmiertelnością ≤ 50% w walce i 31% w trakcie operacji1. Masywna utrata krwi prowadzi do zmniejszenia objętości ciała, co zmniejsza rzut serca. Wzrost całkowitego obwodowego oporu naczyniowego i postępujące upośledzenie mikrokrążenia prowadzą do niedotlenienia narządów podtrzymujących życie. Wstrząs krwotoczny może wystąpić, jeśli stan ten utrzymuje się bez skutecznej interwencji1,4,5. Inne powikłania obejmują postępującą hipotermię i kwasicę metaboliczną, a także zaburzenia krzepnięcia, które utrudniają proces krzepnięcia. Ciężki wstrząs krwotoczny wiąże się z wyższym ryzykiem zgonu6,7,8. W przypadku wstrząsu III stopnia (postępującego) transfuzja krwi jest niezbędna dla przeżycia pacjenta w okresie śródoperacyjnym i pooperacyjnym, zarówno w kontekście powikłań, jak i zgonów. Aby zaradzić wszystkim powyższym sytuacjom zagrażającym życiu, opracowaliśmy nanoporowate rusztowanie kompozytowe wzmocnione włóknami (NFRCS), które wykorzystuje minimalne stężenie polimeru (0,5%), wykorzystując połączenie rozpuszczalnych w wodzie polimerów hemostatycznych.
Dzięki zastosowaniu wzmocnienia włóknem możliwe jest opracowywanie ekonomicznych produktów. Losowo ułożone włókna przypominają strukturę skrzydła ważki, równoważoną poziomymi i pionowymi paskami na skrzydłach. Poprzeczne i podłużne żyłki skrzydła komunikują się z błoną pławną (rys. 1). NFRCS składa się ze wzmocnionego Ct jako systemu rusztowania o lepszej wytrzymałości fizycznej i mechanicznej (rys. 1). Ze względu na przystępną cenę i wysoką jakość wykonania, chirurdzy preferują stosowanie nici bawełnianych (Ct) podczas operacji i opatrunków. Dlatego też, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym zawartość > 90% celulozy krystalicznej (poprawiającej działanie hemostatyczne), Ct został wykorzystany jako układ szkieletowy NFRCS9,10. Dlatego też, biorąc pod uwagę jego liczne korzyści, w tym zawartość > 90% celulozy krystalicznej (poprawiającej działanie hemostatyczne), Ct został wykorzystany jako układ szkieletowy NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. W związku z tym, biorąc pod uwagę liczne korzyści, w tym zawartość celulozy krystalicznej >90% (zaangażowanej w zwiększoną aktywność hemostatyczną), Ct został wykorzystany jako szkielet NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%W związku z tym, biorąc pod uwagę liczne korzyści, w tym zawartość ponad 90% celulozy krystalicznej (pomagającej zwiększyć aktywność hemostatyczną), Ct zastosowano jako rusztowanie dla NFRCS9,10.Ct został pokryty powierzchniowo (obserwowano tworzenie nano-grubej warstwy) i połączony z hemostatyczną kompozycją filmotwórczą (HFFC). HFFC działa jak matrigel, utrzymując losowo rozmieszczone Ct razem. Opracowana konstrukcja przenosi naprężenia w fazie rozproszonej (włóknach wzmacniających). Trudno jest uzyskać struktury nanoporowate o dobrej wytrzymałości mechanicznej przy użyciu minimalnych stężeń polimerów. Ponadto, dostosowanie różnych form do różnych zastosowań biomedycznych nie jest łatwe.
Rysunek przedstawia schemat konstrukcji NFRCS opartej na strukturze skrzydła ważki (A). Na tym zdjęciu przedstawiono porównawczą analogię struktury skrzydła ważki (żyłki przecinające się i podłużne są ze sobą połączone) oraz mikrofotografię przekroju poprzecznego Cp NFRCS (B). Schematyczna reprezentacja NFRCS.
NFRC opracowano przy użyciu HFFC jako fazy ciągłej, aby rozwiązać powyższe ograniczenia. HFFC składa się z różnych tworzących film polimerów hemostatycznych, w tym chitozanu (jako głównego polimeru hemostatycznego) z metylocelulozą (MC), hydroksypropylometylocelulozą (HPMC 50 cp) i alkoholem poliwinylowym (PVA)) (125 kDa) jako polimerem nośnym, który promuje tworzenie skrzepu. Dodanie poliwinylopirolidyny K30 (PVP K30) poprawiło zdolność NFRCS do absorpcji wilgoci. Glikol polietylenowy 400 (PEG 400) dodano w celu poprawy sieciowania polimeru w wiązanych mieszankach polimerowych. Do Ct zastosowano trzy różne kompozycje hemostatyczne HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), mianowicie chitozan z MC (Cm), chitozan z HPMC (Ch) i chitozan z PVA (Cp). Liczne badania in vitro i in vivo potwierdziły hemostatyczne i gojące działanie NFRCS. Materiały kompozytowe oferowane przez NFRCS mogą być wykorzystywane do dostosowywania różnych rodzajów rusztowań do specyficznych potrzeb.
Ponadto NFRCS można modyfikować jako bandaż lub rolkę, aby pokryć cały obszar urazu kończyn dolnych i innych części ciała. Specjalnie dla urazów kończyn bojowych, zaprojektowany projekt NFRCS można zmodyfikować na połowę ramienia lub całą nogę (Rysunek uzupełniający S11). NFRCS można przekształcić w opaskę na nadgarstek z klejem tkankowym, która może być używana do tamowania krwawienia w przypadku poważnych urazów nadgarstka o charakterze samobójczym. Naszym głównym celem jest opracowanie NFRCS z jak najmniejszą ilością polimerów, który będzie mógł być dostarczany dużej populacji (poniżej granicy ubóstwa) i który będzie można umieścić w apteczce pierwszej pomocy. Prosty, wydajny i ekonomiczny w konstrukcji, NFRCS przynosi korzyści lokalnym społecznościom i może mieć globalny wpływ.
Chitozan (masa cząsteczkowa 80 kDa) i amarantus zakupiono w firmie Merck w Indiach. Hydroksypropylometylocelulozę 50 Cp, glikol polietylenowy 400 i metylocelulozę zakupiono w firmie Loba Chemie Pvt. LLC w Mumbaju. Alkohol poliwinylowy (masa cząsteczkowa 125 kDa) (zhydrolizowany w 87-90%) zakupiono w firmie National Chemicals w Gudżaracie. Poliwinylopirolidynę K30 zakupiono w firmie Molychem w Mumbaju, a sterylne waciki zakupiono w firmie Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd. w Tamil Nadu, a nośnikiem była woda Milli Q (system oczyszczania wody Direct-Q3 firmy Merck w Indiach).
Metoda NFRCS została opracowana z wykorzystaniem metody liofilizacji11,12. Wszystkie kompozycje HFFC (Tabela 1) przygotowano za pomocą mieszadła mechanicznego. Przygotować 0,5% roztwór chitozanu, używając 1% kwasu octowego w wodzie, mieszając ciągle z prędkością 800 obr./min na mieszadle mechanicznym. Do roztworu chitozanu dodano dokładną masę załadowanego polimeru, wskazaną w Tabeli 1, i mieszano do uzyskania klarownego roztworu polimeru. Do powstałej mieszaniny dodano PVP K30 i PEG 400 w ilościach wskazanych w Tabeli 1, a następnie kontynuowano mieszanie do uzyskania klarownego, lepkiego roztworu polimeru. Powstałą kąpiel polimerową poddano działaniu ultradźwięków przez 60 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza z mieszaniny polimerów. Jak pokazano na Rysunku uzupełniającym S1(b), Ct było równomiernie rozłożone w każdym dołku płytki 6-dołkowej (formy) uzupełnionej 5 ml HFFC.
Płytkę sześciodołkową poddano działaniu ultradźwięków przez 60 minut, aby uzyskać równomierne zwilżenie i rozprowadzenie HFFC w sieci Ct. Następnie płytkę sześciodołkową zamrożono w temperaturze -20°C na 8–12 godzin. Płytki zamrożone liofilizowano przez 48 godzin, aby uzyskać różne formulacje NFRCS. Tę samą procedurę stosuje się do produkcji różnych kształtów i struktur, takich jak tampony, tampony cylindryczne, lub dowolnych innych kształtów do różnych zastosowań.
Dokładnie odważony chitozan (80 kDa) (3%) rozpuszcza się w 1% kwasie octowym za pomocą mieszadła magnetycznego. Do powstałego roztworu chitozanu dodaje się 1% PEG 400 i miesza przez 30 minut. Powstały roztwór przelewa się do kwadratowego lub prostokątnego pojemnika i zamraża w temperaturze -80°C przez 12 godzin. Zamrożone próbki liofilizowano przez 48 godzin w celu uzyskania porowatego Cs13.
Opracowany NFRCS poddano eksperymentom z wykorzystaniem spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonia) w celu potwierdzenia zgodności chemicznej chitozanu z innymi polimerami14,15. Widma FTIR (szerokość zakresu widmowego od 400 do 4000 cm-1) wszystkich badanych próbek uzyskano, wykonując 32 skany.
Szybkość wchłaniania krwi (BAR) dla wszystkich formulacji oceniano metodą opisaną przez Chen i in. 16 z niewielkimi modyfikacjami. Opracowane NFRK wszystkich kompozycji suszono w piecu próżniowym w temperaturze 105°C przez noc w celu usunięcia resztkowego rozpuszczalnika. 30 mg NFRCS (początkowa masa próbki – W0) i 30 mg Ct (kontrola pozytywna) umieszczono w oddzielnych naczyniach zawierających premiks 3,8% cytrynianu sodu. W ustalonych odstępach czasu, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekund, NFRCS usuwano, a ich powierzchnie oczyszczano z niewchłoniętej krwi, umieszczając próbki na Ct na 30 sekund. W każdym punkcie czasowym uwzględniono ostateczną masę krwi wchłoniętej przez NFRCS 16 (W1). Oblicz procent BAR, korzystając z następującego wzoru:
Czas krzepnięcia krwi (BCT) został określony zgodnie z doniesieniami Wang i in. 17 . Czas potrzebny do krzepnięcia pełnej krwi (krew szczura wstępnie zmieszana z 3,8% cytrynianem sodu) w obecności NFRCS został obliczony jako BCT próbki badanej. Różne składniki NFRCS (30 mg) umieszczono w 10 ml fiolkach z zakrętką i inkubowano w temperaturze 37°C. Do fiolki dodano krew (0,5 ml) i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 w celu aktywacji krzepnięcia krwi. Na koniec odwracano fiolkę co 15 sekund (do 180°), aż do utworzenia stałego skrzepu. BCT próbki oszacowano na podstawie liczby obróceń fiolek17,18. Na podstawie BCT wybrano dwa optymalne składy z NFRCS Cm, Ch i Cp do dalszych badań charakteryzacyjnych.
BCT kompozycji Ch NFRCS i Cp NFRCS określono, stosując metodę opisaną przez Li i in. 19. Umieść 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (kontrola pozytywna) w oddzielnych szalkach Petriego (37 °C). Krew zawierającą 3,8% cytrynianu sodu zmieszano z 0,2 M CaCl2 w stosunku objętościowym 10:1, aby rozpocząć proces krzepnięcia krwi. 20 µl mieszanki krwi szczura 0,2 M CaCl2 naniesiono na powierzchnię próbki i umieszczono w pustej szalce Petriego. Kontrolę stanowiła krew wylana do pustych szalek Petriego bez Ct. W stałych odstępach 0, 3 i 5 minut zatrzymaj krzepnięcie, dodając 10 ml dejonizowanej (DI) wody do próbki zawierającej szalkę, bez naruszania skrzepu. Niezakrzepnięte erytrocyty (erytrocyty) ulegają hemolizie w obecności dejonizowanej wody i uwalniają hemoglobinę. Hemoglobinę w różnych punktach czasowych (HA(t)) mierzono przy długości fali 540 nm (λmax hemoglobiny) za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Jako standard odniesienia przyjęto absorpcję absolutną hemoglobiny (AH(0)) w 20 µl krwi w 10 ml wody dejonizowanej w ciągu 0 min. Względny wychwyt hemoglobiny (RHA) przez skoagulowaną krew obliczono na podstawie stosunku HA(t)/HA(0) dla tej samej partii krwi.
Za pomocą analizatora tekstury (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) określono właściwości adhezyjne NFRK do uszkodzonej tkanki. Dociśnij cylindryczne naczynie z otwartym dnem do wewnętrznej strony skóry wieprzowej (bez warstwy tłuszczu). Próbki (Ch NFRCS i Cp NFRCS) naniesiono kaniulą do cylindrycznych form, aby uzyskać przyczepność do skóry wieprza. Po 3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej (25°C) siłę adhezji NFRCS rejestrowano ze stałą szybkością 0,5 mm/s.
Główną cechą uszczelniaczy chirurgicznych jest zwiększenie krzepnięcia krwi przy jednoczesnym zmniejszeniu jej utraty. Bezstratne krzepnięcie w NFRCS oceniano przy użyciu wcześniej opublikowanej metody z niewielkimi modyfikacjami 19 . Przygotuj probówkę do mikrowirówki (2 ml) (średnica wewnętrzna 10 mm) z otworem 8 × 5 mm2 po jednej stronie probówki do mikrowirówki (reprezentującej otwartą ranę). NFRCS służy do zamknięcia otworu, a taśma jest używana do uszczelnienia zewnętrznych krawędzi. Dodaj 20 µl 0,2 M CaCl2 do probówki do mikrowirówki zawierającej 3,8% premiks cytrynianu sodu. Po 10 minutach probówki do mikrowirówki wyjęto z naczyń i określono wzrost masy naczyń spowodowany wypływem krwi z NFRK (n = 3). Utrata krwi Ch NFRCS i Cp NFRCS zostały porównane z Cs.
Integralność NFRCS w stanie mokrym określono metodą opisaną przez Mishrę i Chaudhary'ego21 z niewielkimi modyfikacjami. Umieścić NFRCS w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml z 50 ml wody i mieszać przez 60 s, nie unosząc jej. Kontrola wizualna i priorytetyzacja próbek pod kątem integralności fizycznej na podstawie pobranej próbki.
Siłę wiązania HFFC z Ct badano przy użyciu wcześniej opublikowanych metod z niewielkimi modyfikacjami. Integralność powłoki powierzchniowej oceniano poprzez ekspozycję NFRK na fale akustyczne (bodziec zewnętrzny) w obecności wody milliQ (Ct). Opracowane NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono w zlewce wypełnionej wodą i poddano działaniu ultradźwięków odpowiednio przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minut. Po wysuszeniu, różnica procentowa między początkową a końcową masą NFRCS została wykorzystana do obliczenia procentowej utraty materiału (HFFC). Badania in vitro BCT dodatkowo potwierdziły siłę wiązania lub utratę materiałów powierzchniowych. Skuteczność wiązania HFFC z Ct zapewnia krzepnięcie krwi i elastyczną powłokę na powierzchni Ct22.
Jednorodność opracowanego NFRCS określono metodą BCT próbek (30 mg) pobranych z losowo wybranych, ogólnych miejsc NFRCS. Aby określić zgodność z NFRCS, należy postępować zgodnie z wcześniej opisaną procedurą BCT. Bliskość wszystkich pięciu próbek zapewnia równomierne pokrycie powierzchni i osadzanie HFFC w siatce Ct.
Nominalną powierzchnię kontaktu z krwią (NBCA) określono zgodnie z wcześniejszymi opisami, z pewnymi modyfikacjami. Koagulację krwi przeprowadzono poprzez zaciśnięcie 20 µl krwi pomiędzy dwiema powierzchniami Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. Po 1 godzinie rozdzielono dwie części stentu i ręcznie zmierzono powierzchnię skrzepu. Za średnią wartość z trzech powtórzeń przyjęto NBCA NFRCS19.
Do oceny skuteczności NFRCS w absorpcji wody ze środowiska zewnętrznego lub z miejsca urazu, odpowiedzialnego za inicjację krzepnięcia, wykorzystano analizę dynamicznej sorpcji pary wodnej (DVS). DVS ocenia lub rejestruje absorpcję i utratę pary wodnej w próbce metodą grawimetryczną, wykorzystując ultraczułą wagę o rozdzielczości masowej ±0,1 µg. Elektroniczny regulator przepływu masy generuje cząstkowe ciśnienie pary wodnej (wilgotność względną) wokół próbki poprzez mieszanie nasyconych i suchych gazów nośnych. Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Farmakopei próbki podzielono na 4 kategorie na podstawie procentowego pochłonięcia wilgoci przez próbki (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w – lekko higroskopijne, 2–15% – umiarkowanie higroskopijne i > 15% – bardzo higroskopijne)23. Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Farmakopei próbki podzielono na 4 kategorie na podstawie procentowego pochłonięcia wilgoci przez próbki (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w – lekko higroskopijne, 2–15% – umiarkowanie higroskopijne i > 15% – bardzo higroskopijne)23.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej, w zależności od stopnia absorpcji wilgoci przez próbki, podzielono je na 4 kategorie (0–0,012% w/w – niehigroskopijne, 0,2–2% w/w słabo higroskopijne, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % umiarkowanie higroskopijne i > 15% bardzo higroskopijne)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性, 0,2-2% w/w 轻微吸湿性, 2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （(0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 非常吸湿）23.Zgodnie z zaleceniami Farmakopei Europejskiej próbki dzieli się na 4 klasy w zależności od zawartości wilgoci wchłoniętej przez próbkę (0-0,012% wag. – niehigroskopijne, 0,2-2% wag. – słabo higroskopijne, 2-15% wag.).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % umiarkowanie higroskopijny, > 15% bardzo higroskopijny) 23.Wydajność higroskopijną NFCS X NFCS i TsN NFCS określono za pomocą analizatora DVS TA TGA Q5000 SA. Podczas tego procesu zmierzono czas pracy, wilgotność względną (RH) oraz masę próbki w czasie rzeczywistym w temperaturze 25°C. Zawartość wilgoci oblicza się za pomocą dokładnej analizy masy NFRCS, stosując następujące równanie:
MC to wilgotność NFRCS. m1 – sucha masa NLPZ. m2 to masa NFRCS w czasie rzeczywistym przy danej wilgotności względnej.
Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z użyciem ciekłego azotu po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 °C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z użyciem ciekłego azotu po opróżnieniu próbek w temperaturze 25 °C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Całkowitą powierzchnię oszacowano przy użyciu eksperymentu adsorpcji azotu z użyciem ciekłego azotu po opróżnieniu próbek w temperaturze 25°C przez 10 h (< 7 × 10–3 Torr).Temperatura 25°C w temperaturze 10°C (< 7 × 10-3 Torr) w temperaturze pokojowej.Temperatura 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 torp). Całkowitą powierzchnię oszacowano, stosując eksperymenty adsorpcji azotu z użyciem ciekłego azotu po opróżnieniu próbek na 10 godzin w temperaturze 25°C (< 7 x 10-3 torr).Całkowitą powierzchnię, objętość porów i rozmiar porów NFRCS wyznaczono za pomocą urządzenia Quantachrome firmy NOVA 1000e (Austria) przy użyciu oprogramowania RS 232.
Przygotuj 5% RBCs (sól fizjologiczna jako rozcieńczalnik) z krwi pełnej. Następnie przenieś alikwot HFFC (0,25 ml) na płytkę 96-dołkową i 5% masy RBCs (0,1 ml). Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 40 minut. Mieszaninę czerwonych krwinek i surowicy uznano za kontrolę dodatnią, a mieszaninę soli fizjologicznej i czerwonych krwinek za kontrolę ujemną. Hemaglutynację określono zgodnie ze skalą Stajitzky'ego. Proponowane skale są następujące: + + + + gęste agregaty ziarniste; + + + gładkie dolne podkładki z zakrzywionymi krawędziami; + + gładkie dolne podkładki z poszarpanymi krawędziami; + wąskie czerwone pierścienie wokół krawędzi gładkich podkładek; – (ujemny) dyskretny czerwony przycisk 12 w środku dolnego dołka.
Hemokompatybilność NFRCS badano zgodnie z metodą Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Metodę grawimetryczną opisali Singh i in. Wprowadzono drobne modyfikacje w celu oceny tworzenia się skrzepu w obecności lub na powierzchni NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS inkubowano w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po 24 godzinach usunięto PBS, a NFRCS potraktowano 2 ml krwi zawierającej 3,8% cytrynianu sodu. Na powierzchnię NFRCS dodano 0,04 ml 0,1 M CaCl2 do inkubowanych próbek. Po 45 minutach dodano 5 ml wody destylowanej w celu zatrzymania krzepnięcia. Skrzepniętą krew na powierzchni NFRK potraktowano 36-38% roztworem formaldehydu. Skrzepy utrwalone formaldehydem wysuszono i zważono. Stopień zakrzepicy oszacowano, obliczając masę szkła bez krwi i próbki (kontrola ujemna) oraz szkła z krwią (kontrola dodatnia).
W celu wstępnego potwierdzenia, próbki zwizualizowano pod mikroskopem optycznym, aby zrozumieć zdolność powłoki powierzchniowej HFFC, połączonych ze sobą jonów Ct i sieci Ct do tworzenia porów. Cienkie skrawki Ch i Cp z NFRCS przycięto ostrzem skalpela. Otrzymany skrawek umieszczono na szkiełku podstawowym, przykryto szkiełkiem nakrywkowym, a krawędzie utrwalono klejem. Przygotowane preparaty obejrzano pod mikroskopem optycznym i wykonano zdjęcia w różnych powiększeniach.
Depozyt polimerów w sieciach Ct uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, bazując na metodzie opisanej przez Rice'a i in.29. Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) przygotowano zgodnie z metodą opisaną wcześniej. Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) przygotowano zgodnie z metodą opisaną wcześniej.Kompozycję HFFC użytą do formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarantem), a NFRCS (Ch i Cp) uzyskano zgodnie z wcześniej opisaną metodą.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料(苋菜)混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Kompozycję HFFC użytą w formulacji zmieszano z barwnikiem fluorescencyjnym (amarant) i otrzymano NFRCS (Ch i Cp), jak wspomniano wcześniej.Z pobranych próbek wycięto cienkie skrawki NFRK, umieszczono je na szkiełkach podstawowych i przykryto szkiełkami nakrywkowymi. Przygotowane preparaty obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym z użyciem zielonego filtra (310–380 nm). Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 4x, aby zrozumieć zależności Ct i nadmierne osadzanie się polimerów w sieci Ct.
Topografię powierzchni NFRCS Ch i Cp określono za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) z ultraostrym wspornikiem TESP w trybie gwintowania: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajwan. Chropowatość powierzchni określono metodą średniej kwadratowej (RMS) za pomocą oprogramowania (Scanning Probe Image Processor). Różne lokalizacje NFRCS wyrenderowano na obrazach 3D w celu sprawdzenia jednorodności powierzchni. Odchylenie standardowe wyniku dla danego obszaru zdefiniowano jako chropowatość powierzchni. Do ilościowego określenia chropowatości powierzchni NFRCS31 wykorzystano równanie RMS.
Badania oparte na FESEM przeprowadzono przy użyciu FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, w celu zrozumienia morfologii powierzchni Ch NFRCS i Cp NFRCS, które wykazały lepszą BCT niż Cm NFRCS. Badanie FESEM przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną przez Zhao i in. 32 z niewielkimi modyfikacjami. NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS wstępnie zmieszano z 20 µl 3,8% cytrynianu sodu wstępnie zmieszanego z krwią szczura. Do próbek poddanych obróbce krwi dodano 20 µl 0,2 M CaCl2 w celu zainicjowania krzepnięcia, a próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ponadto nadmiar erytrocytów usunięto z powierzchni NFRCS poprzez przepłukanie solą fizjologiczną.
Kolejne próbki traktowano 0,1% glutaraldehydem, a następnie suszono w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 37°C w celu usunięcia wilgoci. Wysuszone próbki powlekano i analizowano32. Inne obrazy uzyskane podczas analizy to tworzenie się skrzepu na powierzchni poszczególnych włókien bawełny, osadzanie polimeru pomiędzy Ct, morfologia erytrocytów (kształt), integralność skrzepu i morfologia erytrocytów w obecności NFRCS. Nietraktowane obszary NFRCS oraz obszary NFRCS traktowane Ch i Cp inkubowane z krwią skanowano pod kątem jonów pierwiastkowych (sodu, potasu, azotu, wapnia, magnezu, cynku, miedzi i selenu)33. Porównaj procentowe zawartości jonów pierwiastkowych między próbkami traktowanymi i nietraktowanymi, aby zrozumieć akumulację jonów pierwiastkowych podczas tworzenia skrzepu i jego jednorodność.
Grubość powłoki powierzchniowej Cp HFFC na powierzchni Ct określono za pomocą mikroskopu elektronowego FESEM. Przekroje poprzeczne Cp NFRCS wycięto z ramy i naniesiono powłokę natryskową. Otrzymane próbki powłoki natryskowej obserwowano za pomocą mikroskopu elektronowego FESEM, a grubość powłoki powierzchniowej zmierzono 34, 35, 36.
Mikrotomografia rentgenowska (TK) zapewnia nieniszczące obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości i umożliwia badanie wewnętrznego układu strukturalnego NFRK. Mikrotomografia rentgenowska (TK) wykorzystuje wiązkę promieni rentgenowskich przechodzącą przez próbkę w celu zarejestrowania lokalnego liniowego współczynnika tłumienia promieni rentgenowskich w próbce, co pomaga uzyskać informacje morfologiczne. Wewnętrzna lokalizacja Ct w Cp NFRCS i Cp NFRCS poddanym działaniu krwi została zbadana za pomocą mikrotomografii komputerowej (TK), aby zrozumieć wydajność absorpcji i krzepnięcie krwi w obecności NFRCS37,38,39. Struktury 3D próbek Cp NFRCS poddanych działaniu krwi i niepoddanych działaniu krwi zostały zrekonstruowane za pomocą mikrotomografii komputerowej (V|tome|x S240, Phoenix, Niemcy). Za pomocą oprogramowania VG STUDIO-MAX w wersji 2.2 wykonano kilka zdjęć rentgenowskich pod różnymi kątami (najlepiej w zakresie 360°), aby opracować obrazy 3D dla NFRCS. Zebrane dane projekcyjne zrekonstruowano w postaci obrazów wolumetrycznych 3D przy użyciu prostego oprogramowania 3D ScanIP Academic.
Dodatkowo, aby zrozumieć rozkład skrzepu, do NFRCS dodano 20 µl wstępnie zmieszanej krwi cytrynianowej i 20 µl 0,2 M CaCl2, aby zainicjować krzepnięcie krwi. Przygotowane próbki pozostawiono do stwardnienia. Powierzchnię NFRK potraktowano 0,5% glutaraldehydem i wysuszono w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 30–40°C przez 30 minut. Skrzep krwi utworzony na NFRCS zeskanowano, zrekonstruowano i uzyskano jego obraz 3D.
Testy przeciwbakteryjne przeprowadzono na Cp NFRCS (najlepiej w porównaniu z Ch NFRCS) przy użyciu wcześniej opisanej metody z niewielkimi modyfikacjami. Aktywność przeciwbakteryjną Cp NFRCS i Cp HFFC określono przy użyciu trzech różnych mikroorganizmów testowych [S. aureus (bakterie Gram-dodatnie), E. coli (bakterie Gram-ujemne) i białe Candida (C. albicans)] rosnących na agarze w szalkach Petriego w inkubatorze. Jednorodnie zaszczepić 50 ml rozcieńczonej zawiesiny hodowli bakteryjnej o stężeniu 105-106 CFU ml-1 na podłoże agarowe. Wylać podłoże na szalkę Petriego i pozostawić do zestalenia. Na powierzchni płytki agarowej wykonać dołki, aby wypełnić je HFFC (3 dołki dla HFFC i 1 dla kontroli negatywnej). Dodać 200 µl HFFC do 3 dołków i 200 µl PBS o pH 7,4 do 4 dołka. Po drugiej stronie szalki Petriego umieść krążek Cp NFRCS o średnicy 12 mm na zestalonym agarze i zwilż PBS (pH 7,4). Tabletki cyprofloksacyny, ampicyliny i flukonazolu są uważane za wzorce odniesienia dla Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Zmierz ręcznie strefę zahamowania wzrostu i zrób jej zdjęcie cyfrowe.
Po uzyskaniu zgody komisji etycznej, badanie przeprowadzono w Kasturba Medical College of Education and Research w Manipal w stanie Karnataka w południowych Indiach. Protokół eksperymentalny z TEG in vitro został sprawdzony i zatwierdzony przez Komisję Etyczną Kasturba Medical College w Manipal w stanie Karnataka (IEC: 674/2020). Uczestników rekrutowano spośród ochotników-dawców krwi (w wieku od 18 do 55 lat) ze szpitalnego banku krwi. Dodatkowo, od ochotników uzyskano formularz świadomej zgody na pobranie próbek krwi. Do badania wpływu preparatu Cp HFFC na krew pełną zmieszaną z cytrynianem sodu wykorzystano natywny TEG (N-TEG). N-TEG jest powszechnie uznawany za czynnik odgrywający ważną rolę w resuscytacji przyłóżkowej, co stwarza problemy dla lekarzy ze względu na potencjalne klinicznie istotne opóźnienie w otrzymaniu wyników (rutynowe testy krzepnięcia). Analizę N-TEG przeprowadzono z użyciem krwi pełnej. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę i szczegółowy wywiad medyczny. Badanie nie obejmowało uczestników z powikłaniami hemostatycznymi lub zakrzepowymi, takimi jak ciąża/połóg lub choroba wątroby. Osoby przyjmujące leki wpływające na kaskadę krzepnięcia również zostały wyłączone z badania. Podstawowe badania laboratoryjne (hemoglobina, czas protrombinowy, aktywowana tromboplastyna i liczba płytek krwi) zostały wykonane u wszystkich uczestników zgodnie ze standardowymi procedurami. N-TEG określa lepkosprężystość skrzepu krwi, początkową strukturę skrzepu, interakcje cząstek, wzmocnienie skrzepu i lizę skrzepu. Analiza N-TEG dostarcza danych graficznych i liczbowych na temat łącznego wpływu kilku elementów komórkowych i osocza. Analizę N-TEG przeprowadzono dla dwóch różnych objętości Cp HFFC (10 µl i 50 µl). W rezultacie 1 ml pełnej krwi z kwasem cytrynowym dodano do 10 µl Cp HFFC. Dodać 1 ml (Cp HFFC + krew cytrynianowa) i 340 µl krwi mieszanej do 20 µl płytki TEG zawierającej 0,2 M CaCl2. Następnie płytki TEG umieszczono w urządzeniu TEG® 5000, US, aby zmierzyć R, K, kąt alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% próbek krwi w obecności Cp HFFC41.
Protokół badania in vivo został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Komitetu Kontroli i Nadzoru Eksperymentów na Zwierzętach (CPCSEA). Wszystkie badania in vivo NFRCS (2 × 2 cm2) przeprowadzono na samicach szczurów Wistar (o masie ciała od 200 do 250 g). Wszystkie zwierzęta aklimatyzowano w temperaturze 24–26°C, zwierzęta miały swobodny dostęp do standardowej karmy i wody ad libitum. Wszystkie zwierzęta podzielono losowo na różne grupy, każda grupa składała się z trzech zwierząt. Wszystkie badania przeprowadzono zgodnie z badaniami na zwierzętach: raport z eksperymentów in vivo 43 . Przed badaniem zwierzęta znieczulono dootrzewnowo (ip) mieszaniną 20–50 mg ketaminy (na 1 kg masy ciała) i 2–10 mg ksylazyny (na 1 kg masy ciała). Po badaniu objętość krwawienia obliczono, oceniając różnicę między masą początkową a końcową próbek. Średnią wartość uzyskaną z trzech testów przyjęto jako objętość krwawienia z próbki.
Model amputacji ogona szczura został wdrożony w celu zrozumienia potencjału NFRCS w modulacji krwawienia w urazach, walce lub wypadkach drogowych (model urazu). Odetnij 50% ogona ostrzem skalpela i pozostaw na 15 sekund w powietrzu, aby zapewnić prawidłowe krwawienie. Dodatkowo, próbki testowe umieszczono na ogonie szczura, wywierając nacisk (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS). Krwawienie i PCT odnotowano dla próbek testowych (n = 3)17,45.
Skuteczność kontroli ciśnienia metodą NFRCS w warunkach bojowych badano na modelu tętnicy udowej powierzchownej. Tętnicę udową odsłonięto, nakłuto trokarem 24G i upuszczono krwawienie w ciągu 15 sekund. Po zaobserwowaniu niekontrolowanego krwawienia, próbkę badaną umieszczono w miejscu nakłucia i uciśnięto. Natychmiast po nałożeniu próbki badanej zmierzono czas krzepnięcia i obserwowano skuteczność hemostazy przez kolejne 5 minut. Tę samą procedurę powtórzono z użyciem cezu Cs i cetu Ct46.
Dowling i wsp. 47 zaproponowali model uszkodzenia wątroby w celu oceny potencjału hemostatycznego materiałów hemostatycznych w kontekście krwawienia śródoperacyjnego. BCT rejestrowano dla próbek Ct (kontrola ujemna), struktury Cs (kontrola dodatnia), próbek Ch NFRCS i próbek Cp NFRCS. Nadwątrobowa żyła główna szczura została odsłonięta poprzez wykonanie laparotomii pośrodkowej. Następnie dystalna część lewego płata została wycięta nożyczkami. Wykonaj nacięcie wątroby ostrzem skalpela i pozwól jej krwawić przez kilka sekund. Dokładnie ważone próbki testowe Ch NFRCS i Cp NFRCS umieszczono na uszkodzonej powierzchni bez żadnego dodatniego nacisku i zarejestrowano BCT. Grupa kontrolna (Ct) następnie zastosowała nacisk, a następnie Cs 30 s47 bez rozbijania urazu.
Przeprowadzono testy gojenia ran in vivo, wykorzystując model rany wyciętej, aby ocenić właściwości gojące opracowanych polimerowych NFRCS. Modele ran wyciętych wybrano i wykonano zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami z niewielkimi modyfikacjami19,32,48. Wszystkie zwierzęta znieczulono zgodnie z wcześniej opisanym opisem. Za pomocą wykrojnika biopsyjnego (12 mm) wykonano okrągłe, głębokie nacięcie skóry grzbietu. Przygotowane miejsca ran opatrzono opatrunkami Cs (kontrola dodatnia), Ct (biorąc pod uwagę, że waciki utrudniają gojenie), Ch NFRCS i Cp NFRCS (grupa eksperymentalna) oraz kontrolą ujemną bez żadnego leczenia. Każdego dnia badania mierzono powierzchnię rany u wszystkich szczurów. Za pomocą aparatu cyfrowego wykonano zdjęcie obszaru rany i założono nowy opatrunek. Procent zamknięcia rany mierzono według następującego wzoru:
Na podstawie procentowego stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją za pomocą barwienia H&E oraz barwienia trichromowego Massona. Na podstawie procentowego stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją za pomocą barwienia H&E oraz barwienia trichromowego Massona.Na podstawie procentowego stopnia zamknięcia rany w 12. dniu badania wycięto skórę szczurów z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) i zbadano ją poprzez barwienie hematoksyliną-eozyną i trichromem Massona.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Szczury z najlepszej grupy ((Cp NFRCS) i grupy kontrolnej) poddano barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz barwieniu trichromem Massona na podstawie procentowego zamknięcia rany w 12. dniu badania.Wdrożoną procedurę barwienia przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi metodami49,50. W skrócie, po utrwaleniu w 10% formalinie, próbki odwodniono za pomocą serii stopniowanych alkoholi. Za pomocą mikrotomu uzyskano cienkie skrawki (grubości 5 µm) wyciętej tkanki. Cienkie, seryjne skrawki próbek kontrolnych i Cp NFRCS poddano działaniu hematoksyliny i eozyny w celu zbadania zmian histopatologicznych. Do wykrycia tworzenia się włókienek kolagenowych zastosowano barwienie trichromowe Massona. Uzyskane wyniki zostały zbadane w sposób ślepy przez patologów.
Stabilność próbek Cp NFRCS badano w temperaturze pokojowej (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) przez 12 miesięcy51. Cp NFRCS (przebarwienia powierzchni i wzrost drobnoustrojów) poddano kontroli wizualnej i testom odporności na zużycie i BCT zgodnie z metodami opisanymi powyżej w części Materiały i metody.
Skalowalność i powtarzalność Cp NFRCS zbadano, przygotowując próbki Cp NFRCS o wymiarach 15×15 cm². Dodatkowo, z różnych frakcji Cp NFRCS wycięto próbki o masie 30 mg (n = 5), a BCT badanych próbek oceniono zgodnie z opisem zamieszczonym wcześniej w części „Metody”.
Próbowaliśmy opracować różne kształty i struktury, wykorzystując kompozycje Cp NFRCS do różnych zastosowań biomedycznych. Takie kształty i konfiguracje obejmują stożkowe wymazówki do krwawień z nosa, zabiegów stomatologicznych oraz cylindryczne wymazówki do krwawień z pochwy.
Wszystkie zestawy danych wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe i analizowano je metodą ANOVA przy użyciu programu Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, Kalifornia, USA), a następnie testem wielokrotnych porównań Bonferroniego (*p<0,05).
Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na ludziach były zgodne ze standardami Instytutu i Narodowej Rady Badań Naukowych, a także z Deklaracją Helsińską z 1964 roku i jej późniejszymi zmianami, lub podobnymi normami etycznymi. Wszyscy uczestnicy zostali poinformowani o charakterystyce badania i jego dobrowolnym charakterze. Dane uczestników pozostają poufne po ich zebraniu. Protokół eksperymentalny in vitro TEG został zweryfikowany i zatwierdzony przez Komisję Etyczną Kasturba Medical College w Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Ochotnicy podpisali świadomą zgodę na pobranie próbek krwi.
Wszystkie procedury badań na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wydziału Lekarskiego Kastuba, Instytutu Szkolnictwa Wyższego w Manipalu (IAEC/KMC/69/2020). Wszystkie zaprojektowane eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Kontroli i Nadzoru Eksperymentów na Zwierzętach (CPCSEA). Wszyscy autorzy stosują się do wytycznych ARRIVE.
Widma FTIR wszystkich NFRCS zostały przeanalizowane i porównane z widmem chitozanu przedstawionym na rysunku 2A. Charakterystyczne piki widmowe chitozanu (zarejestrowane) przy 3437 cm-1 (rozciąganie OH i NH, nakładanie), 2945 i 2897 cm-1 (rozciąganie CH), 1660 cm-1 (odkształcenie NH2), 1589 cm-1 (zginanie N–H), 1157 cm-1 (rozciąganie mostka O-), 1067 cm-1 (rozciąganie C–O, hydroksyl drugorzędowy), 993 cm-1 (rozciąganie CO, Bo-OH) 52,53,54. Tabela uzupełniająca S1 przedstawia wartości widma absorpcji FTIR NFRCS dla chitozanu (reporter), czystego chitozanu, Cm, Ch i Cp. Widma FTIR wszystkich NFRCS (Cm, Ch i Cp) wykazały te same charakterystyczne pasma absorpcji, co czysty chitozan, bez żadnych istotnych zmian (rys. 2A). Wyniki FTIR potwierdziły brak oddziaływań chemicznych ani fizycznych między polimerami użytymi do opracowania NFRCS, co wskazuje na ich obojętność.
Charakterystyka in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. (A) przedstawia połączone widma FTIR składów chitozanu i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS poddanych kompresji. (B) a) Szybkość wychwytywania NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg przez pełną krew (n = 3); Próbki Ct wykazały wyższy BAR, ponieważ wacik ma wyższą wydajność absorpcji; b) Krew po absorpcji krwi Ilustracja wchłoniętej próbki. Graficzna reprezentacja BCT próbki testowej C (Cp NFRCS miała najlepszą BCT (15 s, n = 3)). Dane w grupach C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a słupki błędów oznaczają SD, ***p < 0,0001. Dane w grupach C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± SD, a słupki błędów oznaczają SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E i G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют standardowy klucz, ***p <0,0001. Dane w kategoriach C, D, E i G przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, a słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, ***p<0,0001. C, D, E 和G 中的数据显示为平均值± SD, 误差线代表SD,***p < 0,0001. C, D, E 和G 中的数据显示为平均值± SD, 误差线代表SD,***p < 0,0001. Данные в C, D, E i G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют standartnoе отклонение, ***str <0,0001. Dane w komórkach C, D, E i G przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe, słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, ***p<0,0001.