Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Неконтролираното крварење е една од водечките причини за смрт. Постигнувањето брза хемостаза го обезбедува преживувањето на субјектот како прва помош за време на борба, сообраќајни несреќи и операции за намалување на смртните случаи. Нанопорозната композитна скела зајакната со влакна (NFRCS) добиена од едноставен состав што формира хемостатски филм (HFFC) како континуирана фаза може да ја активира и подобри хемостазата. Развојот на NFRCS се базира на дизајнот на крилото на вилинското коњче. Структурата на крилото на вилинското коњче се состои од попречни и надолжни крилја, а мембраните на крилото се поврзани една со друга за да се одржи интегритетот на микроструктурата. HFFC рамномерно ја обложува површината на влакното со филм со нанометриска дебелина и ја поврзува случајно распределената дебелина на памукот (Ct) (дисперзирана фаза) за да формира нанопорозна структура. Комбинацијата на континуирани и дисперзирани фази ја намалува цената на производот за десет пати во споредба со комерцијално достапните производи. Модифицираните NFRCS (тампони или нараквици за зглобови) може да се користат во различни биомедицински апликации. Студиите in vivo заклучиле дека развиениот Cp NFRCS го активира и го подобрува процесот на коагулација на местото на апликација. NFRCS може да ја модулира микросредината и да дејствува на клеточно ниво поради својата нанопорозна структура, што резултира со подобро заздравување на раните во моделот на ексцизиона рана.
Неконтролирано крварење за време на борба, интраоперативни и итни ситуации може да претставува сериозна закана за животот на повредените1. Овие состојби дополнително доведуваат до целокупно зголемување на периферниот васкуларен отпор, што доведува до хеморагичен шок. Соодветните мерки за контрола на крварењето за време и по операцијата се сметаат за потенцијално опасни по живот2,3. Оштетувањето на големите крвни садови доведува до масивна загуба на крв, што резултира со стапка на смртност од ≤ 50% во борба и 31% за време на операцијата1. Масовната загуба на крв доведува до намалување на волуменот на телото, што го намалува срцевиот минутен волумен. Зголемувањето на вкупниот периферен васкуларен отпор и прогресивното оштетување на микроциркулацијата доведуваат до хипоксија во органите за одржување на животот. Хеморагичен шок може да се појави ако состојбата продолжи без ефикасна интервенција1,4,5. Други компликации вклучуваат прогресија на хипотермија и метаболна ацидоза, како и нарушување на коагулацијата што го попречува процесот на коагулација. Тешкиот хеморагичен шок е поврзан со поголем ризик од смрт6,7,8. Кај шок од III степен (прогресивен), трансфузијата на крв е од суштинско значење за преживувањето на пациентот за време на интраоперативниот и постоперативниот морбидитет и морталитет. За да ги надминеме сите горенаведени ситуации кои се опасни по живот, развивме нанопорозна композитна скела зајакната со влакна (NFRCS) која користи минимална концентрација на полимер (0,5%) со употреба на комбинација од хемостатски полимери растворливи во вода.
Со употреба на засилување со влакна, може да се развијат економични производи. Случајно распоредените влакна личат на структурата на крилото на вилинското коњче, избалансирани со хоризонталните и вертикалните ленти на крилјата. Попречните и надолжните вени на крилото комуницираат со мембраната на крилото (сл. 1). NFRCS се состои од зајакнат Ct како систем на скеле со подобра физичка и механичка цврстина (слика 1). Поради прифатливата цена и изработката, хирурзите претпочитаат да користат мерачи од памучен конец (Ct) за време на операциите и преврските. Оттука, со оглед на неговите повеќекратни придобивки, вклучувајќи > 90% кристална целулоза (придонесува во подобрувањето на хемостатската активност), Ct беше користен како скелетен систем на NFRCS9,10. Оттука, со оглед на неговите повеќекратни придобивки, вклучувајќи > 90% кристална целулоза (придонесува во подобрувањето на хемостатската активност), Ct беше користен како скелетен систем на NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многучисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ctolьзовали во качести10Fлетной систем9, ске. Затоа, со оглед на неговите многубројни придобивки, вклучувајќи >90% кристална целулоза (вклучена во зголемена хемостатска активност), Ct беше користен како скелетен систем на NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止觼被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Затоа, со оглед на неговите многубројни придобивки, вклучувајќи над 90% кристална целулоза (помага во подобрување на хемостатската активност), Ct беше користен како основа за NFRCS9,10.Ct беше површински обложен (беше забележано формирање на нано-дебел филм) и меѓусебно поврзан со хемостатски состав за формирање филм (HFFC). HFFC делува како матригел, држејќи ги случајно поставените Ct заедно. Развиениот дизајн пренесува стрес во рамките на дисперзираната фаза (зајакнувачки влакна). Тешко е да се добијат нанопорозни структури со добра механичка цврстина со користење на минимални концентрации на полимери. Покрај тоа, не е лесно да се прилагодат различни калапи за различни биомедицински апликации.
На сликата е прикажан дијаграм на дизајнот на NFRCS базиран на структурата на крилото на вилинското коњче (A). Оваа слика покажува компаративна аналогија на структурата на крилото на вилинското коњче (пресекувачките и надолжните вени на крилото се меѓусебно поврзани) и фотомикрографија на пресек на Cp NFRCS (B). Шематски приказ на NFRCS.
NFFC беа развиени со употреба на HFFC како континуирана фаза за да се решат горенаведените ограничувања. HFFC е составен од различни хемостатски полимери што формираат филм, вклучувајќи хитозан (како главен хемостатски полимер) со метилцелулоза (MC), хидроксипропил метилцелулоза (HPMC 50 cp) и поливинил алкохол (PVA) (125 kDa) како потпорен полимер што го поттикнува формирањето на тромби. Додавањето на поливинилпиролидин K30 (PVP K30) го подобри капацитетот за апсорпција на влага на NFRCS. Полиетилен гликол 400 (PEG 400) беше додаден за да се подобри вкрстеното поврзување на полимерите во врзаните полимерни мешавини. Три различни хемостатски состави на HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC и Cp HFFC), имено хитозан со MC (Cm), хитозан со HPMC (Ch) и хитозан со PVA (Cp), беа применети на Ct. Различни студии за карактеризација in vitro и in vivo ја потврдија хемостатската активност и активноста за заздравување на раните на NFRCS. Композитните материјали што ги нуди NFRCS можат да се користат за прилагодување на различни форми на скеле за да се задоволат специфичните потреби.
Покрај тоа, NFRCS може да се модифицира како завој или ролна за да ја покрие целата област на повредата на долните екстремитети и други делови од телото. Поточно за повреди на екстремитетите во борба, дизајнираниот дизајн на NFRCS може да се промени во половина рака или цела нога (Дополнителна слика S11). NFRCS може да се направи во нараквица со ткивен лепак, кој може да се користи за запирање на крварење од тешки самоубиствени повреди на зглобот. Нашата главна цел е да развиеме NFRCS со што е можно помалку полимер што може да се достави до голема популација (под линијата на сиромаштија) и што може да се стави во комплет за прва помош. Едноставен, ефикасен и економичен по дизајн, NFRCS им користи на локалните заедници и може да има глобално влијание.
Хитозан (молекуларна тежина 80 kDa) и амарант беа купени од Merck, Индија. Хидроксипропил метилцелулоза 50 Cp, полиетилен гликол 400 и метилцелулоза беа купени од Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбаи. Поливинил алкохол (молекуларна тежина 125 kDa) (87-90% хидролизиран) беше купен од National Chemicals, Гуџарат. Поливинилпиролидин K30 беше купен од Molychem, Мумбаи, стерилни брисеви беа купени од Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, со вода Milli Q (систем за прочистување на вода Direct-Q3, Merck, Индија) како носач.
NFRCS е развиен со употреба на метод на лиофилизација11,12. Сите HFFC состави (Табела 1) се подготвени со употреба на механичка мешалка. Подгответе 0,5% раствор на хитозан со употреба на 1% оцетна киселина во вода со континуирано мешање на 800 вртежи во минута на механичка мешалка. Точната тежина на натоварениот полимер наведена во Табела 1 е додадена во растворот на хитозан и се меша додека не се добие бистар полимерен раствор. PVP K30 и PEG 400 се додаваат во добиената смеса во количините наведени во Табела 1, а мешањето се продолжува додека не се добие бистар вискозен полимерен раствор. Добиената бања од полимерен раствор е сонифицирана 60 минути за да се отстранат заробените воздушни меурчиња од полимерната смеса. Како што е прикажано на Дополнителната слика S1(b), Ct е рамномерно распределен во секоја бунар од плоча (калап) со 6 бунари дополнета со 5 ml HFFC.
Плочата со шест бунари беше соникирана 60 минути за да се постигне униформно навлажнување и дистрибуција на HFFC во Ct мрежата. Потоа, плочата со шест бунари беше замрзната на -20°C во период од 8-12 часа. Замрзнатите плочи беа лиофилизирани 48 часа за да се добијат различни формулации на NFRCS. Истата постапка се користи за производство на различни форми и структури, како што се тампони или цилиндрични тампони, или која било друга форма за различни намени.
Точно измерен хитозан (80 kDa) (3%) се раствора во 1% оцетна киселина со помош на магнетна мешалка. Во добиениот раствор на хитозан се додава 1% PEG 400 и се меша 30 минути. Добиениот раствор се истура во квадратен или правоаголен сад и се замрзнува на -80°C 12 часа. Замрзнатите примероци се лиофилизираат 48 часа за да се добие порозен Cs13.
Развиениот NFRCS беше подложен на експерименти со употреба на инфрацрвена спектроскопија со Фуриеова трансформација (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Јапонија) за да се потврди хемиската компатибилност на хитозанот со други полимери14,15. FTIR спектрите (ширина на спектралниот опсег од 400 до 4000 cm-1) на сите тестирани примероци беа добиени со извршување на 32 скенирања.
Стапката на апсорпција во крвта (BAR) за сите формулации беше оценета со користење на методот опишан од Chen et al. 16 со мали модификации. Развиените NFRK од сите состави беа сушени во вакуумска печка на 105°C преку ноќ за да се отстрани преостанатиот растворувач. 30 mg NFRCS (почетна тежина на примерокот – W0) и 30 mg Ct (позитивна контрола) беа ставени во посебни садови што содржат претходна смеса од 3,8% натриум цитрат. Во однапред одредени временски интервали, т.е. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунди, NFRCS беа отстранети, а нивните површини беа исчистени од неапсорбирана крв со поставување на примероците на Ct во период од 30 секунди. Конечната тежина на крвта апсорбирана од NFRCS 16 беше земена предвид (W1) во секоја временска точка. Пресметајте го процентот на BAR користејќи ја следната формула:
Времето на згрутчување на крвта (BCT) беше определено како што е објавено од Wang et al. 17. Времето потребно за згрутчување на целата крв (крв од стаорец претходно измешана со 3,8% натриум цитрат) во присуство на NFRCS беше пресметано како BCT на примерокот за тестирање. Различните компоненти на NFRCS (30 mg) беа ставени во ампули со капаче од 10 ml со навртувач и инкубирани на 37°C. Крв (0,5 ml) беше додадена во ампулата и 0,3 ml од 0,2 M CaCl2 беше додадено за да се активира коагулацијата на крвта. Конечно, превртувајте го ампулата на секои 15 секунди (до 180°) додека не се формира цврст згрутчок. BCT на примерокот се проценува според бројот на превртувања на везилата 17,18. Врз основа на BCT, беа избрани два оптимални состава од NFRCS Cm, Ch и Cp за понатамошни студии за карактеризација.
BCT на составот на Ch NFRCS и Cp NFRCS беше определен со имплементација на методот опишан од Ли и сор. 19. Ставете 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (позитивна контрола) во посебни Петриеви садови (37 °C). Крв што содржи 3,8% натриум цитрат беше измешана со 0,2 M CaCl2 во волуменски сооднос 10:1 за да се започне процесот на коагулација на крвта. 20 µl од мешавина од 0,2 M CaCl2 крв од стаорец беше нанесена на површината на примерокот и ставена во празен Петриеви сад. Контролата беше крв истурена во празни Петриеви садови без Ct. Во фиксни интервали од 0, 3 и 5 минути, запрете го коагулацијата со додавање на 10 ml дејонизирана (DI) вода во примерокот што го содржи садот без да го нарушите згрутчувањето. Некоагулираните еритроцити (еритроцити) подлежат на хемолиза во присуство на дејонизирана вода и ослободуваат хемоглобин. Хемоглобинот во различни временски точки (HA(t)) беше мерен на 540 nm (λmax хемоглобин) со помош на UV-Vis спектрофотометар. Апсолутната апсорпција на хемоглобинот (AH(0)) во 0 мин од 20 µl крв во 10 ml дејонизирана вода беше земена како референтен стандард. Релативната апсорпција на хемоглобинот (RHA) од коагулираната крв беше пресметана од односот HA(t)/HA(0) со користење на истата серија крв.
Користејќи анализатор на текстура (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Брукфилд, САД), беа утврдени адхезивните својства на NFRK за оштетеното ткиво. Притиснете цилиндричен сад со отворено дно на внатрешноста на свинската кожа (без слојот маснотија). Примероците (Ch NFRCS и Cp NFRCS) беа нанесени преку канила во цилиндрични калапи за да се создаде адхезија на кожата на свињата. По 3-минутна инкубација на собна температура (RT) (25° C.), јачината на адхезија на NFRCS беше снимена со константна брзина од 0,5 mm/сек.
Главната карактеристика на хируршките заптивки е зголемување на згрутчувањето на крвта, а воедно намалување на загубата на крв. Коагулацијата без загуби кај NFRCS беше оценета со користење на претходно објавен метод со мали модификации 19. Направете микроцентрифужна цевка (2 ml) (внатрешен дијаметар 10 mm) со дупка од 8 × 5 mm2 на едната страна од центрифугалната цевка (што претставува отворена рана). NFRCS се користи за затворање на отворот, а лента се користи за запечатување на надворешните рабови. Додадете 20 µl од 0,2 M CaCl2 во микроцентрифужната цевка што ја содржи претходната мешавина од 3,8% натриум цитрат. По 10 минути, микроцентрифужните цевки беа извадени од садовите и зголемувањето на масата на садовите беше утврдено поради одливот на крв од NFRK (n = 3). Загубата на крв Ch NFRCS и Cp NFRCS беа споредени со Cs.
Влажниот интегритет на NFRCS беше определен врз основа на методот опишан од Мишра и Чаудари21 со мали модификации. Ставете го NFRCS во Ерленмаерова колба од 100 ml со 50 ml вода и мешајте 60 секунди без да се формира врв. Визуелна инспекција и приоритизација на примероците за физички интегритет врз основа на собирањето.
Јачината на врзување на HFFC за Ct беше проучена со користење на претходно објавени методи со мали модификации. Интегритетот на површинскиот слој беше оценет со изложување на NFRK на акустични бранови (надворешен стимул) во присуство на milliQ вода (Ct). Развиените NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS беа ставени во чаша исполнета со вода и сонифицирани 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минути, соодветно. По сушењето, процентната разлика помеѓу почетната и конечната тежина на NFRCS беше искористена за пресметување на процентот на губење на материјал (HFFC). In vitro BCT дополнително ја потврди јачината на врзување или губењето на површинските материјали. Ефикасноста на врзувањето на HFFC за Ct обезбедува коагулација на крвта и еластичен слој на површината на Ct22.
Хомогеноста на развиениот NFRCS беше утврдена со BCT на примероци (30 mg) земени од случајно избрани општи локации на NFRCS. Следете ја претходно споменатата BCT постапка за да ја утврдите усогласеноста со NFRCS. Близината помеѓу сите пет примероци обезбедува униформна покриеност на површината и таложење на HFFC во Ct мрежата.
Номиналната контактна површина со крв (NBCA) беше одредена како што беше претходно објавено со некои модификации. Коагулирајте ја крвта со стегање на 20 µl крв помеѓу двете површини на Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. По 1 час, двата дела од стентот беа одвоени и рачно беше измерена површината на згрутчувањето. Просечната вредност од три повторувања се сметаше за NBCA NFRCS19.
За да се процени ефикасноста на NFRCS за апсорпција на вода од надворешната средина или од местото на повреда одговорно за иницирање на коагулација, беше користена анализа на динамичка сорпција на пареа (DVS). DVS гравиметриски ја проценува или евидентира апсорпцијата и загубата на пареа во примерокот користејќи ултрасензитивна вага со резолуција на маса од ±0,1 µg. Парцијален притисок на пареа (релативна влажност) се генерира со електронски контролер на масен проток околу примерокот со мешање на заситени и суви гасови-носачи. Според упатствата на Европската фармакопеја, врз основа на процентот на апсорпција на влага од страна на примероците, примероците беа категоризирани во 4 категории (0–0,012% w/w− нехигроскопски, 0,2–2% w/w малку хигроскопски, 2–15% умерено хигроскопски и > 15% многу хигроскопски)23. Според упатствата на Европската фармакопеја, врз основа на процентот на апсорпција на влага од страна на примероците, примероците беа категоризирани во 4 категории (0–0,012% w/w− нехигроскопски, 0,2–2% w/w малку хигроскопски, 2–15% умерено хигроскопски и > 15% многу хигроскопски)23.Во согласност со препораките на Европската фармакопеја, во зависност од процентот на апсорпција на влага од страна на примероците, примероците беа поделени во 4 категории (0–0,012% w/w – нехигроскопски, 0,2–2% w/w малку хигроскопски, 2– петнаесет %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % умерено хигроскопски и > 15% многу хигроскопски)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w/非吸湿性、0,2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 1% 000% 0. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非帀吸湿）Во согласност со препораките на Европската фармакопеја, примероците се поделени во 4 класи во зависност од процентот на влага апсорбирана од примерокот (0-0,012% по тежина – нехигроскопски, 0,2-2% по тежина малку хигроскопски, 2-15% по тежина).% умерено гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % умерено хигроскопски, > 15% многу хигроскопски) 23.Хигроскопската ефикасност на NFCS X NFCS и TsN NFCS беше одредена на анализаторот DVS TA TGA Q5000 SA. За време на овој процес, беа добиени времето на работа, релативната влажност (RH) и тежината на примерокот во реално време на 25°C24. Содржината на влага се пресметува со точна анализа на масата на NFRCS користејќи ја следната равенка:
MC е влажност на NFRCS. m1 – сува тежина на НСАИЛ. m2 е масата на NFRCS во реално време при дадена релативна влажност.
Вкупната површина беше проценета со помош на експеримент за адсорпција на азот со течен азот по празнење на примероците на 25 °C во тек на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Вкупната површина беше проценета со помош на експеримент за адсорпција на азот со течен азот по празнење на примероците на 25 °C во тек на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценувавалась со помош на експерименти по адсорбции азота живи азотом после опорожненија образци при 25 °С во течение 10 ч (< 7 × 10–3 Тор). Вкупната површина беше проценета со помош на експеримент со адсорпција на азот со течен азот откако примероците беа испразнети на 25°C во тек на 10 часа (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实靌估计总表температура од 25°C Общая площадь поверхности оценувавалась со исползуванием експерименти по адсорбции азота живи азотом после опорожненија образцов во течение 10 часа на 25°C (< 7 × 10-3 торр). Вкупната површина беше проценета со користење на експерименти за адсорпција на азот со течен азот откако примероците беа празнени 10 часа на 25°C (< 7 x 10-3 torr).Вкупната површина, волуменот на порите и големината на порите на NFRCS беа определени со Quantachrome од NOVA 1000e, Австрија, користејќи го софтверот RS 232.
Подгответе 5% еритроцити (солен раствор како разредувач) од полна крв. Потоа префрлете аликвот од HFFC (0,25 ml) во плоча со 96 бунари и 5% маса на еритроцити (0,1 ml). Инкубирајте ја смесата на 37°C 40 минути. Мешавина од црвени крвни клетки и серум се сметаше за позитивна контрола, а мешавина од солен раствор и црвени крвни клетки како негативна контрола. Хемаглутинацијата беше определена според Стајицкиевата скала. Предложените скали се следниве: + + + + густи грануларни агрегати; + + + мазни долни перничиња со закривени рабови; + + мазни долни перничиња со искинати рабови; + тесни црвени прстени околу рабовите на мазните перничиња; – (негативно) дискретно црвено копче 12 во центарот на долниот бунар.
Хемокомпатибилноста на NFRCS беше проучена според методот на Меѓународната организација за стандардизација (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Гравиметрискиот метод опишан од Синг и сор. Мали модификации беа направени за да се процени формирањето на тромби во присуство на или на површината на NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS беа инкубирани во фосфатен пуферен солен раствор (PBS) 24 часа на 37°C. По 24 часа, PBS беше отстранет и NFRCS беше третиран со 2 ml крв што содржи 3,8% натриум цитрат. На површината на NFRCS, додадете 0,04 ml од 0,1 M CaCl2 во инкубираните примероци. По 45 минути, додадени се 5 ml дестилирана вода за да се запре коагулацијата. Коагулираната крв на површината на NFRK беше третирана со 36-38% раствор на формалдехид. Згрутчувањата фиксирани со формалдехид беа сушени и измерени. Процентот на тромбоза беше проценет со пресметување на тежината на чашата без крв и примерок (негативна контрола) и чашата со крв (позитивна контрола).
Како почетна потврда, примероците беа визуелизирани под оптички микроскоп за да се разбере способноста на површинскиот слој на HFFC, меѓусебно поврзаните Ct и Ct мрежата да формираат пори. Тенките делови од Ch и Cp од NFRCS беа исечени со сечило од скалпел. Добиениот дел беше поставен на стаклено стакло, покриен со покривно стакленце, а рабовите беа фиксирани со лепак. Подготвените плочки беа прегледани под оптички микроскоп и беа направени фотографии со различни зголемувања.
Таложењето на полимери во Ct мрежи беше визуелизирано со употреба на флуоресцентна микроскопија врз основа на методот опишан од Рајс и сор.29. Составот на HFFC што се користеше за формулацијата беше измешан со флуоресцентна боја (амарант), а NFRCS (Ch и Cp) беа подготвени според претходно споменатиот метод. Составот на HFFC што се користеше за формулацијата беше измешан со флуоресцентна боја (амарант), а NFRCS (Ch и Cp) беа подготвени според претходно споменатиот метод.Составот на HFFC што се користеше за формулација беше измешан со флуоресцентна боја (амарант) и NFRCS (Ch и Cp) беше добиен според претходно споменатиот метод.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的戶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的戶S Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的戶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的戶S Cp）.Составот на HFFC што се користеше во формулацијата беше измешан со флуоресцентна боја (амарант) и прими NFRCS (Ch и Cp), како што беше споменато претходно.Тенки делови од NFRK беа исечени од добиените примероци, поставени на стаклени плочки и покриени со покривни лепчиња. Набљудувајте ги подготвените плочки под флуоресцентен микроскоп користејќи зелен филтер (310-380 nm). Сликите беа направени со 4x зголемување за да се разберат Ct односите и вишокот на полимерно таложење во Ct мрежата.
Топографијата на површината на NFRCS Ch и Cp беше одредена со помош на атомски силовен микроскоп (AFM) со ултраостар TESP конзолен систем во режим на тапкање: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Брукер, Тајван. Рапавоста на површината беше одредена со помош на средна квадратна вредност (RMS) со помош на софтвер (Scanning Probe Image Processor). Различни локации на NFRCS беа рендерирани на 3D слики за да се провери униформноста на површината. Стандардната девијација на резултатот за дадена површина е дефинирана како грубост на површината. RMS равенката беше користена за квантифицирање на грубоста на површината на NFRCS31.
Студиите базирани на FESEM беа спроведени со користење на FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токио, за да се разбере површинската морфологија на Ch NFRCS и Cp NFRCS, кои покажаа подобар BCT од Cm NFRCS. Студијата FESEM беше спроведена според методот опишан од Zhao et al. 32 со мали модификации. NFRCS 20 до 30 mg Ch NFRCS и Cp NFRCS беа претходно измешани со 20 µl од 3,8% натриум цитрат претходно измешан со крв од стаорец. 20 μl од 0,2 M CaCl2 беа додадени во примероците третирани со крв за да се започне коагулација и примероците беа инкубирани на собна температура 10 минути. Дополнително, вишокот еритроцити беше отстранет од површината на NFRCS со плакнење со физиолошки раствор.
Последователните примероци беа третирани со 0,1% глутаралдехид, а потоа сушени во печка со топол воздух на 37°C за да се отстрани влагата. Сувите примероци беа обложени и анализирани 32. Други слики добиени за време на анализата беа формирање на згрутчување на површината на поединечни памучни влакна, таложење на полимер помеѓу Ct, морфологија (форма) на еритроцити, интегритет на згрутчување и морфологија на еритроцити во присуство на NFRCS. Нетретираните NFRCS области и NFRCS областите третирани со Ch и Cp инкубирани со крв беа скенирани за елементарни јони (натриум, калиум, азот, калциум, магнезиум, цинк, бакар и селен) 33. Споредете ги процентите на елементарни јони помеѓу третираните и нетретираните примероци за да ја разберете акумулацијата на елементарни јони за време на формирањето на згрутчување и хомогеноста на згрутчувањето.
Дебелината на површинскиот слој од Cp HFFC на површината на Ct беше определена со користење на FESEM. Попречните пресеци на Cp NFRCS беа исечени од рамката и обложени со распрскување. Добиените примероци од облогата со распрскување беа набљудувани со FESEM и дебелината на површинскиот слој беше измерена 34, 35, 36.
Рентгенскиот микро-КТ овозможува 3Д недеструктивно снимање со висока резолуција и ви овозможува да го проучите внатрешниот структурен распоред на NFRK. Микро-КТ користи рендгенски зрак што минува низ примерокот за да го сними локалниот коефициент на линеарна атенуација на рендгенските зраци во примерокот, што помага да се добијат морфолошки информации. Внатрешната локација на Ct во Cp NFRCS и Cp NFRCS третирани со крв беше испитана со микро-КТ за да се разбере ефикасноста на апсорпцијата и коагулацијата на крвта во присуство на NFRCS37,38,39. 3Д структурите на примероците од Cp NFRCS третирани со крв и нетретирани беа реконструирани со помош на микро-КТ (V|tome|x S240, Феникс, Германија). Користејќи го софтверот VG STUDIO-MAX верзија 2.2, беа направени неколку рендгенски слики од различни агли (идеално покриеност од 360°) за да се развијат 3Д слики за NFRCS. Собраните податоци за проекција беа реконструирани во 3Д волуметриски слики со помош на соодветниот едноставен софтвер 3D ScanIP Academic.
Дополнително, за да се разбере дистрибуцијата на згрутчувањето, во NFRCS беа додадени 20 µl претходно измешана цитрирана крв и 20 µl 0,2 M CaCl2 за да се иницира згрутчување на крвта. Подготвените примероци се оставаат да се стврднат. Површината на NFRK беше третирана со 0,5% глутаралдехид и сушена во печка со топол воздух на 30–40°C во тек на 30 минути. Згрутченото крвно згрутчување формирано на NFRCS беше скенирано, реконструирано и беше визуелизирана 3D слика од згрутченото крвно згрутчување.
Антибактериски анализи беа извршени на Cp NFRCS (најдобро во споредба со Ch NFRCS) користејќи го претходно опишаниот метод со мали модификации. Антибактериската активност на Cp NFRCS и Cp HFFC беше одредена со користење на три различни тест микроорганизми [S.aureus (грам-позитивни бактерии), E.coli (грам-негативни бактерии) и бела Candida (C.albicans)] кои растат на агар во Петриеви садови во инкубатор. Рамномерно инокулирајте 50 ml од разредената суспензија на бактериска култура со концентрација од 105-106 CFU ml-1 врз агарската средина. Истурете ја средината во Петриеви садови и оставете ја да се стврдне. На површината на агарската плоча беа направени бунари за да се наполнат со HFFC (3 бунари за HFFC и 1 за негативна контрола). Додадете 200 µl HFFC во 3 бунари и 200 µl pH 7,4 PBS во 4-тата бунар. На другата страна од Петриевата шоља, поставете диск од 12 mm Cp NFRCS на зацврстениот агар и навлажнете го со PBS (pH 7,4). Таблетите ципрофлоксацин, ампицилин и флуконазол се сметаат за референтни стандарди за Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Измерете ја зоната на инхибиција рачно и направете дигитална слика од зоната на инхибиција.
По институционалното етичко одобрување, студијата беше спроведена на Медицинскиот колеџ за образование и истражување Кастурба во Манипал, Карнатака, во јужна Индија. Експерименталниот протокол за ин витро TEG е прегледан и одобрен од страна на Комитетот за институционална етика на Медицинскиот колеџ Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Испитаниците беа регрутирани од доброволни дарители на крв (на возраст од 18 до 55 години) од банката за крв во болницата. Дополнително, од волонтерите беше добиен формулар за информирана согласност за собирање примероци од крв. Нативниот TEG (N-TEG) ​​беше користен за проучување на ефектот од формулацијата Cp HFFC врз цела крв претходно измешана со натриум цитрат. N-TEG е широко признат по својата улога во реанимацијата на местото на нега, што создава проблеми за лекарите поради потенцијалот за клинички значајно доцнење на резултатите (рутински тестови за коагулација). N-TEG анализата беше извршена со употреба на цела крв. Информирана согласност и детална медицинска историја беа добиени од сите учесници. Студијата не вклучуваше учесници со хемостатски или тромботични компликации како што се бременост/постпартално или заболување на црниот дроб. Испитаниците кои земаат лекови кои влијаат на каскадата на коагулација исто така беа исклучени од студијата. Основни лабораториски тестови (хемоглобин, протромбинско време, активиран тромбопластин и број на тромбоцити) беа извршени кај сите учесници според стандардни процедури. N-TEG ја одредува вискоеластичноста на згрутчувањето на крвта, почетната структура на згрутчувањето, интеракцијата на честичките, зајакнувањето на згрутчувањето и лизата на згрутчувањето. N-TEG анализата обезбедува графички и нумерички податоци за колективните ефекти на неколку клеточни елементи и плазма. N-TEG анализата беше извршена на два различни волумени на Cp HFFC (10 µl и 50 µl). Како резултат на тоа, 1 ml цела крв со лимонска киселина беше додадена на 10 μl Cp HFFC. Додадете 1 ml (Cp HFFC + цитрирана крв), 340 µl мешана крв на 20 µl 0,2 M CaCl2 што содржи TEG сад. Потоа, TEG садовите беа натоварени во TEG® 5000, US за мерење на R, K, алфа агол, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% од примероците од крв во присуство на Cp HFFC41.
Протоколот за студијата in vivo беше прегледан и одобрен од страна на Комитетот за институционална етика на животните (IAEC), Медицински факултет Кастурба, Институт за високо образование Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Сите експерименти со животни беа спроведени во согласност со препораките на Комитетот за контрола и надзор на експериментирање со животни (CPCSEA). Сите студии на NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) беа спроведени на женски стаорци од расата Wistar (со тежина од 200 до 250 g). Сите животни беа аклиматизирани на температура од 24-26°C, животните имаа слободен пристап до стандардна храна и вода ad libitum. Сите животни беа случајно поделени во различни групи, секоја група се состоеше од три животни. Сите студии беа спроведени во согласност со Студии на животни: Извештај за експерименти in vivo 43. Пред студијата, животните беа анестезирани со интраперитонеална (ip) администрација на мешавина од 20-50 mg кетамин (на 1 kg телесна тежина) и 2-10 mg ксилазин (на 1 kg телесна тежина). По студијата, волуменот на крварење беше пресметан со евалуација на разликата помеѓу почетната и конечната тежина на примероците, просечната вредност добиена од трите тестови беше земена како волумен на крварење на примерокот.
Моделот за ампутација на опашката на стаорец беше имплементиран за да се разбере потенцијалот на NFRCS за модулирање на крварењето при траума, борба или сообраќајна несреќа (модел на повреда). Отсечете 50% од опашката со сечило од скалпел и ставете ја на воздух 15 секунди за да се обезбеди нормално крварење. Дополнително, примероците за тестирање беа поставени на опашката на стаорец со примена на притисок (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS). Крварење и PCT беа пријавени за примероци за тестирање (n = 3)17,45.
Ефективноста на контролата на притисокот на NFRCS во борба беше испитана на модел на површинска феморална артерија. Феморалната артерија е изложена, пунктирана со троакар од 24G и крвари во рок од 15 секунди. Откако ќе се забележи неконтролирано крварење, примерокот за тестирање се поставува на местото на пункција со применет притисок. Веднаш по нанесувањето на примерокот за тестирање, времето на коагулација беше снимено и хемостатската ефикасност беше забележана во следните 5 минути. Истата постапка беше повторена со Cs и Ct46.
Даулинг и сор. 47 предложија модел на повреда на црниот дроб за да се процени хемостатскиот потенцијал на хемостатските материјали во контекст на интраоперативно крварење. BCT беше снимен за Ct примероци (негативна контрола), Cs рамка (позитивна контрола), Ch NFRCS примероци и Cp NFRCS примероци. Супрахепатичната вена кава на стаорецот беше изложена со изведување на средна лапаротомија. После тоа, дисталниот дел од левиот лобус беше исечен со ножици. Направете засек во црниот дроб со сечило за скалпел и оставете го да крвари неколку секунди. Точно измерени тест примероци од Ch NFRCS и Cp NFRCS беа поставени на оштетената површина без позитивен притисок и беше снимен BCT. Контролната група потоа примени притисок проследен со Cs 30 s47 без да ја скрши повредата.
Тестовите за заздравување на рани in vivo беа извршени со користење на модел на ексцизиона рана за да се проценат својствата за заздравување на раните на развиените NFRCS базирани на полимери. Моделите на ексцизиона рана беа избрани и извршени според претходно објавени методи со мали модификации19,32,48. Сите животни беа анестезирани како што беше претходно опишано. Користете перфоратор за биопсија (12 mm) за да направите кружен длабок засек на кожата на грбот. Подготвените места на раната беа преврзани со Cs (позитивна контрола), Ct (имајќи предвид дека памучните влошки се мешаат во заздравувањето), Ch NFRCS и Cp NFRCS (експериментална група) и негативна контрола без никаков третман. Секој ден од студијата, површината на раната беше мерена кај сите стаорци. Користете дигитален фотоапарат за да направите фотографија од областа на раната и ставете нов завој. Процентот на затворање на раната беше мерен со следната формула:
Врз основа на процентот на затворање на раната на 12-тиот ден од студијата, кожата на стаорец од најдобрата група беше отстранета ((Cp NFRCS) и контролната група) и проучена со H&E боење и Masson-ово трихромно боење. Врз основа на процентот на затворање на раната на 12-тиот ден од студијата, кожата на стаорец од најдобрата група беше отстранета ((Cp NFRCS) и контролната група) и проучена со H&E боење и Masson-ово трихромно боење.Врз основа на процентот на затворање на раната на 12-тиот ден од студијата, кожата на стаорците од најдобрата група ((Cp NFRCS) и контролната група) беше исечена и испитана со боење со хематоксилин-еозин и Масонов трихром.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Стаорците во најдобрата група ((Cp NFRCS) и контролни групи) беа ексцидирани за боење со хематоксилин-еозин и боење со Масоново трихромно боење врз основа на процентот на затворање на раната на 12-тиот ден од студијата.Имплементираната постапка на боење беше спроведена според претходно опишаните методи49,50. Накратко, по фиксацијата во 10% формалин, примероците беа дехидрирани со употреба на серија градирани алкохоли. Користен е микротом за да се добијат тенки пресеци (дебелина од 5 µm) од исеченото ткиво. Тенките сериски пресеци од контролите и Cp NFRCS беа третирани со хематоксилин и еозин за да се проучат хистопатолошките промени. Масоновото трихромно боење беше користено за да се открие формирањето на колагенски фибрили. Добиените резултати беа слепо проучувани од страна на патолози.
Стабилноста на примероците од Cp NFRCS беше проучена на собна температура (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) во тек на 12 месеци51. Cp NFRCS (површинска промена на бојата и микробен раст) беше визуелно проверена и тестирана за отпорност на абење на превиткување и BCT според горенаведените методи наведени во делот Материјали и методи.
Скалабилноста и репродуктивноста на Cp NFRCS беа испитани со подготовка на Cp NFRCS со големина од 15×15 cm2. Дополнително, примероци од 30 mg (n = 5) беа извадени од различни фракции на Cp NFRCS и BCT на проучуваните примероци беше оценет како што е опишано претходно во делот Методи.
Се обидовме да развиеме различни форми и структури користејќи Cp NFRCS композиции за различни биомедицински апликации. Ваквите форми или конфигурации вклучуваат конусни брисеви за крварење од носот, стоматолошки процедури и цилиндрични брисеви за вагинално крварење.
Сите збирки податоци се изразени како средна вредност ± стандардна девијација и се анализирани со ANOVA користејќи Prism 5.03 (GraphPad, Сан Диего, Калифорнија, САД), проследено со тестот за повеќекратни споредби на Бонферони (*p <0,05).
Сите процедури извршени во студиите врз луѓе беа во согласност со стандардите на Институтот и Националниот истражувачки совет, како и Декларацијата од Хелсинки од 1964 година и нејзините последователни измени, или слични етички стандарди. Сите учесници беа информирани за карактеристиките на студијата и нејзината доброволна природа. Податоците на учесниците остануваат доверливи откако ќе се соберат. Експерименталниот протокол за ин витро TEG е прегледан и одобрен од страна на Комитетот за институционална етика на Медицинскиот колеџ Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Волонтерите потпишаа информирана согласност за собирање примероци од крв.
Сите процедури извршени во студиите врз животни беа спроведени во согласност со Медицинскиот факултет Кастуба, Институт за високо образование Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Сите дизајнирани експерименти врз животни беа спроведени во согласност со упатствата на Комитетот за контрола и надзор на експериментирање врз животни (CPCSEA). Сите автори ги следат упатствата на ARRIVE.
FTIR спектрите на сите NFRCS беа анализирани и споредени со спектарот на хитозан прикажан на Слика 2А. Карактеристични спектрални врвови на хитозан (снимени) на 3437 cm-1 (истегнување на OH и NH, преклопување), 2945 и 2897 cm-1 (истегнување на CH), 1660 cm-1 (напрегање на NH2), 1589 cm-1 (свиткување на N–H ), 1157 cm-1 (истегнување на мостот O-), 1067 cm-1 (истегнување C–O, секундарен хидроксил), 993 cm-1 (истегнување CO, Bo-OH) 52.53.54. Дополнителната табела S1 ги прикажува вредностите на FTIR NFRCS апсорпциониот спектар за хитозан (репортер), чист хитозан, Cm, Ch и Cp. FTIR спектрите на сите NFRCS (Cm, Ch и Cp) покажаа исти карактеристични апсорпциони ленти како чистиот хитозан без никакви значајни промени (Сл. 2А). Резултатите од FTIR потврдија отсуство на хемиски или физички интеракции помеѓу полимерите што се користат за развој на NFRCS, што укажува дека употребените полимери се инертни.
Ин витро карактеризација на Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. (A) ги претставува комбинираните FTIR спектри на составот на хитозан и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS под компресија. (B) a) Стапка на апсорпција на NFRCS од цела крв Cm, Ch, Cp и Cg (n = 3); Ct примероците покажаа повисок BAR бидејќи памучниот стапче има поголема ефикасност на апсорпција; b) Крв по апсорпција на крв Илустрација на апсорбираниот примерок. Графички приказ на BCT на тест примерокот C (Cp NFRCS имаше најдобар BCT (15 s, n = 3)). Податоците во C, D, E и G беа прикажани како средна вредност ± SD, а лентите за грешка претставуваат SD, ***p < 0,0001. Податоците во C, D, E и G беа прикажани како средна вредност ± SD, а лентите за грешка претставуваат SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представи как среднее ± стандартно отклонение, а планки погрешно представляют стандартно отклонение, ***p <0,0001. Податоците во C, D, E и G се претставени како средна вредност ± стандардна девијација, а лентите за грешка ја претставуваат стандардната девијација, ***p <0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p <0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p <0,0001。 Данные в C, D, E и G покажуваат како среднее значење ± стандартно отклонение, планки погрешни представляют стандарно отклонение, ***p <0,0001. Податоците во C, D, E и G се прикажани како средна вредност ± стандардна девијација, лентите за грешка ја претставуваат стандардната девијација, ***p <0,0001.