Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nekontrolirano krvarenje jedan je od vodećih uzroka smrti. Postizanje brze hemostaze osigurava preživljavanje subjekta kao prva pomoć tijekom borbe, prometnih nesreća i operacija smanjenja smrtnosti. Nanoporozni kompozitni skelet ojačan vlaknima (NFRCS) izveden iz jednostavnog hemostatičnog sastava koji stvara film (HFFC) kao kontinuirane faze može pokrenuti i poboljšati hemostazu. Razvoj NFRCS-a temelji se na dizajnu krila vretenaca. Struktura krila vretenaca sastoji se od poprečnih i uzdužnih krila, a membrane krila su međusobno povezane kako bi se održao integritet mikrostrukture. HFFC ravnomjerno prekriva površinu vlakana filmom nanometarske debljine i povezuje nasumično raspoređenu debljinu pamuka (Ct) (disperznu fazu) kako bi se formirala nanoporozna struktura. Kombinacija kontinuirane i disperzne faze smanjuje cijenu proizvoda deset puta u usporedbi s komercijalno dostupnim proizvodima. Modificirani NFRCS (tamponi ili narukvice) mogu se koristiti u raznim biomedicinskim primjenama. Studije in vivo zaključile su da razvijeni Cp NFRCS pokreće i poboljšava proces koagulacije na mjestu primjene. NFRCS može modulirati mikrookoliš i djelovati na staničnoj razini zbog svoje nanoporozne strukture što rezultira boljim zacjeljivanjem rana u modelu ekscizijske rane.
Nekontrolirano krvarenje tijekom borbe, intraoperativnih i hitnih situacija može predstavljati ozbiljnu prijetnju životu ranjenika1. Ova stanja dodatno dovode do ukupnog povećanja perifernog vaskularnog otpora, što dovodi do hemoragijskog šoka. Odgovarajuće mjere za kontrolu krvarenja tijekom i nakon operacije smatraju se potencijalno opasnima po život2,3. Oštećenje velikih krvnih žila dovodi do masovnog gubitka krvi, što rezultira stopom smrtnosti od ≤ 50% u borbi i 31% tijekom operacije1. Masivni gubitak krvi dovodi do smanjenja tjelesnog volumena, što smanjuje minutni volumen srca. Povećanje ukupnog perifernog vaskularnog otpora i progresivno oštećenje mikrocirkulacije dovode do hipoksije u organima za održavanje života. Hemoragijski šok može se pojaviti ako se stanje nastavi bez učinkovite intervencije1,4,5. Druge komplikacije uključuju napredovanje hipotermije i metaboličke acidoze, kao i poremećaj koagulacije koji ometa proces koagulacije. Teški hemoragijski šok povezan je s većim rizikom od smrti6,7,8. Kod šoka III. stupnja (progresivnog), transfuzija krvi je neophodna za preživljavanje pacijenta tijekom intraoperativnog i postoperativnog morbiditeta i mortaliteta. Kako bismo prevladali sve gore navedene po život opasne situacije, razvili smo nanoporozni kompozitni skelet ojačan vlaknima (NFRCS) koji koristi minimalnu koncentraciju polimera (0,5%) koristeći kombinaciju hemostatskih polimera topivih u vodi.
Korištenjem vlakana za ojačanje mogu se razviti isplativi proizvodi. Nasumično raspoređena vlakna nalikuju strukturi krila vretenaca, uravnoteženoj horizontalnim i vertikalnim prugama na krilima. Poprečne i uzdužne vene krila komuniciraju s membranom krila (slika 1). NFRCS se sastoji od ojačanog Ct-a kao sustava skele s boljom fizičkom i mehaničkom čvrstoćom (slika 1). Zbog pristupačnosti i izrade, kirurzi preferiraju korištenje pamučnih niti (Ct) tijekom operacija i previjanja. Stoga je, s obzirom na njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (koja doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct korišten kao skeletni sustav NFRCS9,10. Stoga je, s obzirom na njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (koja doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct korišten kao skeletni sustav NFRCS9,10. Slijedom toga, uzimajući u obzir njegove brojne prednosti, u tom broju > 90% kristalne celuloze (učestvuje u povećanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten u sustavu skeleta NFRCS9,10. Stoga je, s obzirom na njegove brojne prednosti, uključujući >90% kristalne celuloze (uključene u povećanu hemostatsku aktivnost), Ct korišten kao skeletni sustav NFRCS-a9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Stoga je, s obzirom na njegove brojne prednosti, uključujući preko 90% kristalne celuloze (pomaže u poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct korišten kao nosač za NFRCS9,10.Ct je površinski obložen (uočeno je stvaranje nanodebelog filma) i međusobno povezan s hemostatskim sastavom koji stvara film (HFFC). HFFC djeluje poput matrigela, držeći nasumično postavljeni Ct zajedno. Razvijeni dizajn prenosi naprezanje unutar disperzne faze (armirajuća vlakna). Teško je dobiti nanoporozne strukture s dobrom mehaničkom čvrstoćom korištenjem minimalnih koncentracija polimera. Osim toga, nije lako prilagoditi različite kalupe za različite biomedicinske primjene.
Slika prikazuje dijagram dizajna NFRCS-a temeljenog na strukturi krila vretenca (A). Ova slika prikazuje komparativnu analogiju strukture krila vretenca (presijecajuće i uzdužne žile krila međusobno su povezane) i fotomikrografiju presjeka Cp NFRCS-a (B). Shematski prikaz NFRCS-a.
NFRC-i su razvijeni korištenjem HFFC-a kao kontinuirane faze kako bi se riješila gore navedena ograničenja. HFFC se sastoji od različitih hemostatskih polimera koji tvore film, uključujući kitozan (kao glavni hemostatski polimer) s metilcelulozom (MC), hidroksipropil metilcelulozom (HPMC 50 cp) i polivinil alkoholom (PVA) (125 kDa) kao potpornim polimerom koji potiče stvaranje tromba. Dodatak polivinilpirolidina K30 (PVP K30) poboljšao je kapacitet apsorpcije vlage NFRCS-a. Polietilen glikol 400 (PEG 400) dodan je kako bi se poboljšalo umrežavanje polimera u vezanim polimernim mješavinama. Tri različita hemostatska sastava HFFC-a (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), naime kitozan s MC (Cm), kitozan s HPMC (Ch) i kitozan s PVA (Cp), primijenjeni su na Ct. Različite in vitro i in vivo studije karakterizacije potvrdile su hemostatsku aktivnost i aktivnost zacjeljivanja rana NFRCS-a. Kompozitni materijali koje nudi NFRCS mogu se koristiti za prilagodbu različitih oblika skela kako bi se zadovoljile specifične potrebe.
Osim toga, NFRCS se može modificirati kao zavoj ili rola kako bi se pokrilo cijelo područje ozljede donjih ekstremiteta i drugih dijelova tijela. Posebno za ozljede udova u borbi, dizajnirani dizajn NFRCS-a može se promijeniti u pola ruke ili cijele noge (Dodatna slika S11). NFRCS se može napraviti u narukvicu s ljepilom za tkivo, koja se može koristiti za zaustavljanje krvarenja od teških suicidalnih ozljeda zapešća. Naš glavni cilj je razviti NFRCS s što manje polimera koji se može isporučiti velikoj populaciji (ispod granice siromaštva) i koji se može staviti u komplet prve pomoći. Jednostavan, učinkovit i ekonomičan u dizajnu, NFRCS koristi lokalnim zajednicama i može imati globalni utjecaj.
Kitozan (molekularne težine 80 kDa) i amarant kupljeni su od tvrtke Merck, Indija. Hidroksipropil metilceluloza 50 Cp, polietilen glikol 400 i metilceluloza kupljeni su od tvrtke Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polivinilni alkohol (molekularne težine 125 kDa) (87-90% hidroliziran) kupljen je od tvrtke National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirolidin K30 kupljen je od tvrtke Molychem, Mumbai, sterilni štapići kupljeni su od tvrtke Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s vodom Milli Q (Direct-Q3 sustav za pročišćavanje vode, Merck, Indija) kao nosačem.
NFRCS je razvijen metodom liofilizacije11,12. Svi sastavi HFFC-a (Tablica 1) pripremljeni su pomoću mehaničke miješalice. Pripremite 0,5%-tnu otopinu hitosana koristeći 1% octene kiseline u vodi kontinuiranim miješanjem pri 800 okretaja u minuti na mehaničkoj miješalici. Točna težina napunjenog polimera navedena u Tablici 1 dodana je u otopinu hitosana i miješana dok se nije dobila bistra otopina polimera. PVP K30 i PEG 400 dodani su u dobivenu smjesu u količinama navedenim u Tablici 1, a miješanje je nastavljeno dok se nije dobila bistra viskozna otopina polimera. Dobivena kupka otopine polimera sonicirana je 60 minuta kako bi se uklonili zarobljeni mjehurići zraka iz smjese polimera. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici S1(b), Ct je ravnomjerno raspoređen u svakoj jažici ploče (kalupa) sa 6 jažica nadopunjene s 5 ml HFFC-a.
Ploča sa šest jažica sonicirana je 60 minuta kako bi se postiglo jednolično vlaženje i raspodjela HFFC-a u Ct mreži. Zatim je ploča sa šest jažica zamrznuta na -20°C tijekom 8-12 sati. Zamrznute ploče liofilizirane su 48 sati kako bi se dobile različite formulacije NFRCS-a. Isti postupak koristi se za proizvodnju različitih oblika i struktura, poput tampona ili cilindričnih tampona ili bilo kojeg drugog oblika za različite primjene.
Točno odvagani hitosan (80 kDa) (3%) otopi se u 1% octenoj kiselini pomoću magnetske miješalice. Dobivenoj otopini hitosana doda se 1% PEG 400 i miješa 30 minuta. Dobivenu otopinu ulijte u kvadratnu ili pravokutnu posudu i zamrznite na -80°C tijekom 12 sati. Smrznuti uzorci liofilizirani su 48 sati kako bi se dobio porozni Cs13.
Razvijeni NFRCS podvrgnut je eksperimentima korištenjem Fourierove transformacijske infracrvene spektroskopije (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) kako bi se potvrdila kemijska kompatibilnost hitosana s drugim polimerima14,15. FTIR spektri (širina spektralnog raspona od 400 do 4000 cm-1) svih testiranih uzoraka dobiveni su izvođenjem 32 skeniranja.
Brzina apsorpcije krvi (BAR) za sve formulacije procijenjena je korištenjem metode koju su opisali Chen i suradnici 16 s malim izmjenama. Razvijeni NFRK-ovi svih sastava sušeni su u vakuumskoj pećnici na 105 °C preko noći kako bi se uklonilo preostalo otapalo. 30 mg NFRCS-a (početna težina uzorka – W0) i 30 mg Ct (pozitivna kontrola) stavljeno je u odvojene posudice koje su sadržavale premiks od 3,8% natrijevog citrata. U unaprijed određenim vremenskim intervalima, tj. 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekundi, NFRCS-ovi su uklonjeni, a njihove površine očišćene od neapsorbirane krvi stavljanjem uzoraka na Ct tijekom 30 sekundi. Konačna težina krvi apsorbirane pomoću NFRCS-a 16 uzeta je u obzir (W1) u svakoj vremenskoj točki. Izračunajte postotak BAR-a pomoću sljedeće formule:
Vrijeme zgrušavanja krvi (BCT) određeno je prema Wangu i suradnicima 17. Vrijeme potrebno da se puna krv (krv štakora prethodno pomiješana s 3,8% natrijevog citrata) zgruša u prisutnosti NFRCS-a izračunato je kao BCT testnog uzorka. Različite komponente NFRCS-a (30 mg) stavljene su u bočice od 10 ml s navojnim čepom i inkubirane na 37 °C. Krv (0,5 ml) dodana je u bočicu i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 dodano je za aktiviranje zgrušavanja krvi. Na kraju, bočicu okrenite svakih 15 sekundi (do 180°) dok se ne stvori čvrsti ugrušak. BCT uzorka procjenjuje se brojem okretanja bočica 17,18. Na temelju BCT-a, dva optimalna sastava iz NFRCS-a Cm, Ch i Cp odabrana su za daljnje studije karakterizacije.
BCT sastava Ch NFRCS i Cp NFRCS određen je primjenom metode koju su opisali Li i suradnici 19. Stavite 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (pozitivna kontrola) u odvojene Petrijeve zdjelice (37 °C). Krv koja sadrži 3,8% natrijevog citrata pomiješana je s 0,2 M CaCl2 u volumskom omjeru 10:1 kako bi se započeo proces zgrušavanja krvi. 20 µl mješavine 0,2 M CaCl2 krvi štakora naneseno je na površinu uzorka i stavljeno u praznu Petrijevu zdjelicu. Kontrola je bila krv ulivena u prazne Petrijeve zdjelice bez Ct. U fiksnim intervalima od 0, 3 i 5 minuta, zaustavite zgrušavanje dodavanjem 10 ml deionizirane (DI) vode u uzorak koji sadrži zdjelicu bez poremećaja ugruška. Nekoagulirani eritrociti (eritrociti) podliježu hemolizi u prisutnosti deionizirane vode i oslobađaju hemoglobin. Hemoglobin u različitim vremenskim točkama (HA(t)) mjeren je na 540 nm (λmax hemoglobin) pomoću UV-Vis spektrofotometra. Apsolutna apsorpcija hemoglobina (AH(0)) u 0 min od 20 µl krvi u 10 ml deionizirane vode uzeta je kao referentni standard. Relativna apsorpcija hemoglobina (RHA) koagulirane krvi izračunata je iz omjera HA(t)/HA(0) korištenjem iste serije krvi.
Pomoću analizatora teksture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SAD) određena su adhezivna svojstva NFRK-a na oštećeno tkivo. Pritisnite cilindričnu posudu s otvorenim dnom na unutarnju stranu svinjske kože (bez sloja masti). Uzorci (Ch NFRCS i Cp NFRCS) naneseni su kanilou u cilindrične kalupe kako bi se stvorilo prianjanje na kožu svinje. Nakon 3 minute inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) (25°C), adhezivna čvrstoća NFRCS-a zabilježena je konstantnom brzinom od 0,5 mm/s.
Glavna značajka kirurških sealera je povećanje zgrušavanja krvi uz smanjenje gubitka krvi. Koagulacija bez gubitaka u NFRCS-u procijenjena je korištenjem prethodno objavljene metode s malim izmjenama 19. Napravite mikrocentrifugalnu epruvetu (2 ml) (unutarnji promjer 10 mm) s rupom 8 × 5 mm2 na jednoj strani centrifugalne epruvete (koja predstavlja otvorenu ranu). NFRCS se koristi za zatvaranje otvora, a traka se koristi za brtvljenje vanjskih rubova. Dodajte 20 µl 0,2 M CaCl2 u mikrocentrifugalnu epruvetu koja sadrži 3,8%-tnu premiks natrijevog citrata. Nakon 10 minuta, mikrocentrifugalne epruvete su uklonjene iz posuda i utvrđeno je povećanje mase posuda zbog istjecanja krvi iz NFRK (n = 3). Gubitak krvi Ch NFRCS i Cp NFRCS uspoređeni su s Cs.
Mokri integritet NFRCS-a određen je na temelju metode koju su opisali Mishra i Chaudhary21 s manjim izmjenama. Stavite NFRCS u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 ml s 50 ml vode i miješajte 60 sekundi bez stvaranja vrha. Vizualni pregled i određivanje prioriteta uzoraka za fizički integritet na temelju prikupljanja.
Snaga vezanja HFFC-a za Ct proučavana je korištenjem prethodno objavljenih metoda s manjim modifikacijama. Integritet površinskog premaza procijenjen je izlaganjem NFRK akustičnim valovima (vanjski podražaj) u prisutnosti milliQ vode (Ct). Razvijeni NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS stavljeni su u čašu napunjenu vodom i sonicirani 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minuta. Nakon sušenja, postotna razlika između početne i konačne težine NFRCS-a korištena je za izračun postotka gubitka materijala (HFFC). In vitro BCT dodatno je podržao snagu vezanja ili gubitak površinskih materijala. Učinkovitost vezanja HFFC-a za Ct osigurava koagulaciju krvi i elastični premaz na površini Ct22.
Homogenost razvijenog NFRCS-a određena je BCT-om uzoraka (30 mg) uzetih s nasumično odabranih općih lokacija NFRCS-a. Slijedite prethodno spomenuti BCT postupak kako biste utvrdili sukladnost s NFRCS-om. Blizina svih pet uzoraka osigurava jednoliku pokrivenost površine i taloženje HFFC-a u Ct mreži.
Nominalna površina kontakta s krvlju (NBCA) određena je kako je prethodno objavljeno s nekim izmjenama. Krv se koagulira stezanjem 20 µl krvi između dvije površine Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. Nakon 1 sata, dva dijela stenta su odvojena i ručno je izmjerena površina ugruška. Prosječna vrijednost od tri ponavljanja smatrana je NBCA NFRCS19.
Analiza dinamičke sorpcije pare (DVS) korištena je za procjenu učinkovitosti NFRCS-a u apsorpciji vode iz vanjskog okruženja ili s mjesta ozljede odgovornog za pokretanje koagulacije. DVS procjenjuje ili bilježi unos i gubitak pare u uzorku gravimetrijski pomoću ultraosjetljive vage s masenom rezolucijom od ±0,1 µg. Parcijalni tlak pare (relativna vlažnost) generira se elektroničkim regulatorom masenog protoka oko uzorka miješanjem zasićenih i suhih plinova nosača. Prema smjernicama Europske farmakopeje, na temelju postotka upijanja vlage uzorcima, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopni, 0,2–2 % m/m blago higroskopni, 2–15 % umjereno higroskopni i > 15 % vrlo higroskopni)23. Prema smjernicama Europske farmakopeje, na temelju postotka upijanja vlage uzorcima, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopni, 0,2–2 % m/m blago higroskopni, 2–15 % umjereno higroskopni i > 15 % vrlo higroskopni)23.U skladu s preporukama Europske farmakopeje, ovisno o postotku apsorpcije vlage uzorcima, uzorci su podijeljeni u 4 kategorije (0–0,012 % m/m – nehigroskopni, 0,2–2 % m/m slabo higroskopni, 2–petnaest %).% umjereno higroskopičan i > 15% vrlo higroskopičan)23. % umjereno higroskopnih i > 15% vrlo higroskopnih)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0,012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。U skladu s preporukama Europske farmakopeje, uzorci su podijeljeni u 4 klase ovisno o postotku vlage koju uzorak apsorbira (0-0,012% težinski – nehigroskopni, 0,2-2% težinski slabo higroskopni, 2-15% težinski).% umjereno gigroskopski, > 15 % vrlo gigroskopski) 23. % umjereno higroskopno, > 15% vrlo higroskopno) 23.Higroskopska učinkovitost NFCS X NFCS i TsN NFCS određena je na analizatoru DVS TA TGA Q5000 SA. Tijekom ovog procesa dobiveni su vrijeme rada, relativna vlažnost (RH) i težina uzorka u stvarnom vremenu na 25°C24. Sadržaj vlage izračunat je točnom NFRCS analizom mase pomoću sljedeće jednadžbe:
MC je vlažnost NFRCS-a. m1 – suha težina NSAID-a. m2 je masa NFRCS-a u stvarnom vremenu pri danoj relativnoj vlažnosti.
Ukupna površina procijenjena je pomoću eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je pomoću eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina površine ocijenjena je uz pomoć eksperimenta adsorpcije azota židkim azotom nakon isparavanja uzoraka pri 25 °S tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci ispražnjeni na 25°C tijekom 10 sati (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。Temperatura do 25°C Ukupna površina površine ocijenjena je primjenom eksperimenata za adsorpciju azota i azotnih azota nakon isparavanja uzoraka tijekom 10 sati pri 25°C (< 7 × 10-3 torr). Ukupna površina procijenjena je korištenjem eksperimenata adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci pražnjeni 10 sati na 25°C (< 7 x 10-3 torr).Ukupna površina, volumen pora i veličina pora NFRCS-a određeni su Quantachromeom tvrtke NOVA 1000e, Austrija, korištenjem RS 232 softvera.
Pripremite 5% eritrocita (fiziološka otopina kao razrjeđivač) iz pune krvi. Zatim prenesite alikvot HFFC-a (0,25 ml) na ploču s 96 jažica i 5% mase eritrocita (0,1 ml). Inkubirajte smjesu na 37°C tijekom 40 minuta. Smjesa eritrocita i seruma smatrana je pozitivnom kontrolom, a smjesa fiziološke otopine i eritrocita negativnom kontrolom. Hemaglutinacija je određena prema Stajitzkyjevoj ljestvici. Predložene ljestvice su sljedeće: + + + + gusti granularni agregati; + + + glatki donji jastučići sa zakrivljenim rubovima; + + glatki donji jastučići s poderanim rubovima; + uski crveni prstenovi oko rubova glatkih jastučića; – (negativno) diskretni crveni gumb 12 u središtu donje jažice.
Hemokompatibilnost NFRCS-a proučavana je prema metodi Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Gravimetrijska metoda koju su opisali Singh i suradnici. Napravljene su manje modifikacije kako bi se procijenilo stvaranje tromba u prisutnosti ili na površini NFRCS-a. 500 mg Cs, Ch NFRCS-a i Cp NFRCS-a inkubirano je u fosfatno puferiranoj otopini soli (PBS) tijekom 24 sata na 37°C. Nakon 24 sata, PBS je uklonjen, a NFRCS je tretiran s 2 ml krvi koja sadrži 3,8% natrijevog citrata. Na površinu NFRCS-a, inkubiranim uzorcima dodano je 0,04 ml 0,1 M CaCl2. Nakon 45 minuta dodano je 5 ml destilirane vode kako bi se zaustavila koagulacija. Zgrušana krv na površini NFRK-a tretirana je s 36-38%-tnom otopinom formaldehida. Ugrušci fiksirani formaldehidom osušeni su i izvagani. Postotak tromboze procijenjen je izračunavanjem težine čašice bez krvi i uzorka (negativna kontrola) i čašice s krvlju (pozitivna kontrola).
Kao početna potvrda, uzorci su vizualizirani pod optičkim mikroskopom kako bi se razumjela sposobnost površinskog premaza HFFC-a, međusobno povezanog Ct i Ct mreže da tvore pore. Tanki rezovi Ch i Cp iz NFRCS-a obrezani su skalpelom. Dobiveni rez postavljen je na staklenu pločicu, prekriven pokrovnim staklom, a rubovi su fiksirani ljepilom. Pripremljeni preparati pregledani su pod optičkim mikroskopom i fotografije su snimljene pri različitim uvećanjima.
Taloženje polimera u Ct mrežama vizualizirano je korištenjem fluorescentne mikroskopije na temelju metode koju su opisali Rice i suradnici29. Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch i Cp) pripremljeni su prema prethodno spomenutoj metodi. Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch i Cp) pripremljeni su prema prethodno spomenutoj metodi.Sastav HFFC-a korišten za formulaciju pomiješan je s fluorescentnom bojom (amarant) i NFRCS (Ch i Cp) dobiven je prema prethodno spomenutoj metodi.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp).Sastav HFFC-a korišten u formulaciji pomiješan je s fluorescentnom bojom (Amaranth) i primljen je NFRCS (Ch i Cp), kao što je ranije spomenuto.Iz dobivenih uzoraka izrezani su tanki rezovi NFRK-a, postavljeni na staklena stakalca i prekriveni pokrovnim stakalcima. Pripremljena stakalca promatrajte pod fluorescentnim mikroskopom koristeći zeleni filter (310-380 nm). Slike su snimljene pri 4x povećanju kako bi se razumjeli odnosi Ct-a i prekomjerno taloženje polimera u Ct mreži.
Površinska topografija NFRCS Ch i Cp određena je pomoću mikroskopa atomskih sila (AFM) s ultra-oštrom TESP konzolom u načinu rada s tapkanjem: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan. Hrapavost površine određena je efektivnom vrijednošću (RMS) pomoću softvera (Scanning Probe Image Processor). Različite lokacije NFRCS prikazane su na 3D slikama kako bi se provjerila ujednačenost površine. Standardna devijacija rezultata za dano područje definirana je kao hrapavost površine. RMS jednadžba korištena je za kvantificiranje hrapavosti površine NFRCS31.
Studije temeljene na FESEM-u provedene su korištenjem FESEM-a, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, kako bi se razumjela površinska morfologija Ch NFRCS-a i Cp NFRCS-a, koji su pokazali bolji BCT od Cm NFRCS-a. FESEM studija provedena je prema metodi koju su opisali Zhao i suradnici32 s manjim izmjenama. NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS-a i Cp NFRCS-a prethodno je pomiješano s 20 µl 3,8% natrijevog citrata prethodno pomiješanog s krvlju štakora. 20 μl 0,2 M CaCl2 dodano je uzorcima tretirane krvi kako bi se pokrenula koagulacija, a uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 10 minuta. Osim toga, višak eritrocita uklonjen je s površine NFRCS-a ispiranjem fiziološkom otopinom.
Naknadni uzorci tretirani su s 0,1% glutaraldehida, a zatim sušeni u pećnici na vrući zrak na 37°C radi uklanjanja vlage. Osušeni uzorci su premazani i analizirani 32. Ostale slike dobivene tijekom analize bile su stvaranje ugruška na površini pojedinačnih pamučnih vlakana, taloženje polimera između Ct, morfologija (oblik) eritrocita, integritet ugruška i morfologija eritrocita u prisutnosti NFRCS-a. Netretirana područja NFRCS-a i područja NFRCS-a tretirana Ch i Cp inkubirana s krvlju skenirana su na elementarne ione (natrij, kalij, dušik, kalcij, magnezij, cink, bakar i selen) 33. Usporedite postotke elementarnih iona između tretiranih i netretiranih uzoraka kako biste razumjeli akumulaciju elementarnih iona tijekom stvaranja ugruška i homogenost ugruška.
Debljina površinskog premaza Cp HFFC na Ct površini određena je FESEM-om. Presjeci Cp NFRCS-a izrezani su iz okvira i naneseni raspršivanjem. Dobiveni uzorci nanesenog raspršivanjem promatrani su FESEM-om, a debljina površinskog premaza izmjerena je 34, 35, 36.
Rendgenski mikro-CT pruža visokorezolucijsko 3D nerazorno snimanje i omogućuje proučavanje unutarnjeg strukturnog rasporeda NFRK. Mikro-CT koristi rendgenski snop koji prolazi kroz uzorak za snimanje lokalnog linearnog koeficijenta atenuacije rendgenskih zraka u uzorku, što pomaže u dobivanju morfoloških informacija. Unutarnji položaj Ct u Cp NFRCS i Cp NFRCS tretiranom krvlju ispitan je mikro-CT-om kako bi se razumjela učinkovitost apsorpcije i zgrušavanje krvi u prisutnosti NFRCS37,38,39. 3D strukture uzoraka Cp NFRCS tretiranih i netretiranih krvi rekonstruirane su pomoću mikro-CT-a (V|tome|x S240, Phoenix, Njemačka). Korištenjem softvera VG STUDIO-MAX verzije 2.2, snimljeno je nekoliko rendgenskih slika iz različitih kutova (idealno pokrivenost od 360°) za razvoj 3D slika za NFRCS. Prikupljeni projekcijski podaci rekonstruirani su u 3D volumetrijske slike pomoću odgovarajućeg jednostavnog 3D ScanIP Academic softvera.
Osim toga, kako bi se razumjela raspodjela ugruška, u NFRCS dodano je 20 µl prethodno pomiješane citratne krvi i 20 µl 0,2 M CaCl2 kako bi se pokrenulo zgrušavanje krvi. Pripremljeni uzorci ostavljeni su da se stvrdnu. Površina NFRK-a tretirana je s 0,5% glutaraldehida i sušena u pećnici na vrući zrak na 30–40°C tijekom 30 minuta. Krvni ugrušak nastao na NFRCS-u je skeniran, rekonstruiran i vizualizirana je 3D slika krvnog ugruška.
Antibakterijski testovi provedeni su na Cp NFRCS (najbolje u usporedbi s Ch NFRCS) korištenjem prethodno opisane metode s manjim izmjenama. Antibakterijska aktivnost Cp NFRCS i Cp HFFC određena je korištenjem tri različita testna mikroorganizma [S. aureus (gram-pozitivne bakterije), E. coli (gram-negativne bakterije) i bijela Candida (C. albicans)] koji rastu na agaru u Petrijevim zdjelicama u inkubatoru. Ravnomjerno inokulirajte 50 ml razrijeđene suspenzije bakterijske kulture u koncentraciji od 105-106 CFU ml-1 na agar medij. Ulijte medij u Petrijevu zdjelicu i ostavite da se stvrdne. Na površini agar ploče napravljene su jažice za punjenje HFFC-om (3 jažice za HFFC i 1 za negativnu kontrolu). Dodajte 200 µl HFFC-a u 3 jažice i 200 µl PBS pH 7,4 u 4. jažicu. S druge strane petrijeve zdjelice, stavite 12 mm Cp NFRCS disk na očvrsnuti agar i navlažite PBS-om (pH 7,4). Tablete ciprofloksacina, ampicilina i flukonazola smatraju se referentnim standardima za Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Ručno izmjerite zonu inhibicije i snimite digitalnu sliku zone inhibicije.
Nakon institucionalnog etičkog odobrenja, studija je provedena na Medicinskom fakultetu za obrazovanje i istraživanje Kasturba u Manipalu, Karnataka, u južnoj Indiji. In vitro TEG eksperimentalni protokol pregledao je i odobrio Institucionalni etički odbor Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Ispitanici su regrutirani među dobrovoljnim davateljima krvi (u dobi od 18 do 55 godina) iz bolničke banke krvi. Osim toga, od volontera je dobiven obrazac informiranog pristanka za prikupljanje uzoraka krvi. Nativni TEG (N-TEG) ​​korišten je za proučavanje učinka formulacije Cp HFFC na punu krv prethodno pomiješanu s natrijevim citratom. N-TEG je široko prepoznat po svojoj ulozi u reanimaciji na mjestu pružanja zdravstvene zaštite, što stvara probleme kliničarima zbog mogućnosti klinički značajnog kašnjenja rezultata (rutinski testovi koagulacije). N-TEG analiza provedena je korištenjem pune krvi. Od svih sudionika dobiveni su informirani pristanak i detaljna medicinska anamneza. Studija nije uključivala sudionike s hemostatskim ili trombotičkim komplikacijama poput trudnoće/nakon poroda ili bolesti jetre. Ispitanici koji su uzimali lijekove koji utječu na kaskadu koagulacije također su isključeni iz studije. Osnovni laboratorijski testovi (hemoglobin, protrombinsko vrijeme, aktivirani tromboplastin i broj trombocita) provedeni su na svim sudionicima prema standardnim postupcima. N-TEG određuje viskoelastičnost krvnog ugruška, početnu strukturu ugruška, interakciju čestica, jačanje ugruška i lizu ugruška. N-TEG analiza pruža grafičke i numeričke podatke o kolektivnim učincima nekoliko staničnih elemenata i plazme. N-TEG analiza provedena je na dva različita volumena Cp HFFC (10 µl i 50 µl). Kao rezultat toga, 1 ml pune krvi s limunskom kiselinom dodan je u 10 μl Cp HFFC. Dodajte 1 ml (Cp HFFC + citratna krv), 340 µl miješane krvi u 20 µl 0,2 M CaCl2 koja sadrži TEG zdjelicu. Nakon toga, TEG zdjelice su stavljene u TEG® 5000, US za mjerenje R, K, alfa kuta, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% uzoraka krvi u prisutnosti Cp HFFC41.
Protokol in vivo studije pregledao je i odobrio Institucionalni odbor za etiku životinja (IAEC), Medicinskog fakulteta Kasturba, Visokog obrazovnog instituta Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Svi pokusi na životinjama provedeni su u skladu s preporukama Odbora za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA). Sve in vivo NFRCS studije (2 × 2 cm2) provedene su na ženkama štakora Wistar (težine 200 do 250 g). Sve životinje su aklimatizirane na temperaturi od 24-26°C, životinje su imale slobodan pristup standardnoj hrani i vodi ad libitum. Sve životinje su nasumično podijeljene u različite skupine, a svaka skupina se sastojala od tri životinje. Sve studije provedene su u skladu s Izvješćem o pokusima in vivo u studiji na životinjama 43. Prije istraživanja, životinje su anestezirane intraperitonealnom (ip) primjenom smjese od 20-50 mg ketamina (po 1 kg tjelesne težine) i 2-10 mg ksilazina (po 1 kg tjelesne težine). Nakon istraživanja, volumen krvarenja izračunat je procjenom razlike između početne i konačne težine uzoraka, a prosječna vrijednost dobivena iz tri testa uzeta je kao volumen krvarenja uzorka.
Model amputacije repa štakora implementiran je kako bi se razumio potencijal NFRCS-a za modulaciju krvarenja u traumi, borbi ili prometnoj nesreći (model ozljede). Odrežite 50% repa skalpelom i stavite ga na zrak na 15 sekundi kako biste osigurali normalno krvarenje. Osim toga, uzorci za testiranje postavljeni su na rep štakora primjenom pritiska (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS). Krvarenje i PCT zabilježeni su za uzorke za testiranje (n = 3)17,45.
Učinkovitost kontrole tlaka NFRCS-a u borbi istražena je na modelu površinske femoralne arterije. Femoralna arterija je izložena, probušena trokarom 24G i iskrvarena unutar 15 sekundi. Nakon što se uoči nekontrolirano krvarenje, testni uzorak se postavlja na mjesto uboda uz primjenu pritiska. Odmah nakon primjene testnog uzorka zabilježeno je vrijeme zgrušavanja i hemostatska učinkovitost promatrana je sljedećih 5 minuta. Isti postupak ponovljen je s Cs i Ct46.
Dowling i sur.47 predložili su model ozljede jetre za procjenu hemostatskog potencijala hemostatskih materijala u kontekstu intraoperativnog krvarenja. BCT je zabilježen za Ct uzorke (negativna kontrola), Cs okvir (pozitivna kontrola), Ch NFRCS uzorke i Cp NFRCS uzorke. Suprahepatična šuplja vena štakora je izložena izvođenjem medijalne laparotomije. Nakon toga, distalni dio lijevog režnja je izrezan škarama. Napravite rez na jetri oštricom skalpela i pustite da krvari nekoliko sekundi. Točno izvagani Ch NFRCS i Cp NFRCS test uzorci postavljeni su na oštećenu površinu bez ikakvog pozitivnog tlaka i BCT je zabilježen. Kontrolna skupina (Ct) je zatim primijenila pritisak, a zatim Cs 30 s47 bez pucanja ozljede.
In vivo testovi zacjeljivanja rana provedeni su korištenjem modela ekscizijske rane kako bi se procijenila svojstva zacjeljivanja rana razvijenih NFRCS-ova na bazi polimera. Modeli ekscizijskih rana odabrani su i izvedeni prema prethodno objavljenim metodama s manjim izmjenama19,32,48. Sve životinje su anestezirane kako je prethodno opisano. Korištenjem biopsijskog bušilice (12 mm) napravljen je kružni duboki rez na koži leđa. Pripremljena mjesta rane prekrivena su s Cs (pozitivna kontrola), Ct (uzimajući u obzir da pamučni jastučići ometaju zacjeljivanje), Ch NFRCS-om i Cp NFRCS-om (eksperimentalna skupina) te negativnom kontrolom bez ikakvog tretmana. Svakog dana studije, površina rane izmjerena je kod svih štakora. Digitalnim fotoaparatom snimljeno je područje rane i stavljen novi zavoj. Postotak zatvaranja rane mjeren je sljedećom formulom:
Na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža štakora najbolje skupine ((Cp NFRCS) i kontrolne skupine) je izrezana te proučavana H&E bojenjem i Massonovim trikromnim bojenjem. Na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža štakora najbolje skupine ((Cp NFRCS) i kontrolne skupine) je izrezana te proučavana H&E bojenjem i Massonovim trikromnim bojenjem.Na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža štakora najbolje skupine ((Cp NFRCS) i kontrolne skupine) je izrezana i pregledana bojenjem hematoksilin-eozinom i Massonovim trikromom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组＄)Štakori u najboljoj skupini ((Cp NFRCS) i kontrolnoj skupini) izrezani su za bojenje hematoksilin-eozinom i Massonovo trikromno bojenje na temelju postotka zatvaranja rane 12. dana studije.Implementirani postupak bojenja proveden je prema prethodno opisanim metodama49,50. Ukratko, nakon fiksacije u 10% formalinu, uzorci su dehidrirani pomoću niza stupnjevanih alkohola. Za dobivanje tankih rezova (debljine 5 µm) izrezanog tkiva korišten je mikrotom. Tanki serijski rezovi kontrolnih i Cp NFRCS uzorka tretirani su hematoksilinom i eozinom za proučavanje histopatoloških promjena. Massonova trikromna boja korištena je za otkrivanje stvaranja kolagenih fibrila. Dobivene rezultate patolozi su slijepo proučavali.
Stabilnost uzoraka Cp NFRCS proučavana je na sobnoj temperaturi (25 °C ± 2 °C/60 % relativne vlažnosti ± 5 %) tijekom 12 mjeseci51. Cp NFRCS (promjena boje površine i rast mikroba) vizualno je pregledan i testiran na otpornost na pregibno trošenje i BCT prema gore navedenim metodama opisanim u odjeljku Materijali i metode.
Skalabilnost i reproducibilnost Cp NFRCS ispitana je pripremom Cp NFRCS veličine 15 × 15 cm2. Osim toga, uzorci od 30 mg (n = 5) izrezani su iz različitih frakcija Cp NFRCS, a BCT proučavanih uzoraka procijenjen je kako je ranije opisano u odjeljku Metode.
Pokušali smo razviti različite oblike i strukture koristeći Cp NFRCS sastave za različite biomedicinske primjene. Takvi oblici ili konfiguracije uključuju konusne štapiće za krvarenje iz nosa, stomatološke zahvate i cilindrične štapiće za vaginalno krvarenje.
Svi skupovi podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su ANOVA-om korištenjem programa Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, SAD), a zatim Bonferronijevim testom višestrukih usporedbi (*p<0,05).
Svi postupci provedeni u studijama na ljudima bili su u skladu sa standardima Instituta i Nacionalnog istraživačkog vijeća, kao i Helsinškom deklaracijom iz 1964. i njezinim naknadnim izmjenama i dopunama ili sličnim etičkim standardima. Svi sudionici bili su obaviješteni o značajkama studije i njezinoj dobrovoljnoj prirodi. Podaci o sudionicima ostaju povjerljivi nakon prikupljanja. Protokol eksperimenta in vitro TEG pregledao je i odobrio Institucionalni etički odbor Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Volonteri su potpisali informirani pristanak za prikupljanje uzoraka krvi.
Svi postupci provedeni u studijama na životinjama provedeni su u skladu s uputama Medicinskog fakulteta Kastuba, Visokog obrazovnog instituta Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Svi osmišljeni pokusi na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama Odbora za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA). Svi autori slijede smjernice ARRIVE.
FTIR spektri svih NFRCS-ova su analizirani i uspoređeni sa spektrom kitozana prikazanim na slici 2A. Karakteristični spektralni vrhovi kitozana (snimljeni) na 3437 cm-1 (istezanje OH i NH, preklapanje), 2945 i 2897 cm-1 (istezanje CH), 1660 cm-1 (naprezanje NH2), 1589 cm-1 (savijanje N–H), 1157 cm-1 (istezanje mosta O-), 1067 cm-1 (istezanje C–O, sekundarni hidroksil), 993 cm-1 (istezanje CO, Bo-OH) 52,53,54. Dodatna tablica S1 prikazuje vrijednosti apsorpcijskog spektra FTIR NFRCS-a za kitozan (reporter), čisti kitozan, Cm, Ch i Cp. FTIR spektri svih NFRCS-ova (Cm, Ch i Cp) pokazali su iste karakteristične apsorpcijske vrpce kao i čisti kitozan bez ikakvih značajnih promjena (slika 2A). Rezultati FTIR-a potvrdili su odsutnost kemijskih ili fizičkih interakcija između polimera korištenih za razvoj NFRCS-a, što ukazuje na to da su korišteni polimeri inertni.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs. (A) predstavlja kombinirane FTIR spektre sastava kitozana i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS pod kompresijom. (B) a) Brzina apsorpcije Cm, Ch, Cp i Cg u punoj krvi NFRCS (n = 3); Ct uzorci pokazali su veći BAR jer pamučni štapić ima veću učinkovitost apsorpcije; b) Krv nakon apsorpcije krvi. Ilustracija apsorbiranog uzorka. Grafički prikaz BCT-a testnog uzorka C (Cp NFRCS imao je najbolji BCT (15 s, n = 3)). Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci pogreške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± SD, a stupci pogreške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednje ± standardno odstupanje, a pogrešne ploče predstavljaju standardno odstupanje, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, a stupci pogreške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardno odstupanje, pogrešne ploče predstavljaju standardno odstupanje, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, stupci pogreške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001.