Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Неконтролисано крварење је један од водећих узрока смрти. Постизање брзе хемостазе осигурава преживљавање субјекта као прва помоћ током борбе, саобраћајних несрећа и операција за смањење смртности. Нанопорозни влакнима ојачани композитни скелет (NFRCS) изведен из једноставног хемостатског састава који формира филм (HFFC) као континуиране фазе може покренути и побољшати хемостазу. Развој NFRCS-а заснива се на дизајну крила вилиног коњица. Структура крила вилиног коњица састоји се од попречних и уздужних крила, а мембране крила су повезане једна са другом како би се одржао интегритет микроструктуре. HFFC равномерно прекрива површину влакана филмом нанометарске дебљине и повезује насумично распоређену дебљину памука (Ct) (дисперзована фаза) да би се формирала нанопорозна структура. Комбинација континуиране и дисперзоване фазе смањује цену производа десет пута у поређењу са комерцијално доступним производима. Модификовани NFRCS (тампони или наруквице) могу се користити у различитим биомедицинским применама. Студије in vivo су закључиле да развијени Cp NFRCS покреће и побољшава процес коагулације на месту примене. НФРЦС може модулирати микроокружење и деловати на ћелијском нивоу због своје нанопорозне структуре што резултира бољим зарастањем рана у моделу ексцизионе ране.
Неконтролисано крварење током борбе, интраоперативних и ванредних ситуација може представљати озбиљну претњу по живот рањеника1. Ова стања додатно доводе до укупног повећања периферног васкуларног отпора, што доводи до хеморагичног шока. Одговарајуће мере за контролу крварења током и након операције сматрају се потенцијално опасним по живот2,3. Оштећење великих крвних судова доводи до масивног губитка крви, што резултира стопом морталитета од ≤ 50% у борби и 31% током операције1. Масовни губитак крви доводи до смањења телесног волумена, што смањује срчани излаз. Повећање укупног периферног васкуларног отпора и прогресивно оштећење микроциркулације доводе до хипоксије у органима који одржавају живот. Хеморагични шок може се јавити ако се стање настави без ефикасне интервенције1,4,5. Друге компликације укључују прогресију хипотермије и метаболичке ацидозе, као и поремећај коагулације који омета процес коагулације. Тешки хеморагични шок повезан је са већим ризиком од смрти6,7,8. Код шока трећег степена (прогресивног), трансфузија крви је неопходна за преживљавање пацијента током интраоперативног и постоперативног морбидитета и морталитета. Да бисмо превазишли све горе наведене ситуације опасне по живот, развили смо нанопорозни композитни скелет ојачан влакнима (NFRCS) који користи минималну концентрацију полимера (0,5%) користећи комбинацију хемостатских полимера растворљивих у води.
Употребом влакана за ојачање могу се развити исплативи производи. Насумично распоређена влакна подсећају на структуру крила вилиног коњица, уравнотежену хоризонталним и вертикалним пругама на крилима. Попречне и уздужне вене крила комуницирају са мембраном крила (Сл. 1). NFRCS се састоји од ојачаног Ct као система скеле са бољом физичком и механичком чврстоћом (Слика 1). Због приступачности и израде, хирурзи више воле да користе памучне конце (Ct) током операција и превијања. Стога, с обзиром на његове вишеструке предности, укључујући > 90% кристалне целулозе (доприноси побољшању хемостатске активности), Ct је коришћен као скелетни систем NFRCS9,10. Стога, с обзиром на његове вишеструке предности, укључујући > 90% кристалне целулозе (доприноси побољшању хемостатске активности), Ct је коришћен као скелетни систем NFRCS9,10. Следовательно, уважаа его многочисленние преимусества, в том числе > 90% кристаллическој целулози (учествует в повећане хемостатическе активности), Цт использовал в качественој скелетној системи НФРЦС9,10. Стога, с обзиром на његове бројне предности, укључујући >90% кристалне целулозе (укључене у повећану хемостатску активност), Ct је коришћен као скелетни систем NFRCS9,10.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90% 的结晶纤维素 (有助于增强止血漴Ｚ止血漴)被用作НФРЦС9,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处, 包括> 90%Стога, с обзиром на његове бројне предности, укључујући преко 90% кристалне целулозе (помаже у побољшању хемостатске активности), Ct је коришћен као скела за NFRCS9,10.Ct је површински обложен (примећено је формирање нано-дебелог филма) и међусобно повезан са хемостатским саставом који формира филм (HFFC). HFFC делује као матригел, држећи насумично постављени Ct заједно. Развијени дизајн преноси напрезање унутар дисперговане фазе (ојачујући влакна). Тешко је добити нанопорозне структуре са добром механичком чврстоћом коришћењем минималних концентрација полимера. Поред тога, није лако прилагодити различите калупе за различите биомедицинске примене.
Слика приказује дијаграм дизајна NFRCS-а заснованог на структури крила вилиног коњица (А). Ова слика приказује упоредну аналогију структуре крила вилиног коњица (укрштене и уздужне вене крила су међусобно повезане) и фотомикрографију попречног пресека Cp NFRCS-а (Б). Шематски приказ NFRCS-а.
НФРЦ су развијени коришћењем ХФЦ као континуиране фазе како би се решила горе наведена ограничења. ХФЦ је састављен од различитих хемостатских полимера који формирају филм, укључујући хитозан (као главни хемостатски полимер) са метилцелулозом (МЦ), хидроксипропил метилцелулозом (ХПМЦ 50 цп) и поливинил алкохолом (ПВА) (125 кДа) као носећим полимером који подстиче стварање тромба. Додавање поливинилпиролидина К30 (ПВП К30) побољшало је капацитет апсорпције влаге НФРЦС-а. Полиетилен гликол 400 (ПЕГ 400) је додат да би се побољшало умрежавање полимера у везаним полимерним мешавинама. Три различита хемостатска састава ХФЦС-а (Цм ХФЦС, Цх ХФЦС и Цп ХФЦС), наиме хитозан са МЦ (Цм), хитозан са ХПМЦ (Цх) и хитозан са ПВА (Цп), примењени су на Цт. Различите студије карактеризације ин витро и ин виво потврдиле су хемостатску активност и активност зарастања рана НФРЦС-а. Композитни материјали које нуди NFRCS могу се користити за прилагођавање различитих облика скела како би се задовољиле специфичне потребе.
Поред тога, НФРЦС се може модификовати као завој или ролна како би се покрило целокупно подручје повреде доњих екстремитета и других делова тела. Посебно за повреде удова у борби, дизајнирани НФРЦС дизајн може се променити у пола руке или целе ноге (Додатна слика С11). НФРЦС се може направити у наруквицу са лепком за ткиво, која се може користити за заустављање крварења од тешких самоубилачких повреда зглоба. Наш главни циљ је да развијемо НФРЦС са што је могуће мање полимера који се може испоручити великој популацији (испод границе сиромаштва) и који се може ставити у комплет прве помоћи. Једноставан, ефикасан и економичан по дизајну, НФРЦС користи локалним заједницама и може имати глобални утицај.
Хитозан (молекулска тежина 80 kDa) и амарант су купљени од компаније Merck, Индија. Хидроксипропил метилцелулоза 50 Cp, полиетилен гликол 400 и метилцелулоза су купљени од компаније Loba Chemie Pvt. LLC, Мумбај. Поливинил алкохол (молекулска тежина 125 kDa) (87-90% хидролизован) је купљен од компаније National Chemicals, Гуџарат. Поливинилпиролидин K30 је купљен од компаније Molychem, Мумбај, стерилни брисеви су купљени од компаније Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Тамил Наду, са водом Milli Q (Direct-Q3 систем за пречишћавање воде, Merck, Индија) као носачем.
NFRCS је развијен коришћењем методе лиофилизације11,12. Сви састави HFFC-а (Табела 1) су припремљени коришћењем механичке мешалице. Припремити 0,5% раствор хитозана користећи 1% сирћетне киселине у води континуираним мешањем на 800 о/мин на механичкој мешалици. Тачна тежина напуњеног полимера наведена у Табели 1 је додата у раствор хитозана и мешана док се није добио бистар раствор полимера. PVP K30 и PEG 400 су додати у добијену смешу у количинама наведеним у Табели 1, и мешање је настављено док се није добио бистар вискозни раствор полимера. Добијена купка раствора полимера је соницирана 60 минута да би се уклонили заробљени мехурићи ваздуха из полимерне смеше. Као што је приказано на Додатној слици S1(b), Ct је равномерно распоређен у сваком бунарићу плоче (калупа) са 6 бунарића допуњеног са 5 ml HFFC-а.
Плоча са шест бунарића је соницирана 60 минута како би се постигло равномерно влажење и расподела HFFC-а у Ct мрежи. Затим је плоча са шест бунарића замрзнута на -20°C током 8-12 сати. Замрзнуте плоче су лиофилизоване 48 сати да би се добиле различите формулације NFRCS-а. Исти поступак се користи за производњу различитих облика и структура, као што су тампони или цилиндрични тампони, или било који други облик за различите примене.
Прецизно измерени хитозан (80 kDa) (3%) је растворен у 1% сирћетној киселини помоћу магнетне мешалице. Добијеном раствору хитозана је додат 1% PEG 400 и мешан 30 минута. Сипати добијени раствор у квадратну или правоугаону посуду и замрзнути на -80°C током 12 сати. Замрзнути узорци су лиофилизовани 48 сати да би се добио порозни Cs13.
Развијени NFRCS је подвргнут експериментима коришћењем Фуријеове трансформационе инфрацрвене спектроскопије (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токио, Јапан) како би се потврдила хемијска компатибилност хитозана са другим полимерима14,15. FTIR спектри (ширина спектралног опсега од 400 до 4000 cm-1) свих тестираних узорака добијени су извођењем 32 скенирања.
Брзина апсорпције крви (БАР) за све формулације је процењена коришћењем методе коју су описали Чен и др. 16 са малим модификацијама. Развијени НФРК-ови свих састава су сушени у вакуумској пећи на 105°C преко ноћи како би се уклонио преостали растварач. 30 мг НФРЦС (почетна тежина узорка – W0) и 30 мг Ct (позитивна контрола) су стављени у одвојене посуде које садрже премикс од 3,8% натријум цитрата. У унапред одређеним временским интервалима, тј. 5, 10, 20, 30, 40 и 60 секунди, НФРЦС су уклоњени, а њихове површине очишћене од неапсорбоване крви стављањем узорака на Ct током 30 секунди. Коначна тежина крви апсорбоване помоћу НФРЦС 16 је узета у обзир (W1) у свакој временској тачки. Израчунајте проценат БАР користећи следећу формулу:
Време згрушавања крви (BCT) одређено је како су известили Ванг и др. 17. Време потребно да се цела крв (крв пацова претходно помешана са 3,8% натријум цитрата) згруша у присуству NFRCS израчунато је као BCT тест узорка. Различите компоненте NFRCS (30 mg) су стављене у бочице са затварачем од 10 ml и инкубиране на 37°C. Крв (0,5 ml) је додата у бочицу и додато је 0,3 ml 0,2 M CaCl2 да би се активирала коагулација крви. На крају, окрећите бочицу сваких 15 секунди (до 180°) док се не формира чврст угрушак. BCT узорка се процењује бројем окретања бочица 17,18. На основу BCT, одабрана су два оптимална састава из NFRCS Cm, Ch и Cp за даље студије карактеризације.
BCT састава Ch NFRCS и Cp NFRCS одређен је применом методе коју су описали Ли и др. 19. Ставити 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs (позитивна контрола) у одвојене Петријеве шоље (37 °C). Крв која садржи 3,8% натријум цитрата помешана је са 0,2 M CaCl2 у запреминском односу 10:1 да би се започео процес згрушавања крви. 20 µl мешавине крви пацова са 0,2 M CaCl2 нането је на површину узорка и стављено у празну Петријеву шољу. Контрола је била крв сипана у празне Петријеве шоље без Ct. У фиксним интервалима од 0, 3 и 5 минута, зауставити згрушавање додавањем 10 ml дејонизоване (DI) воде у узорак који садржи шољу без нарушавања угрушка. Некоагулисани еритроцити (еритроцити) подлежу хемолизи у присуству дејонизоване воде и ослобађају хемоглобин. Хемоглобин у различитим временским тачкама (HA(t)) је мерен на 540 nm (λmax хемоглобин) коришћењем UV-Vis спектрофотометра. Апсолутна апсорпција хемоглобина (AH(0)) у 0 мин од 20 µl крви у 10 ml дејонизоване воде узета је као референтни стандард. Релативни апсорпција хемоглобина (RHA) коагулисане крви израчуната је из односа HA(t)/HA(0) користећи исту серију крви.
Користећи анализатор текстуре (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, САД), одређена су адхезивна својства NFRK на оштећено ткиво. Притиснути цилиндричну посуду са отвореним дном на унутрашњу страну свињске коже (без слоја масти). Узорци (Ch NFRCS и Cp NFRCS) су нанети путем каниле у цилиндричне калупе да би се створило пријањање на кожу свиње. Након 3 минута инкубације на собној температури (RT) (25°C), јачина адхезије NFRCS је забележена константном брзином од 0,5 mm/sec.
Главна карактеристика хируршких заптивача је повећање згрушавања крви уз смањење губитка крви. Коагулација без губитака у NFRCS је процењена коришћењем претходно објављене методе са малим модификацијама 19. Направити микроцентрифужну епрувету (2 ml) (унутрашњи пречник 10 mm) са отвором 8 × 5 mm2 на једној страни центрифужне епрувете (што представља отворену рану). NFRCS се користи за затварање отвора, а трака се користи за заптивање спољашњих ивица. Додати 20 µl 0,2 M CaCl2 у микроцентрифужну епрувету која садржи премикс натријум цитрата од 3,8%. Након 10 минута, микроцентрифужне епрувете су уклоњене из посуда и повећање масе посуда је одређено због одлива крви из NFRK (n = 3). Губитак крви Ch NFRCS и Cp NFRCS су упоређени са Cs.
Влажни интегритет NFRCS-а одређен је на основу методе коју су описали Мишра и Чаудари21 са мањим изменама. NFRCS се ставља у Ерленмајерову тиквицу од 100 мл са 50 мл воде и мућка 60 секунди без стварања врха. Визуелни преглед и одређивање приоритета узорака за физички интегритет на основу сакупљања.
Јачина везивања HFFC-а за Ct је проучавана коришћењем претходно објављених метода са мањим модификацијама. Интегритет површинског премаза је процењен излагањем NFRK акустичним таласима (спољашњи стимулус) у присуству milliQ воде (Ct). Развијени NFRCS Ch NFRCS и Cp NFRCS су стављени у чашу напуњену водом и соницирани 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 30 минута, респективно. Након сушења, процентуална разлика између почетне и коначне тежине NFRCS је коришћена за израчунавање процентуалног губитка материјала (HFFC). In vitro BCT је додатно подржао јачину везивања или губитак површинских материјала. Ефикасност везивања HFFC-а за Ct обезбеђује коагулацију крви и еластични премаз на површини Ct22.
Хомогеност развијеног NFRCS-а одређена је BCT-ом узорака (30 мг) узетих са насумично одабраних општих локација NFRCS-а. Пратите претходно поменуту BCT процедуру да бисте утврдили усаглашеност са NFRCS-ом. Близина свих пет узорака обезбеђује равномерно покривање површине и таложење HFFC-а у Ct мрежи.
Номинална површина контакта са крвљу (NBCA) је одређена као што је претходно објављено, са неким модификацијама. Крв је коагулирана стезањем 20 µl крви између две површине Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. Након 1 сата, два дела стента су раздвојена и ручно је измерена површина угрушка. Просечна вредност од три понављања је сматрана NBCA NFRCS19.
Анализа динамичке сорпције паре (DVS) коришћена је за процену ефикасности NFRCS-а у апсорпцији воде из спољашње средине или са места повреде одговорног за покретање коагулације. DVS процењује или бележи апсорпцију и губитак паре у узорку гравиметријски користећи ултра-осетљиву вагу са масеном резолуцијом од ±0,1 µg. Парцијални притисак паре (релативна влажност) генерише се електронским регулатором масеног протока око узорка мешањем засићених и сувих носачких гасова. Према смерницама Европске фармакопеје, на основу процента апсорпције влаге од стране узорака, узорци су категорисани у 4 категорије (0–0,012% w/w – нехигроскопни, 0,2–2% w/w благо хигроскопни, 2–15% умерено хигроскопни и > 15% веома хигроскопни)23. Према смерницама Европске фармакопеје, на основу процента апсорпције влаге од стране узорака, узорци су категорисани у 4 категорије (0–0,012% w/w – нехигроскопни, 0,2–2% w/w благо хигроскопни, 2–15% умерено хигроскопни и > 15% веома хигроскопни)23.У складу са препорукама Европске фармакопеје, у зависности од процента апсорпције влаге од стране узорака, узорци су подељени у 4 категорије (0–0,012% w/w – нехигроскопни, 0,2–2% w/w благо хигроскопни, 2–петнаест %).% умерено гигроскопичан и > 15% веома гигроскопичан)23. % умерено хигроскопних и > 15% веома хигроскопних)23.根据欧洲药典指南, 根据样品吸收水分的百分比, 样品分为4 类（0-0,012% в/в非吸湿性、0,2-2% в/в 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 缻00 ，（（0-0.Ｚ В/в- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% В/в 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15% 非常吸湿，> 15% 非常吸湿）У складу са препорукама Европске фармакопеје, узорци су подељени у 4 класе у зависности од процента влаге коју је узорак апсорбовао (0-0,012% тежине – нехигроскопни, 0,2-2% тежине благо хигроскопни, 2-15% тежине).% умерено гигроскопичан, > 15 % веома гигроскопичан) 23. % умерено хигроскопно, > 15% веома хигроскопно) 23.Хигроскопска ефикасност NFCS X NFCS и TsN NFCS одређена је на анализатору DVS TA TGA Q5000 SA. Током овог процеса добијени су време рада, релативна влажност (RH) и тежина узорка у реалном времену на 25°C24. Садржај влаге се израчунава прецизном NFRCS анализом масе коришћењем следеће једначине:
MC је влажност у NFRCS-у. m1 – сува тежина NSAIL-а. m2 је маса у NFRCS-у у реалном времену при датој релативној влажности.
Укупна површина је процењена коришћењем експеримента адсорпције азота са течним азотом након пражњења узорака на 25 °C током 10 сати (< 7 × 10–3 Torr). Укупна површина је процењена коришћењем експеримента адсорпције азота са течним азотом након пражњења узорака на 25 °C током 10 сати (< 7 × 10–3 Torr). Обсаа плосадь поверхности оценивалась с помосьу експеримента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнениа образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Укупна површина је процењена коришћењем експеримента адсорпције азота са течним азотом након што су узорци испражњени на 25°C током 10 сати (< 7 × 10–3 Torr).25°Ц 10 сати (< 7 × 10-3 тора)25°Ц Обсаа плосадь поверхности оценивалась с использованием експериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнениа образцов в течение 10 часов при 25°Ц (< 7 × 10-3 торр). Укупна површина је процењена коришћењем експеримената адсорпције азота са течним азотом након што су узорци пражњени 10 сати на 25°C (< 7 x 10-3 torr).Укупна површина, запремина пора и величина пора NFRCS одређене су помоћу Quantachrome-а произвођача NOVA 1000e, Аустрија, користећи RS 232 софтвер.
Припремите 5% еритроцита (слани раствор као разблаживач) из пуне крви. Затим пребаците аликвот HFFC-а (0,25 ml) на плочу са 96 бунарића и 5% масе еритроцита (0,1 ml). Инкубирајте смешу на 37°C током 40 минута. Смеша црвених крвних зрнаца и серума сматрана је позитивном контролом, а смеша сланог раствора и црвених крвних зрнаца негативном контролом. Хемаглутинација је одређена према Стајицкијевој скали. Предложене скале су следеће: + + + + густи грануларни агрегати; + + + глатка доња јастучића са закривљеним ивицама; + + глатка доња јастучића са поцепаним ивицама; + уски црвени прстенови око ивица глатких јастучића; – (негативно) дискретно црвено дугме 12 у центру доњег бунарића.
Хемокомпатибилност NFRCS-а је проучавана према методи Међународне организације за стандардизацију (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Гравиметријска метода коју су описали Сингх и др. Направљене су мање модификације да би се проценило формирање тромба у присуству или на површини NFRCS-а. 500 мг Cs, Ch NFRCS-а и Cp NFRCS-а је инкубирано у фосфатно пуферованом физиолошком раствору (PBS) током 24 сата на 37°C. Након 24 сата, PBS је уклоњен, а NFRCS је третиран са 2 мл крви која садржи 3,8% натријум цитрата. На површину NFRCS-а, додати 0,04 мл 0,1 М CaCl2 у инкубиране узорке. Након 45 минута, додато је 5 мл дестиловане воде да би се зауставила коагулација. Згрушана крв на површини NFRK-а је третирана 36-38% раствором формалдехида. Угрушци фиксирани формалдехидом су осушени и измерени. Проценат тромбозе је процењен израчунавањем тежине чаше без крви и узорка (негативна контрола) и чаше са крвљу (позитивна контрола).
Као почетна потврда, узорци су визуализовани под оптичким микроскопом како би се разумела способност површинског премаза HFFC-а, међусобно повезаног Ct и Ct мреже да формирају поре. Танки пресеци Ch и Cp из NFRCS су обрезани скалпелом. Добијени пресек је постављен на стаклену плочицу, прекривен покровним стаклом, а ивице су фиксиране лепком. Припремљене плочице су прегледане под оптичким микроскопом и фотографисане су при различитим увећањима.
Таложење полимера у Ct мрежама је визуализовано коришћењем флуоресцентне микроскопије на основу методе коју су описали Рајс и др.29. Састав HFFC-а који је коришћен за формулацију је помешан са флуоресцентном бојом (амарант), а NFRCS (Ch и Cp) су припремљени према претходно поменутој методи. Састав HFFC-а који је коришћен за формулацију је помешан са флуоресцентном бојом (амарант), а NFRCS (Ch и Cp) су припремљени према претходно поменутој методи.Композиција HFFC-а која је коришћена за формулацију је помешана са флуоресцентном бојом (амарант) и NFRCS (Ch и Cp) је добијена према претходно поменутој методи.将用于配方的ХФФЦ 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方Цп).将用于配方的ХФФЦ 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方Цп).Састав HFFC-а који је коришћен у формулацији је помешан са флуоресцентном бојом (Амарант) и добио је NFRCS (Ch и Cp), као што је раније поменуто.Танки пресеци NFRK су исечени из добијених узорака, стављени на стаклене плочице и прекривени покровним стаклом. Посматрајте припремљене плочице под флуоресцентним микроскопом користећи зелени филтер (310-380 nm). Слике су снимљене при увећању од 4 пута како би се разумели односи Ct и вишак полимерног таложења у Ct мрежи.
Површинска топографија NFRCS Ch и Cp одређена је коришћењем атомског силовог микроскопа (AFM) са ултра-оштрим TESP конзолним носачем у режиму тапкања: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Тајван. Храпавост површине одређена је помоћу средње квадратне вредности (RMS) коришћењем софтвера (Scanning Probe Image Processor). Различите локације NFRCS су приказане на 3D сликама како би се проверила уједначеност површине. Стандардна девијација резултата за дато подручје дефинисана је као храпавост површине. RMS једначина је коришћена за квантификацију храпавости површине NFRCS31.
Студије засноване на FESEM-у спроведене су коришћењем FESEM-а, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Токио, како би се разумела површинска морфологија Ch NFRCS и Cp NFRCS, који су показали бољи BCT од Cm NFRCS. FESEM студија је спроведена према методи коју су описали Zhao et al.32 са мањим модификацијама. NFRCS 20 до 30 mg Ch NFRCS и Cp NFRCS су претходно помешани са 20 µl 3,8% натријум цитрата претходно помешаног са крвљу пацова. 20 μl 0,2 M CaCl2 је додато узорцима третираним крвљу да би се иницирала коагулација и узорци су инкубирани на собној температури 10 минута. Поред тога, вишак еритроцита је уклоњен са површине NFRCS испирањем физиолошким раствором.
Накнадни узорци су третирани са 0,1% глутаралдехида, а затим сушени у пећи на врућ ваздух на 37°C ради уклањања влаге. Осушени узорци су премазани и анализирани 32. Остале слике добијене током анализе биле су формирање угрушка на површини појединачних памучних влакана, таложење полимера између Ct, морфологија еритроцита (облик), интегритет угрушка и морфологија еритроцита у присуству NFRCS. Нетретирана подручја NFRCS и подручја NFRCS третирана Ch и Cp инкубирана са крвљу скенирана су на елементарне јоне (натријум, калијум, азот, калцијум, магнезијум, цинк, бакар и селен) 33. Упоредите проценте елементарних јона између третираних и нетретираних узорака да бисте разумели акумулацију елементарних јона током формирања угрушка и хомогеност угрушка.
Дебљина површинског премаза Cp HFFC на Ct површини одређена је помоћу FESEM-а. Попречни пресеци Cp NFRCS-а су исечени из оквира и нанесени распршивањем. Добијени узорци распршеног премаза су посматрани FESEM-ом и мерена је дебљина површинског премаза 34, 35, 36.
Рендгенски микро-КТ пружа 3Д недеструктивно снимање високе резолуције и омогућава вам да проучите унутрашњи структурни распоред NFRK. Микро-КТ користи рендгенски сноп који пролази кроз узорак да би забележио локални линеарни коефицијент слабљења рендгенских зрака у узорку, што помаже у добијању морфолошких информација. Унутрашња локација Ct у Cp NFRCS и Cp NFRCS третираном крвљу испитана је микро-КТ-ом како би се разумела ефикасност апсорпције и згрушавање крви у присуству NFRCS37,38,39. 3Д структуре узорака Cp NFRCS третиране и нетретиране крви реконструисане су коришћењем микро-КТ-а (V|tome|x S240, Финикс, Немачка). Користећи VG STUDIO-MAX софтвер верзије 2.2, неколико рендгенских снимака је снимљено из различитих углова (идеално покривеност од 360°) да би се развиле 3Д слике за NFRCS. Прикупљени пројекциони подаци реконструисани су у 3Д волуметријске слике коришћењем одговарајућег једноставног 3D ScanIP Academic софтвера.
Поред тога, да би се разумела дистрибуција угрушка, 20 µl претходно помешане цитратне крви и 20 µl 0,2 M CaCl2 су додате у NFRCS да би се иницирало згрушавање крви. Припремљени узорци су остављени да се стврдну. Површина NFRK је третирана са 0,5% глутаралдехида и сушена у пећи на врући ваздух на 30–40°C током 30 минута. Крвни угрушак формиран на NFRCS је скениран, реконструисан, и визуелизована је 3D слика крвног угрушка.
Антибактеријски тестови су спроведени на Cp NFRCS (најбоље упоређен са Ch NFRCS) коришћењем претходно описане методе са мањим модификацијама. Антибактеријска активност Cp NFRCS и Cp HFFC је одређена коришћењем три различита тест микроорганизма [S. aureus (грам-позитивне бактерије), E. coli (грам-негативне бактерије) и бела Candida (C. albicans)] који расту на агару у Петријевим шољама у инкубатору. Равномерно инокулирати 50 ml разблажене суспензије бактеријске културе у концентрацији од 105-106 CFU ml-1 на агар медијум. Сипати медијум у Петријеву шољу и оставити да се стврдне. На површини агар плоче су направљене бунариће за напуњавање HFFC-ом (3 бунарића за HFFC и 1 за негативну контролу). Додати 200 µl HFFC у 3 бунарића и 200 µl PBS pH 7,4 у 4. бунар. Са друге стране петријеве шоље, поставите диск Cp NFRCS од 12 mm на очврсли агар и навлажите га PBS-ом (pH 7,4). Таблете ципрофлоксацина, ампицилина и флуконазола сматрају се референтним стандардима за Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Измерите зону инхибиције ручно и направите дигиталну слику зоне инхибиције.
Након етичког одобрења институције, студија је спроведена на Медицинском колеџу за образовање и истраживање Кастурба у Манипалу, Карнатака, у јужној Индији. Експериментални протокол in vitro TEG прегледао је и одобрио Институционални етички комитет Медицинског колеџа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Субјекти су регрутовани међу добровољним даваоцима крви (старости од 18 до 55 година) из болничке банке крви. Поред тога, од добровољаца је добијен образац информисаног пристанка за прикупљање узорака крви. Нативни TEG (N-TEG) ​​је коришћен за проучавање ефекта формулације Cp HFFC на пуну крв претходно помешану са натријум цитратом. N-TEG је широко препознат по својој улози у реанимацији на месту неге, што ствара проблеме за клиничаре због потенцијалног клинички значајног кашњења резултата (рутински тестови коагулације). N-TEG анализа је извршена коришћењем пуне крви. Информисани пристанак и детаљна медицинска историја су добијени од свих учесника. Студија није укључивала учеснике са хемостатским или тромботичним компликацијама као што су трудноћа/постпорођајни период или болести јетре. Субјекти који су узимали лекове који утичу на каскаду коагулације такође су искључени из студије. Основни лабораторијски тестови (хемоглобин, протромбинско време, активирани тромбопластин и број тромбоцита) су обављени код свих учесника према стандардним процедурама. N-TEG одређује вискоеластичност крвног угрушка, почетну структуру угрушка, интеракцију честица, јачање угрушка и лизу угрушка. N-TEG анализа пружа графичке и нумеричке податке о колективним ефектима неколико ћелијских елемената и плазме. N-TEG анализа је спроведена на две различите запремине Cp HFFC (10 µl и 50 µl). Као резултат тога, 1 ml пуне крви са лимунском киселином је додато у 10 μl Cp HFFC. Додати 1 ml (Cp HFFC + цитратна крв), 340 µl мешане крви у 20 µl 0,2 M CaCl2 која садржи TEG. Након тога, TEG посуде су стављене у TEG® 5000, US да би се измериле R, K, алфа угао, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% узорака крви у присуству Cp HFFC41.
Протокол студије in vivo прегледао је и одобрио Институционални комитет за етику животиња (IAEC), Медицинског факултета Кастурба, Института за високо образовање Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Сви експерименти на животињама су спроведени у складу са препорукама Комитета за контролу и надзор експеримената на животињама (CPCSEA). Све NFRCS студије in vivo (2 × 2 cm2) су спроведене на женкама Вистар пацова (тежине од 200 до 250 g). Све животиње су аклиматизоване на температури од 24-26°C, животиње су имале слободан приступ стандардној храни и води ad libitum. Све животиње су насумично подељене у различите групе, свака група се састојала од три животиње. Све студије су спроведене у складу са Извештајем о експериментима in vivo 43 из публикације „Студије на животињама: Извештај о експериментима in vivo“ 43. Пре студије, животиње су анестезиране интраперитонеалном (ип) применом смеше од 20-50 мг кетамина (по 1 кг телесне тежине) и 2-10 мг ксилазина (по 1 кг телесне тежине). Након студије, запремина крварења је израчуната проценом разлике између почетне и коначне тежине узорака, просечна вредност добијена из три теста је узета као запремина крварења узорка.
Модел ампутације репа пацова је имплементиран како би се разумео потенцијал NFRCS-а да модулира крварење у трауми, борби или саобраћајној несрећи (модел повреде). Одсеците 50% репа скалпелом и ставите на ваздух на 15 секунди како бисте осигурали нормално крварење. Поред тога, тест узорци су постављени на реп пацова применом притиска (Ct, Cs, Ch NFRCS и Cp NFRCS). Крварење и PCT су пријављени за тест узорке (n = 3)17,45.
Ефикасност контроле притиска NFRCS-а у борби испитивана је на моделу површинске феморалне артерије. Феморална артерија је изложена, пробушена троакаром од 24G и искрварена у року од 15 секунди. Након што се примети неконтролисано крварење, тест узорак се поставља на место убода уз примену притиска. Одмах након примене тест узорка, забележено је време згрушавања и праћена је хемостатска ефикасност током наредних 5 минута. Исти поступак је поновљен са Cs и Ct46.
Даулинг и др.47 предложили су модел оштећења јетре за процену хемостатског потенцијала хемостатских материјала у контексту интраоперативног крварења. BCT је забележен за Ct узорке (негативна контрола), Cs оквир (позитивна контрола), Ch NFRCS узорке и Cp NFRCS узорке. Супрахепатична шупља вена пацова је изложена извођењем средње лапаротомије. Након тога, дистални део левог режња је исечен маказама. Направљен је рез на јетри скалпелом и остављен да крвари неколико секунди. Прецизно измерени Ch NFRCS и Cp NFRCS тест узорци су постављени на оштећену површину без икаквог позитивног притиска и BCT је забележен. Контролна група (Ct) је затим применила притисак, а затим Cs 30 s47 без прекидања повреде.
Ин виво тестови зарастања рана спроведени су коришћењем модела ексцизионе ране како би се проценила својства зарастања рана развијених НФРЦС на бази полимера. Модели ексцизионих рана су одабрани и изведени према претходно објављеним методама са мањим модификацијама19,32,48. Све животиње су анестезиране као што је претходно описано. Користи се биопсијски бушилица (12 мм) да се направи кружни дубоки рез на кожи леђа. Припремљена места ране су прекривена са Cs (позитивна контрола), Ct (узимајући у обзир да памучни јастучићи ометају зарастање), Ch NFRCS и Cp NFRCS (експериментална група) и негативном контролом без икаквог третмана. Сваког дана студије, површина ране је мерена код свих пацова. Користи се дигитални фотоапарат да се слика површина ране и стави нови завој. Проценат затварања ране је мерен следећом формулом:
На основу процента затварања ране 12. дана студије, кожа пацова најбоље групе је исечена ((Cp NFRCS) и контролна група) и проучавана бојењем H&E и Масоновим трихромним бојењем. На основу процента затварања ране 12. дана студије, кожа пацова најбоље групе је исечена ((Cp NFRCS) и контролна група) и проучавана бојењем H&E и Масоновим трихромним бојењем.На основу процента затварања ране 12. дана студије, кожа пацова најбоље групе ((Cp NFRCS) и контролне групе) је исечена и испитана бојењем хематоксилин-еозином и Масоновим трихромом.根据研究第12天的伤口闭合百分比, 切除最佳组((Цп НФРЦС)和对照组)的大鼠皮肤，进行Х&Е染色和Массон三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比, 切除最佳组((Цп НФРЦС)和对照组)的大鼠皮肤，进行Х&Е染色和眳组)Пацови у најбољој групи ((Cp NFRCS) и контролној групи) су исечени ради бојења хематоксилин-еозином и Масоновог трихромног бојења на основу процента затварања ране 12. дана студије.Примењени поступак бојења је спроведен према претходно описаним методама49,50. Укратко, након фиксације у 10% формалину, узорци су дехидрирани коришћењем низа градираних алкохола. Користи се микротом за добијање танких пресека (дебљине 5 µm) исеченог ткива. Танки серијски пресеци контролних и Cp NFRCS узорка су третирани хематоксилином и еозином ради проучавања хистопатолошких промена. Масоново трихромно бојење је коришћено за детекцију формирања колагенских фибрила. Добијене резултате су патолози слепо проучавали.
Стабилност узорака Cp NFRCS проучавана је на собној температури (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) током 12 месеци51. Cp NFRCS (промена боје површине и раст микроба) је визуелно прегледан и тестиран на отпорност на хабање услед прегиба и BCT према горе наведеним методама наведеним у одељку Материјали и методе.
Скалабилност и репродуктивност Cp NFRCS испитана је припремом Cp NFRCS величине 15×15 cm2. Поред тога, узорци од 30 mg (n = 5) су исечени из различитих фракција Cp NFRCS и BCT проучаваних узорака је процењен као што је раније описано у одељку Методе.
Покушали смо да развијемо различите облике и структуре користећи Cp NFRCS композиције за различите биомедицинске примене. Такви облици или конфигурације укључују конусне брисеве за крварење из носа, стоматолошке процедуре и цилиндричне брисеве за вагинално крварење.
Сви скупови података су изражени као средња вредност ± стандардна девијација и анализирани су ANOVA анализом коришћењем Prism 5.03 (GraphPad, Сан Дијего, Калифорнија, САД), а затим Бонферонијевим тестом вишеструких поређења (*p<0,05).
Све процедуре спроведене у студијама на људима биле су у складу са стандардима Института и Националног истраживачког савета, као и Хелсиншком декларацијом из 1964. године и њеним накнадним амандманима, или сличним етичким стандардима. Сви учесници су обавештени о карактеристикама студије и њеној добровољној природи. Подаци о учесницима остају поверљиви након прикупљања. Експериментални протокол in vitro TEG прегледао је и одобрио Институционални етички комитет Медицинског колеџа Кастурба, Манипал, Карнатака (IEC: 674/2020). Волонтери су потписали информисани пристанак за прикупљање узорака крви.
Све процедуре спроведене у студијама на животињама спроведене су у складу са прописима Медицинског факултета Кастуба, Института за високо образовање Манипал, Манипал (IAEC/KMC/69/2020). Сви експерименти на животињама спроведени су у складу са смерницама Комитета за контролу и надзор експеримената на животињама (CPCSEA). Сви аутори прате смернице ARRIVE.
ФТИР спектри свих НФРЦС су анализирани и упоређени са спектром хитозана приказаним на слици 2А. Карактеристични спектрални врхови хитозана (снимљени) на 3437 цм-1 (истезање ОХ и NH, преклапање), 2945 и 2897 цм-1 (истезање ЦХ), 1660 цм-1 (напрезање НХ2), 1589 цм-1 (савијање Н–Х), 1157 цм-1 (истезање моста О-), 1067 цм-1 (истезање Ц–О, секундарна хидроксил), 993 цм-1 (истезање ЦО, Бо-ОХ) 52,53,54. Додатна табела С1 приказује вредности апсорпционог спектра ФТИР НФРЦС за хитозан (репортер), чисти хитозан, Cm, Ch и Cp. ФТИР спектри свих НФРЦС (Cm, Ch и Cp) показали су исте карактеристичне апсорпционе траке као и чисти хитозан без икаквих значајних промена (слика 2А). Резултати FTIR-а потврдили су одсуство хемијских или физичких интеракција између полимера коришћених за развој NFRCS-а, што указује да су коришћени полимери инертни.
Ин витро карактеризација Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS и Cs. (А) представља комбиноване FTIR спектре састава хитозана и Cm NFRCS, Ch NFRCS и Cp NFRCS под компресијом. (Б) а) Брзина апсорпције пуне крви NFRCS Cm, Ch, Cp и Cg (n = 3); Ct узорци су показали већи BAR јер памучни штапић има већу ефикасност апсорпције; б) Крв након апсорпције крви. Илустрација апсорбованог узорка. Графички приказ BCT тест узорка C (Cp NFRCS је имао најбољи BCT (15 s, n = 3)). Подаци у C, D, E и G су приказани као средња вредност ± SD, а траке грешака представљају SD, ***p < 0,0001. Подаци у C, D, E и G су приказани као средња вредност ± SD, а траке грешака представљају SD, ***p < 0,0001. Данние в Ц, Д, Е и Г представљени као средње ± стандардно отклонение, а планки погрешности представљају стандардное отклонение, ***п <0,0001. Подаци у C, D, E и G су представљени као средња вредност ± стандардна девијација, а грешке представљају стандардну девијацију, ***p<0,0001. Ц、Д、Е 和Г 中的数据显示为平均值± СД,误差线代表СД，***п < 0,0001。 Ц、Д、Е 和Г 中的数据显示为平均值± СД,误差线代表СД，***п < 0,0001。 Данние в Ц, Д, Е и Г показују како средњу вредност ± стандардное отклонение, планки погрешности представљају стандардное отклонение, ***п <0,0001. Подаци у C, D, E и G су приказани као средња вредност ± стандардна девијација, грешке представљају стандардну девијацију, ***p<0,0001.