Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Okontrollerad blödning är en av de främsta dödsorsakerna. Att uppnå snabb hemostas säkerställer försökspersonens överlevnad som första hjälpen under strid, trafikolyckor och operationer för att minska dödsfall. Nanoporös fiberförstärkt kompositställning (NFRCS) härledd från en enkel hemostatisk filmbildande komposition (HFFC) som en kontinuerlig fas kan utlösa och förbättra hemostasen. Utvecklingen av NFRCS baseras på designen av trollsländans vinge. Trollsländans vingstruktur består av tvärgående och längsgående vingar, och vingmembranen är sammankopplade för att bibehålla mikrostrukturens integritet. HFFC täcker fiberns yta jämnt med en film av nanometertjocklek och sammankopplar den slumpmässigt fördelade bomullstjockleken (Ct) (dispergerad fas) för att bilda en nanoporös struktur. Kombinationen av kontinuerliga och dispergerade faser minskar produktkostnaden med tio gånger jämfört med kommersiellt tillgängliga produkter. Modifierade NFRCS (tamponger eller armband) kan användas i en mängd olika biomedicinska tillämpningar. In vivo-studier har dragit slutsatsen att den utvecklade Cp NFRCS utlöser och förstärker koagulationsprocessen vid applikationsstället. NFRCS kan modulera mikromiljön och verka på cellnivå tack vare sin nanoporösa struktur, vilket resulterar i bättre sårläkning i excisionssårmodellen.
Okontrollerad blödning under strid, intraoperativa och akuta situationer kan utgöra ett allvarligt hot mot de sårades liv1. Dessa tillstånd leder ytterligare till en generell ökning av perifert kärlmotstånd, vilket leder till hemorragisk chock. Lämpliga åtgärder för att kontrollera blödning under och efter operation anses potentiellt livshotande2,3. Skador på stora kärl leder till massiv blodförlust, vilket resulterar i en dödlighet på ≤ 50 % i strid och 31 % under operation1. Massiv blodförlust leder till en minskning av kroppsvolymen, vilket minskar hjärtminutvolymen. En ökning av totalt perifert kärlmotstånd och en progressiv försämring av mikrocirkulationen leder till hypoxi i livsuppehållande organ. Hemorragisk chock kan uppstå om tillståndet fortsätter utan effektiv intervention1,4,5. Andra komplikationer inkluderar progression av hypotermi och metabolisk acidos, samt en koagulationsstörning som hindrar koagulationsprocessen. Allvarlig hemorragisk chock är förknippad med en högre risk för död6,7,8. Vid grad III (progressiv) chock är blodtransfusion avgörande för patientens överlevnad under intraoperativ och postoperativ sjuklighet och dödlighet. För att övervinna alla ovanstående livshotande situationer har vi utvecklat en nanoporös fiberförstärkt kompositställning (NFRCS) som använder en minimal polymerkoncentration (0,5 %) med hjälp av en kombination av vattenlösliga hemostatiska polymerer.
Med hjälp av fiberförstärkning kan kostnadseffektiva produkter utvecklas. De slumpmässigt arrangerade fibrerna liknar strukturen hos en trollsländas vinge, balanserade av de horisontella och vertikala ränderna på vingarna. Vingens tvärgående och längsgående vener kommunicerar med vingmembranet (Fig. 1). NFRCS består av förstärkt Ct som ett ställningssystem med bättre fysisk och mekanisk hållfasthet (Figur 1). På grund av överkomliga priser och hantverksskicklighet föredrar kirurger att använda bomullstrådsgivare (Ct) under operationer och förband. Med tanke på dess många fördelar, inklusive > 90 % kristallin cellulosa (som bidrar till att förbättra den hemostatiska aktiviteten), användes Ct som ett skelettsystem för NFRCS9,10. Med tanke på dess många fördelar, inklusive > 90 % kristallin cellulosa (som bidrar till att förbättra den hemostatiska aktiviteten), användes Ct som ett skelettsystem för NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристаллической целлюческой целючавы гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Med tanke på dess många fördelar, inklusive >90 % kristallin cellulosa (involverad i ökad hemostatisk aktivitet), användes Ct därför som NFRCS-skelettsystem9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强歼血洠，t被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Med tanke på dess många fördelar, inklusive över 90 % kristallin cellulosa (hjälper till att förbättra den hemostatiska aktiviteten), användes Ct därför som ett stöd för NFRCS9,10.Ct belades ytligt (nano-tjock filmbildning observerades) och sammankopplades med en hemostatisk filmbildande komposition (HFFC). HFFC fungerar som en matrigel som håller ihop slumpmässigt placerad Ct. Den utvecklade designen överför spänningar inom den dispergerade fasen (förstärkande fibrer). Det är svårt att erhålla nanoporösa strukturer med god mekanisk hållfasthet med minimala polymerkoncentrationer. Dessutom är det inte lätt att anpassa olika formar för olika biomedicinska tillämpningar.
Figuren visar ett diagram över NFRCS-designen baserad på trollsländans vingstruktur (A). Denna bild visar en jämförande analogi av vingstrukturen hos en trollslända (vingens korsande och längsgående vener är sammankopplade) och ett tvärsnittsmikroskopfoto av Cp NFRCS (B). Schematisk representation av NFRCS.
NFRC utvecklades med HFFC som en kontinuerlig fas för att hantera ovanstående begränsningar. HFFC består av olika filmbildande hemostatiska polymerer, inklusive kitosan (som den huvudsakliga hemostatiska polymeren) med metylcellulosa (MC), hydroxipropylmetylcellulosa (HPMC 50 cp) och polyvinylalkohol (PVA) (125 kDa) som en stödpolymer som främjar trombbildning. Tillsatsen av polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) förbättrade fuktabsorptionskapaciteten hos NFRCS. Polyetylenglykol 400 (PEG 400) tillsattes för att förbättra polymertvärbindningen i bundna polymerblandningar. Tre olika HFFC-hemostatiska kompositioner (Cm HFFC, Ch HFFC och Cp HFFC), nämligen kitosan med MC (Cm), kitosan med HPMC (Ch) och kitosan med PVA (Cp), applicerades på Ct. Olika in vitro- och in vivo-karakteriseringsstudier har bekräftat den hemostatiska och sårläkande aktiviteten hos NFRCS. Kompositmaterial som erbjuds av NFRCS kan användas för att anpassa olika former av byggnadsställningar för att möta specifika behov.
Dessutom kan NFRCS modifieras som ett bandage eller en rulle för att täcka hela skadeområdet på nedre extremiteterna och andra delar av kroppen. Specifikt för skador i stridsbenen kan den utformade NFRCS-designen ändras till en halv arm eller ett helt ben (kompletterande figur S11). NFRCS kan göras om till ett armband med vävnadslim, vilket kan användas för att stoppa blödningar från allvarliga självmordsrelaterade handledsskador. Vårt huvudmål är att utveckla ett NFRCS med så lite polymer som möjligt som kan levereras till en stor befolkning (under fattigdomsgränsen) och som kan placeras i en första hjälpen-låda. NFRCS är enkelt, effektivt och ekonomiskt i designen och gynnar lokalsamhällen och kan ha en global inverkan.
Kitosan (molekylvikt 80 kDa) och amarant köptes från Merck, Indien. Hydroxipropylmetylcellulosa 50 Cp, polyetylenglykol 400 och metylcellulosa köptes från Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polyvinylalkohol (molekylvikt 125 kDa) (87–90 % hydrolyserad) köptes från National Chemicals, Gujarat. Polyvinylpyrrolidin K30 köptes från Molychem, Mumbai, och sterila prover köptes från Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q-vatten (Direct-Q3 vattenreningssystem, Merck, Indien) som bärare.
NFRCS utvecklades med hjälp av en frystorkningsmetod11,12. Alla HFFC-kompositioner (tabell 1) framställdes med hjälp av en mekanisk omrörare. Framställ en 0,5 % lösning av kitosan med 1 % ättiksyra i vatten genom kontinuerlig omrörning vid 800 rpm på en mekanisk omrörare. Den exakta vikten av den laddade polymeren som anges i tabell 1 tillsattes till kitosanlösningen och omrördes tills en klar polymerlösning erhölls. PVP K30 och PEG 400 tillsattes till den resulterande blandningen i de mängder som anges i tabell 1, och omrörningen fortsatte tills en klar viskös polymerlösning erhölls. Det resulterande badet av polymerlösning sonikerades i 60 minuter för att avlägsna instängda luftbubblor från polymerblandningen. Som visas i kompletterande figur S1(b) fördelades Ct jämnt i varje brunn i en 6-brunnsplatta (form) kompletterad med 5 ml HFFC.
Sexbrunnsplattan sonikerades i 60 minuter för att uppnå jämn vätning och distribution av HFFC i Ct-nätverket. Därefter frystes sexbrunnsplattan vid -20 °C i 8–12 timmar. Frysplattorna frystorkades i 48 timmar för att erhålla olika formuleringar av NFRCS. Samma procedur används för att producera olika former och strukturer, såsom tamponger eller cylindriska tamponger, eller någon annan form för olika tillämpningar.
Noggrant vägd kitosan (80 kDa) (3 %) löses i 1 % ättiksyra med hjälp av en magnetomrörare. Till den resulterande kitosanlösningen tillsattes 1 % PEG 400 och omrördes i 30 minuter. Häll den resulterande lösningen i en kvadratisk eller rektangulär behållare och frys vid -80 °C i 12 timmar. Frysta prover frystorkades i 48 timmar för att erhålla porös Cs13.
Det utvecklade NFRCS-provet experimenterades med Fouriertransformerad infrarödspektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) för att bekräfta kitosans kemiska kompatibilitet med andra polymerer14,15. FTIR-spektra (spektralområdets bredd från 400 till 4000 cm-1) för alla testade prover erhölls genom att utföra 32 skanningar.
Blodabsorptionshastigheten (BAR) för alla formuleringar utvärderades med hjälp av metoden som beskrivs av Chen et al. 16 med smärre modifieringar. De utvecklade NFRK:erna för alla kompositioner torkades i en vakuumugn vid 105 °C över natten för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel. 30 mg NFRCS (initial provvikt – W0) och 30 mg Ct (positiv kontroll) placerades i separata skålar innehållande en förblandning av 3,8 % natriumcitrat. Vid förutbestämda tidsintervall, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 och 60 sekunder, avlägsnades NFRCS och deras ytor rengjordes från oabsorberat blod genom att proverna placerades på Ct i 30 sekunder. Den slutliga vikten av blod som absorberats av NFRCS 16 beaktades (W1) vid varje tidpunkt. Beräkna BAR-procenten med hjälp av följande formel:
Blodkoagulationstiden (BCT) bestämdes enligt Wang et al. 17. Den tid som krävdes för helblod (råttblod förblandat med 3,8 % natriumcitrat) att koagulera i närvaro av NFRCS beräknades som BCT för testprovet. De olika NFRCS-komponenterna (30 mg) placerades i 10 ml skruvkorkflaskor och inkuberades vid 37 °C. Blod (0,5 ml) tillsattes till flaskan och 0,3 ml 0,2 M CaCl2 tillsattes för att aktivera blodkoagulationen. Slutligen, vänd flaskan upp och ner var 15:e sekund (upp till 180 °) tills en fast koagel bildades. BCT för provet uppskattas genom antalet vändningar av flaskorna 17,18. Baserat på BCT valdes två optimala kompositioner från NFRCS Cm, Ch och Cp för vidare karakteriseringsstudier.
BCT för Ch NFRCS- och Cp NFRCS-kompositioner bestämdes genom att implementera metoden som beskrivs av Li et al. 19. Placera 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs (positiv kontroll) i separata petriskålar (37 °C). Blod innehållande 3,8 % natriumcitrat blandades med 0,2 M CaCl2 i ett volymförhållande på 10:1 för att starta blodkoaguleringsprocessen. 20 µl av 0,2 M CaCl2 råttblodsblandning applicerades på provytan och placerades i en tom petriskål. Kontrollen var blod som hälldes i tomma petriskålar utan Ct. Med fasta intervall på 0, 3 och 5 minuter, stoppa koaguleringen genom att tillsätta 10 ml avjoniserat (DI) vatten till provet som innehöll skålen utan att störa koagulen. Okoagulerade erytrocyter (erytrocyter) genomgår hemolys i närvaro av avjoniserat vatten och frisätter hemoglobin. Hemoglobin vid olika tidpunkter (HA(t)) mättes vid 540 nm (λmax hemoglobin) med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer. Den absoluta absorptionen av hemoglobin (AH(0)) på 0 minuter av 20 µl blod i 10 ml avjoniserat vatten användes som referensstandard. Det relativa hemoglobinupptaget (RHA) i koagulerat blod beräknades från förhållandet HA(t)/HA(0) med samma blodsats.
Med hjälp av en texturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) bestämdes NFRK:s vidhäftningsegenskaper till skadad vävnad. Pressade en öppen cylindrisk skål mot insidan av fläskskinnet (utan fettlagret). Prover (Ch NFRCS och Cp NFRCS) applicerades via kanyl i cylindriska formar för att skapa vidhäftning till grisens hud. Efter 3 minuters inkubation vid rumstemperatur (RT) (25 °C) registrerades NFRCS vidhäftningsstyrka med en konstant hastighet av 0,5 mm/sek.
Huvudfunktionen hos kirurgiska förseglingsmedel är att öka blodkoagulationen samtidigt som blodförlusten minskas. Förlustfri koagulation i NFRCS utvärderades med hjälp av en tidigare publicerad metod med smärre modifieringar 19. Tillverka ett mikrocentrifugrör (2 ml) (innerdiameter 10 mm) med ett 8 × 5 mm2 hål på ena sidan av centrifugröret (vilket representerar ett öppet sår). NFRCS används för att stänga öppningen och tejp används för att försegla ytterkanterna. Tillsätt 20 µl 0,2 M CaCl2 till mikrocentrifugröret innehållande 3,8% natriumcitrat-premixen. Efter 10 minuter togs mikrocentrifugrören bort från skålarna och ökningen av skålarnas massa bestämdes på grund av blodutflödet från NFRK (n = 3). Blodförlust Ch NFRCS och Cp NFRCS jämfördes med Cs.
Våtintegriteten hos NFRCS bestämdes baserat på metoden som beskrivs av Mishra och Chaudhary21 med mindre modifieringar. Placera NFRCS i en 100 ml Erlenmeyerkolv med 50 ml vatten och virvla i 60 sekunder utan att en topp bildas. Visuell inspektion och prioritering av prover för fysisk integritet baserat på insamling.
Bindningsstyrkan hos HFFC till Ct studerades med tidigare publicerade metoder med mindre modifieringar. Ytbeläggningens integritet bedömdes genom att exponera NFRK för akustiska vågor (extern stimulus) i närvaro av milliQ-vatten (Ct). De utvecklade NFRCS Ch NFRCS och Cp NFRCS placerades i en bägare fylld med vatten och sonikerades i 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 respektive 30 minuter. Efter torkning användes den procentuella skillnaden mellan den initiala och slutliga vikten av NFRCS för att beräkna den procentuella materialförlusten (HFFC). In vitro BCT stödde ytterligare bindningsstyrkan eller förlusten av ytmaterial. Effektiviteten av HFFC-bindning till Ct ger blodkoagulation och en elastisk beläggning på ytan av Ct22.
Homogeniteten hos den utvecklade NFRCS bestämdes genom BCT av prover (30 mg) tagna från slumpmässigt utvalda allmänna platser inom NFRCS. Följ den tidigare nämnda BCT-proceduren för att bestämma NFRCS-överensstämmelse. Närhet mellan alla fem prover säkerställer enhetlig yttäckning och HFFC-deponering i Ct-nätet.
Den nominella blodkontaktytan (NBCA) bestämdes som tidigare rapporterats med vissa modifieringar. Koagulera blodet genom att klämma 20 µl blod mellan de två ytorna av Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs. Efter 1 timme separerades de två delarna av stenten och koaguleringsytan mättes manuellt. Medelvärdet av tre repetitioner ansågs vara NBCA NFRCS19.
Dynamisk ångsorptionsanalys (DVS) användes för att utvärdera effektiviteten hos NFRCS för att absorbera vatten från den yttre miljön eller från det skadade området som initierar koaguleringen. DVS utvärderar eller registrerar ångupptaget och ångförlusten i ett prov gravimetriskt med hjälp av en ultrakänslig våg med en massupplösning på ±0,1 µg. Ett partiellt ångtryck (relativ fuktighet) genereras av en elektronisk massflödesregulator runt provet genom att blanda mättade och torra bärargaser. Enligt Europeiska farmakopéns riktlinjer kategoriserades proverna i fyra kategorier (0–0,012 % w/w− icke-hygroskopiska, 0,2–2 % w/w svagt hygroskopiska, 2–15 % måttligt hygroskopiska och > 15 % mycket hygroskopiska)23, baserat på provernas andel fuktupptag. Enligt Europeiska farmakopéns riktlinjer kategoriserades proverna i fyra kategorier (0–0,012 % w/w− icke-hygroskopiska, 0,2–2 % w/w svagt hygroskopiska, 2–15 % måttligt hygroskopiska och > 15 % mycket hygroskopiska)23, baserat på provernas andel fuktupptag.I enlighet med rekommendationerna i Europeiska farmakopén delades proverna in i fyra kategorier (0–0,012 % w/w – icke-hygroskopisk, 0,2–2 % w/w svagt hygroskopisk, 2–15 %), beroende på provernas andel fuktabsorption.% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % måttligt hygroskopisk och > 15 % mycket hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w-非吸湿性、0,2-2 % w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 刱为 分为 刱为 ,0＆为 ,0＆为W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23I enlighet med rekommendationerna i Europeiska farmakopén delas prover in i fyra klasser beroende på hur mycket fukt som provet absorberar (0–0,012 viktprocent – ​​icke-hygroskopiskt, 0,2–2 viktprocent – ​​lätt hygroskopiskt, 2–15 viktprocent).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % måttligt hygroskopisk, > 15 % mycket hygroskopisk) 23.Den hygroskopiska effektiviteten hos NFCS X NFCS och TsN NFCS bestämdes på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA. Under denna process erhölls körtid, relativ fuktighet (RH) och provvikt i realtid vid 25 °C24. Fukthalten beräknas genom noggrann NFRCS-massanalys med följande ekvation:
MC är NFRCS-fuktighet. m1 – torrvikten för NSAID:er. m2 är NFRCS-massan i realtid vid en given RH.
Den totala ytarean uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr). Den totala ytarean uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азозотом образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Den totala ytarean uppskattades med hjälp av ett kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts vid 25 °C i 10 timmar (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计怂觯逢积鯝+25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотро образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Den totala ytarean uppskattades med hjälp av kväveadsorptionsexperiment med flytande kväve efter att proverna tömts i 10 timmar vid 25 °C (< 7 x 10⁻³ torr).Total ytarea, porvolym och NFRCS-porstorlek bestämdes med en Quantachrome från NOVA 1000e, Österrike, med användning av RS 232-programvara.
Bered 5 % erytrocyter (saltlösning som utspädningsmedel) från helblod. Överför sedan en alikvot av HFFC (0,25 ml) till en 96-brunnsplatta och 5 % erytrocytmassa (0,1 ml). Inkubera blandningen vid 37 °C i 40 minuter. En blandning av röda blodkroppar och serum betraktades som positiv kontroll och en blandning av saltlösning och röda blodkroppar som negativ kontroll. Hemagglutination bestämdes enligt Stajitzky-skalan. De föreslagna skalorna är följande: + + + + täta granulära aggregat; + + + släta bottendynor med böjda kanter; + + släta bottendynor med trasiga kanter; + smala röda ringar runt kanterna på de släta dynorna; – (negativ) diskret röd knapp 12 i mitten av den nedre brunnen.
Hemokompatibiliteten hos NFRCS studerades enligt metoden från International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Den gravimetriska metoden som beskrivs av Singh et al. Mindre modifieringar gjordes för att bedöma trombbildning i närvaro av eller på ytan av NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS och Cp NFRCS inkuberades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 24 timmar vid 37°C. Efter 24 timmar avlägsnades PBS och NFRCS behandlades med 2 ml blod innehållande 3,8 % natriumcitrat. Tillsätt 0,04 ml 0,1 M CaCl2 till de inkuberade proverna på ytan av NFRCS. Efter 45 minuter tillsattes 5 ml destillerat vatten för att stoppa koaguleringen. Koagulerat blod på ytan av NFRK behandlades med 36–38 % formaldehydlösning. De koagulerade blodproppen som fixerats med formaldehyd torkades och vägdes. Procentandelen trombos uppskattades genom att beräkna vikten av glaset utan blod och prov (negativ kontroll) och glaset med blod (positiv kontroll).
Som en initial bekräftelse visualiserades proverna under ett optiskt mikroskop för att förstå förmågan hos HFFC-ytbeläggningen, sammankopplade Ct och Ct-nätverk att bilda porer. Tunna snitt av Ch och Cp från NFRCS trimmades med ett skalpellblad. Den resulterande sektionen placerades på ett objektglas, täcktes med ett täckglas och kanterna fixerades med lim. De förberedda objektglasen undersöktes under ett optiskt mikroskop och fotografier togs med olika förstoringsgrader.
Polymeravsättning i Ct-nätverk visualiserades med hjälp av fluorescensmikroskopi baserat på metoden som beskrivs av Rice et al. 29. HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant), och NFRCS (Ch & Cp) framställdes enligt den tidigare nämnda metoden. HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant), och NFRCS (Ch & Cp) framställdes enligt den tidigare nämnda metoden.HFFC-kompositionen som användes för formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (amarant) och NFRCS (Ch och Cp) erhölls enligt den tidigare nämnda metoden.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的CS（ &ChNFR Cp）.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的CS（ &ChNFR Cp）.HFFC-kompositionen som användes i formuleringen blandades med ett fluorescerande färgämne (Amaranth) och fick NFRCS (Ch och Cp), såsom nämnts tidigare.Tunna sektioner av NFRK skars ut från de erhållna proverna, placerades på objektglas och täcktes med täckglas. Observera de förberedda objektglasen under ett fluorescerande mikroskop med ett grönt filter (310–380 nm). Bilder togs med 4x förstoring för att förstå Ct-förhållanden och överskottspolymeravsättning i Ct-nätverket.
Yttopografin för NFRCS Ch och Cp bestämdes med hjälp av ett atomkraftsmikroskop (AFM) med en ultraskarp TESP-utkragning i tappningsläge: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2–5 nm, Bruker, Taiwan. Ytjämnheten bestämdes med root mean square (RMS) med hjälp av programvara (Scanning Probe Image Processor). Olika NFRCS-positioner återgavs på 3D-bilder för att kontrollera ytjämnheten. Standardavvikelsen för poängen för ett givet område definieras som ytjämnheten. RMS-ekvationen användes för att kvantifiera ytjämnheten för NFRCS31.
FESEM-baserade studier utfördes med FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, för att förstå ytmorfologin hos Ch NFRCS och Cp NFRCS, vilka visade bättre BCT än Cm NFRCS. FESEM-studien utfördes enligt metoden beskriven av Zhao et al. 32 med mindre modifieringar. NFRCS 20 till 30 mg Ch NFRCS och Cp NFRCS förblandades med 20 µl 3,8 % natriumcitrat förblandat med råttblod. 20 µl 0,2 M CaCl2 tillsattes till de blodbehandlade proverna för att initiera koagulering och proverna inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. Dessutom avlägsnades överskott av erytrocyter från NFRCS-ytan genom sköljning med saltlösning.
Efterföljande prover behandlades med 0,1 % glutaraldehyd och torkades sedan i en varmluftsugn vid 37 °C för att avlägsna fukt. De torkade proverna belades och analyserades 32. Andra bilder som erhölls under analysen var koagelbildning på ytan av individuella bomullsfibrer, polymeravsättning mellan Ct, erytrocytmorfologi (form), koagelintegritet och erytrocytmorfologi i närvaro av NFRCS. Obehandlade NFRCS-områden och Ch- och Cp-behandlade NFRCS-områden inkuberade med blod skannades för elementära joner (natrium, kalium, kväve, kalcium, magnesium, zink, koppar och selen) 33. Jämför elementära jonprocentandelar mellan behandlade och obehandlade prover för att förstå elementärjonackumulering under koagelbildning och koagelhomogenitet.
Tjockleken på Cp HFFC-ytbeläggningen på Ct-ytan bestämdes med hjälp av FESEM. Tvärsnitten av Cp NFRCS skars ut från ramverket och sputterbelades. De resulterande sputterbeläggningsproverna observerades med FESEM och tjockleken på ytbeläggningen mättes 34, 35, 36.
Röntgen-mikro-CT ger högupplöst 3D-icke-destruktiv avbildning och låter dig studera den interna strukturella arrangemanget av NFRK. Mikro-CT använder en röntgenstråle som passerar genom provet för att registrera den lokala linjära dämpningskoefficienten för röntgenstrålarna i provet, vilket hjälper till att erhålla morfologisk information. Den interna placeringen av Ct i Cp NFRCS och blodbehandlade Cp NFRCS undersöktes med mikro-CT för att förstå absorptionseffektivitet och blodkoagulering i närvaro av NFRCS37,38,39. 3D-strukturerna hos blodbehandlade och obehandlade Cp NFRCS-prover rekonstruerades med mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland). Med hjälp av VG STUDIO-MAX-programvara version 2.2 togs flera röntgenbilder från olika vinklar (helst 360° täckning) för att utveckla 3D-bilder för NFRCS. De insamlade projektionsdata rekonstruerades till 3D-volymetriska bilder med hjälp av motsvarande enkla 3D ScanIP Academic-programvara.
För att förstå koagelns distribution tillsattes dessutom 20 µl förblandat citrerat blod och 20 µl 0,2 M CaCl2 till NFRCS för att initiera blodkoagulering. De preparerade proverna får härda. NFRK-ytan behandlades med 0,5 % glutaraldehyd och torkades i en varmluftsugn vid 30–40 °C i 30 minuter. Blodproppen som bildats på NFRCS skannades, rekonstruerades och en 3D-bild av blodproppen visualiserades.
Antibakteriella analyser utfördes på Cp NFRCS (bäst jämfört med Ch NFRCS) med den tidigare beskrivna metoden med mindre modifieringar. Den antibakteriella aktiviteten hos Cp NFRCS och Cp HFFC bestämdes med hjälp av tre olika testmikroorganismer [S. aureus (grampositiva bakterier), E. coli (gramnegativa bakterier) och vit Candida (C. albicans)] som odlades på agar i petriskålar i en inkubator. Inokulera jämnt 50 ml av den utspädda bakteriekultursuspensionen vid en koncentration av 105-106 CFU ml-1 på agarmediet. Häll mediet i en petriskål och låt det stelna. Brunnar gjordes på agarplattans yta för att fyllas med HFFC (3 brunnar för HFFC och 1 för negativ kontroll). Tillsätt 200 µl HFFC till 3 brunnar och 200 µl pH 7,4 PBS till den fjärde brunnen. På andra sidan av petriskålen placerar du en 12 mm Cp NFRCS-skiva på den stelnade agarn och fuktar med PBS (pH 7,4). Ciprofloxacin-, ampicillin- och flukonazoltabletter anses vara referensstandarder för Staphylococcus aureus, Escherichia coli och Candida albicans. Mät inhiberingszonen manuellt och ta en digital bild av inhiberingszonen.
Efter institutionellt etiskt godkännande genomfördes studien vid Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i södra Indien. In vitro-TEG-experimentprotokollet har granskats och godkänts av den institutionella etikkommittén vid Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Försökspersonerna rekryterades från frivilliga blodgivare (i åldern 18 till 55) från sjukhusets blodbank. Dessutom erhölls ett informerat samtyckesformulär från volontärerna för insamling av blodprover. Naturligt TEG (N-TEG) ​​användes för att studera effekten av Cp HFFC-formuleringen på helblod förblandat med natriumcitrat. N-TEG är allmänt erkänt för sin roll vid återupplivning på vårdplatsen, vilket skapar problem för kliniker på grund av risken för kliniskt signifikant försening av resultat (rutinmässiga koagulationstester). N-TEG-analys utfördes med helblod. Informerat samtycke och detaljerad sjukdomshistoria erhölls från alla deltagare. Studien inkluderade inte deltagare med hemostatiska eller trombotiska komplikationer såsom graviditet/postpartum eller leversjukdom. Försökspersoner som tar läkemedel som påverkar koagulationskaskaden exkluderades också från studien. Grundläggande laboratorietester (hemoglobin, protrombintid, aktiverat tromboplastin och trombocytantal) utfördes på alla deltagare enligt standardprocedurer. N-TEG bestämmer blodkoaglets viskoelasticitet, initial koagelstruktur, partikelinteraktion, koagelförstärkning och koagellys. N-TEG-analysen ger grafiska och numeriska data om de kollektiva effekterna av flera cellulära element och plasma. N-TEG-analys utfördes på två olika volymer Cp HFFC (10 µl och 50 µl). Som ett resultat tillsattes 1 ml helblod med citronsyra till 10 µl Cp HFFC. Tillsätt 1 ml (Cp HFFC + citratblod), 340 µl blandat blod till 20 µl 0,2 M CaCl2-innehållande TEG-skål. Därefter laddades TEG-skålar i TEG® 5000, US för att mäta R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % av blodproverna i närvaro av Cp HFFC41.
In vivo-studieprotokollet granskades och godkändes av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alla djurförsök utfördes i enlighet med rekommendationerna från Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alla in vivo NFRCS-studier (2 × 2 cm2) utfördes på Wistar-honråttor (som vägde 200 till 250 g). Alla djur acklimatiserades vid en temperatur på 24–26 °C, djuren hade fri tillgång till standardfoder och vatten ad libitum. Alla djur delades slumpmässigt in i olika grupper, varje grupp bestod av tre djur. Alla studier utfördes i enlighet med Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Före studien sövdes djuren genom intraperitoneal (ip) administrering av en blandning av 20–50 mg ketamin (per 1 kg kroppsvikt) och 2–10 mg xylazin (per 1 kg kroppsvikt). Efter studien beräknades blödningsvolymen genom att utvärdera skillnaden mellan provernas initiala och slutliga vikt, varvid medelvärdet från de tre testerna togs som provets blödningsvolym.
En modell för amputation av råttsvans implementerades för att förstå potentialen hos NFRCS att modulera blödning vid trauma, strid eller trafikolyckor (skademodell). 50 % av svansen skars av med ett skalpellblad och placerades i luft i 15 sekunder för att säkerställa normal blödning. Dessutom placerades testprover på råttans svans genom att applicera tryck (Ct, Cs, Ch NFRCS och Cp NFRCS). Blödning och PCT rapporterades för testprover (n = 3)17,45.
Effektiviteten av NFRCS-tryckkontroll i strid undersöktes på en modell av den ytliga lårbensartären. Lårbensartären exponeras, punkteras med en 24G-trokar och blodas inom 15 sekunder. Efter att okontrollerad blödning observerats placeras testprovet på punkteringsstället med applicerat tryck. Omedelbart efter applicering av testprovet registrerades koagulationstiden och hemostatisk effektivitet observerades under de kommande 5 minuterna. Samma procedur upprepades med Cs och Ct46.
Dowling et al. 47 föreslog en leverskademodell för att bedöma den hemostatiska potentialen hos hemostatiska material i samband med intraoperativ blödning. BCT registrerades för Ct-prover (negativ kontroll), Cs-ramverk (positiv kontroll), Ch NFRCS-prover och Cp NFRCS-prover. Råttans suprahepatiska hålvener exponerades genom att utföra en median laparotomi. Därefter skars den distala delen av vänster lob ut med en sax. Gör ett snitt i levern med ett skalpellblad och låt den blöda i några sekunder. Noggrant vägda Ch NFRCS- och Cp NFRCS-testprover placerades på den skadade ytan utan något positivt tryck och BCT registrerades. Kontrollgruppen (Ct) applicerade sedan tryck följt av Cs 30 s47 utan att bryta skadan.
In vivo sårläkningsanalyser utfördes med hjälp av en excisionssårmodell för att utvärdera sårläkningsegenskaperna hos de utvecklade polymerbaserade NFRCS:erna. Modeller av excisionssår valdes ut och utfördes enligt tidigare publicerade metoder med mindre modifieringar19,32,48. Alla djur sövdes enligt tidigare beskrivning. Använd en biopsipunsch (12 mm) för att göra ett cirkulärt djupt snitt i huden på ryggen. Förberedda sårområden förbands med Cs (positiv kontroll), Ct (medvetet om att bomullsrondeller stör läkning), Ch NFRCS och Cp NFRCS (experimentgrupp) och en negativ kontroll utan någon behandling. Varje dag i studien mättes sårområdet hos alla råttor. Använd en digitalkamera för att ta en bild av sårområdet och sätta på ett nytt förband. Procentandelen sårförslutning mättes med följande formel:
Baserat på andelen sårförslutning på studiens 12:e dag skars råtthuden från den bästa gruppen ut ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) och studerades med H&E-färgning och Massons trikromfärgning. Baserat på andelen sårförslutning på studiens 12:e dag skars råtthuden från den bästa gruppen ut ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) och studerades med H&E-färgning och Massons trikromfärgning.Baserat på andelen sårförslutning på studiens 12:e dag skars huden på råttorna i den bästa gruppen ((Cp NFRCS) och kontrollgruppen) bort och undersöktes genom färgning med hematoxylin-eosin och Massons trikrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Råttor i den bästa gruppen ((Cp NFRCS) och kontrollgrupper) exciderades för hematoxylin-eosin-färgning och Massons trikrom-färgning baserat på procentuell sårförslutning på dag 12 av studien.Den implementerade färgningsproceduren utfördes enligt tidigare beskrivna metoder49,50. Kortfattat, efter fixering i 10 % formalin, dehydrerades proverna med hjälp av en serie graderade alkoholer. Använd en mikrotom för att erhålla tunna snitt (5 µm tjocka) av den borttagna vävnaden. Tunna seriesnitt av kontroller och Cp NFRCS behandlades med hematoxylin och eosin för att studera histopatologiska förändringar. Massons trikromfärgning användes för att detektera bildandet av kollagenfibriller. De erhållna resultaten studerades blint av patologer.
Stabiliteten hos Cp NFRCS-prover studerades vid rumstemperatur (25 °C ± 2 °C/60 % RF ± 5 %) i 12 månader51. Cp NFRCS (missfärgning av ytan och mikrobiell tillväxt) inspekterades visuellt och testades med avseende på vikningsbeständighet och BCT enligt ovanstående metoder som beskrivs i avsnittet Material och metoder.
Skalbarheten och reproducerbarheten hos Cp NFRCS undersöktes genom att framställa Cp NFRCS med en storlek på 15×15 cm2. Dessutom skars 30 mg prover (n = 5) ut från olika Cp NFRCS-fraktioner och BCT för de studerade proverna utvärderades enligt beskrivningen tidigare i metodavsnittet.
Vi har försökt utveckla olika former och strukturer med hjälp av Cp NFRCS-kompositioner för olika biomedicinska tillämpningar. Sådana former eller konfigurationer inkluderar koniska provpinnar för näsblod, tandbehandlingar och cylindriska provpinnar för vaginal blödning.
Alla datamängder uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse och analyserades med ANOVA med Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) följt av Bonferronis multipla jämförelsetest (*p < 0,05).
Alla procedurer som utfördes i studier på människor var i enlighet med Institutets och Nationella forskningsrådets standarder, samt Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess efterföljande ändringar, eller liknande etiska standarder. Alla deltagare informerades om studiens egenskaper och dess frivilliga natur. Deltagardata förblir konfidentiella efter insamling. In vitro TEG-experimentprotokollet har granskats och godkänts av den institutionella etikkommittén vid Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Volontärer undertecknade informerat samtycke till att samla in blodprover.
Alla procedurer som utförts i djurstudier utfördes i enlighet med Kastubas medicinska fakultet, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alla planerade djurförsök genomfördes i enlighet med riktlinjerna från kommittén för kontroll och övervakning av djurförsök (CPCSEA). Alla författare följer ARRIVE-riktlinjerna.
FTIR-spektra för alla NFRCS analyserades och jämfördes med kitosanspektrumet som visas i figur 2A. Karakteristiska spektraltoppar för kitosan (registrerade) vid 3437 cm⁻¹ (OH- och NH-sträckning, överlappning), 2945 och 2897 cm⁻¹ (CH-sträckning), 1660 cm⁻¹ (NH2-stam), 1589 cm⁻¹ (N–H-böjning), 1157 cm⁻¹ (bryggsträckning O-), 1067 cm⁻¹ (sträckning C–O, sekundär hydroxyl), 993 cm⁻¹ (sträckning CO, Bo-OH) 52, 53, 54. Kompletterande tabell S1 visar FTIR NFRCS-absorptionsspektrumvärden för kitosan (reporter), ren kitosan, Cm, Ch och Cp. FTIR-spektra för alla NFRCS (Cm, Ch och Cp) visade samma karakteristiska absorptionsband som ren kitosan utan några signifikanta förändringar (fig. 2A). FTIR-resultaten bekräftade avsaknaden av kemiska eller fysikaliska interaktioner mellan de polymerer som användes för att utveckla NFRCS, vilket indikerar att de använda polymererna är inerta.
In vitro-karakterisering av Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS och Cs. (A) representerar de kombinerade FTIR-spektra för kompositionerna av kitosan och Cm NFRCS, Ch NFRCS och Cp NFRCS under kompression. (B) a) Helblodsupptagshastighet för NFRCS Cm, Ch, Cp och Cg (n = 3); Ct-proverna visade en högre BAR eftersom bomullspinnen har en högre absorptionseffektivitet; b) Blod efter blod-absorption Illustration av det absorberade provet. Grafisk representation av BCT för testprov C (Cp NFRCS hade den bästa BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E och G visades som medelvärde ± SD, och felstaplarna representerar SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E och G visades som medelvärde ± SD, och felstaplarna representerar SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E och G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляюю отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E och G presenteras som medelvärde ± standardavvikelse, och felstaplarna representerar standardavvikelsen, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E och G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предартедставля отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E och G visas som medelvärde ± standardavvikelse, felstaplar representerar standardavvikelse, ***p < 0,0001.