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통제되지 않는 출혈은 주요 사망 원인 중 하나입니다. 신속한 지혈은 전투, 교통사고, 사망 감소 작전 중 응급 처치로서 대상의 생존을 보장합니다. 간단한 지혈 필름 형성 조성물(HFFC)을 연속상으로 사용하여 만든 나노다공성 섬유 강화 복합 지지체(NFRCS)는 지혈을 촉진하고 향상시킬 수 있습니다. NFRCS는 잠자리 날개의 설계를 기반으로 개발되었습니다. 잠자리 날개 구조는 가로 날개와 세로 날개로 구성되며, 날개 막은 미세 구조의 무결성을 유지하기 위해 서로 연결되어 있습니다. HFFC는 섬유 표면을 나노미터 두께의 필름으로 균일하게 코팅하고, 무작위로 분포된 면 두께(Ct)(분산상)를 연결하여 나노다공성 구조를 형성합니다. 연속상과 분산상의 조합은 시중 제품 대비 제품 비용을 10배까지 절감합니다. 변형된 NFRCS(탐폰 또는 손목밴드)는 다양한 생물의학 분야에 사용될 수 있습니다. 생체 내 연구에 따르면, 개발된 Cp NFRCS는 적용 부위의 응고 과정을 촉진하고 증진시키는 것으로 나타났습니다. NFRCS는 나노다공성 구조로 인해 미세환경을 조절하고 세포 수준에서 작용하여 절제 상처 모델에서 상처 치유를 촉진합니다.
전투, 수술 중 및 응급 상황에서 조절되지 않는 출혈은 부상자의 생명에 심각한 위협이 될 수 있습니다.1 이러한 상황은 말초 혈관 저항의 전반적인 증가로 이어져 출혈성 쇼크로 이어집니다. 수술 중 및 수술 후 출혈을 조절하기 위한 적절한 조치는 잠재적으로 생명을 위협하는 것으로 간주됩니다.2,3 큰 혈관 손상은 대량의 실혈을 초래하여 전투 중 사망률은 ≤50%, 수술 중 사망률은 31%입니다.1 대량의 실혈은 체액량 감소로 이어져 심박출량을 감소시킵니다. 총 말초 혈관 저항의 증가와 점진적인 미세순환 장애는 생명 유지 기관의 저산소증을 유발합니다. 효과적인 개입 없이 상태가 지속될 경우 출혈성 쇼크가 발생할 수 있습니다.1,4,5 다른 합병증으로는 저체온증과 대사성 산증의 진행, 그리고 응고 과정을 방해하는 응고 장애가 있습니다. 심각한 출혈성 쇼크는 사망 위험이 더 높습니다.6,7,8 3등급(진행성) 쇼크에서 수혈은 수술 중 및 수술 후 이환율과 사망률 측면에서 환자의 생존에 필수적입니다. 이러한 모든 생명을 위협하는 상황을 극복하기 위해, 저희는 수용성 지혈 폴리머를 조합하여 최소 폴리머 농도(0.5%)를 사용하는 나노다공성 섬유 강화 복합 지지체(NFRCS)를 개발했습니다.
섬유 강화재를 사용하면 비용 효율적인 제품을 개발할 수 있습니다. 무작위로 배열된 섬유는 잠자리 날개의 구조와 유사하며, 날개의 가로 및 세로 줄무늬와 균형을 이룹니다. 날개의 가로 및 세로 맥은 날개막과 연결되어 있습니다(그림 1). NFRCS는 물리적 및 기계적 강도가 더 우수한 지지대 시스템인 강화된 Ct로 구성됩니다(그림 1). 저렴한 가격과 뛰어난 기술력으로 인해 외과의들은 수술 및 드레싱 시 면사 게이지(Ct)를 사용하는 것을 선호합니다. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로스(지혈 활동 향상에 도움)를 포함한 다양한 이점을 고려하여 Ct를 NFRCS9,10의 골격계로 사용했습니다. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로스(지혈 활동 향상에 도움)를 포함한 다양한 이점을 고려하여 Ct를 NFRCS9,10의 골격계로 사용했습니다. Следовательно, учитывая его многочисленные преимуЂества, в том числе > 90% Кристаллической целлулозы (участвует в повышении гемостатической aktiвности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. 따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로스(지혈 활동 증가에 관여)를 포함한 많은 이점을 감안하여 Ct를 NFRCS 골격계로 사용했습니다9,10.因此，考虑到它多 多重益处，包括> 90% 의 结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用은 NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它多益处，包括> 90%따라서 90% 이상의 결정질 셀룰로스(지혈 활동 향상에 도움)를 포함한 많은 이점을 감안할 때, Ct는 NFRCS9,10의 스캐폴드로 사용되었습니다.Ct는 표면 코팅(나노 두께의 필름 형성이 관찰됨)되어 지혈 필름 형성 조성물(HFFC)과 상호 연결되었습니다. HFFC는 마트리젤처럼 작용하여 무작위로 배치된 Ct를 함께 고정합니다. 개발된 설계는 분산된 상(보강 섬유) 내에서 응력을 전달합니다. 최소의 고분자 농도를 사용하여 우수한 기계적 강도를 가진 나노다공성 구조를 얻는 것은 어렵습니다. 또한, 다양한 생체의학 응용 분야에 맞게 다양한 금형을 맞춤 제작하는 것도 쉽지 않습니다.
그림은 잠자리 날개 구조(A)에 기반한 NFRCS 설계 다이어그램을 보여줍니다. 이 이미지는 잠자리 날개 구조(날개의 교차맥과 종맥이 서로 연결되어 있음)와 Cp NFRCS의 단면 현미경 사진(B)을 비교 비교한 것입니다. NFRCS의 개략도.
NFRC는 위의 한계를 해결하기 위해 HFFC를 연속상으로 사용하여 개발되었습니다.HFFC는 키토산(주요 지혈 중합체)과 메틸셀룰로오스(MC), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC 50 cp) 및 혈전 형성을 촉진하는 지지 중합체인 폴리비닐알코올(PVA)(125 kDa)을 포함한 다양한 필름 형성 지혈 중합체로 구성됩니다.폴리비닐피롤리딘 K30(PVP K30)을 첨가하면 NFRCS의 수분 흡수 용량이 향상되었습니다.폴리에틸렌 글리콜 400(PEG 400)을 첨가하여 결합된 중합체 블렌드에서 중합체 가교를 향상시켰습니다.세 가지 다른 HFFC 지혈 조성물(Cm HFFC, Ch HFFC 및 Cp HFFC), 즉 MC가 있는 키토산(Cm), HPMC가 있는 키토산(Ch), PVA가 있는 키토산(Cp)이 Ct에 적용되었습니다. 다양한 시험관내 및 생체내 특성화 연구를 통해 NFRCS의 지혈 및 상처 치유 활성이 확인되었습니다. NFRCS에서 제공하는 복합 소재는 특정 요구에 맞춰 다양한 형태의 스캐폴딩을 맞춤 제작하는 데 사용될 수 있습니다.
또한, NFRCS는 붕대나 롤 형태로 변형하여 하지 및 신체 다른 부위의 부상 부위 전체를 덮을 수 있습니다. 특히 전투 중 부상의 경우, 설계된 NFRCS는 팔의 절반 또는 다리 전체로 변형될 수 있습니다(보충 그림 S11). NFRCS는 조직 접착제를 사용하여 손목 밴드 형태로 제작할 수 있으며, 심각한 자살성 손목 부상으로 인한 출혈을 멈추는 데 사용할 수 있습니다. 저희의 주요 목표는 폴리머 사용량을 최소화하여 빈곤선 이하의 많은 사람들에게 전달되고 구급상자에 보관할 수 있는 NFRCS를 개발하는 것입니다. 간단하고 효율적이며 경제적인 설계를 통해 NFRCS는 지역 사회에 도움을 줄 뿐만 아니라 전 세계적인 영향을 미칠 수 있습니다.
키토산(분자량 80 kDa)과 아마란스는 인도 머크(Merck)에서 구입했습니다. 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 50 Cp, 폴리에틸렌 글리콜 400, 메틸셀룰로오스는 뭄바이의 로바 케미(Loba Chemie Pvt. LLC)에서 구입했습니다. 폴리비닐알코올(분자량 125 kDa)(87-90% 가수분해)은 구자라트주의 내셔널 케미컬스(National Chemicals)에서 구입했습니다. 폴리비닐피롤리딘 K30은 뭄바이의 몰리켐(Molychem)에서 구입했고, 멸균 면봉은 타밀나두주의 라마라주 서지어리 코튼 밀스(Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd.)에서 구입했으며, 밀리큐 워터(Milli Q water, Direct-Q3 정수 시스템, 머크, 인도)를 담체로 사용했습니다.
NFRCS는 동결건조법11,12을 사용하여 개발되었습니다. 모든 HFFC 조성물(표 1)은 기계식 교반기를 사용하여 제조되었습니다. 물에 1% 아세트산을 첨가하고 기계식 교반기에서 800rpm으로 연속 교반하여 0.5% 키토산 용액을 제조합니다. 표 1에 표시된 정확한 중량의 로딩된 폴리머를 키토산 용액에 첨가하고 투명한 폴리머 용액이 얻어질 때까지 교반합니다. PVP K30과 PEG 400을 표 1에 표시된 양으로 생성된 혼합물에 첨가하고 투명한 점성 폴리머 용액이 얻어질 때까지 교반을 계속합니다. 생성된 폴리머 용액조를 60분 동안 초음파 처리하여 폴리머 혼합물에서 갇힌 기포를 제거합니다. 보충 그림 S1(b)에서 볼 수 있듯이, Ct는 5ml의 HFFC가 보충된 6웰 플레이트(몰드)의 각 웰에 고르게 분포되었습니다.
6웰 플레이트를 60분 동안 초음파 처리하여 Ct 네트워크 내 HFFC의 균일한 습윤 및 분포를 달성했습니다. 그런 다음 6웰 플레이트를 -20°C에서 8~12시간 동안 동결했습니다. 동결된 플레이트를 48시간 동안 동결건조하여 다양한 제형의 NFRCS를 얻었습니다. 탐폰, 원통형 탐폰 등 다양한 모양과 구조, 또는 다양한 용도에 맞는 다른 모양의 제품을 생산하는 데에도 동일한 과정이 사용됩니다.
정확하게 무게를 잰 키토산(80 kDa)(3%)을 자석 교반기를 사용하여 1% 아세트산에 녹입니다. 생성된 키토산 용액에 1% PEG 400을 첨가하고 30분 동안 교반합니다. 생성된 용액을 정사각형 또는 직사각형 용기에 붓고 -80°C에서 12시간 동안 동결합니다. 동결된 시료를 48시간 동안 동결건조하여 다공성 Cs13을 얻습니다.
개발된 NFRCS를 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)(Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan)을 이용하여 키토산과 다른 고분자의 화학적 적합성을 확인하는 실험을 수행하였다.14,15 모든 시험 시료의 FTIR 스펙트럼(스펙트럼 범위 400~4000 cm-1)은 32회 스캔하여 얻었다.
모든 제형의 혈액 흡수율(BAR)은 Chen et al. 16에 기술된 방법을 약간 수정하여 평가했습니다. 모든 조성의 개발된 NFRK를 진공 오븐에서 105°C로 하룻밤 건조하여 잔류 용매를 제거했습니다. 30mg의 NFRCS(초기 샘플 중량 - W0)와 30mg의 Ct(양성 대조군)를 3.8% 구연산나트륨 프리믹스가 담긴 별도의 접시에 담았습니다. 미리 정해진 시간 간격(5, 10, 20, 30, 40, 60초)마다 NFRCS를 제거하고 샘플을 Ct에 30초 동안 올려놓아 흡수되지 않은 혈액을 표면에서 제거했습니다. 각 시점에서 NFRCS 16에 흡수된 최종 혈액 중량(W1)을 고려했습니다. 다음 공식을 사용하여 BAR 백분율을 계산합니다.
혈액 응고 시간(BCT)은 Wang 등이 보고한 대로 결정했습니다.17. NFRCS가 있는 상태에서 전혈(3.8% 구연산나트륨과 미리 혼합한 쥐 혈액)이 응고하는 데 걸리는 시간은 테스트 샘플의 BCT로 계산했습니다. 다양한 NFRCS 성분(30mg)을 10ml 스크류 캡 바이알에 넣고 37°C에서 배양했습니다. 혈액(0.5ml)을 바이알에 넣고 0.2M CaCl2 0.3ml를 넣어 혈액 응고를 활성화했습니다. 마지막으로 단단한 응고가 형성될 때까지 15초마다(최대 180°) 바이알을 뒤집습니다. 샘플의 BCT는 뒤집기 횟수로 추정합니다.17,18. BCT를 기반으로 NFRCS Cm, Ch 및 Cp의 두 가지 최적 구성을 추가 특성화 연구를 위해 선택했습니다.
Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 조성의 BCT는 Li et al. 19에서 설명한 방법을 구현하여 결정했습니다. 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs(양성 대조군)를 별도의 페트리 접시(37 °C)에 넣습니다. 3.8% 구연산나트륨이 함유된 혈액을 0.2 M CaCl2와 10:1 부피 비율로 혼합하여 혈액 응고 과정을 시작했습니다. 0.2 M CaCl2 쥐 혈액 혼합물 20 µl를 샘플 표면에 바르고 빈 페트리 접시에 넣었습니다. 대조군은 Ct가 없는 빈 페트리 접시에 붓는 혈액이었습니다. 0, 3, 5분의 고정 간격으로 응고를 방해하지 않고 접시가 들어 있는 샘플에 탈이온수(DI) 10 ml를 추가하여 응고를 멈춥니다. 응고되지 않은 적혈구(적혈구)는 탈이온수가 있으면 용혈되어 헤모글로빈을 방출합니다. UV-Vis 분광광도계를 사용하여 540 nm(λmax 헤모글로빈)에서 다양한 시점의 헤모글로빈(HA(t))을 측정했습니다. 10 ml의 탈이온수에 20 µl의 혈액을 넣고 0분 동안 측정한 헤모글로빈의 절대 흡광도(AH(0))를 기준 표준으로 삼았습니다. 응고된 혈액의 상대 헤모글로빈 흡수율(RHA)은 동일한 혈액 배치를 사용하여 HA(t)/HA(0)의 비율로부터 계산했습니다.
질감 분석기(Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA)를 사용하여 손상된 조직에 대한 NFRK의 접착력을 측정했습니다. 바닥이 열린 원통형 접시를 돼지껍질 안쪽(지방층이 없는 상태)에 대고 누릅니다. 샘플(Ch NFRCS 및 Cp NFRCS)을 캐뉼라를 통해 원통형 몰드에 도포하여 돼지껍질에 접착되도록 했습니다. 실온(RT)(25°C)에서 3분간 배양한 후, NFRCS 접착력을 0.5 mm/초의 일정한 속도로 측정했습니다.
수술용 실런트의 주요 특징은 혈액 손실을 줄이는 동시에 혈액 응고를 증가시키는 것입니다.NFRCS의 무손실 응고는 약간의 수정을 거친 이전에 발표된 방법을 사용하여 평가했습니다 19. 원심분리관 한쪽에 8 × 5 mm2 구멍(열린 상처를 나타냄)이 있는 미세원심분리관(2 ml)(내경 10 mm)을 만듭니다.NFRCS를 사용하여 개구부를 닫고 테이프를 사용하여 바깥쪽 가장자리를 밀봉합니다.3.8% 구연산나트륨 프리믹스가 들어 있는 미세원심분리관에 0.2 M CaCl2 20 µl를 첨가합니다.10분 후, 미세원심분리관을 접시에서 제거하고 NFRK에서 혈액이 유출되어 접시의 질량이 증가한 것을 확인했습니다(n = 3).혈액 손실 Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 Cs와 비교했습니다.
NFRCS의 습윤 건전성은 Mishra와 Chaudhary21가 제시한 방법을 약간 수정하여 측정했습니다. NFRCS를 100ml 삼각 플라스크에 넣고 물 50ml를 넣은 후, 뚜껑이 열리지 않도록 60초 동안 흔들어 줍니다. 채취한 시료의 물리적 건전성을 육안으로 검사하고 우선순위를 정합니다.
HFFC와 Ct의 결합 강도는 이전에 발표된 방법을 약간 수정하여 연구했습니다. 표면 코팅 무결성은 밀리큐 수분(Ct)이 존재하는 상태에서 NFRK를 음향파(외부 자극)에 노출시켜 평가했습니다. 개발된 NFRCS Ch NFRCS와 Cp NFRCS를 물이 채워진 비이커에 넣고 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30분 동안 초음파 처리했습니다. 건조 후, NFRCS의 초기 무게와 최종 무게의 차이(%)를 사용하여 물질 손실률(HFFC)을 계산했습니다. 시험관 내 BCT는 표면 물질의 결합 강도 또는 손실을 더욱 뒷받침했습니다. HFFC가 Ct에 결합하는 효율은 혈액 응고와 Ct22 표면에 탄성 코팅을 제공합니다.
개발된 NFRCS의 균질성은 NFRCS 내 무작위로 선택된 일반적인 위치에서 채취한 시료(30mg)의 BCT(Best-Test-Content-Chemical Conclusion)를 통해 확인했습니다. NFRCS 적합성을 확인하려면 앞서 언급한 BCT 절차를 따르세요. 다섯 시료가 모두 근접해 있어 균일한 표면 피복과 Ct 메시 내 HFFC 증착이 보장됩니다.
공칭 혈액 접촉 면적(NBCA)은 이전에 보고된 바와 같이 약간의 수정을 거쳐 결정되었습니다. Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS, Cs의 두 표면 사이에 20 µl의 혈액을 채워 혈액을 응고시킵니다. 1시간 후, 스텐트의 두 부분을 분리하고 혈전 면적을 수동으로 측정했습니다. 세 번의 반복 측정 결과의 평균값을 NBCA NFRCS19로 간주했습니다.
동적 증기 흡착(DVS) 분석은 응고를 유발하는 외부 환경 또는 손상 부위에서 NFRCS가 수분을 흡수하는 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. DVS는 ±0.1µg의 질량 분해능을 가진 초고감도 저울을 사용하여 시료의 증기 흡수 및 손실을 중량 측정 방식으로 평가 또는 기록합니다. 전자 질량 유량 제어기(MFC)는 포화 및 건조 운반 가스를 혼합하여 시료 주변의 분증기압(상대 습도)을 생성합니다. 유럽 ​​약전 지침에 따라, 샘플의 수분 흡수율을 기준으로 샘플을 4가지 범주(0~0.012% w/w 비흡습성, 0.2~2% w/w 약간 흡습성, 2~15% 중간 흡습성, >15% 매우 흡습성)23으로 분류했습니다. 유럽 ​​약전 지침에 따라, 샘플의 수분 흡수율을 기준으로 샘플을 4가지 범주(0~0.012% w/w 비흡습성, 0.2~2% w/w 약간 흡습성, 2~15% 중간 흡습성, >15% 매우 흡습성)23으로 분류했습니다.유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 샘플의 수분 흡수율에 따라 샘플을 4가지 범주(0~0.012% w/w - 비흡습성, 0.2~2% w/w 약간 흡습성, 2~15%)로 나누었습니다.% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. %는 적당히 흡습성이 있고 > 15%는 매우 흡습성이 있음)23.根据欧洲药典指南，根据样product吸收water分比，样product分为4 类（0-0.012% w/w- 비흡수성、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15%适島吸湿，> 15% 不常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样product 分为 分为 分为 类 （(0-0.012% W/w- 吸湿性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 속도 吸湿 ，> 15 %비常吸湿)23。유럽 ​​약전의 권장 사항에 따라 샘플은 샘플이 흡수한 수분의 비율에 따라 4가지 등급으로 나뉩니다(무게 기준 0-0.012% - 비흡습성, 무게 기준 0.2-2% - 약간 흡습성, 무게 기준 2-15%).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % 중간 정도의 흡습성, > 15% 매우 흡습성) 23.NFCS X NFCS와 TsN NFCS의 흡습 효율은 DVS TA TGA Q5000 SA 분석기에서 측정되었습니다. 이 과정에서 실행 시간, 상대 습도(RH), 그리고 25°C에서의 실시간 시료 중량을 측정했습니다. 수분 함량은 다음 방정식을 사용하여 정확한 NFRCS 질량 분석을 통해 계산됩니다.
MC는 NFRCS 습도입니다. m1은 NSAID의 건조 중량입니다. m2는 주어진 RH에서의 실시간 NFRCS 질량입니다.
총 표면적은 샘플을 25 °C에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추산되었습니다(< 7 × 10–3 Torr). 총 표면적은 샘플을 25 °C에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추산되었습니다(< 7 × 10–3 Torr). поверхности оценивалась с помочьу эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). 총 표면적은 샘플을 25°C에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추산되었습니다(< 7 × 10–3 Torr).25°C에서 공기 청정 제품은 100°C(< 7 × 10-3 Torr)로 유지되며, 사용 가능한 전력은 10%입니다.25°C에서 поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C(< 7 × 10-3 торр). 총 표면적은 샘플을 25°C(< 7 x 10-3 torr)에서 10시간 동안 비운 후 액체 질소를 이용한 질소 흡착 실험을 통해 추산되었습니다.총 표면적, 기공 부피 및 NFRCS 기공 크기는 RS 232 소프트웨어를 사용하여 오스트리아 NOVA 1000e의 Quantachrome으로 측정했습니다.
전혈에서 5% 적혈구(희석액으로 생리식염수 사용)를 준비합니다. 그런 다음 HFFC(0.25ml)를 96웰 플레이트와 5% 적혈구 덩어리(0.1ml)에 분주합니다. 혼합물을 37°C에서 40분 동안 배양합니다. 적혈구와 혈청 혼합물을 양성 대조군으로, 생리식염수와 적혈구 혼합물을 음성 대조군으로 간주합니다. 적혈구 응집 반응은 Stajitzky 척도에 따라 측정합니다. 제안된 척도는 다음과 같습니다. + + + + 치밀한 과립 응집체; + + + 가장자리가 곡선인 매끄러운 바닥 패드; + + 가장자리가 찢어진 매끄러운 바닥 패드; + 매끄러운 패드 가장자리 주변의 좁은 빨간색 고리; – (음성) 하단 웰 중앙에 뚜렷한 빨간색 버튼 12가 있습니다.
NFRCS의 혈액적합성은 국제표준화기구(ISO)의 방법(ISO10993-4, 1999)26,27에 따라 연구했습니다. Singh 등이 설명한 중량 측정법입니다. NFRCS가 있거나 NFRCS 표면에서 혈전 형성을 평가하기 위해 사소한 수정을 가했습니다. 500mg의 Cs, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS를 인산완충식염수(PBS)에서 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간 후, PBS를 제거하고 NFRCS를 3.8% 구연산나트륨이 함유된 혈액 2ml로 처리했습니다. NFRCS 표면에 배양된 샘플에 0.1M CaCl2 0.04ml를 첨가했습니다. 45분 후, 응고를 멈추기 위해 증류수 5ml를 첨가했습니다. NFRK 표면의 응고된 혈액을 36-38% 포름알데히드 용액으로 처리했습니다. 포름알데히드로 고정된 혈전을 건조하여 무게를 측정하였다. 혈액과 검체가 없는 유리잔(음성 대조군)과 혈액이 있는 유리잔(양성 대조군)의 무게를 계산하여 혈전 발생률을 추정하였다.
초기 확인으로, HFFC 표면 코팅, Ct 상호 연결, 그리고 Ct 네트워크가 기공을 형성하는 능력을 이해하기 위해 광학 현미경으로 샘플을 시각화했습니다. NFRCS에서 Ch와 Cp의 얇은 절편을 메스로 다듬었습니다. 그 결과 생성된 절편을 유리 슬라이드 위에 놓고 커버슬립으로 덮은 후 가장자리를 접착제로 고정했습니다. 준비된 슬라이드를 광학 현미경으로 관찰하고 다양한 배율로 사진을 촬영했습니다.
Ct 네트워크에서의 폴리머 침전은 Rice et al.29에서 기술한 방법을 기반으로 한 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광염료(아마란스)와 혼합되었고, NFRCS(Ch & Cp)는 이전에 언급한 방법에 따라 제조되었습니다. 제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광염료(아마란스)와 혼합되었고, NFRCS(Ch & Cp)는 이전에 언급한 방법에 따라 제조되었습니다.제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광염료(아마란스)와 혼합되었고, NFRCS(Ch 및 Cp)는 이전에 언급한 방법에 따라 얻어졌습니다.사용 가능한 HFFC 결합물은 荧光染料(苋菜) 결합, 并按 사진에 앞서 면提到적 방법 제조에 NFRCS(Ch & Cp)입니다.사용 가능한 HFFC 결합물은 荧光染料(苋菜) 결합, 并按 사진에 앞서 면提到적 방법 제조에 NFRCS(Ch & Cp)입니다.제형에 사용된 HFFC 조성물은 형광염료(아마란스)와 혼합되었고, 앞서 언급한 바와 같이 NFRCS(Ch 및 Cp)를 받았습니다.얻어진 샘플에서 NFRK의 얇은 절편을 잘라 유리 슬라이드에 놓고 커버슬립으로 덮었다. 준비된 슬라이드를 녹색 필터(310-380 nm)를 사용하여 형광 현미경으로 관찰했다. Ct 관계와 Ct 네트워크 내 과도한 중합체 침착을 이해하기 위해 4배 배율로 이미지를 촬영했다.
NFRCS Ch와 Cp의 표면 지형은 초고선명 TESP 캔틸레버를 장착한 원자간력현미경(AFM)을 사용하여 측정했습니다. AFM은 탭핑 모드(42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan)를 사용했습니다. 표면 거칠기는 소프트웨어(Scanning Probe Image Processor)를 사용하여 제곱평균제곱근(RMS)으로 측정했습니다. 다양한 NFRCS 위치를 3D 이미지에 렌더링하여 표면 균일성을 확인했습니다. 특정 영역에 대한 점수의 표준편차를 표면 거칠기로 정의했습니다. RMS 방정식을 사용하여 NFRCS31의 표면 거칠기를 정량화했습니다.
FESEM 기반 연구는 FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo를 사용하여 Ch NFRCS와 Cp NFRCS의 표면 형태를 파악하기 위해 수행되었으며, Cm NFRCS보다 BCT가 더 우수했습니다. FESEM 연구는 Zhao et al. 32에서 설명한 방법을 약간 수정하여 수행했습니다. NFRCS 20~30 mg Ch NFRCS와 Cp NFRCS를 쥐 혈액과 미리 혼합한 3.8% 구연산나트륨 20 μl와 미리 혼합했습니다. 혈액 처리된 샘플에 0.2 M CaCl2 20 μl를 첨가하여 응고를 시작하고 샘플을 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 또한, 생리식염수로 헹궈 NFRCS 표면에서 과도한 적혈구를 제거했습니다.
이후 샘플은 0.1% 글루타르알데히드로 처리한 후 37°C의 열풍 오븐에서 건조하여 수분을 제거했습니다. 건조된 샘플은 코팅하여 분석했습니다.32 분석 중 얻은 다른 이미지로는 개별 면 섬유 표면의 혈전 형성, Ct 사이의 중합체 침착, 적혈구 형태(모양), 혈전 완전성, NFRCS 존재 하의 적혈구 형태가 있습니다. 미처리 NFRCS 영역과 Ch 및 Cp 처리 NFRCS 영역을 혈액과 함께 배양하여 원소 이온(나트륨, 칼륨, 질소, 칼슘, 마그네슘, 아연, 구리 및 셀레늄)을 스캔했습니다.33 처리된 샘플과 미처리된 샘플 간의 원소 이온 비율을 비교하여 혈전 형성 및 혈전 균질성 동안의 원소 이온 축적을 파악했습니다.
Ct 표면의 Cp HFFC 표면 코팅 두께는 FESEM을 이용하여 측정하였다. Cp NFRCS의 단면을 골격으로부터 절단하여 스퍼터 코팅하였다. 얻어진 스퍼터 코팅 샘플을 FESEM으로 관찰하고 표면 코팅 두께를 측정하였다[34, 35, 36].
X선 마이크로 CT는 고해상도 3D 비파괴 영상을 제공하며 NFRK의 내부 구조 배열을 연구할 수 있도록 합니다. 마이크로 CT는 샘플을 통과하는 X선 빔을 사용하여 샘플 내 X선의 국소 선형 감쇠 계수를 기록하여 형태학적 정보를 얻는 데 도움이 됩니다. NFRCS 존재 하에서 흡수 효율과 혈액 응고를 이해하기 위해 Cp NFRCS와 혈액 처리된 Cp NFRCS에서 Ct의 내부 위치를 마이크로 CT로 검사했습니다37,38,39. 혈액 처리된 Cp NFRCS 샘플과 처리되지 않은 Cp NFRCS 샘플의 3D 구조는 마이크로 CT(V|tome|x S240, Phoenix, Germany)를 사용하여 재구성했습니다. VG STUDIO-MAX 소프트웨어 버전 2.2를 사용하여 다양한 각도(이상적으로는 360° 범위)에서 여러 X선 이미지를 촬영하여 NFRCS의 3D 이미지를 구현했습니다. 수집된 투영 데이터는 해당되는 간단한 3D ScanIP Academic 소프트웨어를 사용하여 3D 체적 이미지로 재구성되었습니다.
또한, 혈전 분포를 파악하기 위해, 미리 혼합된 구연산 혈액 20 µl와 0.2 M CaCl2 20 µl를 NFRCS에 첨가하여 혈액 응고를 유도했습니다. 준비된 샘플은 굳을 때까지 방치했습니다. NFRK 표면을 0.5% 글루타르알데히드로 처리하고 30~40°C의 열풍 오븐에서 30분 동안 건조했습니다. NFRCS에 형성된 혈전을 스캔하여 재구성하고, 혈전의 3D 이미지를 시각화했습니다.
영어: 항균 검정은 사소한 수정을 가한 이전에 설명된 방법을 사용하여 Cp NFRCS(Ch NFRCS와 가장 잘 비교됨)에서 수행되었습니다. Cp NFRCS와 Cp HFFC의 항균 활성은 배양기의 페트리 접시에서 한천에 자라는 세 가지 다른 시험 미생물[S.aureus(그람 양성균), E.coli(그람 음성균) 및 백색 칸디다(C.albicans)]을 사용하여 결정했습니다. 105-106 CFU ml-1 농도의 희석된 세균 배양 현탁액 50ml를 한천 배지에 균일하게 접종했습니다. 배지를 페트리 접시에 붓고 굳히십시오. 한천 플레이트 표면에 HFFC를 채울 웰을 만들었습니다(HFFC용 웰 3개, 음성 대조군용 웰 1개). 3개 웰에 HFFC 200µl를 넣고 4번째 웰에 pH 7.4 PBS 200µl를 넣습니다. 페트리 접시 반대편에 12mm Cp NFRCS 디스크를 고형화된 한천 위에 놓고 PBS(pH 7.4)로 적셔줍니다. 시프로플록사신, 암피실린, 플루코나졸 정제는 황색포도상구균, 대장균, 칸디다 알비칸스에 대한 표준균으로 간주됩니다. 억제대를 수동으로 측정하고 디지털 이미지를 촬영합니다.
기관 윤리 승인을 받은 후, 연구는 인도 남부 카르나타카 주 마니팔에 있는 카스투르바 의과대학 교육연구에서 수행되었습니다. 시험관 내 TEG 실험 프로토콜은 카르나타카 주 마니팔에 있는 카스투르바 의과대학 기관 윤리위원회(IEC: 674/2020)에서 검토 및 승인되었습니다. 피험자는 병원 혈액은행의 자원 헌혈자(연령 18~55세) 중에서 모집되었습니다. 또한, 혈액 샘플 수집을 위해 자원 봉사자로부터 동의서를 받았습니다. 네이티브 TEG(N-TEG)는 시트르산나트륨과 미리 혼합된 전혈에 대한 Cp HFFC 제형의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. N-TEG는 현장 소생술에서의 역할로 널리 알려져 있지만, 임상적으로 유의미한 결과 지연(일상적인 응고 검사) 가능성으로 인해 임상의에게 문제를 일으킵니다. N-TEG 분석은 전혈을 사용하여 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 동의서와 자세한 병력을 받았습니다. 이 연구에는 임신/산후 또는 간 질환과 같은 지혈 또는 혈전 합병증이 있는 참가자는 포함되지 않았습니다.응고 계단에 영향을 미치는 약물을 복용하는 대상도 연구에서 제외되었습니다.기본 실험실 검사(헤모글로빈, 프로트롬빈 시간, 활성화된 트롬보플라스틴 및 혈소판 수)는 표준 절차에 따라 모든 참가자에게 시행되었습니다.N-TEG는 혈전 점탄성, 초기 혈전 구조, 입자 상호 작용, 혈전 강화 및 혈전 용해를 결정합니다.N-TEG 분석은 여러 세포 요소와 혈장의 집합적 효과에 대한 그래픽 및 수치 데이터를 제공합니다.N-TEG 분석은 두 가지 다른 용량의 Cp HFFC(10µl 및 50µl)에서 시행되었습니다.결과적으로, 구연산이 함유된 전혈 1ml를 Cp HFFC 10µl에 첨가했습니다.1ml(Cp HFFC + 구연산 처리된 혈액), 혼합된 혈액 340µl를 0.2M CaCl2가 들어 있는 TEG 접시 20µl에 첨가합니다. 그 후, TEG 접시를 TEG® 5000, US에 넣어 Cp HFFC41이 존재하는 상태에서 혈액 샘플의 R, K, 알파 각도, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30%를 측정했습니다.
생체 내 연구 프로토콜은 마니팔 고등 교육 연구소, 카스투르바 의과대학, 마니팔 기관 동물 윤리 위원회(IAEC)에서 검토 및 승인되었습니다(IAEC/KMC/69/2020). 모든 동물 실험은 동물 실험 관리 및 감독 위원회(CPCSEA)의 권고에 따라 수행되었습니다. 모든 생체 내 NFRCS 연구(2 × 2cm2)는 암컷 위스타 쥐(무게 200~250g)에서 수행되었습니다. 모든 동물은 24~26°C의 온도에서 적응시켰고, 동물은 표준 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었습니다. 모든 동물은 무작위로 다른 그룹으로 나뉘었고, 각 그룹은 세 마리의 동물로 구성되었습니다. 모든 연구는 동물 연구: 생체 내 실험 보고서 43에 따라 수행되었습니다. 연구 전, 동물들은 체중 1kg당 케타민 20~50mg과 자일라진 2~10mg을 혼합하여 복강내(ip) 투여하여 마취되었습니다. 연구 종료 후, 출혈량은 검체의 초기 무게와 최종 무게의 차이를 평가하여 계산하였고, 세 번의 검사를 통해 얻은 평균값을 검체의 출혈량으로 사용했습니다.
외상, 전투, 교통사고(손상 모델)에서 NFRCS가 출혈을 조절하는 잠재력을 이해하기 위해 쥐 꼬리 절단 모델을 구현했습니다. 메스로 꼬리의 50%를 절단하고 15초 동안 공기 중에 두어 정상적인 출혈을 유도했습니다. 또한, 쥐 꼬리에 압력을 가하여(Ct, Cs, Ch NFRCS, Cp NFRCS) 시험편을 부착했습니다. 시험편(n = 3)에 대한 출혈과 PCT를 보고했습니다.17,45.
전투 중 NFRCS 압력 조절의 효과를 표재성 대퇴동맥 모델을 이용하여 조사하였다. 대퇴동맥을 노출시키고 24G 트로카로 천자하여 15초 이내에 출혈을 유도하였다. 출혈이 조절되지 않는 경우, 천자 부위에 시험편을 위치시키고 압력을 가하였다. 시험편을 부착한 직후, 응고 시간을 기록하고 5분 동안 지혈 효율을 관찰하였다. Cs와 Ct46을 사용하여 동일한 절차를 반복하였다.
Dowling 등(47)은 수술 중 출혈 상황에서 지혈제의 지혈 가능성을 평가하기 위해 간 손상 모델을 제안했습니다. Ct 샘플(음성 대조군), Cs 프레임워크(양성 대조군), Ch NFRCS 샘플, Cp NFRCS 샘플에 대한 BCT를 기록했습니다. 정중 개복술을 시행하여 쥐의 간상대정맥을 노출시켰습니다. 그 후, 가위로 좌엽의 원위부를 잘라냈습니다. 메스로 간에 절개를 하고 몇 초 동안 출혈을 방치했습니다. 정확하게 무게를 측정한 Ch NFRCS 및 Cp NFRCS 검사 샘플을 양압 없이 손상된 표면에 놓고 BCT를 기록했습니다. 그런 다음 대조군(Ct)은 손상을 파괴하지 않고 Cs 30 s47을 가한 후 압력을 가했습니다.
개발된 폴리머 기반 NFRCS의 상처 치유 특성을 평가하기 위해 절제 상처 모델을 사용하여 생체 내 상처 치유 분석을 수행했습니다. 절제 상처 모델은 이전에 발표된 방법(19, 32, 48)을 약간 수정하여 선택하여 수행했습니다. 모든 동물은 이전에 설명된 대로 마취했습니다. 생검 펀치(12mm)를 사용하여 등 피부에 원형의 깊은 절개를 했습니다. 준비된 상처 부위는 Cs(양성 대조군), Ct(면 패드가 치유를 방해함을 인지), Ch NFRCS 및 Cp NFRCS(실험군) 및 아무런 처치도 하지 않은 음성 대조군으로 드레싱했습니다. 연구 기간 동안 매일 모든 쥐의 상처 면적을 측정했습니다. 디지털 카메라를 사용하여 상처 부위를 촬영하고 새 드레싱을 부착했습니다. 상처 봉합률은 다음 공식을 사용하여 측정했습니다.
연구 12일차 상처 봉합률을 기준으로 가장 좋은 군의 쥐 피부를 절제하여((Cp NFRCS) 및 대조군) H&E 염색과 메이슨 트리크롬 염색을 실시하여 연구하였다. 연구 12일차 상처 봉합률을 기준으로 가장 좋은 군의 쥐 피부를 절제하여((Cp NFRCS) 및 대조군) H&E 염색과 메이슨 트리크롬 염색을 실시하여 연구하였다.연구 12일차 상처 봉합률을 기준으로, 가장 좋은 그룹((Cp NFRCS)과 대조군) 쥐의 피부를 절제하여 헤마톡실린-에오신과 메이슨 트리크롬 염색을 통해 검사했습니다.根据研究第12는 切除最佳组((Cp NFRCS)와 对光组)의 大鼠皮肤, 进行H&E染color와 Masson三color染color研究입니다.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)and对光组)的大鼠皮肤，进行H&E染color眳组)최상의 그룹((Cp NFRCS) 및 대조군)의 쥐는 연구 12일차에 상처 폐쇄율에 따라 헤마톡실린-에오신 염색과 메이슨 트리크롬 염색을 위해 절제했습니다.구현된 염색 과정은 이전에 기술된 방법49,50에 따라 수행되었다. 간략하게 설명하면, 10% 포르말린에 고정한 후, 여러 단계의 알코올을 사용하여 샘플을 탈수시켰다. 마이크로톰을 사용하여 절제된 조직의 박편(5 µm 두께)을 얻었다. 대조군과 Cp NFRCS의 박편을 연속적으로 채취하여 헤마톡실린과 에오신으로 처리하여 조직병리학적 변화를 연구했다. 마슨 트리크롬 염색을 사용하여 콜라겐 섬유 형성을 검출했다. 얻어진 결과는 병리학자들이 맹검으로 분석했다.
Cp NFRCS 시료의 안정성은 실온(25°C ± 2°C/60% RH ± 5%)에서 12개월 동안 연구되었습니다.51 Cp NFRCS(표면 변색 및 미생물 증식)는 재료 및 방법 섹션에 명시된 방법에 따라 육안 검사 및 내마모성 및 BCT 시험을 거쳤습니다.
Cp NFRCS의 확장성과 재현성을 15×15 cm² 크기의 Cp NFRCS를 제조하여 조사했습니다. 또한, 다양한 Cp NFRCS 분획에서 30 mg 시료(n = 5)를 채취하여 연구 시료의 BCT를 앞서 방법 섹션에서 설명한 바와 같이 평가했습니다.
저희는 다양한 생의학적 응용 분야를 위해 Cp NFRCS 조성물을 이용하여 다양한 모양과 구조를 개발하고자 시도했습니다. 이러한 모양이나 구성에는 코피, 치과 시술용 원뿔형 면봉, 질 출혈용 원통형 면봉 등이 포함됩니다.
모든 데이터 세트는 평균 ± 표준 편차로 표현되었으며 Prism 5.03(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여 ANOVA로 분석한 후 Bonferroni의 다중 비교 검정(*p<0.05)을 실시했습니다.
인간 연구에서 수행된 모든 절차는 연구소 및 국가연구위원회의 기준, 그리고 1964년 헬싱키 선언 및 그 후속 개정안, 또는 이와 유사한 윤리 기준을 준수했습니다. 모든 참가자에게는 연구의 특징과 자발적 참여에 대한 설명이 제공되었습니다. 참가자 데이터는 수집 후 기밀로 유지됩니다. 체외 TEG 실험 프로토콜은 카르나타카 마니팔에 있는 카스투르바 의과대학 기관윤리위원회(IEC: 674/2020)의 검토 및 승인을 받았습니다. 자원봉사자들은 혈액 샘플 채취에 대한 사전 동의서에 서명했습니다.
동물 연구에서 수행된 모든 절차는 마니팔 고등교육기관, 카스투바 의과대학(IAEC/KMC/69/2020)의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 동물실험관리위원회(CPCSEA)의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 저자는 ARRIVE 지침을 준수합니다.
모든 NFRCS의 FTIR 스펙트럼을 분석하여 그림 2A에 나타난 키토산 스펙트럼과 비교했습니다. 키토산의 특징적인 스펙트럼 피크(기록됨)는 3437cm-1(OH 및 NH 신축, 중첩), 2945 및 2897cm-1(CH 신축), 1660cm-1(NH2 변형), 1589cm-1(N–H 굽힘), 1157cm-1(브릿지 신축 O-), 1067cm-1(신축 C–O, 2차 수산기), 993cm-1(신축 CO, Bo-OH)에서 52.53.54입니다. 보충 표 S1은 키토산(리포터), 순수 키토산, Cm, Ch 및 Cp의 FTIR NFRCS 흡수 스펙트럼 값을 보여줍니다. 모든 NFRCS(Cm, Ch 및 Cp)의 FTIR 스펙트럼은 유의미한 변화 없이 순수 키토산과 동일한 특징적인 흡수 밴드를 나타냈습니다(그림 2A). FTIR 결과는 NFRCS 개발에 사용된 고분자 간에 화학적 또는 물리적 상호작용이 없음을 확인시켜 주었으며, 이는 사용된 고분자가 비활성임을 시사합니다.
Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS 및 Cs의 시험관 내 특성 분석. (A)는 압축 하에서 키토산과 Cm NFRCS, Ch NFRCS 및 Cp NFRCS의 조성을 합친 FTIR 스펙트럼을 나타낸다. (B) a) NFRCS Cm, Ch, Cp 및 Cg(n = 3)의 전혈 흡수율; Ct 샘플은 면봉의 흡수 효율이 더 높기 때문에 더 높은 BAR을 보였다. b) 혈액 흡수 후 혈액 흡수된 샘플의 그림. 시험 샘플 C의 BCT를 그래픽으로 표현한 것(Cp NFRCS의 BCT가 가장 좋았다(15초, n = 3)). C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± SD로 표시되었으며 오차 막대는 SD를 나타냅니다. ***p < 0.0001. C, D, E 및 G의 데이터는 평균 ± SD로 표시되었으며 오차 막대는 SD를 나타냅니다. ***p < 0.0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляѕт стандартное отклонение, ***p <0,0001. C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. ***p<0.0001. C、D、E 와 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 와 G 中的数据显示为平均值±SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C, D, E 및 G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представлякт стандартное отклонение, ***p <0,0001. C, D, E, G의 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시되었으며, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. ***p<0.0001.