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Le emorragie incontrollate sono una delle principali cause di morte. Un'emostasi rapida è fondamentale per la sopravvivenza del soggetto, come nel caso del primo soccorso in situazioni di combattimento, incidenti stradali e operazioni di riduzione della mortalità. I ​​scaffold compositi rinforzati con fibre nanoporose (NFRCS), derivati ​​da una semplice composizione filmogena emostatica (HFFC) come fase continua, possono innescare e migliorare l'emostasi. Lo sviluppo degli NFRCS si basa sul design dell'ala della libellula. La struttura dell'ala della libellula è composta da ali trasversali e longitudinali, le cui membrane sono connesse tra loro per mantenere l'integrità della microstruttura. L'HFFC riveste uniformemente la superficie della fibra con un film di spessore nanometrico e collega lo spessore di cotone (Ct) distribuito in modo casuale (fase dispersa) per formare una struttura nanoporosa. La combinazione di fasi continua e dispersa riduce il costo del prodotto di dieci volte rispetto ai prodotti commerciali. Gli NFRCS modificati (tamponi o braccialetti) possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni biomediche. Studi in vivo hanno concluso che il Cp NFRCS sviluppato innesca e potenzia il processo di coagulazione nel sito di applicazione. L'NFRCS è in grado di modulare il microambiente e agire a livello cellulare grazie alla sua struttura nanoporosa, determinando una migliore guarigione delle ferite nel modello di ferita da escissione.
Le emorragie incontrollate durante il combattimento, in ambito intraoperatorio e in situazioni di emergenza possono rappresentare una seria minaccia per la vita dei feriti1. Queste condizioni, inoltre, determinano un aumento complessivo delle resistenze vascolari periferiche, con conseguente shock emorragico. L'adozione di misure appropriate per il controllo dell'emorragia durante e dopo l'intervento chirurgico è considerata potenzialmente letale2,3. Il danneggiamento dei grandi vasi sanguigni provoca un'ingente perdita di sangue, con un tasso di mortalità pari o inferiore al 50% in combattimento e al 31% durante gli interventi chirurgici1. L'ingente perdita di sangue comporta una riduzione del volume corporeo, che a sua volta diminuisce la gittata cardiaca. Un aumento delle resistenze vascolari periferiche totali e un progressivo deterioramento della microcircolazione causano ipossia negli organi vitali. Lo shock emorragico può verificarsi se la condizione persiste senza un intervento efficace1,4,5. Altre complicanze includono la progressione dell'ipotermia e dell'acidosi metabolica, nonché un disturbo della coagulazione che compromette il processo di coagulazione. Lo shock emorragico grave è associato a un rischio maggiore di morte6,7,8. Nello shock di grado III (progressivo), la trasfusione di sangue è essenziale per la sopravvivenza del paziente durante la morbilità e la mortalità intraoperatoria e postoperatoria. Per superare tutte le suddette situazioni di pericolo di vita, abbiamo sviluppato un'impalcatura composita nanoporosa rinforzata con fibre (NFRCS) che utilizza una concentrazione minima di polimero (0,5%) mediante una combinazione di polimeri emostatici idrosolubili.
Grazie all'utilizzo di rinforzi in fibra, è possibile sviluppare prodotti economicamente vantaggiosi. Le fibre disposte in modo casuale ricordano la struttura dell'ala di una libellula, bilanciata dalle strisce orizzontali e verticali presenti sulle ali. Le nervature trasversali e longitudinali dell'ala comunicano con la membrana alare (Fig. 1). Il sistema NFRCS è costituito da filo di cotone rinforzato (Ct) che funge da impalcatura, garantendo una migliore resistenza fisica e meccanica (Figura 1). Grazie alla sua economicità e alla facilità di lavorazione, i chirurghi preferiscono utilizzare fili di cotone (Ct) durante gli interventi chirurgici e le medicazioni. Pertanto, considerando i suoi molteplici vantaggi, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (che contribuisce al miglioramento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. Pertanto, considerando i suoi molteplici vantaggi, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (che contribuisce al miglioramento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. L'uso di una grande quantità di fibre cristalline è superiore al 90% (Uчаствует в повышении attività gestazionale), Ct utilizzato nei sistemi scheletrici naturali NFRCS9,10. Pertanto, visti i suoi numerosi vantaggi, tra cui >90% di cellulosa cristallina (coinvolta in una maggiore attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico NFRCS9,10.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性）, Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Pertanto, visti i suoi numerosi vantaggi, tra cui oltre il 90% di cellulosa cristallina (che contribuisce a migliorare l'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come impalcatura per NFRCS9,10.Il Ct è stato rivestito superficialmente (è stata osservata la formazione di un film di spessore nanometrico) e interconnesso con una composizione filmogena emostatica (HFFC). L'HFFC agisce come un Matrigel, tenendo insieme il Ct posizionato in modo casuale. Il design sviluppato trasmette lo stress all'interno della fase dispersa (fibre di rinforzo). È difficile ottenere strutture nanoporose con una buona resistenza meccanica utilizzando concentrazioni minime di polimero. Inoltre, non è facile personalizzare diversi stampi per diverse applicazioni biomediche.
La figura mostra uno schema del design NFRCS basato sulla struttura dell'ala di una libellula (A). Questa immagine mostra un'analogia comparativa della struttura dell'ala di una libellula (le nervature intersecanti e longitudinali dell'ala sono interconnesse) e una microfotografia in sezione trasversale di Cp NFRCS (B). Rappresentazione schematica di NFRCS.
I NFRC sono stati sviluppati utilizzando HFFC come fase continua per affrontare le limitazioni sopra menzionate. L'HFFC è composto da vari polimeri emostatici filmogeni, tra cui il chitosano (come polimero emostatico principale) con metilcellulosa (MC), idrossipropilmetilcellulosa (HPMC 50 cp) e alcol polivinilico (PVA) (125 kDa) come polimero di supporto che promuove la formazione del trombo. L'aggiunta di polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) ha migliorato la capacità di assorbimento dell'umidità del NFRC. Il polietilenglicole 400 (PEG 400) è stato aggiunto per migliorare la reticolazione del polimero nelle miscele polimeriche legate. Tre diverse composizioni emostatiche di HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), ovvero chitosano con MC (Cm), chitosano con HPMC (Ch) e chitosano con PVA (Cp), sono state applicate a Ct. Diversi studi di caratterizzazione in vitro e in vivo hanno confermato l'attività emostatica e di cicatrizzazione delle ferite del NFRCS. I materiali compositi offerti dal NFRCS possono essere utilizzati per personalizzare varie forme di scaffold per soddisfare esigenze specifiche.
Inoltre, NFRCS può essere modificato come una benda o un rotolo per coprire l'intera area lesa degli arti inferiori e di altre parti del corpo. Nello specifico, per le lesioni agli arti subite in combattimento, il design di NFRCS può essere modificato per coprire mezzo braccio o una gamba intera (Figura supplementare S11). NFRCS può essere trasformato in un braccialetto con colla per tessuti, utilizzabile per arrestare le emorragie da gravi lesioni al polso causate da tentativi di suicidio. Il nostro obiettivo principale è sviluppare un NFRCS con la minor quantità possibile di polimero, che possa essere distribuito a una vasta popolazione (al di sotto della soglia di povertà) e che possa essere incluso in un kit di pronto soccorso. Semplice, efficiente ed economico, NFRCS apporta benefici alle comunità locali e può avere un impatto globale.
Il chitosano (peso molecolare 80 kDa) e l'amaranto sono stati acquistati da Merck, India. L'idrossipropilmetilcellulosa 50 Cp, il polietilenglicole 400 e la metilcellulosa sono stati acquistati da Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. L'alcol polivinilico (peso molecolare 125 kDa) (87-90% idrolizzato) è stato acquistato da National Chemicals, Gujarat. La polivinilpirrolidina K30 è stata acquistata da Molychem, Mumbai, i tamponi sterili sono stati acquistati da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con acqua Milli Q (sistema di purificazione dell'acqua Direct-Q3, Merck, India) come veicolo.
NFRCS è stato sviluppato utilizzando un metodo di liofilizzazione11,12. Tutte le composizioni HFFC (Tabella 1) sono state preparate utilizzando un agitatore meccanico. Preparare una soluzione allo 0,5% di chitosano utilizzando acido acetico all'1% in acqua mediante agitazione continua a 800 rpm su un agitatore meccanico. Il peso esatto del polimero caricato indicato nella Tabella 1 è stato aggiunto alla soluzione di chitosano e agitato fino ad ottenere una soluzione polimerica limpida. PVP K30 e PEG 400 sono stati aggiunti alla miscela risultante nelle quantità indicate nella Tabella 1 e l'agitazione è stata continuata fino ad ottenere una soluzione polimerica viscosa limpida. Il bagno di soluzione polimerica risultante è stato sonicato per 60 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate dalla miscela polimerica. Come mostrato nella Figura supplementare S1(b), Ct è stato distribuito uniformemente in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (stampo) integrata con 5 ml di HFFC.
La piastra a sei pozzetti è stata sottoposta a sonicazione per 60 minuti per ottenere una bagnatura e una distribuzione uniformi dell'HFFC nella rete di Ct. Successivamente, la piastra a sei pozzetti è stata congelata a -20 °C per 8-12 ore. Le piastre congelate sono state liofilizzate per 48 ore per ottenere diverse formulazioni di NFRCS. La stessa procedura viene utilizzata per produrre forme e strutture diverse, come tamponi o tamponi cilindrici, o qualsiasi altra forma per diverse applicazioni.
Il chitosano (80 kDa) (3%), accuratamente pesato, viene disciolto in acido acetico all'1% utilizzando un agitatore magnetico. Alla soluzione di chitosano risultante viene aggiunto PEG 400 all'1% e la soluzione viene agitata per 30 minuti. La soluzione ottenuta viene versata in un contenitore quadrato o rettangolare e congelata a -80 °C per 12 ore. I campioni congelati vengono liofilizzati per 48 ore per ottenere Cs13 poroso.
Il NFRCS sviluppato è stato sottoposto a esperimenti utilizzando la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Giappone) per confermare la compatibilità chimica del chitosano con altri polimeri14,15. Gli spettri FTIR (ampiezza dell'intervallo spettrale da 400 a 4000 cm-1) di tutti i campioni testati sono stati ottenuti eseguendo 32 scansioni.
Il tasso di assorbimento del sangue (BAR) per tutte le formulazioni è stato valutato utilizzando il metodo descritto da Chen et al. 16 con lievi modifiche. Gli NFRK sviluppati di tutte le composizioni sono stati essiccati in un forno sottovuoto a 105 °C per tutta la notte per rimuovere il solvente residuo. 30 mg di NFRCS (peso iniziale del campione – W0) e 30 mg di Ct (controllo positivo) sono stati posti in capsule separate contenenti una premiscela di citrato di sodio al 3,8%. A intervalli di tempo predeterminati, ovvero 5, 10, 20, 30, 40 e 60 secondi, gli NFRCS sono stati rimossi e le loro superfici pulite dal sangue non assorbito posizionando i campioni su Ct per 30 secondi. Il peso finale del sangue assorbito dagli NFRCS 16 è stato considerato (W1) in ciascun punto temporale. Calcolare la percentuale di BAR utilizzando la seguente formula:
Il tempo di coagulazione del sangue (BCT) è stato determinato come riportato da Wang et al. 17. Il tempo necessario affinché il sangue intero (sangue di ratto premiscelato con citrato di sodio al 3,8%) coagulasse in presenza di NFRCS è stato calcolato come BCT del campione di prova. I vari componenti NFRCS (30 mg) sono stati posti in fiale da 10 ml con tappo a vite e incubati a 37 °C. Sono stati aggiunti 0,5 ml di sangue alla fiala e 0,3 ml di CaCl2 0,2 ​​M per attivare la coagulazione del sangue. Infine, la fiala è stata capovolta ogni 15 secondi (fino a 180 °) fino alla formazione di un coagulo solido. Il BCT del campione è stato stimato dal numero di capovolgimenti delle fiale17,18. Sulla base del BCT, sono state selezionate due composizioni ottimali di NFRCS Cm, Ch e Cp per ulteriori studi di caratterizzazione.
Il BCT delle composizioni Ch NFRCS e Cp NFRCS è stato determinato implementando il metodo descritto da Li et al. 19. Posizionare 15 x 15 mm2 di Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controllo positivo) in piastre di Petri separate (37 °C). Il sangue contenente il 3,8% di citrato di sodio è stato miscelato con 0,2 M CaCl2 in un rapporto volumetrico di 10:1 per avviare il processo di coagulazione del sangue. 20 µl di miscela di sangue di ratto con 0,2 M CaCl2 sono stati applicati sulla superficie del campione e posizionati in una piastra di Petri vuota. Il controllo era costituito da sangue versato in piastre di Petri vuote senza Ct. A intervalli fissi di 0, 3 e 5 minuti, interrompere la coagulazione aggiungendo 10 ml di acqua deionizzata (DI) al campione contenente la piastra senza disturbare il coagulo. Gli eritrociti non coagulati subiscono emolisi in presenza di acqua deionizzata e rilasciano emoglobina. L'emoglobina in diversi momenti (HA(t)) è stata misurata a 540 nm (λmax emoglobina) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. L'assorbimento assoluto dell'emoglobina (AH(0)) a 0 min di 20 µl di sangue in 10 ml di acqua deionizzata è stato preso come standard di riferimento. L'assorbimento relativo di emoglobina (RHA) del sangue coagulato è stato calcolato dal rapporto HA(t)/HA(0) utilizzando lo stesso lotto di sangue.
Utilizzando un analizzatore di texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sono state determinate le proprietà adesive di NFRK al tessuto danneggiato. Una piastra cilindrica a fondo aperto è stata premuta contro la parte interna della pelle di maiale (senza lo strato di grasso). I campioni (Ch NFRCS e Cp NFRCS) sono stati applicati tramite cannula in stampi cilindrici per creare adesione alla pelle del maiale. Dopo un'incubazione di 3 minuti a temperatura ambiente (TA) (25 °C), la forza adesiva di NFRCS è stata registrata a una velocità costante di 0,5 mm/sec.
La caratteristica principale dei sigillanti chirurgici è quella di aumentare la coagulazione del sangue riducendo al contempo la perdita di sangue. La coagulazione senza perdita di sangue in NFRCS è stata valutata utilizzando un metodo precedentemente pubblicato con lievi modifiche 19. Preparare una provetta da microcentrifuga (2 ml) (diametro interno 10 mm) con un foro di 8 × 5 mm2 su un lato della provetta (che rappresenta una ferita aperta). NFRCS viene utilizzato per chiudere l'apertura e nastro adesivo viene utilizzato per sigillare i bordi esterni. Aggiungere 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M alla provetta da microcentrifuga contenente la premiscela di citrato di sodio al 3,8%. Dopo 10 minuti, le provette da microcentrifuga sono state rimosse dalle piastre e l'aumento di massa delle piastre è stato determinato a causa del deflusso di sangue da NFRK (n = 3). La perdita di sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS è stata confrontata con Cs.
L'integrità umida del NFRCS è stata determinata in base al metodo descritto da Mishra e Chaudhary21 con lievi modifiche. Mettere il NFRCS in una beuta da 100 ml con 50 ml di acqua e agitare per 60 s senza formare un tappo. Ispezione visiva e prioritizzazione dei campioni per l'integrità fisica in base alla raccolta.
La forza di legame dell'HFFC al Ct è stata studiata utilizzando metodi precedentemente pubblicati con lievi modifiche. L'integrità del rivestimento superficiale è stata valutata esponendo NFRK a onde acustiche (stimolo esterno) in presenza di acqua milliQ (Ct). I NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS sviluppati sono stati posti in un becher riempito d'acqua e sonicati per 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 minuti, rispettivamente. Dopo l'essiccazione, la differenza percentuale tra il peso iniziale e finale dei NFRCS è stata utilizzata per calcolare la perdita percentuale di materiale (HFFC). Il BCT in vitro ha ulteriormente supportato la forza di legame o la perdita di materiale superficiale. L'efficienza del legame dell'HFFC al Ct fornisce la coagulazione del sangue e un rivestimento elastico sulla superficie del Ct22.
L'omogeneità del NFRCS sviluppato è stata determinata mediante il BCT di campioni (30 mg) prelevati da posizioni generali selezionate casualmente del NFRCS. Seguire la procedura BCT precedentemente menzionata per determinare la conformità del NFRCS. La prossimità tra tutti e cinque i campioni garantisce una copertura superficiale uniforme e la deposizione di HFFC nella rete Ct.
L'area nominale di contatto con il sangue (NBCA) è stata determinata come precedentemente riportato con alcune modifiche. Il sangue è stato coagulato bloccando 20 µl di sangue tra le due superfici di Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. Dopo 1 ora, le due parti dello stent sono state separate e l'area del coagulo è stata misurata manualmente. Il valore medio di tre ripetizioni è stato considerato NBCA NFRCS19.
L'analisi di assorbimento dinamico di vapore (DVS) è stata utilizzata per valutare l'efficacia del NFRCS nell'assorbire acqua dall'ambiente esterno o dal sito della lesione responsabile dell'avvio della coagulazione. Il DVS valuta o registra l'assorbimento e la perdita di vapore in un campione gravimetricamente utilizzando una bilancia ultrasensibile con una risoluzione di massa di ±0,1 µg. Una pressione parziale di vapore (umidità relativa) viene generata da un regolatore elettronico di flusso di massa attorno al campione mediante la miscelazione di gas vettori saturi e secchi. Secondo le linee guida della Farmacopea Europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, questi sono stati categorizzati in 4 categorie (0–0,012% p/p− non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15% moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23. Secondo le linee guida della Farmacopea Europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, questi sono stati categorizzati in 4 categorie (0–0,012% p/p− non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15% moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23.In conformità con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, a seconda della percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, questi sono stati suddivisi in 4 categorie (0–0,012% p/p – non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15%).% умеренно гигроскопичен e > 15% очень гигроскопичен)23. % moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23.根据欧洲药典指南, 根据样品吸收水分的百分比, 样品分为4 （0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿,> 15% 非常吸湿）23.（（0-0.012% W/w-吸湿 性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿,> 15 %非常吸湿）23.In conformità con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, i campioni sono suddivisi in 4 classi a seconda della percentuale di umidità assorbita dal campione (0-0,012% in peso – non igroscopico, 0,2-2% in peso leggermente igroscopico, 2-15% in peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderatamente igroscopici, > 15% molto igroscopici) 23.L'efficienza igroscopica di NFCS X NFCS e TsN NFCS è stata determinata su un analizzatore DVS TA TGA Q5000 SA. Durante questo processo, sono stati rilevati il ​​tempo di esecuzione, l'umidità relativa (RH) e il peso del campione in tempo reale a 25 °C24. Il contenuto di umidità è calcolato mediante un'accurata analisi di massa di NFCS utilizzando la seguente equazione:
MC è l'umidità NFRCS. m1 – peso secco dei FANS. m2 è la massa NFRCS in tempo reale a una data umidità relativa.
La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr). L'esperienza di miglioramento è stata definita con un esperimento effettuato per l'aggiunta di un esperimento successivo funzionamento a una temperatura di 25 °C течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni sono stati svuotati a 25 °C per 10 ore (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后,使用液氮的氮吸附实验估计总表面积.在 25°C L'esperienza di miglioramento è stata sviluppata con l'utilizzo di esperimenti di adsorbimento in un ambiente umido dopo l'osservazione di temperatura 10 ore a 25°C (< 7 × 10-3 ore). La superficie totale è stata stimata utilizzando esperimenti di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni sono stati svuotati per 10 ore a 25 °C (< 7 x 10⁻³ torr).La superficie totale, il volume dei pori e la dimensione dei pori NFRCS sono stati determinati con un analizzatore Quantachrome della NOVA 1000e, Austria, utilizzando il software RS 232.
Preparare una soluzione di globuli rossi al 5% (soluzione fisiologica come diluente) da sangue intero. Trasferire quindi un'aliquota di HFFC (0,25 ml) in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 0,1 ml di massa di globuli rossi al 5%. Incubare la miscela a 37°C per 40 minuti. Una miscela di globuli rossi e siero è stata considerata come controllo positivo, mentre una miscela di soluzione fisiologica e globuli rossi come controllo negativo. L'emoagglutinazione è stata determinata secondo la scala di Stajitzky. Le scale proposte sono le seguenti: + + + + aggregati granulari densi; + + + cuscinetti a fondo liscio con bordi curvi; + + cuscinetti a fondo liscio con bordi lacerati; + anelli rossi stretti attorno ai bordi dei cuscinetti lisci; – (negativo) pulsante rosso discreto 12 al centro del pozzetto inferiore.
L'emocompatibilità di NFRCS è stata studiata secondo il metodo dell'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Il metodo gravimetrico descritto da Singh et al. Sono state apportate piccole modifiche per valutare la formazione di trombi in presenza di o sulla superficie di NFRCS. 500 mg di Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati incubati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 24 ore a 37°C. Dopo 24 ore, il PBS è stato rimosso e NFRCS è stato trattato con 2 ml di sangue contenente citrato di sodio al 3,8%. Sulla superficie di NFRCS, aggiungere 0,04 ml di CaCl2 0,1 M ai campioni incubati. Dopo 45 minuti, sono stati aggiunti 5 ml di acqua distillata per arrestare la coagulazione. Il sangue coagulato sulla superficie di NFRK è stato trattato con una soluzione di formaldeide al 36-38%. I coaguli fissati con formaldeide sono stati essiccati e pesati. La percentuale di trombosi è stata stimata calcolando il peso del bicchiere senza sangue e campione (controllo negativo) e del bicchiere con sangue (controllo positivo).
Come prima conferma, i campioni sono stati visualizzati al microscopio ottico per comprendere la capacità del rivestimento superficiale HFFC, del Ct interconnesso e della rete di Ct di formare pori. Sezioni sottili di Ch e Cp provenienti da NFRCS sono state tagliate con una lama di bisturi. La sezione risultante è stata posta su un vetrino, coperta con un vetrino coprioggetti e i bordi sono stati fissati con colla. I vetrini preparati sono stati osservati al microscopio ottico e sono state scattate fotografie a diversi ingrandimenti.
La deposizione del polimero nelle reti di Ct è stata visualizzata mediante microscopia a fluorescenza basata sul metodo descritto da Rice et al.29. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e gli NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo precedentemente menzionato. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e gli NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo precedentemente menzionato.La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e NFRCS (Ch e Cp) è stato ottenuto secondo il metodo precedentemente menzionato.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp）).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合,并按照前面提到的方法制备NFRCS(Ch & Cp）).La composizione HFFC utilizzata nella formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (Amaranto) e ha ricevuto NFRCS (Ch e Cp), come menzionato in precedenza.Sono state ricavate sezioni sottili di NFRK dai campioni ottenuti, posizionate su vetrini e coperte con vetrini coprioggetto. I vetrini preparati sono stati osservati al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro verde (310-380 nm). Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 4x per comprendere le relazioni Ct e l'eccesso di deposizione di polimero nella rete Ct.
La topografia superficiale di NFRCS Ch e Cp è stata determinata utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) con un cantilever TESP ultra-affilato in modalità tapping: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. La rugosità superficiale è stata determinata mediante il valore quadratico medio (RMS) utilizzando un software (Scanning Probe Image Processor). Diverse posizioni di NFRCS sono state riprodotte su immagini 3D per verificare l'uniformità della superficie. La deviazione standard del punteggio per una data area è definita come rugosità superficiale. L'equazione RMS è stata utilizzata per quantificare la rugosità superficiale di NFRCS31.
Sono stati condotti studi basati su FESEM utilizzando un FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, per comprendere la morfologia superficiale di Ch NFRCS e Cp NFRCS, che hanno mostrato un BCT migliore rispetto a Cm NFRCS. Lo studio FESEM è stato condotto secondo il metodo descritto da Zhao et al. 32 con lievi modifiche. Da 20 a 30 mg di Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati premiscelati con 20 µl di citrato di sodio al 3,8% premiscelato con sangue di ratto. Sono stati aggiunti 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M ai campioni trattati con sangue per avviare la coagulazione e i campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Inoltre, gli eritrociti in eccesso sono stati rimossi dalla superficie di NFRCS mediante risciacquo con soluzione salina.
I campioni successivi sono stati trattati con glutaraldeide allo 0,1% e poi essiccati in un forno ad aria calda a 37 °C per rimuovere l'umidità. I ​​campioni essiccati sono stati rivestiti e analizzati 32. Altre immagini ottenute durante l'analisi erano la formazione del coagulo sulla superficie delle singole fibre di cotone, la deposizione del polimero tra Ct, la morfologia (forma) degli eritrociti, l'integrità del coagulo e la morfologia degli eritrociti in presenza di NFRCS. Le aree NFRCS non trattate e le aree NFRCS trattate con Ch e Cp incubate con sangue sono state scansionate per gli ioni elementari (sodio, potassio, azoto, calcio, magnesio, zinco, rame e selenio)33. Confrontare le percentuali di ioni elementari tra campioni trattati e non trattati per comprendere l'accumulo di ioni elementari durante la formazione del coagulo e l'omogeneità del coagulo.
Lo spessore del rivestimento superficiale Cp HFFC sulla superficie Ct è stato determinato utilizzando FESEM. Le sezioni trasversali di Cp NFRCS sono state tagliate dalla struttura e rivestite mediante sputtering. I campioni di rivestimento sputtering risultanti sono stati osservati mediante FESEM e lo spessore del rivestimento superficiale è stato misurato 34, 35, 36.
La micro-TC a raggi X fornisce immagini 3D non distruttive ad alta risoluzione e consente di studiare la disposizione strutturale interna dell'NFRK. La micro-TC utilizza un fascio di raggi X che attraversa il campione per registrare il coefficiente di attenuazione lineare locale dei raggi X nel campione, il che aiuta a ottenere informazioni morfologiche. La posizione interna del Ct nel Cp NFRCS e nel Cp NFRCS trattato con sangue è stata esaminata mediante micro-TC per comprendere l'efficienza di assorbimento e la coagulazione del sangue in presenza di NFRCS37,38,39. Le strutture 3D dei campioni di Cp NFRCS trattati e non trattati con sangue sono state ricostruite utilizzando la micro-TC (V|tome|x S240, Phoenix, Germania). Utilizzando il software VG STUDIO-MAX versione 2.2, sono state acquisite diverse immagini a raggi X da diverse angolazioni (idealmente con copertura a 360°) per sviluppare immagini 3D per l'NFRCS. I dati di proiezione raccolti sono stati ricostruiti in immagini volumetriche 3D utilizzando il corrispondente software 3D ScanIP Academic.
Inoltre, per comprendere la distribuzione del coagulo, sono stati aggiunti 20 µl di sangue citrato premiscelato e 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M al NFRCS per avviare la coagulazione del sangue. I campioni preparati sono stati lasciati indurire. La superficie del NFRK è stata trattata con glutaraldeide allo 0,5% e asciugata in un forno ad aria calda a 30–40 °C per 30 minuti. Il coagulo di sangue formatosi sul NFRCS è stato scansionato, ricostruito e ne è stata visualizzata un'immagine 3D.
Sono stati eseguiti test antibatterici su Cp NFRCS (migliore rispetto a Ch NFRCS) utilizzando il metodo precedentemente descritto con lievi modifiche. L'attività antibatterica di Cp NFRCS e Cp HFFC è stata determinata utilizzando tre diversi microrganismi di prova [S. aureus (batterio Gram-positivo), E. coli (batterio Gram-negativo) e Candida bianca (C. albicans)] cresciuti su agar in piastre di Petri in un incubatore. Inoculare uniformemente 50 ml della sospensione di coltura batterica diluita a una concentrazione di 10⁵-10⁶ CFU ml⁻¹ sul terreno di coltura agarizzato. Versare il terreno in una piastra di Petri e lasciarlo solidificare. Sono stati creati dei pozzetti sulla superficie della piastra di agar da riempire con HFFC (3 pozzetti per HFFC e 1 per il controllo negativo). Aggiungere 200 µl di HFFC a 3 pozzetti e 200 µl di PBS a pH 7,4 al quarto pozzetto. Dall'altro lato della piastra di Petri, posizionare un disco di Cp NFRCS da 12 mm sull'agar solidificato e inumidire con PBS (pH 7,4). Le compresse di ciprofloxacina, ampicillina e fluconazolo sono considerate standard di riferimento per Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Misurare manualmente la zona di inibizione e scattare una foto digitale della zona di inibizione.
Dopo l'approvazione etica istituzionale, lo studio è stato condotto presso il Kasturba Medical College of Education and Research di Manipal, Karnataka, nell'India meridionale. Il protocollo sperimentale TEG in vitro è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I soggetti sono stati reclutati tra i donatori di sangue volontari (di età compresa tra 18 e 55 anni) della banca del sangue dell'ospedale. Inoltre, è stato ottenuto un modulo di consenso informato dai volontari per la raccolta dei campioni di sangue. Il TEG nativo (N-TEG) ​​è stato utilizzato per studiare l'effetto della formulazione Cp HFFC sul sangue intero premiscelato con citrato di sodio. L'N-TEG è ampiamente riconosciuto per il suo ruolo nella rianimazione point-of-care, che crea problemi per i medici a causa del potenziale ritardo clinicamente significativo nei risultati (test di coagulazione di routine). L'analisi N-TEG è stata eseguita utilizzando sangue intero. Il consenso informato e l'anamnesi dettagliata sono stati ottenuti da tutti i partecipanti. Lo studio non ha incluso partecipanti con complicanze emostatiche o trombotiche come gravidanza/post-partum o malattie epatiche. Sono stati esclusi dallo studio anche i soggetti che assumevano farmaci che influenzano la cascata della coagulazione. Su tutti i partecipanti sono stati eseguiti esami di laboratorio di base (emoglobina, tempo di protrombina, tromboplastina attivata e conta piastrinica) secondo procedure standard. L'N-TEG determina la viscoelasticità del coagulo di sangue, la struttura iniziale del coagulo, l'interazione delle particelle, il rafforzamento del coagulo e la lisi del coagulo. L'analisi N-TEG fornisce dati grafici e numerici sugli effetti collettivi di diversi elementi cellulari e del plasma. L'analisi N-TEG è stata eseguita su due diversi volumi di Cp HFFC (10 µl e 50 µl). Di conseguenza, 1 ml di sangue intero con acido citrico è stato aggiunto a 10 μl di Cp HFFC. Aggiungere 1 ml (Cp HFFC + sangue citrato), 340 µl di sangue misto a 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M in una piastra TEG. Successivamente, le piastre TEG sono state caricate nel TEG® 5000, US per misurare R, K, angolo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% dei campioni di sangue in presenza di Cp HFFC41.
Il protocollo di studio in vivo è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale per la Sperimentazione Animale (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del Comitato per il Controllo e la Supervisione della Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti gli studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) sono stati condotti su ratti Wistar femmine (del peso compreso tra 200 e 250 g). Tutti gli animali sono stati acclimatati a una temperatura di 24-26 °C e hanno avuto libero accesso a cibo standard e acqua ad libitum. Tutti gli animali sono stati suddivisi casualmente in diversi gruppi, ciascuno composto da tre animali. Tutti gli studi sono stati condotti in conformità con Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Prima dello studio, gli animali sono stati anestetizzati mediante somministrazione intraperitoneale (ip) di una miscela di 20-50 mg di ketamina (per 1 kg di peso corporeo) e 2-10 mg di xilazina (per 1 kg di peso corporeo). Al termine dello studio, il volume di sanguinamento è stato calcolato valutando la differenza tra il peso iniziale e quello finale dei campioni; il valore medio ottenuto dalle tre prove è stato considerato come volume di sanguinamento del campione.
Il modello di amputazione della coda del ratto è stato implementato per comprendere il potenziale di NFRCS nel modulare il sanguinamento in caso di trauma, combattimento o incidente stradale (modello di lesione). Il 50% della coda è stato tagliato con una lama di bisturi e lasciato all'aria per 15 secondi per garantire un sanguinamento normale. Inoltre, i campioni di prova sono stati posizionati sulla coda di un ratto applicando pressione (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS). Il sanguinamento e il PCT sono stati riportati per i campioni di prova (n = 3)17,45.
L'efficacia del controllo pressorio NFRCS in ambito bellico è stata studiata su un modello dell'arteria femorale superficiale. L'arteria femorale è stata esposta, puntata con un trocar da 24G e fatta sanguinare entro 15 secondi. Dopo aver osservato un sanguinamento incontrollato, il campione di prova è stato posizionato nel sito di puntura applicando pressione. Immediatamente dopo l'applicazione del campione di prova, è stato registrato il tempo di coagulazione e l'efficacia emostatica è stata osservata per i successivi 5 minuti. La stessa procedura è stata ripetuta con Cs e Ct46.
Dowling et al. 47 hanno proposto un modello di lesione epatica per valutare il potenziale emostatico dei materiali emostatici nel contesto del sanguinamento intraoperatorio. Il BCT è stato registrato per i campioni Ct (controllo negativo), la struttura Cs (controllo positivo), i campioni Ch NFRCS e i campioni Cp NFRCS. La vena cava sovraepatica del ratto è stata esposta mediante laparotomia mediana. Successivamente, la parte distale del lobo sinistro è stata tagliata con le forbici. È stata praticata un'incisione nel fegato con una lama di bisturi e lasciata sanguinare per alcuni secondi. Campioni di prova Ch NFRCS e Cp NFRCS accuratamente pesati sono stati posizionati sulla superficie danneggiata senza alcuna pressione positiva e il BCT è stato registrato. Il gruppo di controllo (Ct) ha quindi applicato pressione seguito da Cs 30 s47 senza rompere la lesione.
Sono stati eseguiti test di guarigione delle ferite in vivo utilizzando un modello di ferita da escissione per valutare le proprietà di guarigione delle ferite dei NFRCS a base di polimeri sviluppati. I modelli di ferite da escissione sono stati selezionati ed eseguiti secondo metodi precedentemente pubblicati con lievi modifiche19,32,48. Tutti gli animali sono stati anestetizzati come precedentemente descritto. Utilizzare un punch per biopsia (12 mm) per praticare un'incisione circolare profonda nella pelle del dorso. I siti della ferita preparati sono stati medicati con Cs (controllo positivo), Ct (riconoscendo che i tamponi di cotone interferiscono con la guarigione), Ch NFRCS e Cp NFRCS (gruppo sperimentale) e un controllo negativo senza alcun trattamento. Ogni giorno dello studio, l'area della ferita è stata misurata in tutti i ratti. Utilizzare una fotocamera digitale per scattare una foto dell'area della ferita e applicare una nuova medicazione. La percentuale di chiusura della ferita è stata misurata con la seguente formula:
In base alla percentuale di chiusura della ferita al dodicesimo giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore è stata escissa ((Cp NFRCS) e del gruppo di controllo) e studiata mediante colorazione con ematossilina-eosina e colorazione tricromica di Masson. In base alla percentuale di chiusura della ferita al dodicesimo giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore è stata escissa ((Cp NFRCS) e del gruppo di controllo) e studiata mediante colorazione con ematossilina-eosina e colorazione tricromica di Masson.In base alla percentuale di chiusura della ferita al dodicesimo giorno dello studio, la cute dei ratti del gruppo migliore ((Cp NFRCS) e del gruppo di controllo) è stata escissa ed esaminata mediante colorazione con ematossilina-eosina e tricromica di Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFCS) e 对照组)的大鼠皮肤, 进行H&E染色 e Masson三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) e 对照组)的大鼠皮肤, 进行H&E染色和眳组）I ratti del gruppo migliore (Cp NFRCS e gruppo di controllo) sono stati sottoposti a escissione per la colorazione con ematossilina-eosina e la colorazione tricromica di Masson, in base alla percentuale di chiusura della ferita al dodicesimo giorno dello studio.La procedura di colorazione implementata è stata eseguita secondo metodi precedentemente descritti49,50. In breve, dopo la fissazione in formalina al 10%, i campioni sono stati disidratati utilizzando una serie di alcoli a concentrazione crescente. Utilizzando un microtomo, sono state ottenute sezioni sottili (5 µm di spessore) del tessuto escisso. Sezioni seriali sottili di controlli e Cp NFRCS sono state trattate con ematossilina ed eosina per studiare le alterazioni istopatologiche. La colorazione tricromica di Masson è stata utilizzata per rilevare la formazione di fibrille di collagene. I risultati ottenuti sono stati studiati in cieco da patologi.
La stabilità dei campioni di Cp NFRCS è stata studiata a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/60% UR ± 5%) per 12 mesi51. Il Cp NFRCS (decolorazione della superficie e crescita microbica) è stato ispezionato visivamente e testato per la resistenza all'usura da piegatura e BCT secondo i metodi sopra descritti nella sezione Materiali e Metodi.
La scalabilità e la riproducibilità del Cp NFRCS sono state esaminate preparando campioni di Cp NFRCS di dimensioni pari a 15×15 cm2. Inoltre, sono stati prelevati campioni da 30 mg (n = 5) da diverse frazioni di Cp NFRCS e il BCT dei campioni studiati è stato valutato come descritto in precedenza nella sezione Metodi.
Abbiamo cercato di sviluppare varie forme e strutture utilizzando composizioni Cp NFRCS per diverse applicazioni biomediche. Tali forme o configurazioni includono tamponi conici per epistassi e procedure odontoiatriche, e tamponi cilindrici per sanguinamento vaginale.
Tutti i set di dati sono espressi come media ± deviazione standard e sono stati analizzati mediante ANOVA utilizzando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) seguito dal test di confronti multipli di Bonferroni (*p<0,05).
Tutte le procedure eseguite negli studi sull'uomo sono state condotte in conformità con gli standard dell'Istituto e del Consiglio Nazionale delle Ricerche, nonché con la Dichiarazione di Helsinki del 1964 e i suoi successivi emendamenti, o con standard etici simili. Tutti i partecipanti sono stati informati sulle caratteristiche dello studio e sulla sua natura volontaria. I dati dei partecipanti rimangono riservati una volta raccolti. Il protocollo sperimentale TEG in vitro è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). I volontari hanno firmato il consenso informato per la raccolta dei campioni di sangue.
Tutte le procedure eseguite negli studi sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida della Facoltà di Medicina Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati progettati e condotti in conformità con le linee guida del Comitato per il Controllo e la Supervisione della Sperimentazione Animale (CPCSEA). Tutti gli autori seguono le linee guida ARRIVE.
Gli spettri FTIR di tutti gli NFRCS sono stati analizzati e confrontati con lo spettro del chitosano mostrato nella Figura 2A. Picchi spettrali caratteristici del chitosano (registrati) a 3437 cm-1 (stiramento OH e NH, sovrapposizione), 2945 e 2897 cm-1 (stiramento CH), 1660 cm-1 (tensione NH2), 1589 cm-1 (piegamento N–H), 1157 cm-1 (stiramento a ponte O-), 1067 cm-1 (stiramento C–O, idrossile secondario), 993 cm-1 (stiramento CO, Bo-OH) 52.53.54. La Tabella supplementare S1 mostra i valori dello spettro di assorbimento FTIR NFRCS per il chitosano (reporter), il chitosano puro, Cm, Ch e Cp. Gli spettri FTIR di tutti i NFRCS (Cm, Ch e Cp) hanno mostrato le stesse bande di assorbimento caratteristiche del chitosano puro senza alcuna variazione significativa (Fig. 2A). I ​​risultati FTIR hanno confermato l'assenza di interazioni chimiche o fisiche tra i polimeri utilizzati per sviluppare i NFRCS, indicando che i polimeri utilizzati sono inerti.
Caratterizzazione in vitro di Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs. (A) rappresenta gli spettri FTIR combinati delle composizioni di chitosano e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sotto compressione. (B) a) Tasso di assorbimento del sangue intero di NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3); i campioni Ct hanno mostrato un BAR più alto perché il tampone di cotone ha una maggiore efficienza di assorbimento; b) Sangue dopo l'assorbimento del sangue. Illustrazione del campione assorbito. Rappresentazione grafica del BCT del campione di prova C (Cp NFRCS ha avuto il miglior BCT (15 s, n = 3)). I dati in C, D, E e G sono stati presentati come media ± deviazione standard (DS), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G sono stati presentati come media ± deviazione standard (DS), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G sono preimpostati come ± esclusione standard, le tabelle sono preimpostate standard esclusione, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono presentati come media ± deviazione standard e le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD,***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD,***p < 0,0001. I dati in C, D, E e G vengono visualizzati come informazioni predefinite ± esclusione standard, piani di creazione predefiniti esclusione standard, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono mostrati come media ± deviazione standard, le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001.