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제어되지 않는 출혈은 주요 사망 원인 중 하나입니다. 신속한 지혈은 전투, 교통사고 및 사망률 감소 작전 중 응급 처치로서 환자의 생존을 보장합니다. 단순 지혈 필름 형성 조성물(HFFC)을 연속상으로 사용하는 나노다공성 섬유 강화 복합 스캐폴드(NFRCS)는 지혈을 유도하고 강화할 수 있습니다. NFRCS 개발은 잠자리 날개 구조에서 영감을 받았습니다. 잠자리 날개는 가로 날개와 세로 날개로 구성되며, 날개막은 서로 연결되어 미세 구조의 완전성을 유지합니다. HFFC는 섬유 표면에 나노미터 두께의 필름을 균일하게 코팅하고, 무작위로 분포된 면섬유(Ct)(분산상)와 결합하여 나노다공성 구조를 형성합니다. 연속상과 분산상의 조합으로 시판 제품에 비해 제품 비용을 10분의 1로 절감할 수 있습니다. 변형된 NFRCS(탐폰 또는 손목 밴드)는 다양한 생의학 분야에 적용될 수 있습니다. 생체 내 연구 결과, 개발된 Cp NFRCS는 적용 부위에서 응고 과정을 촉발하고 강화하는 것으로 나타났습니다. NFRCS는 나노다공성 구조 덕분에 미세 환경을 조절하고 세포 수준에서 작용하여 절제창 모델에서 더 나은 상처 치유를 유도합니다.
전투, 수술 중 및 응급 상황에서 통제되지 않는 출혈은 부상자의 생명을 심각하게 위협할 수 있습니다.¹ 이러한 상황은 말초혈관 저항을 전반적으로 증가시켜 출혈성 쇼크로 이어질 수 있습니다. 수술 중 및 수술 후 출혈을 조절하기 위한 적절한 조치는 생명을 위협할 수 있습니다.^2,3 대혈관 손상은 대량 출혈을 초래하여 전투 중 사망률이 50% 이하, 수술 중에는 31%에 달합니다.¹ 대량 출혈은 체액량 감소를 유발하고 심박출량을 감소시킵니다. 총 말초혈관 저항의 증가와 미세순환의 점진적인 저하는 생명 유지 기관의 저산소증을 초래합니다. 효과적인 치료 없이 이러한 상태가 지속되면 출혈성 쇼크가 발생할 수 있습니다.^1,4,5 다른 합병증으로는 저체온증 및 대사성 산증의 진행, 그리고 응고 과정을 저해하는 응고 장애가 있습니다. 중증 출혈성 쇼크는 사망 위험을 높입니다.^6,7,8 3단계(진행성) 쇼크에서 수술 중 및 수술 후 합병증과 사망률을 예방하고 환자의 생존을 위해서는 수혈이 필수적입니다. 이러한 생명을 위협하는 모든 상황을 극복하기 위해, 본 연구에서는 수용성 지혈 고분자를 조합하여 최소한의 고분자 농도(0.5%)로 나노다공성 섬유 강화 복합 스캐폴드(NFRCS)를 개발했습니다.
섬유 보강재를 사용하면 비용 효율적인 제품을 개발할 수 있습니다. 무작위로 배열된 섬유는 잠자리 날개의 구조와 유사하며, 날개의 가로 및 세로 줄무늬가 균형을 이루고 있습니다. 날개의 가로맥과 세로맥은 날개막과 연결됩니다(그림 1). NFRCS는 물리적 및 기계적 강도가 향상된 강화 면사(Ct)를 지지체 시스템으로 사용합니다(그림 1). 경제성과 제작 용이성 때문에 외과의들은 수술 및 드레싱 시 면사 거즈(Ct)를 선호합니다. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로오스(지혈 활성 향상에 기여)를 포함한 여러 가지 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS9,10의 골격 시스템으로 사용되었습니다. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로오스(지혈 활성 향상에 기여)를 포함한 여러 가지 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS9,10의 골격 시스템으로 사용되었습니다. Следовательно, учитывая его многочисленные преимуЂества, в том числе > 90% Кристаллической целлулозы (участвует в повышении гемостатической aktiвности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로오스(지혈 활동 증가에 관여)를 포함한 많은 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS 골격계로 사용되었습니다9,10.因此，考虑到它多 多重益处，包括> 90% 의 结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用은 NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它多益处，包括> 90%따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로오스(지혈 활성 향상에 도움)를 포함한 많은 이점을 고려하여 Ct는 NFRCS9,10의 지지체로 사용되었습니다.Ct는 표면적으로 코팅되었고(나노 두께의 필름 형성이 관찰됨), 지혈 필름 형성 조성물(HFFC)과 상호 연결되었습니다. HFFC는 매트리겔처럼 작용하여 무작위로 배치된 Ct를 서로 결합시킵니다. 개발된 설계는 분산상(강화 섬유) 내에서 응력을 전달합니다. 최소한의 고분자 농도로 우수한 기계적 강도를 갖는 나노다공성 구조를 얻는 것은 어렵습니다. 또한, 다양한 생의학 응용 분야에 맞춰 다양한 금형을 맞춤 제작하는 것도 쉽지 않습니다.
이 그림은 잠자리 날개 구조를 기반으로 한 NFRCS 설계의 개략도를 보여줍니다(A). 이 이미지는 잠자리 날개 구조(날개의 교차하는 세로맥이 서로 연결되어 있음)와 Cp NFRCS의 단면 현미경 사진을 비교하여 보여줍니다(B). NFRCS의 개략적인 표현입니다.
위의 한계를 해결하기 위해 HFFC를 연속상으로 사용하여 NFRC를 개발했습니다. HFFC는 키토산(주요 지혈 고분자)과 메틸셀룰로오스(MC), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC 50 cp), 그리고 혈전 형성을 촉진하는 지지 고분자인 폴리비닐알코올(PVA)(125 kDa)을 포함한 다양한 필름 형성 지혈 고분자로 구성됩니다. 폴리비닐피롤리딘 K30(PVP K30)을 첨가하여 NFRC의 수분 흡수 능력을 향상시켰습니다. 폴리에틸렌글리콜 400(PEG 400)은 결합된 고분자 블렌드의 고분자 가교를 개선하기 위해 첨가되었습니다. 키토산과 MC(Cm), 키토산과 HPMC(Ch), 키토산과 PVA(Cp)의 세 가지 HFFC 지혈 조성물(Cm HFFC, Ch HFFC, Cp HFFC)을 Ct에 적용했습니다. 다양한 시험관 내 및 생체 내 특성 분석을 통해 NFRCS의 지혈 및 상처 치유 활성이 확인되었습니다. NFRCS에서 제공하는 복합 재료는 특정 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 형태의 지지체를 맞춤 제작하는 데 사용할 수 있습니다.
또한, NFRCS는 붕대나 롤 형태로 변형하여 하지 및 기타 신체 부위의 전체 부상 부위를 덮을 수 있습니다. 특히 전투 중 발생한 사지 부상의 경우, 설계된 NFRCS는 팔 절반 또는 다리 전체를 덮을 수 있도록 변경할 수 있습니다(보충 그림 S11). NFRCS는 조직 접착제를 사용하여 손목 밴드 형태로 제작할 수 있으며, 심각한 자살 시도 손목 부상 시 출혈을 멈추는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구의 주요 목표는 가능한 한 적은 양의 폴리머를 사용하여 빈곤층을 포함한 많은 사람들에게 보급하고 구급상자에 포함할 수 있는 NFRCS를 개발하는 것입니다. 간단하고 효율적이며 경제적인 디자인의 NFRCS는 지역 사회에 도움이 될 뿐만 아니라 전 세계적으로 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
키토산(분자량 80 kDa)과 아마란스는 인도 머크사에서 구입했습니다. 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 50 Cp, 폴리에틸렌글리콜 400, 메틸셀룰로오스는 뭄바이 로바 케미(Loba Chemie Pvt. LLC)에서 구입했습니다. 폴리비닐알코올(분자량 125 kDa, 87-90% 가수분해)은 구자라트 내셔널 케미컬스(National Chemicals)에서 구입했습니다. 폴리비닐피롤리딘 K30은 뭄바이 몰리켐(Molychem)에서 구입했으며, 멸균 면봉은 타밀나두 라마라주 서저리 코튼 밀스(Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd.)에서 구입했고, 담체로는 밀리큐(Milli Q) 정제수(Direct-Q3 정수 시스템, 머크사, 인도)를 사용했습니다.
NFRCS는 동결건조법을 이용하여 개발되었습니다.11,12 모든 HFFC 조성물(표 1)은 기계식 교반기를 사용하여 제조되었습니다. 기계식 교반기를 사용하여 800 rpm으로 연속 교반하여 1% 아세트산 수용액을 이용하여 0.5% 키토산 용액을 제조했습니다. 표 1에 표시된 정확한 양의 고분자를 키토산 용액에 첨가하고 투명한 고분자 용액이 얻어질 때까지 교반했습니다. 생성된 혼합물에 표 1에 표시된 양의 PVP K30과 PEG 400을 첨가하고 투명하고 점성이 있는 고분자 용액이 얻어질 때까지 교반을 계속했습니다. 생성된 고분자 용액을 60분 동안 초음파 처리하여 고분자 혼합물 내의 기포를 제거했습니다. 보충 그림 S1(b)에 나타낸 바와 같이, Ct는 5 ml의 HFFC가 첨가된 6웰 플레이트(몰드)의 각 웰에 고르게 분포되었습니다.
6웰 플레이트를 60분 동안 초음파 처리하여 Ct 네트워크 내 HFFC의 균일한 습윤 및 분포를 얻었습니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 -20°C에서 8~12시간 동안 냉동했습니다. 냉동된 플레이트를 48시간 동안 동결건조하여 다양한 형태의 NFRCS를 얻었습니다. 동일한 절차를 사용하여 탐폰이나 원통형 탐폰 등 다양한 형태와 구조, 또는 다른 용도에 맞는 형태를 제조할 수 있습니다.
정확하게 계량한 키토산(80 kDa)(3%)을 자석 교반기를 사용하여 1% 아세트산에 용해시켰다. 얻어진 키토산 용액에 1% PEG 400을 첨가하고 30분간 교반하였다. 이 용액을 사각형 또는 직사각형 용기에 붓고 -80°C에서 12시간 동안 냉동시켰다. 냉동된 시료를 48시간 동안 동결건조하여 다공성 Cs13을 얻었다.
개발된 NFRCS는 키토산과 다른 폴리머의 화학적 호환성을 확인하기 위해 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)(Shimadzu 8400s FTIR, 도쿄, 일본)을 사용한 실험을 거쳤습니다.14,15 모든 테스트 샘플의 FTIR 스펙트럼(스펙트럼 범위 폭 400~4000cm-1)은 32회 스캔을 통해 얻었습니다.
모든 제형의 혈액 흡수율(BAR)은 Chen et al. 16이 기술한 방법을 약간 수정하여 평가했습니다. 개발된 모든 조성의 NFRK는 잔류 용매를 제거하기 위해 105°C의 진공 오븐에서 밤새 건조했습니다. 30mg의 NFRCS(초기 시료 무게 – W0)와 30mg의 Ct(양성 대조군)를 각각 3.8% 시트르산나트륨 프리믹스가 담긴 접시에 넣었습니다. 미리 정해진 시간 간격(5, 10, 20, 30, 40, 60초)으로 NFRCS를 꺼내어 30초 동안 Ct 위에 올려놓아 흡수되지 않은 혈액을 표면에서 제거했습니다. 각 시점에서 NFRCS에 흡수된 최종 혈액 무게(W1)를 측정했습니다. 다음 공식을 사용하여 BAR 백분율을 계산했습니다.
혈액 응고 시간(BCT)은 Wang 등¹⁷이 보고한 방법에 따라 측정하였다. NFRCS 존재 하에서 전혈(쥐 혈액을 3.8% 시트르산나트륨과 혼합)이 응고되는 데 걸리는 시간을 시험 시료의 BCT로 계산하였다. 다양한 NFRCS 성분(30mg)을 10ml 스크류 캡 바이알에 넣고 37°C에서 배양하였다. 바이알에 혈액(0.5ml)을 넣고 혈액 응고를 활성화하기 위해 0.2M CaCl₂ 0.3ml를 첨가하였다. 마지막으로, 단단한 응고가 형성될 때까지 15초마다 바이알을 뒤집었다(최대 180°). 시료의 BCT는 바이알을 뒤집은 횟수로 추정하였다^17,18. BCT를 기준으로 NFRCS Cm, Ch 및 Cp 중에서 최적의 두 가지 조성물을 선택하여 추가적인 특성 분석 연구를 진행하였다.
Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 조성물의 BCT는 Li et al. 19에 기술된 방법을 사용하여 측정했습니다. 15 x 15 mm2 크기의 Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs(양성 대조군)를 각각 다른 페트리 접시에 넣고 37°C로 유지했습니다. 혈액 응고를 시작하기 위해 3.8% 시트르산나트륨을 함유한 혈액을 0.2 M CaCl2와 10:1의 부피비로 혼합했습니다. 0.2 M CaCl2 쥐 혈액 혼합물 20 µl를 시료 표면에 도포하고 빈 페트리 접시에 넣었습니다. 대조군은 Ct 없이 빈 페트리 접시에 혈액을 부었습니다. 0, 3, 5분의 일정 간격으로 응고된 시료를 건드리지 않고 접시에 탈이온수(DI) 10 ml를 첨가하여 응고를 중단했습니다. 응고되지 않은 적혈구는 탈이온수 존재 하에서 용혈되어 헤모글로빈을 방출합니다. 다양한 시점의 헤모글로빈(HA(t))은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 540 nm(λmax 헤모글로빈)에서 측정되었습니다. 10 ml의 탈이온수에 20 µl의 혈액을 녹인 용액의 0분에서의 헤모글로빈 절대 흡광도(AH(0))를 기준 표준으로 사용했습니다. 응고된 혈액의 상대적 헤모글로빈 흡수율(RHA)은 동일한 혈액 배치를 사용하여 HA(t)/HA(0) 비율로부터 계산되었습니다.
텍스처 분석기(Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA)를 사용하여 손상된 조직에 대한 NFRK의 접착 특성을 측정했습니다. 바닥이 열린 원통형 접시를 돼지껍질 안쪽(지방층 제외)에 밀착시켰습니다. 샘플(Ch NFRCS 및 Cp NFRCS)을 캐뉼라를 통해 원통형 몰드에 주입하여 돼지껍질에 접착시켰습니다. 실온(25°C)에서 3분간 배양한 후, 0.5mm/sec의 일정한 속도로 NFRCS의 접착 강도를 측정했습니다.
수술용 지혈제의 주요 특징은 혈액 응고를 증가시키면서 혈액 손실을 줄이는 것입니다. NFRCS의 무손실 응고는 이전에 발표된 방법을 약간 수정하여 평가했습니다. 19 마이크로원심분리 튜브(2ml, 내경 10mm)의 한쪽에 8 × 5 mm² 크기의 구멍(개방형 상처를 나타냄)을 만듭니다. NFRCS를 사용하여 구멍을 막고 테이프를 사용하여 바깥쪽 가장자리를 밀봉합니다. 3.8% 시트르산나트륨 프리믹스가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 0.2M CaCl₂ 20µl를 추가합니다. 10분 후, 마이크로원심분리 튜브를 접시에서 꺼내고 NFRCS에서 혈액이 유출됨에 따라 접시의 질량 증가를 측정했습니다(n = 3). 혈액 손실량 Ch NFRCS와 Cp NFRCS를 Cs와 비교했습니다.
NFRCS의 습윤 상태는 Mishra와 Chaudhary21이 설명한 방법을 약간 수정하여 결정했습니다. NFRCS를 100ml 삼각 플라스크에 물 50ml와 함께 넣고 윗부분이 생기지 않도록 60초 동안 흔들어 줍니다. 채취 순서에 따라 육안으로 물리적 상태를 검사하고 시료의 우선순위를 정합니다.
HFFC와 Ct의 결합 강도는 기존에 발표된 방법을 약간 수정하여 연구했습니다. 표면 코팅의 무결성은 MilliQ 증류수(Ct) 존재 하에 NFRK를 음파(외부 자극)에 노출시켜 평가했습니다. 개발된 NFRCS Ch NFRCS와 Cp NFRCS를 물이 담긴 비커에 넣고 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30분 동안 초음파 처리했습니다. 건조 후, NFRCS의 초기 무게와 최종 무게의 차이를 이용하여 물질 손실률(HFFC)을 계산했습니다. 시험관 내 BCT 실험을 통해 결합 강도 또는 표면 물질 손실을 추가적으로 확인했습니다. HFFC가 Ct에 효율적으로 결합하면 혈액 응고를 유도하고 Ct22 표면에 탄성 코팅을 형성합니다.
개발된 NFRCS의 균질성은 NFRCS의 무작위로 선택된 일반적인 위치에서 채취한 샘플(30mg)의 BCT를 통해 확인되었습니다. NFRCS의 적합성을 확인하려면 앞서 언급한 BCT 절차를 따르십시오. 다섯 개의 샘플이 서로 가까이 위치하므로 표면 피복이 균일하고 Ct 메쉬에 HFFC가 침착되었음을 보장합니다.
명목 혈액 접촉 면적(NBCA)은 일부 수정 사항을 적용하여 기존에 보고된 방법과 동일하게 측정하였다. Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs의 두 표면 사이에 20µl의 혈액을 가두어 응고시켰다. 1시간 후, 스텐트의 두 부분을 분리하고 혈전 면적을 수동으로 측정하였다. 세 번 반복 측정한 평균값을 NBCA NFRCS19로 간주하였다.
동적 증기 흡착(DVS) 분석을 사용하여 NFRCS가 외부 환경 또는 응고를 유발하는 손상 부위로부터 수분을 흡수하는 효과를 평가했습니다. DVS는 질량 분해능이 ±0.1 µg인 초고감도 저울을 사용하여 시료의 증기 흡수 및 손실을 중량 측정 방식으로 평가 또는 기록합니다. 전자식 질량 유량 제어기를 통해 포화 및 건조 운반 기체를 혼합하여 시료 주변에 부분 증기압(상대 습도)을 생성합니다. 유럽 ​​약전 지침에 따라 샘플의 수분 흡수율을 기준으로 샘플을 4가지 범주(0–0.012% w/w− 비흡습성, 0.2–2% w/w 약간 흡습성, 2–15% 중간 흡습성, > 15% 매우 흡습성)23로 분류했습니다. 유럽 ​​약전 지침에 따라 샘플의 수분 흡수율을 기준으로 샘플을 4가지 범주(0–0.012% w/w - 비흡습성, 0.2–2% w/w - 약간 흡습성, 2–15% - 중간 정도의 흡습성, > 15% - 매우 흡습성)23로 분류했습니다.유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 시료의 수분 흡수율에 따라 시료를 4가지 범주(0~0.012% w/w - 비흡습성, 0.2~2% w/w - 약간의 흡습성, 2~15%)로 분류했습니다.% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. (중간 정도의 흡습성 및 15% 이상의 매우 흡습성)23.根据欧洲药典指南，根据样product吸收water分比，样product分为4 类（0-0.012% w/w- 비흡수성、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15%适島吸湿，> 15% 不常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样product 分为 分为 分为 类 （(0-0.012% W/w- 吸湿性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 속도 吸湿 ，> 15 %비常吸湿)23。유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 시료는 시료가 흡수한 수분의 백분율에 따라 4가지 등급으로 분류됩니다(0-0.012% 중량 - 비흡습성, 0.2-2% 중량 - 약간의 흡습성, 2-15% 중량).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. (흡습성이 중간 정도인 경우 %, 흡습성이 매우 높은 경우 > 15%) 23.NFCS X NFCS 및 TsN NFCS의 흡습 효율은 DVS TA TGA Q5000 SA 분석기를 사용하여 측정했습니다. 이 과정에서 실행 시간, 상대 습도(RH) 및 25°C에서의 실시간 시료 무게를 얻었습니다. 수분 함량은 다음 방정식을 사용하여 정확한 NFCS 질량 분석을 통해 계산했습니다.
MC는 NFRCS 습도입니다. m1은 NSAID의 건조 중량입니다. m2는 주어진 상대 습도에서의 실시간 NFRCS 질량입니다.
총 표면적은 시료를 25°C에서 10시간 동안 액체 질소(7 × 10⁻³ Torr 미만)로 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추정하였다. 총 표면적은 시료를 25°C에서 10시간 동안 액체 질소(7 × 10⁻³ Torr 미만)로 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추정하였다. поверхности оценивалась с помочьу эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). 시료를 25°C에서 10시간 동안 액체 질소(7 × 10⁻³ Torr 미만)로 비운 후, 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 총 표면적을 추정하였다.25°C에서 공기 청정 제품은 100°C(< 7 × 10-3 Torr)로 유지되며, 사용 가능한 전력은 10%입니다.25°C에서 поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C(< 7 × 10-3 торр). 시료를 25°C(< 7 x 10⁻³ torr)에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 총 표면적을 추정하였다.총 표면적, 기공 부피 및 NFRCS 기공 크기는 오스트리아 NOVA 1000e사의 Quantachrome 장비와 RS 232 소프트웨어를 사용하여 측정했습니다.
전혈에서 5% 적혈구 용액(희석액은 생리식염수)을 준비합니다. 그런 다음 HFFC(0.25 ml)를 96웰 플레이트에 옮기고 5% 적혈구 용액(0.1 ml)을 첨가합니다. 혼합물을 37°C에서 40분 동안 배양합니다. 적혈구와 혈청 혼합물을 양성 대조군으로, 생리식염수와 적혈구 혼합물을 음성 대조군으로 사용했습니다. 혈구응집은 스타지츠키 척도에 따라 판정했습니다. 제시된 척도는 다음과 같습니다. ++ +++ + 조밀한 과립형 응집체; ++++ + 곡선 가장자리를 가진 매끄러운 바닥 패드; ++++ + 찢어진 가장자리를 가진 매끄러운 바닥 패드; +++ + 매끄러운 패드 가장자리를 둘러싼 좁은 붉은 고리; – (음성) - 하단 웰 중앙에 뚜렷한 붉은색 반점.
NFRCS의 혈액 적합성은 국제 표준화 기구(ISO)의 방법(ISO10993-4, 1999)26,27에 따라 연구되었습니다. Singh 등이 기술한 중량 측정법을 약간 수정하여 NFRCS의 존재 하 또는 표면에서 혈전 형성을 평가했습니다. 500mg의 Cs, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 인산염 완충 용액(PBS)에 넣고 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간 후 PBS를 제거하고 NFRCS에 3.8% 시트르산나트륨을 함유한 혈액 2ml를 처리했습니다. 배양된 샘플에 NFRCS 표면에 0.04ml의 0.1M CaCl2를 첨가했습니다. 45분 후 증류수 5ml를 첨가하여 응고를 중지시켰습니다. NFRK 표면에서 응고된 혈액은 36-38% 포름알데히드 용액으로 처리했습니다. 포르말린으로 고정시킨 혈전을 건조시킨 후 무게를 측정했습니다. 혈전증 발생률은 혈액과 검체가 없는 유리 용기(음성 대조군)와 혈액이 있는 유리 용기(양성 대조군)의 무게를 계산하여 추정했습니다.
초기 확인 단계로, HFFC 표면 코팅, Ct 상호 연결부 및 Ct 네트워크의 기공 형성 능력을 파악하기 위해 광학 현미경으로 샘플을 관찰했습니다. NFRCS에서 얻은 Ch와 Cp의 얇은 절편을 메스날로 다듬었습니다. 이렇게 만든 절편을 유리 슬라이드에 놓고 커버슬립으로 덮은 후 가장자리를 접착제로 고정했습니다. 제작된 슬라이드를 광학 현미경으로 관찰하고 다양한 배율에서 사진을 촬영했습니다.
Ct 네트워크의 폴리머 증착은 Rice et al.29가 설명한 방법을 기반으로 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었으며, NFRCS(Ch 및 Cp)는 앞서 언급한 방법에 따라 제조되었습니다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었으며, NFRCS(Ch 및 Cp)는 앞서 언급한 방법에 따라 제조되었습니다.제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었으며, NFRCS(Ch 및 Cp)는 앞서 언급한 방법에 따라 얻어졌습니다.사용 가능한 HFFC 결합물은 荧光染料(苋菜) 결합, 并按 사진에 앞서 면提到적 방법 제조에 NFRCS(Ch & Cp)입니다.사용 가능한 HFFC 결합물은 荧光染料(苋菜) 결합, 并按 사진에 앞서 면提到적 방법 제조에 NFRCS(Ch & Cp)입니다.제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광 염료(아마란스)와 혼합되었으며 앞서 언급한 바와 같이 NFRCS(Ch 및 Cp)를 받았습니다.얻어진 시료에서 NFRK의 얇은 절편을 잘라 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 덮었다. 준비된 슬라이드를 녹색 필터(310-380 nm)를 사용하는 형광 현미경으로 관찰했다. 4배율로 이미지를 촬영하여 Ct 네트워크 내의 Ct 관계 및 과잉 중합체 침착을 분석했다.
NFRCS Ch 및 Cp의 표면 지형은 Bruker(대만)사의 초정밀 TESP 캔틸레버를 장착한 원자력 현미경(AFM)을 탭핑 모드(42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm)로 사용하여 측정하였다. 표면 거칠기는 주사 탐침 이미지 프로세서(SPI) 소프트웨어를 이용하여 제곱평균제곱근(RMS)으로 계산하였다. 표면 균일성을 확인하기 위해 NFRCS의 여러 위치를 3D 이미지로 구현하였다. 특정 영역에 대한 점수의 표준편차를 표면 거칠기로 정의하였다. NFRCS31의 표면 거칠기는 RMS 공식을 이용하여 정량화하였다.
Ch NFRCS와 Cp NFRCS의 표면 형태를 이해하기 위해 FESEM(SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo)을 사용하여 연구를 수행했습니다. Ch NFRCS와 Cp NFRCS는 Cm NFRCS보다 BCT가 더 우수했습니다. FESEM 연구는 Zhao 등32이 기술한 방법을 약간 수정하여 수행했습니다. 20~30mg의 Ch NFRCS와 Cp NFRCS를 쥐 혈액과 혼합한 20µl의 3.8% 시트르산나트륨 용액과 혼합했습니다. 혈액 처리된 시료에 20µl의 0.2M CaCl2를 첨가하여 응고를 시작하고 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 또한, 생리식염수로 헹궈 NFRCS 표면의 과량의 적혈구를 제거했습니다.
이후 샘플은 0.1% 글루타르알데히드로 처리한 후 37°C의 열풍 건조기에서 건조하여 수분을 제거했습니다. 건조된 샘플은 코팅 후 분석했습니다.32 분석 과정에서 얻은 다른 이미지로는 개별 면섬유 표면의 혈전 형성, Ct 사이의 고분자 침착, 적혈구 형태(모양), 혈전 완전성, NFRCS 존재 하에서의 적혈구 형태 등이 있습니다. 혈액과 함께 배양한 미처리 NFRCS 영역과 Ch 및 Cp로 처리한 NFRCS 영역에서 원소 이온(나트륨, 칼륨, 질소, 칼슘, 마그네슘, 아연, 구리 및 셀레늄)을 분석했습니다.33 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 간의 원소 이온 백분율을 비교하여 혈전 형성 중 원소 이온 축적 및 혈전 균질성을 파악했습니다.
Ct 표면의 Cp HFFC 표면 코팅 두께는 FESEM을 사용하여 측정되었습니다. Cp NFRCS의 단면은 프레임워크에서 잘라내어 스퍼터 코팅했습니다. 결과적으로 생성된 스퍼터 코팅 샘플을 FESEM으로 관찰하고 표면 코팅 두께를 측정했습니다. 34, 35, 36
X선 마이크로 CT는 고해상도 3D 비파괴 이미징을 제공하여 NFRK의 내부 구조 배열을 연구할 수 있게 해줍니다. 마이크로 CT는 시료를 통과하는 X선 빔을 이용하여 시료 내 X선의 국소 선형 감쇠 계수를 기록함으로써 형태학적 정보를 얻습니다. Cp NFRCS 및 혈액 처리된 Cp NFRCS 내 Ct의 내부 위치는 마이크로 CT를 이용하여 NFRCS 존재 하에서의 흡수 효율 및 혈액 응고를 이해하기 위해 조사되었습니다.37,38,39 혈액 처리 및 미처리 Cp NFRCS 시료의 3D 구조는 마이크로 CT(V|tome|x S240, Phoenix, Germany)를 사용하여 재구성되었습니다. VG STUDIO-MAX 소프트웨어 버전 2.2를 사용하여 여러 각도(이상적으로는 360° 범위)에서 X선 ​​이미지를 촬영하여 NFRCS의 3D 이미지를 생성했습니다. 수집된 투영 데이터는 해당 simple 3D ScanIP Academic 소프트웨어를 사용하여 3D 체적 이미지로 재구성되었습니다.
또한, 혈전의 분포를 파악하기 위해 미리 혼합한 구연산 처리 혈액 20µl와 0.2M CaCl2 용액 20µl를 NFRCS에 첨가하여 혈액 응고를 유도했습니다. 준비된 시료는 경화될 때까지 방치했습니다. NFRK 표면은 0.5% 글루타르알데히드로 처리한 후 30~40°C의 열풍 건조기에서 30분간 건조했습니다. NFRCS에 형성된 혈전을 스캔하고 재구성하여 혈전의 3D 이미지를 시각화했습니다.
Cp NFRCS(Ch NFRCS와 비교했을 때 가장 우수함)에 대한 항균 활성 검사는 기존에 기술된 방법을 약간 수정하여 수행하였다. Cp NFRCS와 Cp HFFC의 항균 활성은 배양기 내 페트리 접시의 한천 배지에서 배양된 세 가지 시험 미생물[황색포도상구균(S. aureus, 그람 양성균), 대장균(E. coli, 그람 음성균), 칸디다 알비칸스(C. albicans)]을 사용하여 측정하였다. 희석된 세균 배양액 현탁액 50ml를 10⁵-10⁶ CFU ml⁻¹ 농도로 한천 배지에 균일하게 접종하였다. 배지를 페트리 접시에 붓고 굳혔다. 한천 배지 표면에 HFFC를 채울 웰을 만들었다(HFFC용 웰 3개, 음성 대조군용 웰 1개). 3개의 웰에는 HFFC 200µl를, 나머지 웰에는 pH 7.4 PBS 200µl를 넣었다. 페트리 접시의 반대쪽에는 굳은 한천 위에 12mm Cp NFRCS 디스크를 놓고 PBS(pH 7.4)로 적셔줍니다. 시프로플록사신, 암피실린, 플루코나졸 정제는 각각 황색포도상구균, 대장균, 칸디다 알비칸스에 대한 표준 치료제로 사용됩니다. 저해 영역의 크기를 수동으로 측정하고, 저해 영역의 디지털 이미지를 촬영합니다.
기관윤리위원회의 승인을 받은 후, 본 연구는 인도 남부 카르나타카주 마니팔에 위치한 카스투르바 의과대학에서 수행되었습니다. 체외 TEG 실험 프로토콜은 카스투르바 의과대학 기관윤리위원회(IEC: 674/2020)의 검토 및 승인을 받았습니다. 연구 대상자는 병원 혈액은행에서 모집한 자원 헌혈자(18~55세)였습니다. 또한, 혈액 샘플 채취에 대한 사전 동의서를 자원자들로부터 받았습니다. Cp HFFC 제형이 구연산나트륨과 혼합된 전혈에 미치는 영향을 연구하기 위해 비정형 TEG(N-TEG)를 사용했습니다. N-TEG는 임상적으로 중요한 결과 지연 가능성(일반적인 응고 검사)으로 인해 임상의에게 어려움을 야기하는 현장 응급 처치에 널리 사용되는 검사입니다. N-TEG 분석은 전혈을 사용하여 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의서와 상세한 병력을 수집했습니다. 본 연구에서는 임신/산후 또는 간 질환과 같은 지혈 또는 혈전 합병증이 있는 참가자는 포함하지 않았습니다. 응고 연쇄 반응에 영향을 미치는 약물을 복용하는 대상자도 연구에서 제외되었습니다. 모든 참가자에 대해 표준 절차에 따라 기본 임상 검사(헤모글로빈, 프로트롬빈 시간, 활성화 트롬보플라스틴 및 혈소판 수)를 수행했습니다. N-TEG는 혈전의 점탄성, 초기 혈전 구조, 입자 상호작용, 혈전 강화 및 혈전 용해를 측정합니다. N-TEG 분석은 여러 세포 요소와 혈장의 종합적인 효과에 대한 그래프 및 수치 데이터를 제공합니다. N-TEG 분석은 두 가지 다른 용량의 Cp HFFC(10 µl 및 50 µl)를 사용하여 수행되었습니다. 그 결과, 1 ml의 구연산이 첨가된 전혈을 10 µl의 Cp HFFC에 첨가했습니다. 1 ml(Cp HFFC + 구연산 처리된 혈액) 혼합액 340 µl를 20 µl의 0.2 M CaCl2가 포함된 TEG 접시에 첨가했습니다. 이후, TEG 접시를 TEG® 5000, US에 넣고 Cp HFFC41이 존재하는 조건에서 혈액 샘플의 30%에 대해 R, K, 알파 각도, MA, G, CI, TPI, EPL, LY를 측정했습니다.
생체 내 연구 프로토콜은 마니팔 고등교육기관 카스투르바 의과대학 기관 동물 윤리 위원회(IAEC/KMC/69/2020)의 검토 및 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험은 동물 실험 관리 및 감독 위원회(CPCSEA)의 권고 사항에 따라 수행되었습니다. 모든 생체 내 NFRCS 연구(2 × 2 cm2)는 암컷 위스타 쥐(체중 200~250g)를 대상으로 수행되었습니다. 모든 동물은 24~26°C의 온도에 적응시켰으며, 표준 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 했습니다. 모든 동물은 무작위로 세 마리씩 여러 그룹으로 나누었습니다. 모든 연구는 동물 연구: 생체 내 실험 보고서 43에 따라 수행되었습니다. 연구 시작 전, 동물들에게 케타민 20-50mg(체중 1kg당)과 자일라진 2-10mg(체중 1kg당)의 혼합물을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 연구 후, 채혈량은 시료의 초기 무게와 최종 무게의 차이를 측정하여 계산하였고, 세 번의 측정에서 얻은 평균값을 시료의 채혈량으로 간주하였다.
쥐 꼬리 절단 모델을 이용하여 외상, 전투 또는 교통사고(손상 모델)에서 NFRCS가 출혈을 조절하는 잠재력을 이해하고자 했습니다. 메스날로 꼬리의 50%를 절단하고 15초 동안 공기 중에 두어 정상적인 출혈을 유도했습니다. 또한, 시험 샘플(Ct, Cs, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS)을 쥐의 꼬리에 압력을 가하여 올려놓았습니다. 시험 샘플(n=3)에 대해 출혈량과 PCT를 측정했습니다.
대퇴동맥 표면 모델을 이용하여 전투 상황에서 NFRCS 압력 조절의 효과를 조사하였다. 대퇴동맥을 노출시키고 24G 트로카로 천자한 후 15초 이내에 출혈을 유도하였다. 지혈이 되지 않는 것이 관찰되면 천자 부위에 시험편을 놓고 압력을 가하였다. 시험편 적용 직후 응고 시간을 측정하고 이후 5분 동안 지혈 효율을 관찰하였다. 동일한 절차를 Cs와 Ct46을 사용하여 반복하였다.
Dowling 등47은 수술 중 출혈 상황에서 지혈 물질의 지혈 잠재력을 평가하기 위해 간 손상 모델을 제안했습니다. Ct 샘플(음성 대조군), Cs 프레임워크(양성 대조군), Ch NFRCS 샘플 및 Cp NFRCS 샘플에 대해 BCT를 기록했습니다. 정중 복부 절개를 통해 쥐의 간상정맥을 노출시켰습니다. 그 후, 가위로 좌엽의 원위부를 절제했습니다. 메스날로 간에 절개를 하고 몇 초 동안 출혈을 유도했습니다. 정확하게 무게를 잰 Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 시험 샘플을 양압 없이 손상 부위에 놓고 BCT를 기록했습니다. 대조군(Ct)에는 압력을 가한 후, Cs 30초47을 손상 부위를 파괴하지 않고 적용했습니다.
개발된 고분자 기반 NFRCS의 상처 치유 특성을 평가하기 위해 절제창 모델을 사용하여 생체 내 상처 치유 시험을 수행했습니다. 절제창 모델은 이전에 발표된 방법을 약간 수정하여 선택 및 수행했습니다.19,32,48 모든 동물은 이전에 설명된 대로 마취했습니다. 생검 펀치(12mm)를 사용하여 등 피부에 원형의 깊은 절개를 했습니다. 준비된 상처 부위에 Cs(양성 대조군), Ct(솜 패드가 치유를 방해하는 것을 인지한 경우), Ch NFRCS 및 Cp NFRCS(실험군)와 아무런 처치를 하지 않은 음성 대조군을 드레싱했습니다. 연구 기간 동안 매일 모든 쥐의 상처 면적을 측정했습니다. 디지털 카메라로 상처 부위 사진을 찍고 새 드레싱을 했습니다. 상처 폐쇄율은 다음 공식을 사용하여 계산했습니다.
연구 12일째 상처 폐쇄율을 기준으로, 가장 효과가 좋은 그룹(Cp NFRCS)과 대조군의 쥐 피부를 절제하여 H&E 염색과 마손 삼색 염색을 통해 연구하였다. 연구 12일째 상처 폐쇄율을 기준으로, 가장 효과가 좋은 그룹(Cp NFRCS)과 대조군의 쥐 피부를 절제하여 H&E 염색과 마손 삼색 염색을 통해 연구하였다.연구 12일째 상처 폐쇄율을 기준으로 최적군(Cp NFRCS 투여군)과 대조군의 쥐 피부를 절제하여 헤마톡실린-에오신 염색과 마손 트리크롬 염색을 통해 검사하였다.根据研究第12는 切除最佳组((Cp NFRCS)와 对光组)의 大鼠皮肤, 进行H&E染color와 Masson三color染color研究입니다.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)and对光组)的大鼠皮肤，进行H&E染color眳组)최적군(Cp NFRCS)과 대조군에 속한 쥐들을 대상으로 연구 12일째에 상처 폐쇄율을 기준으로 헤마톡실린-에오신 염색과 마손 트리크롬 염색을 실시하였다.시행된 염색 절차는 이전에 기술된 방법49,50에 따라 수행되었습니다. 간단히 설명하면, 10% 포르말린에 고정한 후, 단계별 알코올 용액을 사용하여 시료를 탈수했습니다. 절제된 조직에서 마이크로톰을 이용하여 5µm 두께의 얇은 절편을 제작했습니다. 대조군과 Cp NFRCS의 얇은 연속 절편을 헤마토실린-에오신 염색하여 조직병리학적 변화를 관찰했습니다. 콜라겐 섬유 형성은 마손 트리크롬 염색을 사용하여 확인했습니다. 얻어진 결과는 병리학자들이 맹검법으로 분석했습니다.
Cp NFRCS 샘플의 안정성은 실온(25°C ± 2°C/60% RH ± 5%)에서 12개월 동안 연구되었습니다.51 Cp NFRCS(표면 변색 및 미생물 성장)는 육안으로 검사하고 재료 및 방법 섹션에 설명된 위의 방법에 따라 접힘 마모 저항 및 BCT를 테스트했습니다.
Cp NFRCS의 확장성과 재현성을 확인하기 위해 15×15 cm2 크기의 Cp NFRCS를 제조하였다. 또한, 다양한 Cp NFRCS 분획에서 30 mg 샘플(n=5)을 채취하여 앞서 방법 섹션에서 설명한 바와 같이 샘플의 BCT를 평가하였다.
본 연구에서는 다양한 생의학 응용 분야에 활용하기 위해 Cp NFRCS 조성물을 사용하여 다양한 모양과 구조를 개발하고자 시도했습니다. 이러한 모양 또는 구조에는 코피용 원뿔형 면봉, 치과 시술용 면봉, 질 출혈용 원통형 면봉 등이 포함됩니다.
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, Prism 5.03(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여 ANOVA 분석을 실시한 후 Bonferroni 다중 비교 검정을 수행했습니다(*p<0.05).
인체 대상 연구에서 수행된 모든 절차는 연구소 및 국립연구위원회의 기준, 1964년 헬싱키 선언 및 그 후속 수정안 또는 이와 유사한 윤리 기준에 따라 진행되었습니다. 모든 참가자는 연구의 특징과 자발적 참여에 대해 충분히 고지받았습니다. 참가자 데이터는 수집 후 기밀로 유지됩니다. 체외 TEG 실험 프로토콜은 카르나타카주 마니팔에 위치한 카스투르바 의과대학 기관윤리위원회(IEC: 674/2020)의 검토 및 승인을 받았습니다. 자원 참가자들은 혈액 샘플 채취에 대한 정보 제공 동의서에 서명했습니다.
동물 실험에 사용된 모든 절차는 마니팔 고등교육기관 카스투바 의과대학(IAEC/KMC/69/2020)의 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험 설계는 유럽 동물실험윤리위원회(CPCSEA)의 지침에 따라 진행되었습니다. 모든 저자는 ARRIVE 가이드라인을 준수합니다.
모든 NFRCS의 FTIR 스펙트럼을 분석하고 그림 2A에 나타낸 키토산 스펙트럼과 비교했습니다. 키토산의 특징적인 스펙트럼 피크는 3437 cm⁻¹(OH 및 NH 신축 진동, 중첩), 2945 및 2897 cm⁻¹(CH 신축 진동), 1660 cm⁻¹(NH₂ 변형 진동), 1589 cm⁻¹(N–H 굽힘 진동), 1157 cm⁻¹(O- 브리지 신축 진동), 1067 cm⁻¹(C–O 신축 진동, 2차 하이드록실기), 993 cm⁻¹(CO 신축 진동, Bo-OH)에서 관찰되었습니다. 보충표 S1에는 키토산(리포터), 순수 키토산, Cm, Ch 및 Cp의 FTIR NFRCS 흡수 스펙트럼 값이 나와 있습니다. 모든 NFRCS(Cm, Ch 및 Cp)의 FTIR 스펙트럼은 순수 키토산과 동일한 특징적인 흡수 밴드를 나타냈으며, 뚜렷한 변화는 없었다(그림 2A). FTIR 결과는 NFRCS 개발에 사용된 고분자들 사이에 화학적 또는 물리적 상호작용이 없음을 확인시켜 주었으며, 이는 사용된 고분자들이 불활성임을 나타낸다.
Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs의 시험관 내 특성 분석. (A) 압축 상태에서 키토산과 Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS 조성물의 결합된 FTIR 스펙트럼을 나타낸다. (B) a) NFRCS Cm, Ch, Cp, Cg의 전혈 흡수율(n=3); Ct 샘플은 면봉의 흡수 효율이 높아 더 높은 BAR 값을 보였다. b) 혈액 흡수 후 혈액. 흡수된 샘플의 그림. 시험 샘플 C의 BCT를 그래프로 나타낸 것(Cp NFRCS가 가장 짧은 BCT(15초, n=3)를 보였다). C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 오차 막대는 표준편차를 나타냅니다. ***p < 0.0001. C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 오차 막대는 표준편차를 나타냅니다. ***p < 0.0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляѕт стандартное отклонение, ***p <0,0001. C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되었으며, 오차 막대는 표준편차를 나타냅니다. ***p<0.0001. C、D、E 와 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 와 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C, D, E 및 G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представлякт стандартное отклонение, ***p <0,0001. C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 오차 막대는 표준편차를 나타냅니다. ***p<0.0001.