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L'emorragia incontrollata è una delle principali cause di morte. Ottenere un'emostasi rapida garantisce la sopravvivenza del soggetto come primo soccorso durante combattimenti, incidenti stradali e operazioni di riduzione della mortalità. Un'impalcatura composita rinforzata con fibre nanoporose (NFRCS), derivata da una semplice composizione emostatica filmogena (HFFC), utilizzata come fase continua, può innescare e migliorare l'emostasi. Lo sviluppo dell'NFRCS si basa sulla conformazione dell'ala della libellula. La struttura alare della libellula è costituita da ali trasversali e longitudinali, e le membrane alari sono collegate tra loro per mantenere l'integrità della microstruttura. L'HFFC riveste uniformemente la superficie della fibra con un film di spessore nanometrico e collega lo spessore del cotone (Ct) distribuito casualmente (fase dispersa) per formare una struttura nanoporosa. La combinazione di fasi continue e disperse riduce il costo del prodotto di dieci volte rispetto ai prodotti disponibili in commercio. Gli NFRCS modificati (tamponi o braccialetti) possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni biomediche. Studi in vivo hanno concluso che il Cp NFRCS sviluppato innesca e migliora il processo di coagulazione nel sito di applicazione. Il NFRCS può modulare il microambiente e agire a livello cellulare grazie alla sua struttura nanoporosa, con conseguente miglioramento della guarigione delle ferite nel modello di escissione.
Un'emorragia incontrollata durante il combattimento, le situazioni intraoperatorie e di emergenza può rappresentare una seria minaccia per la vita dei feriti1. Queste condizioni portano inoltre a un aumento complessivo delle resistenze vascolari periferiche, con conseguente shock emorragico. Misure appropriate per controllare l'emorragia durante e dopo l'intervento chirurgico sono considerate potenzialmente letali2,3. I danni ai grandi vasi portano a una massiccia perdita di sangue, con un tasso di mortalità ≤ 50% in combattimento e del 31% durante l'intervento chirurgico1. Una massiccia perdita di sangue porta a una diminuzione del volume corporeo, che riduce la gittata cardiaca. Un aumento delle resistenze vascolari periferiche totali e una progressiva compromissione della microcircolazione portano a ipossia negli organi di supporto vitale. Lo shock emorragico può verificarsi se la condizione persiste senza un intervento efficace1,4,5. Altre complicanze includono la progressione dell'ipotermia e dell'acidosi metabolica, nonché un disturbo della coagulazione che impedisce il processo di coagulazione. Lo shock emorragico grave è associato a un rischio maggiore di morte6,7,8. Nello shock di grado III (progressivo), la trasfusione di sangue è essenziale per la sopravvivenza del paziente durante la morbilità e mortalità intraoperatoria e postoperatoria. Per superare tutte le situazioni potenzialmente letali sopra descritte, abbiamo sviluppato un'impalcatura composita nanoporosa rinforzata con fibre (NFRCS) che utilizza una concentrazione minima di polimeri (0,5%) utilizzando una combinazione di polimeri emostatici idrosolubili.
L'uso del rinforzo in fibra consente di sviluppare prodotti economicamente vantaggiosi. Le fibre disposte in modo casuale ricordano la struttura dell'ala di una libellula, bilanciata dalle strisce orizzontali e verticali presenti sulle ali. Le vene trasversali e longitudinali dell'ala comunicano con la membrana alare (Fig. 1). Il NFRCS è costituito da filo di cotone rinforzato come sistema di supporto con una migliore resistenza fisica e meccanica (Figura 1). Grazie al prezzo accessibile e alla lavorazione artigianale, i chirurghi preferiscono utilizzare fili di cotone (Ct) durante gli interventi chirurgici e le medicazioni. Pertanto, considerando i suoi molteplici benefici, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (che contribuisce al potenziamento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. Pertanto, considerando i suoi molteplici benefici, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (che contribuisce al potenziamento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. L'uso di una grande quantità di fibre cristalline è superiore al 90% (Uчаствует в повышении attività gestazionale), Ct utilizzato nei sistemi scheletrici naturali NFRCS9,10. Pertanto, dati i suoi numerosi benefici, tra cui >90% di cellulosa cristallina (coinvolta nell'aumento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico NFRCS9,10.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性）, Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Pertanto, dati i suoi numerosi benefici, tra cui oltre il 90% di cellulosa cristallina (che aiuta a migliorare l'attività emostatica), il Ct è stato utilizzato come impalcatura per NFRCS9,10.Il Ct è stato rivestito superficialmente (è stata osservata la formazione di un film nano-spesso) e interconnesso con una composizione filmogena emostatica (HFFC). L'HFFC agisce come un matrigel, mantenendo insieme i Ct disposti in modo casuale. Il design sviluppato trasmette lo stress all'interno della fase dispersa (fibre di rinforzo). È difficile ottenere strutture nanoporose con buona resistenza meccanica utilizzando concentrazioni minime di polimero. Inoltre, non è facile personalizzare stampi diversi per diverse applicazioni biomediche.
La figura mostra uno schema del progetto NFRCS basato sulla struttura alare di una libellula (A). Questa immagine mostra un'analogia comparativa della struttura alare di una libellula (le vene intersecanti e longitudinali dell'ala sono interconnesse) e una microfotografia in sezione trasversale di Cp NFRCS (B). Rappresentazione schematica di NFRCS.
Gli NFRC sono stati sviluppati utilizzando l'HFFC come fase continua per superare le limitazioni di cui sopra. L'HFFC è composto da vari polimeri emostatici filmogeni, tra cui chitosano (come principale polimero emostatico) con metilcellulosa (MC), idrossipropilmetilcellulosa (HPMC 50 cp) e alcol polivinilico (PVA) (125 kDa) come polimero di supporto che promuove la formazione di trombi. L'aggiunta di polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) ha migliorato la capacità di assorbimento dell'umidità degli NFRC. È stato aggiunto polietilenglicole 400 (PEG 400) per migliorare la reticolazione del polimero nelle miscele polimeriche legate. Tre diverse composizioni emostatiche di HFFC (HFFC al Cm, HFFC al Ch e HFFC al Cp), ovvero chitosano con MC (Cm), chitosano con HPMC (Ch) e chitosano con PVA (Cp), sono state applicate a Ct. Diversi studi di caratterizzazione in vitro e in vivo hanno confermato l'attività emostatica e di guarigione delle ferite del NFRCS. I materiali compositi offerti dal NFRCS possono essere utilizzati per personalizzare diverse forme di scaffold per soddisfare esigenze specifiche.
Inoltre, l'NFRCS può essere modificato come una benda o un rotolo per coprire l'intera area della lesione degli arti inferiori e di altre parti del corpo. Specificamente per le lesioni agli arti in combattimento, il design dell'NFRCS progettato può essere modificato per coprire mezzo braccio o una gamba intera (Figura integrativa S11). L'NFRCS può essere trasformato in un braccialetto con colla per tessuti, che può essere utilizzato per arrestare il sanguinamento da gravi lesioni al polso con intento suicida. Il nostro obiettivo principale è sviluppare un NFRCS con la minor quantità possibile di polimeri, che possa essere distribuito a una vasta popolazione (al di sotto della soglia di povertà) e che possa essere inserito in un kit di pronto soccorso. Semplice, efficiente ed economico nel design, l'NFRCS apporta benefici alle comunità locali e può avere un impatto globale.
Chitosano (peso molecolare 80 kDa) e amaranto sono stati acquistati da Merck, India. Idrossipropilmetilcellulosa 50 Cp, polietilenglicole 400 e metilcellulosa sono stati acquistati da Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Alcol polivinilico (peso molecolare 125 kDa) (idrolizzato all'87-90%) è stato acquistato da National Chemicals, Gujarat. Polivinilpirrolidina K30 è stata acquistata da Molychem, Mumbai; tamponi sterili sono stati acquistati da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, utilizzando acqua Milli Q (sistema di purificazione dell'acqua Direct-Q3, Merck, India) come vettore.
L'NFRCS è stato sviluppato utilizzando un metodo di liofilizzazione11,12. Tutte le composizioni di HFFC (Tabella 1) sono state preparate utilizzando un agitatore meccanico. Preparare una soluzione di chitosano allo 0,5% utilizzando acido acetico all'1% in acqua, agitando continuamente a 800 giri al minuto su un agitatore meccanico. Il peso esatto del polimero caricato indicato nella Tabella 1 è stato aggiunto alla soluzione di chitosano e agitato fino a ottenere una soluzione polimerica limpida. PVP K30 e PEG 400 sono stati aggiunti alla miscela risultante nelle quantità indicate nella Tabella 1 e l'agitazione è stata continuata fino a ottenere una soluzione polimerica limpida e viscosa. Il bagno risultante di soluzione polimerica è stato sonicato per 60 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate dalla miscela polimerica. Come mostrato nella Figura Supplementare S1(b), Ct è stato distribuito uniformemente in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (stampo) addizionata con 5 ml di HFFC.
La piastra a sei pozzetti è stata sonicata per 60 minuti per ottenere una bagnatura e una distribuzione uniformi dell'HFFC nella rete Ct. Successivamente, la piastra a sei pozzetti è stata congelata a -20 °C per 8-12 ore. Le piastre congelate sono state liofilizzate per 48 ore per ottenere diverse formulazioni di NFRCS. La stessa procedura viene utilizzata per produrre diverse forme e strutture, come tamponi o tamponi cilindrici, o qualsiasi altra forma per diverse applicazioni.
Chitosano (80 kDa) (3%) pesato con precisione viene sciolto in acido acetico all'1% utilizzando un agitatore magnetico. Alla soluzione di chitosano risultante è stato aggiunto l'1% di PEG 400 e agitato per 30 minuti. Versare la soluzione risultante in un contenitore quadrato o rettangolare e congelare a -80 °C per 12 ore. I campioni congelati sono stati liofilizzati per 48 ore per ottenere Cs13 poroso.
Il NFRCS sviluppato è stato sottoposto a esperimenti utilizzando la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Giappone) per confermare la compatibilità chimica del chitosano con altri polimeri14,15. Gli spettri FTIR (ampiezza dell'intervallo spettrale da 400 a 4000 cm-1) di tutti i campioni testati sono stati ottenuti eseguendo 32 scansioni.
Il tasso di assorbimento del sangue (BAR) per tutte le formulazioni è stato valutato utilizzando il metodo descritto da Chen et al. 16 con lievi modifiche. Gli NFRK sviluppati di tutte le composizioni sono stati essiccati in un forno sotto vuoto a 105 °C per una notte per rimuovere il solvente residuo. 30 mg di NFRCS (peso iniziale del campione - W0) e 30 mg di Ct (controllo positivo) sono stati posti in piastre separate contenenti una premiscela di citrato di sodio al 3,8%. A intervalli di tempo predeterminati, ovvero 5, 10, 20, 30, 40 e 60 secondi, gli NFRCS sono stati rimossi e le loro superfici pulite dal sangue non assorbito posizionando i campioni su Ct per 30 secondi. Il peso finale del sangue assorbito da NFRCS 16 è stato considerato (W1) a ciascun punto temporale. Calcolare la percentuale di BAR utilizzando la seguente formula:
Il tempo di coagulazione del sangue (BCT) è stato determinato come riportato da Wang et al. 17 . Il tempo necessario affinché il sangue intero (sangue di ratto premiscelato con citrato di sodio al 3,8%) coagulasse in presenza di NFRCS è stato calcolato come BCT del campione di prova. I vari componenti di NFRCS (30 mg) sono stati collocati in fiale con tappo a vite da 10 ml e incubati a 37 °C. È stato aggiunto sangue (0,5 ml) alla fiala e sono stati aggiunti 0,3 ml di CaCl2 0,2 ​​M per attivare la coagulazione del sangue. Infine, capovolgere la fiala ogni 15 secondi (fino a 180°) fino alla formazione di un coagulo solido. Il BCT del campione è stimato dal numero di capovolgimenti delle fiale17,18. Sulla base del BCT, sono state selezionate due composizioni ottimali di NFRCS Cm, Ch e Cp per ulteriori studi di caratterizzazione.
Il BCT delle composizioni di Ch NFRCS e Cp NFRCS è stato determinato implementando il metodo descritto da Li et al. 19 . Porre 15 x 15 mm2 di Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controllo positivo) in piastre Petri separate (37 °C). Il sangue contenente il 3,8% di citrato di sodio è stato miscelato con CaCl2 0,2 ​​M in un rapporto di volume 10:1 per avviare il processo di coagulazione del sangue. 20 µl di miscela di sangue di ratto CaCl2 0,2 ​​M sono stati applicati sulla superficie del campione e posizionati in una piastra Petri vuota. Il controllo era sangue versato in piastre Petri vuote senza Ct. A intervalli fissi di 0, 3 e 5 minuti, interrompere la coagulazione aggiungendo 10 ml di acqua deionizzata (DI) al campione contenente la piastra senza disturbare il coagulo. Gli eritrociti non coagulati (eritrociti) subiscono emolisi in presenza di acqua deionizzata e rilasciano emoglobina. L'emoglobina a diversi punti temporali (HA(t)) è stata misurata a 540 nm (λmax emoglobina) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. L'assorbimento assoluto di emoglobina (AH(0)) in 0 min di 20 µl di sangue in 10 ml di acqua deionizzata è stato utilizzato come standard di riferimento. L'assorbimento relativo di emoglobina (RHA) del sangue coagulato è stato calcolato dal rapporto HA(t)/HA(0) utilizzando lo stesso lotto di sangue.
Utilizzando un analizzatore di texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sono state determinate le proprietà adesive dell'NFRK al tessuto danneggiato. Premere una capsula cilindrica a fondo aperto contro la parte interna della pelle di maiale (senza lo strato di grasso). I campioni (Ch NFRCS e Cp NFRCS) sono stati applicati tramite cannula in stampi cilindrici per creare adesione alla pelle del maiale. Dopo un'incubazione di 3 minuti a temperatura ambiente (TA) (25 °C), la forza adesiva dell'NFRK è stata registrata a una velocità costante di 0,5 mm/sec.
La caratteristica principale dei sigillanti chirurgici è quella di aumentare la coagulazione del sangue riducendo al contempo la perdita di sangue. La coagulazione senza perdite nella NFRCS è stata valutata utilizzando un metodo precedentemente pubblicato con lievi modifiche 19 . Preparare una provetta da microcentrifuga (2 ml) (diametro interno 10 mm) con un foro di 8 × 5 mm2 su un lato della provetta da centrifuga (che rappresenta una ferita aperta). La NFRCS viene utilizzata per chiudere l'apertura e il nastro adesivo viene utilizzato per sigillare i bordi esterni. Aggiungere 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M alla provetta da microcentrifuga contenente la premiscela di citrato di sodio al 3,8%. Dopo 10 minuti, le provette da microcentrifuga sono state rimosse dalle piastre e l'aumento della massa delle piastre è stato determinato dovuto al deflusso di sangue dalla NFRK (n = 3). La perdita di sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS sono state confrontate con Cs.
L'integrità a umido del NFRCS è stata determinata seguendo il metodo descritto da Mishra e Chaudhary21 con piccole modifiche. Versare il NFRCS in una beuta da 100 ml con 50 ml di acqua e agitare per 60 secondi senza formare il tappo. Ispezione visiva e prioritizzazione dei campioni per l'integrità fisica in base al metodo di raccolta.
La forza di legame dell'HFFC al Ct è stata studiata utilizzando metodi precedentemente pubblicati con piccole modifiche. L'integrità del rivestimento superficiale è stata valutata esponendo l'NFRK a onde acustiche (stimolo esterno) in presenza di acqua milliQ (Ct). Gli NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS sviluppati sono stati posti in un becher riempito d'acqua e sonicati rispettivamente per 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 minuti. Dopo l'essiccazione, la differenza percentuale tra il peso iniziale e quello finale dell'NFRCS è stata utilizzata per calcolare la percentuale di perdita di materiale (HFFC). La BCT in vitro ha ulteriormente confermato la forza di legame o la perdita di materiali superficiali. L'efficienza del legame dell'HFFC al Ct fornisce coagulazione del sangue e un rivestimento elastico sulla superficie di Ct22.
L'omogeneità del NFRCS sviluppato è stata determinata mediante il BCT di campioni (30 mg) prelevati da punti generici del NFRCS selezionati casualmente. Seguire la procedura BCT precedentemente descritta per determinare la conformità al NFRCS. La prossimità tra tutti e cinque i campioni garantisce una copertura superficiale uniforme e una deposizione di HFFC nella mesh Ct.
L'area di contatto nominale con il sangue (NBCA) è stata determinata come precedentemente riportato con alcune modifiche. Coagulare il sangue clampando 20 µl di sangue tra le due superfici di Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. Dopo 1 ora, le due parti dello stent sono state separate e l'area del coagulo è stata misurata manualmente. Il valore medio di tre ripetizioni è stato considerato NBCA NFRCS19.
L'analisi di assorbimento dinamico del vapore (DVS) è stata utilizzata per valutare l'efficacia del NFRCS nell'assorbire acqua dall'ambiente esterno o dal sito della lesione responsabile dell'avvio della coagulazione. Il DVS valuta o registra l'assorbimento e la perdita di vapore in un campione gravimetricamente utilizzando una bilancia ultrasensibile con una risoluzione di massa di ±0,1 µg. Un regolatore elettronico di flusso di massa genera una pressione parziale di vapore (umidità relativa) attorno al campione miscelando gas di trasporto saturi e secchi. Secondo le linee guida della Farmacopea Europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, questi sono stati suddivisi in 4 categorie (0–0,012% p/p - non igroscopico, 0,2–2% p/p leggermente igroscopico, 2–15% moderatamente igroscopico e > 15% molto igroscopico)23. Secondo le linee guida della Farmacopea Europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, questi sono stati suddivisi in 4 categorie (0–0,012% p/p - non igroscopico, 0,2–2% p/p leggermente igroscopico, 2–15% moderatamente igroscopico e > 15% molto igroscopico)23.In conformità con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, a seconda della percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, i campioni sono stati suddivisi in 4 categorie (0–0,012% p/p – non igroscopico, 0,2–2% p/p leggermente igroscopico, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен e > 15% очень гигроскопичен)23. % moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23.根据欧洲药典指南, 根据样品吸收水分的百分比, 样品分为4 （0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿,> 15% 非常吸湿）23.（（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿,> 15 %非常吸湿）23.In conformità con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, i campioni vengono suddivisi in 4 classi a seconda della percentuale di umidità assorbita dal campione (0-0,012% in peso – non igroscopico, 0,2-2% in peso leggermente igroscopico, 2-15% in peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderatamente igroscopico, > 15% molto igroscopico) 23.L'efficienza igroscopica di NFCS X NFCS e TsN NFCS è stata determinata su un analizzatore DVS TA TGA Q5000 SA. Durante questo processo, sono stati ottenuti il ​​tempo di analisi, l'umidità relativa (UR) e il peso del campione in tempo reale a 25 °C24. Il contenuto di umidità è calcolato mediante un'accurata analisi di massa NFRCS utilizzando la seguente equazione:
MC è l'umidità del NFRCS. m1 – peso secco dei FANS. m2 è la massa del NFRCS in tempo reale a una data umidità relativa.
L'area superficiale totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 °C per 10 h (< 7 × 10–3 Torr). L'area superficiale totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 °C per 10 h (< 7 × 10–3 Torr). L'esperienza di miglioramento è stata definita con un esperimento effettuato per l'aggiunta di un esperimento successivo funzionamento a una temperatura di 25 °C течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). L'area superficiale totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni erano stati svuotati a 25°C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后,使用液氮的氮吸附实验估计总表面积.在 25°C L'esperienza di miglioramento è stata sviluppata con l'utilizzo di esperimenti di adsorbimento in un ambiente umido dopo l'osservazione in una temperatura di 10 ore a 25°C (< 7 × 10-3 ore). L'area superficiale totale è stata stimata utilizzando esperimenti di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni erano stati svuotati per 10 ore a 25°C (< 7 x 10-3 torr).L'area superficiale totale, il volume dei pori e la dimensione dei pori NFRCS sono stati determinati con un Quantachrome della NOVA 1000e, Austria, utilizzando il software RS 232.
Preparare il 5% di globuli rossi (soluzione salina come diluente) da sangue intero. Quindi trasferire un'aliquota di HFFC (0,25 ml) in una piastra a 96 pozzetti e il 5% della massa di globuli rossi (0,1 ml). Incubare la miscela a 37 °C per 40 minuti. Una miscela di globuli rossi e siero è stata considerata come controllo positivo e una miscela di soluzione salina e globuli rossi come controllo negativo. L'emoagglutinazione è stata determinata secondo la scala Stajitzky. Le scale proposte sono le seguenti: + + + + aggregati granulari densi; + + + cuscinetti a fondo liscio con bordi curvi; + + cuscinetti a fondo liscio con bordi strappati; + stretti anelli rossi attorno ai bordi dei cuscinetti a fondo liscio; – (negativo) bottone rosso discreto 12 al centro del pozzetto inferiore.
L'emocompatibilità del NFRCS è stata studiata secondo il metodo dell'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Il metodo gravimetrico descritto da Singh et al. Sono state apportate piccole modifiche per valutare la formazione di trombi in presenza o sulla superficie del NFRCS. 500 mg di Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati incubati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 24 ore a 37 °C. Dopo 24 ore, il PBS è stato rimosso e il NFRCS è stato trattato con 2 ml di sangue contenente citrato di sodio al 3,8%. Sulla superficie del NFRCS, aggiungere 0,04 ml di CaCl₂ 0,1 M ai campioni incubati. Dopo 45 minuti, sono stati aggiunti 5 ml di acqua distillata per bloccare la coagulazione. Il sangue coagulato sulla superficie del NFRCS è stato trattato con una soluzione di formaldeide al 36-38%. I coaguli fissati con formaldeide sono stati essiccati e pesati. La percentuale di trombosi è stata stimata calcolando il peso del bicchiere senza sangue e campione (controllo negativo) e del bicchiere con sangue (controllo positivo).
Come conferma iniziale, i campioni sono stati visualizzati al microscopio ottico per comprendere la capacità del rivestimento superficiale dell'HFFC, dell'interconnessione di Ct e della rete di Ct di formare pori. Sezioni sottili di Ch e Cp da NFRCS sono state ritagliate con una lama di bisturi. La sezione risultante è stata posizionata su un vetrino, coperta con un coprioggetto e i bordi sono stati fissati con colla. I vetrini preparati sono stati osservati al microscopio ottico e sono state scattate fotografie a diversi ingrandimenti.
La deposizione di polimeri nelle reti Ct è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza basata sul metodo descritto da Rice et al.29. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e gli NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo menzionato in precedenza. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e gli NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo menzionato in precedenza.La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e si è ottenuto NFRCS (Ch e Cp) secondo il metodo precedentemente menzionato.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp）).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp）).La composizione HFFC utilizzata nella formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e ha ricevuto NFRCS (Ch e Cp), come menzionato in precedenza.Sezioni sottili di NFRK sono state ricavate dai campioni ottenuti, posizionate su vetrini e coperte con coprioggetto. Osservare i vetrini preparati al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro verde (310-380 nm). Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 4x per comprendere le relazioni Ct e l'eccesso di deposizione polimerica nella rete Ct.
La topografia superficiale di NFRCS Ch e Cp è stata determinata utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) con un cantilever TESP ultra-affilato in modalità tapping: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. La rugosità superficiale è stata determinata tramite il valore quadratico medio (RMS) utilizzando un software (Scanning Probe Image Processor). Diverse posizioni NFRCS sono state renderizzate su immagini 3D per verificarne l'uniformità superficiale. La deviazione standard del punteggio per una data area è definita come rugosità superficiale. L'equazione RMS è stata utilizzata per quantificare la rugosità superficiale di NFRCS31.
Studi basati su FESEM sono stati condotti utilizzando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, per comprendere la morfologia superficiale di Ch NFRCS e Cp NFRCS, che hanno mostrato una BCT migliore rispetto a Cm NFRCS. Lo studio FESEM è stato condotto secondo il metodo descritto da Zhao et al. 32 con piccole modifiche. NFRCS da 20 a 30 mg di Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati premiscelati con 20 µl di citrato di sodio al 3,8% premiscelato con sangue di ratto. 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M sono stati aggiunti ai campioni di sangue trattati per avviare la coagulazione e i campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Inoltre, gli eritrociti in eccesso sono stati rimossi dalla superficie del NFRCS mediante lavaggio con soluzione salina.
I campioni successivi sono stati trattati con glutaraldeide allo 0,1% e quindi essiccati in un forno ad aria calda a 37 °C per rimuovere l'umidità. I ​​campioni essiccati sono stati rivestiti e analizzati 32 . Altre immagini ottenute durante l'analisi sono state la formazione di coaguli sulla superficie delle singole fibre di cotone, la deposizione di polimeri tra Ct, la morfologia degli eritrociti (forma), l'integrità del coagulo e la morfologia degli eritrociti in presenza di NFRCS. Le aree NFRCS non trattate e le aree NFRCS trattate con Ch e Cp incubate con sangue sono state scansionate per ioni elementari (sodio, potassio, azoto, calcio, magnesio, zinco, rame e selenio) 33 . Confrontare le percentuali di ioni elementari tra campioni trattati e non trattati per comprendere l'accumulo di ioni elementari durante la formazione del coagulo e l'omogeneità del coagulo.
Lo spessore del rivestimento superficiale di Cp HFFC sulla superficie di Ct è stato determinato mediante FESEM. Le sezioni trasversali di Cp NFRCS sono state ricavate dalla struttura e sottoposte a rivestimento mediante sputtering. I campioni di rivestimento mediante sputtering risultanti sono stati osservati mediante FESEM e ne è stato misurato lo spessore superficiale 34, 35, 36.
La micro-TC a raggi X fornisce immagini 3D non distruttive ad alta risoluzione e consente di studiare la disposizione strutturale interna del tessuto non tessuto fibroso (NFRK). La micro-TC utilizza un fascio di raggi X che attraversa il campione per registrare il coefficiente di attenuazione lineare locale dei raggi X nel campione, il che aiuta a ottenere informazioni morfologiche. La posizione interna di Ct nel NFRCS di Cp e nel NFRCS di Cp trattato con sangue è stata esaminata mediante micro-TC per comprendere l'efficienza di assorbimento e la coagulazione del sangue in presenza di NFRCS37,38,39. Le strutture 3D dei campioni di NFRCS di Cp trattati con sangue e non trattati sono state ricostruite utilizzando la micro-TC (V|tome|x S240, Phoenix, Germania). Utilizzando il software VG STUDIO-MAX versione 2.2, sono state acquisite diverse immagini radiografiche da diverse angolazioni (idealmente con una copertura di 360°) per sviluppare immagini 3D per NFRCS. I dati di proiezione raccolti sono stati ricostruiti in immagini volumetriche 3D utilizzando il semplice software 3D ScanIP Academic.
Inoltre, per comprendere la distribuzione del coagulo, 20 µl di sangue citrato premiscelato e 20 µl di CaCl₂ 0,2 M sono stati aggiunti al NFRCS per avviare la coagulazione. I campioni preparati vengono lasciati indurire. La superficie del NFRK è stata trattata con glutaraldeide allo 0,5% ed essiccata in un forno ad aria calda a 30-40 °C per 30 minuti. Il coagulo di sangue formatosi sul NFRCS è stato scansionato, ricostruito e ne è stata visualizzata un'immagine 3D.
I test antibatterici sono stati eseguiti su Cp NFRCS (migliore rispetto a Ch NFRCS) utilizzando il metodo precedentemente descritto con piccole modifiche. L'attività antibatterica di Cp NFRCS e Cp HFFC è stata determinata utilizzando tre diversi microrganismi di prova [S. aureus (batterio gram-positivo), E. coli (batterio gram-negativo) e Candida bianca (C. albicans)] coltivati ​​su agar in piastre Petri in un incubatore. Inoculare uniformemente 50 ml della sospensione di coltura batterica diluita a una concentrazione di 105-106 UFC ml-1 sul terreno agarizzato. Versare il terreno in una piastra Petri e lasciarlo solidificare. Sono stati praticati dei pozzetti sulla superficie della piastra di agar da riempire con HFFC (3 pozzetti per HFFC e 1 per il controllo negativo). Aggiungere 200 µl di HFFC a 3 pozzetti e 200 µl di PBS a pH 7,4 al 4° pozzetto. Sull'altro lato della piastra Petri, posizionare un disco Cp NFRCS da 12 mm sull'agar solidificato e inumidire con PBS (pH 7,4). Le compresse di ciprofloxacina, ampicillina e fluconazolo sono considerate standard di riferimento per Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Misurare manualmente la zona di inibizione e acquisirne un'immagine digitale.
Dopo l'approvazione etica istituzionale, lo studio è stato condotto presso il Kasturba Medical College of Education and Research di Manipal, Karnataka, nell'India meridionale. Il protocollo sperimentale in vitro del TEG è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Kasturba Medical College di Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I soggetti sono stati reclutati tra donatori di sangue volontari (di età compresa tra 18 e 55 anni) presso la banca del sangue dell'ospedale. Inoltre, è stato ottenuto un modulo di consenso informato dai volontari per la raccolta dei campioni di sangue. Il TEG nativo (N-TEG) ​​è stato utilizzato per studiare l'effetto della formulazione Cp HFFC su sangue intero premiscelato con citrato di sodio. L'N-TEG è ampiamente riconosciuto per il suo ruolo nella rianimazione point-of-care, che crea problemi ai medici a causa del potenziale ritardo clinicamente significativo nei risultati (test di coagulazione di routine). L'analisi N-TEG è stata eseguita su sangue intero. Il consenso informato e la raccolta di un'anamnesi medica dettagliata sono stati ottenuti da tutti i partecipanti. Lo studio non ha incluso partecipanti con complicanze emostatiche o trombotiche come gravidanza/postpartum o malattie epatiche. Sono stati esclusi dallo studio anche i soggetti che assumevano farmaci che influenzano la cascata della coagulazione. I test di laboratorio di base (emoglobina, tempo di protrombina, tromboplastina attivata e conta piastrinica) sono stati eseguiti su tutti i partecipanti secondo le procedure standard. L'N-TEG determina la viscoelasticità del coagulo sanguigno, la struttura iniziale del coagulo, l'interazione delle particelle, il rafforzamento del coagulo e la lisi del coagulo. L'analisi N-TEG fornisce dati grafici e numerici sugli effetti collettivi di diversi elementi cellulari e del plasma. L'analisi N-TEG è stata eseguita su due diversi volumi di Cp HFFC (10 µl e 50 µl). Di conseguenza, 1 ml di sangue intero con acido citrico è stato aggiunto a 10 µl di Cp HFFC. Aggiungere 1 ml (Cp HFFC + sangue citrato), 340 µl di sangue misto a 20 µl di soluzione 0,2 M di CaCl2 nella piastra TEG. Successivamente, le piastre TEG sono state caricate nel TEG® 5000, US per misurare R, K, angolo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY nel 30% dei campioni di sangue in presenza di Cp HFFC41.
Il protocollo dello studio in vivo è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale per gli Animali (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del Comitato per il Controllo e la Supervisione della Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti gli studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) sono stati condotti su ratti Wistar femmina (del peso di 200-250 g). Tutti gli animali sono stati acclimatati a una temperatura di 24-26 °C e avevano libero accesso a cibo e acqua standard ad libitum. Tutti gli animali sono stati suddivisi casualmente in gruppi diversi, ciascuno composto da tre animali. Tutti gli studi sono stati condotti in conformità con Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Prima dello studio, gli animali sono stati anestetizzati mediante somministrazione intraperitoneale (ip) di una miscela di 20-50 mg di ketamina (per 1 kg di peso corporeo) e 2-10 mg di xilazina (per 1 kg di peso corporeo). Dopo lo studio, il volume di sanguinamento è stato calcolato valutando la differenza tra il peso iniziale e quello finale dei campioni; il valore medio ottenuto dai tre test è stato assunto come volume di sanguinamento del campione.
Il modello di amputazione della coda di ratto è stato implementato per comprendere il potenziale dell'NFRCS nel modulare il sanguinamento in caso di traumi, combattimenti o incidenti stradali (modello di lesione). È stato tagliato il 50% della coda con un bisturi e il campione è stato lasciato in aria per 15 secondi per garantire un sanguinamento normale. Inoltre, i campioni di prova sono stati posizionati sulla coda di un ratto applicando una pressione (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS). Sono stati riportati sanguinamento e PCT per i campioni di prova (n = 3)17,45.
L'efficacia del controllo della pressione NFRCS in combattimento è stata studiata su un modello di arteria femorale superficiale. L'arteria femorale viene esposta, punturata con un trocar da 24G e sanguinata entro 15 secondi. Dopo aver osservato un sanguinamento incontrollato, il campione di prova viene posizionato nel sito di puntura applicando una pressione. Immediatamente dopo l'applicazione del campione di prova, è stato registrato il tempo di coagulazione e l'efficienza emostatica è stata osservata per i successivi 5 minuti. La stessa procedura è stata ripetuta con Cs e Ct46.
Dowling et al. 47 hanno proposto un modello di danno epatico per valutare il potenziale emostatico dei materiali emostatici nel contesto di un sanguinamento intraoperatorio. La BCT è stata registrata per i campioni di Ct (controllo negativo), il framework di Cs (controllo positivo), i campioni di Ch NFRCS e i campioni di Cp NFRCS. La vena cava sopraepatica del ratto è stata esposta eseguendo una laparotomia mediana. Successivamente, la parte distale del lobo sinistro è stata tagliata con le forbici. È stata praticata un'incisione nel fegato con un bisturi e lasciata sanguinare per alcuni secondi. Campioni di Ch NFRCS e Cp NFRCS accuratamente pesati sono stati posizionati sulla superficie danneggiata senza alcuna pressione positiva e la BCT è stata registrata. Il gruppo di controllo (Ct) ha quindi applicato pressione seguita da Cs 30 s47 senza rompere la lesione.
Sono stati condotti test di guarigione delle ferite in vivo utilizzando un modello di ferita escissionale per valutare le proprietà di guarigione delle ferite dei NFRCS sviluppati a base di polimeri. I modelli di ferite escissionali sono stati selezionati ed eseguiti secondo metodi precedentemente pubblicati con piccole modifiche19,32,48. Tutti gli animali sono stati anestetizzati come precedentemente descritto. È stata utilizzata una punta da biopsia (12 mm) per praticare un'incisione circolare profonda nella cute del dorso. Le sedi delle ferite preparate sono state medicate con Cs (controllo positivo), Ct (considerando che i dischetti di cotone interferiscono con la guarigione), Ch NFRCS e Cp NFRCS (gruppo sperimentale) e un controllo negativo senza alcun trattamento. Ogni giorno dello studio, l'area della ferita è stata misurata in tutti i ratti. È stata utilizzata una fotocamera digitale per scattare una foto dell'area della ferita e applicare una nuova medicazione. La percentuale di chiusura della ferita è stata misurata con la seguente formula:
Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore (Cp NFRCS) e del gruppo di controllo è stata asportata e studiata mediante colorazione con H&E e colorazione tricromica di Masson. Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore (Cp NFRCS) e del gruppo di controllo è stata asportata e studiata mediante colorazione con H&E e colorazione tricromica di Masson.Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore (Cp NFRCS) e del gruppo di controllo) è stata escissa ed esaminata mediante colorazione con ematossilina-eosina e tricromica di Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFCS) e 对照组)的大鼠皮肤, 进行H&E染色 e Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) e 对照组)的大鼠皮肤, 进行H&E染色和眳组）I ratti del gruppo migliore (Cp NFRCS) e del gruppo di controllo sono stati sottoposti a escissione per la colorazione con ematossilina-eosina e la colorazione tricromica di Masson in base alla percentuale di chiusura della ferita il 12° giorno dello studio.La procedura di colorazione implementata è stata eseguita secondo i metodi precedentemente descritti49,50. In breve, dopo la fissazione in formalina al 10%, i campioni sono stati disidratati utilizzando una serie di alcoli graduati. Utilizzare un microtomo per ottenere sezioni sottili (5 µm di spessore) del tessuto escisso. Sezioni seriali sottili di controlli e di cellule staminali neuroendocrine (NFRC) di Cp sono state trattate con ematossilina ed eosina per studiare le alterazioni istopatologiche. La colorazione tricromica di Masson è stata utilizzata per rilevare la formazione di fibrille di collagene. I risultati ottenuti sono stati analizzati in cieco dai patologi.
La stabilità dei campioni di Cp NFRCS è stata studiata a temperatura ambiente (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) per 12 mesi51. Il Cp NFRCS (scolorimento superficiale e crescita microbica) è stato ispezionato visivamente e testato per la resistenza all'usura da piega e BCT secondo i metodi sopra descritti nella sezione Materiali e metodi.
La scalabilità e la riproducibilità del Cp NFRCS sono state esaminate preparando il Cp NFRCS con una dimensione di 15×15 cm². Inoltre, campioni da 30 mg (n = 5) sono stati prelevati da diverse frazioni di Cp NFRCS e il BCT dei campioni studiati è stato valutato come descritto in precedenza nella sezione Metodi.
Abbiamo cercato di sviluppare diverse forme e strutture utilizzando composizioni di Cp NFRCS per diverse applicazioni biomediche. Tali forme o configurazioni includono tamponi conici per epistassi, procedure odontoiatriche e tamponi cilindrici per emorragie vaginali.
Tutti i set di dati sono espressi come media ± deviazione standard e sono stati analizzati tramite ANOVA utilizzando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) seguito dal test di confronti multipli di Bonferroni (*p<0,05).
Tutte le procedure eseguite negli studi sull'uomo sono state eseguite in conformità con gli standard dell'Istituto e del Consiglio Nazionale delle Ricerche, nonché con la Dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche, o con standard etici analoghi. Tutti i partecipanti sono stati informati sulle caratteristiche dello studio e sulla sua natura volontaria. I dati dei partecipanti rimangono riservati una volta raccolti. Il protocollo sperimentale TEG in vitro è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I volontari hanno firmato il consenso informato per la raccolta dei campioni di sangue.
Tutte le procedure eseguite negli studi sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida della Facoltà di Medicina di Kastuba, Istituto di Istruzione Superiore di Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti gli esperimenti sugli animali progettati sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per il Controllo e la Supervisione della Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti gli autori seguono le linee guida ARRIVE.
Gli spettri FTIR di tutti i NFRCS sono stati analizzati e confrontati con lo spettro del chitosano mostrato in Figura 2A. Picchi spettrali caratteristici del chitosano (registrati) a 3437 cm-1 (allungamento di OH e NH, sovrapposizione), 2945 e 2897 cm-1 (allungamento di CH), 1660 cm-1 (deformazione di NH2), 1589 cm-1 (piegatura di N–H), 1157 cm-1 (allungamento a ponte di O-), 1067 cm-1 (allungamento di C–O, idrossile secondario), 993 cm-1 (allungamento di CO, Bo-OH) 52,53,54. La Tabella supplementare S1 mostra i valori dello spettro di assorbimento FTIR NFRCS per chitosano (reporter), chitosano puro, Cm, Ch e Cp. Gli spettri FTIR di tutti i NFRCS (Cm, Ch e Cp) hanno mostrato le stesse bande di assorbimento caratteristiche del chitosano puro, senza variazioni significative (Fig. 2A). I ​​risultati FTIR hanno confermato l'assenza di interazioni chimiche o fisiche tra i polimeri utilizzati per sviluppare i NFRCS, indicando che i polimeri utilizzati sono inerti.
Caratterizzazione in vitro di Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. (A) rappresenta gli spettri FTIR combinati delle composizioni di chitosano e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sotto compressione. (B) a) Tasso di assorbimento del sangue intero di NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3); I campioni Ct hanno mostrato un BAR più elevato perché il tampone di cotone ha una maggiore efficienza di assorbimento; b) Sangue dopo l'assorbimento del sangue Illustrazione del campione assorbito. Rappresentazione grafica del BCT del campione di prova C (Cp NFRCS ha avuto il miglior BCT (15 s, n = 3)). I dati in C, D, E e G sono stati mostrati come media ± DS e le barre di errore rappresentano la DS, ***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G sono stati mostrati come media ± DS e le barre di errore rappresentano la DS, ***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G sono preimpostati come ± esclusione standard, le tabelle sono preimpostate standard esclusione, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono presentati come media ± deviazione standard e le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD,***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD,***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G vengono visualizzati come informazioni predefinite ± esclusione standard, piani di creazione predefiniti esclusione standard, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono mostrati come media ± deviazione standard, le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001.