Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Ongecontroleerde bloedingen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken. Snelle hemostase is essentieel voor de overleving van de patiënt en kan worden toegepast bij eerste hulp tijdens gevechten, verkeersongevallen en operaties ter vermindering van het aantal dodelijke slachtoffers. Een nanoporeus vezelversterkt composietmateriaal (NFRCS), afgeleid van een eenvoudige hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC) als continue fase, kan hemostase bevorderen en verbeteren. De ontwikkeling van het NFRCS is gebaseerd op het ontwerp van de vleugel van een libel. De vleugelstructuur van een libel bestaat uit dwars- en lengtevinnen, waarvan de membranen met elkaar verbonden zijn om de integriteit van de microstructuur te behouden. HFFC bedekt het vezeloppervlak uniform met een film van nanometerdikte en verbindt de willekeurig verdeelde katoenvezels (Ct) (gedispergeerde fase) om een ​​nanoporeuze structuur te vormen. De combinatie van continue en gedispergeerde fasen verlaagt de productkosten met een factor tien ten opzichte van commercieel verkrijgbare producten. Gemodificeerde NFRCS (tampons of polsbandjes) kunnen worden gebruikt in diverse biomedische toepassingen. In vivo-onderzoek heeft aangetoond dat het ontwikkelde Cp NFRCS het stollingsproces op de aanbrengplaats activeert en versterkt. Dankzij de nanoporeuze structuur kan NFRCS het micro-omgeving moduleren en op cellulair niveau werken, wat resulteert in een betere wondgenezing in het excisiewondmodel.
Ongecontroleerde bloedingen tijdens gevechten, intraoperatieve en noodsituaties kunnen een ernstige bedreiging vormen voor het leven van de gewonde.¹ Deze omstandigheden leiden bovendien tot een algehele toename van de perifere vaatweerstand, met als gevolg hemorragische shock. Het nemen van de juiste maatregelen om bloedingen tijdens en na een operatie te beheersen, wordt als potentieel levensbedreigend beschouwd.^2,3 Beschadiging van grote bloedvaten leidt tot massaal bloedverlies, met een sterftecijfer van ≤ 50% in gevechtssituaties en 31% tijdens een operatie.¹ Massaal bloedverlies leidt tot een afname van het lichaamsvolume, waardoor de hartminuutvolume afneemt. Een toename van de totale perifere vaatweerstand en een progressieve aantasting van de microcirculatie leiden tot hypoxie in de levensondersteunende organen. Hemorragische shock kan optreden als de situatie aanhoudt zonder effectieve interventie.^1,4,5 Andere complicaties zijn onder meer de progressie van hypothermie en metabole acidose, evenals een stollingsstoornis die het stollingsproces belemmert. Ernstige hemorragische shock gaat gepaard met een hoger risico op overlijden.^6,7,8 Bij graad III (progressieve) shock is bloedtransfusie essentieel voor de overleving van de patiënt tijdens intraoperatieve en postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Om al deze levensbedreigende situaties te overwinnen, hebben we een nanoporeus vezelversterkt composietsteunweefsel (NFRCS) ontwikkeld dat gebruikmaakt van een minimale polymeerconcentratie (0,5%) door een combinatie van wateroplosbare hemostatische polymeren.
Door het gebruik van vezelversterking kunnen kosteneffectieve producten worden ontwikkeld. De willekeurig gerangschikte vezels lijken op de structuur van een libellenvleugel, in evenwicht gehouden door de horizontale en verticale strepen op de vleugels. De dwars- en lengteaders van de vleugel staan ​​in verbinding met het vleugelmembraan (Fig. 1). NFRCS bestaat uit versterkt Ct als een steigersysteem met een betere fysieke en mechanische sterkte (Figuur 1). Vanwege de betaalbaarheid en het vakmanschap geven chirurgen er de voorkeur aan om katoenen gaasjes (Ct) te gebruiken tijdens operaties en verbandwisselingen. Gezien de vele voordelen, waaronder het gehalte van meer dan 90% kristallijne cellulose (wat bijdraagt ​​aan de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als skeletsysteem van NFRCS9,10. Gezien de vele voordelen, waaronder het gehalte van meer dan 90% kristallijne cellulose (wat bijdraagt ​​aan de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als skeletsysteem van NFRCS9,10. Als u een percentage van > 90% bereikt, целлюлозы (участвует in повышении гемостатической активности), Ct использовали in качестве скелетной системы NFRCS9,10. Gezien de vele voordelen, waaronder het gehalte van >90% kristallijne cellulose (wat bijdraagt ​​aan een verhoogde hemostatische activiteit), werd Ct daarom gebruikt als het skeletsysteem van de NFRCS9,10.Ct Bekijk de resultaten van NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Gezien de vele voordelen, waaronder het feit dat Ct voor meer dan 90% uit kristallijne cellulose bestaat (wat de hemostatische activiteit bevordert), werd het daarom gebruikt als steunstructuur voor NFRCS9,10.Ct werd oppervlakkig gecoat (er werd een nanodikke filmvorming waargenomen) en verbonden met een hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC). HFFC werkt als een matrigel en houdt willekeurig geplaatste Ct bij elkaar. Het ontwikkelde ontwerp brengt spanning over binnen de gedispergeerde fase (versterkende vezels). Het is moeilijk om nanoporeuze structuren met een goede mechanische sterkte te verkrijgen met minimale polymeerconcentraties. Bovendien is het niet eenvoudig om verschillende mallen op maat te maken voor verschillende biomedische toepassingen.
De afbeelding toont een diagram van het NFRCS-ontwerp gebaseerd op de vleugelstructuur van een libel (A). Deze afbeelding toont een vergelijkende analogie van de vleugelstructuur van een libel (de kruisende en longitudinale nerven van de vleugel zijn met elkaar verbonden) en een dwarsdoorsnede-fotomicrograaf van Cp NFRCS (B). Schematische weergave van NFRCS.
NFRC's werden ontwikkeld met HFFC als continue fase om de bovengenoemde beperkingen aan te pakken. HFFC is samengesteld uit verschillende filmvormende hemostatische polymeren, waaronder chitosan (als het belangrijkste hemostatische polymeer) met methylcellulose (MC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC 50 cp) en polyvinylalcohol (PVA) (125 kDa) als ondersteunend polymeer dat trombusvorming bevordert. De toevoeging van polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) verbeterde het vochtabsorptievermogen van de NFRCS. Polyethyleenglycol 400 (PEG 400) werd toegevoegd om de polymerenverknoping in gebonden polymeermengsels te verbeteren. Drie verschillende hemostatische HFFC-samenstellingen (Cm HFFC, Ch HFFC en Cp HFFC), namelijk chitosan met MC (Cm), chitosan met HPMC (Ch) en chitosan met PVA (Cp), werden toegepast op Ct. Verschillende in vitro en in vivo karakteriseringsstudies hebben de hemostatische en wondhelende werking van NFRCS bevestigd. De composietmaterialen van NFRCS kunnen worden gebruikt om diverse soorten steigers op maat te maken die aan specifieke behoeften voldoen.
Bovendien kan NFRCS worden aangepast tot een verband of rol om het gehele verwonde gebied van de onderste ledematen en andere lichaamsdelen te bedekken. Speciaal voor gevechtsgerelateerde ledematenverwondingen kan het NFRCS-ontwerp worden aangepast tot een halve arm of een volledig been (aanvullende afbeelding S11). NFRCS kan met weefsellijm tot een polsband worden gemaakt, die kan worden gebruikt om bloedingen te stoppen bij ernstige, zelf toegebrachte polsverwondingen. Ons hoofddoel is om een ​​NFRCS te ontwikkelen met zo min mogelijk polymeer, dat beschikbaar is voor een grote groep mensen (onder de armoedegrens) en dat in een EHBO-kit kan worden opgenomen. Eenvoudig, efficiënt en economisch van ontwerp, komt NFRCS lokale gemeenschappen ten goede en kan het een wereldwijde impact hebben.
Chitosan (moleculair gewicht 80 kDa) en amarant werden gekocht bij Merck, India. Hydroxypropylmethylcellulose 50 Cp, polyethyleenglycol 400 en methylcellulose werden gekocht bij Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polyvinylalcohol (moleculair gewicht 125 kDa) (87-90% gehydrolyseerd) werd gekocht bij National Chemicals, Gujarat. Polyvinylpyrrolidine K30 werd gekocht bij Molychem, Mumbai. Steriele wattenstaafjes werden gekocht bij Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, met Milli Q-water (Direct-Q3 waterzuiveringssysteem, Merck, India) als drager.
NFRCS werd ontwikkeld met behulp van een lyofilisatiemethode11,12. Alle HFFC-samenstellingen (Tabel 1) werden bereid met behulp van een mechanische roerder. Bereid een 0,5% oplossing van chitosan met 1% azijnzuur in water door continu te roeren met een mechanische roerder bij 800 rpm. Het exacte gewicht van het geladen polymeer, zoals aangegeven in Tabel 1, werd aan de chitosanoplossing toegevoegd en geroerd totdat een heldere polymeeroplossing werd verkregen. PVP K30 en PEG 400 werden aan het resulterende mengsel toegevoegd in de hoeveelheden zoals aangegeven in Tabel 1, en het roeren werd voortgezet totdat een heldere, viskeuze polymeeroplossing werd verkregen. Het resulterende bad met polymeeroplossing werd gedurende 60 minuten gesoniceerd om ingesloten luchtbellen uit het polymeermengsel te verwijderen. Zoals weergegeven in Aanvullende Figuur S1(b), werd Ct gelijkmatig verdeeld in elk putje van een 6-wells plaat (mal) aangevuld met 5 ml HFFC.
De zeswellsplaat werd 60 minuten lang gesoniceerd om een ​​uniforme bevochtiging en verdeling van HFFC in het Ct-netwerk te verkrijgen. Vervolgens werd de zeswellsplaat 8-12 uur lang ingevroren bij -20 °C. De ingevroren platen werden 48 uur lang gelyofiliseerd om verschillende formuleringen van NFRCS te verkrijgen. Dezelfde procedure wordt gebruikt om verschillende vormen en structuren te produceren, zoals tampons of cilindrische tampons, of elke andere vorm voor verschillende toepassingen.
Nauwkeurig afgewogen chitosan (80 kDa) (3%) wordt opgelost in 1% azijnzuur met behulp van een magneetroerder. Aan de resulterende chitosanoplossing wordt 1% PEG 400 toegevoegd en gedurende 30 minuten geroerd. Giet de oplossing in een vierkante of rechthoekige container en vries deze gedurende 12 uur in bij -80 °C. De bevroren monsters worden gedurende 48 uur gevriesdroogd om poreus Cs13 te verkrijgen.
Het ontwikkelde NFRCS werd onderworpen aan experimenten met behulp van Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) om de chemische compatibiliteit van chitosan met andere polymeren te bevestigen14,15. De FTIR-spectra (spectraalbereik van 400 tot 4000 cm-1) van alle geteste monsters werden verkregen door 32 scans uit te voeren.
De bloedabsorptiesnelheid (BAR) voor alle formuleringen werd geëvalueerd met behulp van de methode beschreven door Chen et al. 16 met enkele kleine aanpassingen. De ontwikkelde NFRK's van alle samenstellingen werden 's nachts in een vacuümoven gedroogd bij 105 °C om resterend oplosmiddel te verwijderen. 30 mg NFRCS (initieel monstergewicht – W0) en 30 mg Ct (positieve controle) werden in aparte schaaltjes geplaatst die een premix van 3,8% natriumcitraat bevatten. Op vooraf bepaalde tijdsintervallen, namelijk 5, 10, 20, 30, 40 en 60 seconden, werden de NFRCS verwijderd en hun oppervlakken gereinigd van niet-geabsorbeerd bloed door de monsters 30 seconden op Ct te plaatsen. Het uiteindelijke gewicht van het door NFRCS 16 geabsorbeerde bloed werd op elk tijdstip beschouwd (W1). Bereken het BAR-percentage met behulp van de volgende formule:
De bloedstollingstijd (BCT) werd bepaald zoals beschreven door Wang et al. 17. De tijd die nodig is voor de stolling van volbloed (rattenbloed voorgemengd met 3,8% natriumcitraat) in aanwezigheid van NFRCS werd berekend als de BCT van het testmonster. De verschillende NFRCS-componenten (30 mg) werden in schroefdopflacons van 10 ml gedaan en geïncubeerd bij 37 °C. Bloed (0,5 ml) werd aan de flacon toegevoegd en 0,3 ml 0,2 M CaCl2 werd toegevoegd om de bloedstolling te activeren. Vervolgens werd de flacon elke 15 seconden (tot 180°) omgekeerd totdat een stevig stolsel was gevormd. De BCT van het monster werd geschat aan de hand van het aantal keren dat de flacons werden omgedraaid17,18. Op basis van de BCT werden twee optimale samenstellingen van NFRCS Cm, Ch en Cp geselecteerd voor verder karakteriseringsonderzoek.
De BCT van Ch NFRCS- en Cp NFRCS-samenstellingen werd bepaald met behulp van de methode beschreven door Li et al. 19. Plaats 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs (positieve controle) in afzonderlijke petrischalen (37 °C). Bloed met 3,8% natriumcitraat werd gemengd met 0,2 M CaCl2 in een volumeverhouding van 10:1 om het bloedstollingsproces te starten. 20 µl van het 0,2 M CaCl2-rattenbloedmengsel werd op het oppervlak van het monster aangebracht en in een lege petrischaal geplaatst. De controle bestond uit bloed dat in lege petrischalen zonder Ct werd gegoten. Met vaste tussenpozen van 0, 3 en 5 minuten werd de stolling gestopt door 10 ml gedemineraliseerd water aan het monster in de schaal toe te voegen zonder het stolsel te verstoren. Niet-gestolde erytrocyten ondergaan hemolyse in aanwezigheid van gedemineraliseerd water en geven hemoglobine vrij. De hemoglobineconcentratie op verschillende tijdstippen (HA(t)) werd gemeten bij 540 nm (λmax hemoglobine) met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. De absolute absorptie van hemoglobine (AH(0)) in 0 min van 20 µl bloed in 10 ml gedemineraliseerd water werd als referentiestandaard gebruikt. De relatieve hemoglobineopname (RHA) van gestold bloed werd berekend uit de verhouding HA(t)/HA(0) met behulp van dezelfde bloedbatch.
Met behulp van een textuuranalyzer (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, VS) werden de hechtende eigenschappen van NFRK aan beschadigd weefsel bepaald. Druk een cilindrische schaal met open bodem tegen de binnenkant van de varkenshuid (zonder de vetlaag). Monsters (Ch NFRCS en Cp NFRCS) werden via een canule in cilindrische mallen aangebracht om hechting aan de varkenshuid te creëren. Na een incubatie van 3 minuten bij kamertemperatuur (25 °C) werd de hechtsterkte van NFRCS gemeten met een constante snelheid van 0,5 mm/sec.
Het belangrijkste kenmerk van chirurgische sealants is het bevorderen van bloedstolling en tegelijkertijd het verminderen van bloedverlies. Verliesvrije coagulatie in NFRCS werd geëvalueerd met behulp van een eerder gepubliceerde methode met kleine aanpassingen 19. Maak een microcentrifugebuisje (2 ml) (binnendiameter 10 mm) met een gat van 8 × 5 mm² aan één zijde van het centrifugebuisje (dat een open wond voorstelt). NFRCS wordt gebruikt om de opening te sluiten en tape wordt gebruikt om de buitenranden af ​​te dichten. Voeg 20 µl 0,2 M CaCl₂ toe aan het microcentrifugebuisje met de 3,8% natriumcitraat-premix. Na 10 minuten werden de microcentrifugebuisjes uit de schalen verwijderd en werd de toename in massa van de schalen bepaald als gevolg van de bloeduitstroom uit de NFRK (n = 3). Het bloedverlies Ch NFRCS en Cp NFRCS werd vergeleken met Cs.
De natte integriteit van NFRCS werd bepaald op basis van de methode beschreven door Mishra en Chaudhary21 met enkele kleine aanpassingen. Plaats de NFRCS in een Erlenmeyerfles van 100 ml met 50 ml water en zwenk gedurende 60 seconden zonder dat er een bovenkant ontstaat. Visuele inspectie en prioritering van de monsters op basis van fysieke integriteit op basis van de verzameldatum.
De bindingssterkte van HFFC aan Ct werd onderzocht met behulp van eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen. De integriteit van de oppervlaktecoating werd beoordeeld door NFRK bloot te stellen aan akoestische golven (externe stimulus) in aanwezigheid van milliQ-water (Ct). De ontwikkelde NFRCS Ch NFRCS en Cp NFRCS werden in een bekerglas met water geplaatst en respectievelijk 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 en 30 minuten gesoniceerd. Na het drogen werd het procentuele verschil tussen het begin- en eindgewicht van de NFRCS gebruikt om het percentage materiaalverlies (HFFC) te berekenen. In vitro BCT ondersteunde verder de bindingssterkte of het verlies van oppervlaktematerialen. De efficiëntie van de binding van HFFC aan Ct zorgt voor bloedstolling en een elastische coating op het oppervlak van Ct22.
De homogeniteit van het ontwikkelde NFRCS werd bepaald door de BCT-test van monsters (30 mg) genomen van willekeurig geselecteerde algemene locaties van het NFRCS. Volg de eerder beschreven BCT-procedure om de conformiteit van het NFRCS te bepalen. De nabijheid van alle vijf monsters zorgt voor een uniforme oppervlaktebedekking en HFFC-afzetting in het Ct-gaas.
Het nominale bloedcontactoppervlak (NBCA) werd bepaald zoals eerder beschreven, met enkele aanpassingen. Het bloed werd gestold door 20 µl bloed tussen de twee oppervlakken van Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs te klemmen. Na 1 uur werden de twee delen van de stent gescheiden en werd het oppervlak van het stolsel handmatig gemeten. De gemiddelde waarde van drie herhalingen werd beschouwd als NBCA NFRCS19.
Dynamische dampabsorptie (DVS)-analyse werd gebruikt om de effectiviteit van NFRCS te evalueren bij het absorberen van water uit de externe omgeving of van de letsellocatie die coagulatie initieert. De DVS evalueert of registreert de dampopname en het dampverlies in een monster gravimetrisch met behulp van een ultragevoelige balans met een massaresolutie van ±0,1 µg. Een partiële dampdruk (relatieve vochtigheid) wordt gegenereerd door een elektronische massastroomregelaar rond het monster door verzadigde en droge draaggassen te mengen. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee werden de monsters, op basis van het percentage vochtopname, in vier categorieën ingedeeld (0–0,012% w/w – niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15% matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee werden de monsters, op basis van het percentage vochtopname, in vier categorieën ingedeeld (0–0,012% w/w – niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15% matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.Volgens de aanbevelingen van de Europese Farmacopee werden de monsters, afhankelijk van het percentage vochtabsorptie, in vier categorieën verdeeld (0–0,012% w/w – niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15%).% aandeel en > 15% aandeel)23. % matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.4 类（0-0,012% w/w- 0,2-2% w/w 2-15% > 15% 23.根据 欧洲 药典 指南, 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 (（0-0,012%) W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 、 2-15% 适度 吸湿,> 15 %非常吸湿）23。Volgens de aanbevelingen van de Europese Farmacopee worden monsters ingedeeld in 4 klassen, afhankelijk van het percentage vocht dat door het monster wordt geabsorbeerd (0-0,012 gewichtsprocent – ​​niet-hygroscopisch, 0,2-2 gewichtsprocent – ​​licht hygroscopisch, 2-15 gewichtsprocent).% aandeel van het vermogen, > 15 % percentage van het vermogen) 23. % matig hygroscopisch, > 15% zeer hygroscopisch) 23.De hygroscopische efficiëntie van NFCS X NFCS en TsN NFCS werd bepaald met een DVS TA TGA Q5000 SA-analysator. Tijdens dit proces werden de looptijd, de relatieve vochtigheid (RV) en het realtime monstergewicht bij 25 °C24 gemeten. Het vochtgehalte wordt berekend door middel van een nauwkeurige NFCS-massa-analyse met behulp van de volgende vergelijking:
MC staat voor NFRCS-vochtigheid. m1 is het droge gewicht van NSAID's. m2 is de realtime NFRCS-massa bij een gegeven relatieve vochtigheid.
Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C waren geleegd (< 7 × 10–3 Torr). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C waren geleegd (< 7 × 10–3 Torr). Zorg ervoor dat u een goed beeld krijgt van uw bedrijf temperatuurbereik 25 °С in течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C waren geleegd (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Zorg ervoor dat u een goed product kunt vinden жидким азотом после опорожнения образцов in течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van stikstofadsorptie-experimenten met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C (< 7 x 10⁻³ torr) waren geleegd.Het totale oppervlak, het porievolume en de NFRCS-poriegrootte werden bepaald met een Quantachrome van NOVA 1000e, Oostenrijk, met behulp van RS 232-software.
Bereid 5% RBC's (fysiologische zoutoplossing als verdunningsmiddel) uit volbloed. Breng vervolgens een aliquot HFFC (0,25 ml) over naar een 96-wells plaat en voeg 0,1 ml 5% RBC-massa toe. Incubeer het mengsel gedurende 40 minuten bij 37°C. Een mengsel van rode bloedcellen en serum werd gebruikt als positieve controle, en een mengsel van fysiologische zoutoplossing en rode bloedcellen als negatieve controle. Hemagglutinatie werd bepaald volgens de Stajitzky-schaal. De voorgestelde schaal is als volgt: + + + + dichte korrelige aggregaten; + + + gladde bodemplaten met gebogen randen; + + gladde bodemplaten met gescheurde randen; + smalle rode ringen rond de randen van de gladde platen; – (negatief) discrete rode knop 12 in het midden van de onderste put.
De hemocompatibiliteit van NFRCS werd onderzocht volgens de methode van de Internationale Organisatie voor Standaardisatie (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. De gravimetrische methode beschreven door Singh et al. werd gebruikt. Kleine aanpassingen werden gedaan om trombusvorming in aanwezigheid van of op het oppervlak van NFRCS te beoordelen. 500 mg Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS werden gedurende 24 uur bij 37°C geïncubeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na 24 uur werd de PBS verwijderd en werd NFRCS behandeld met 2 ml bloed dat 3,8% natriumcitraat bevatte. Aan het oppervlak van de NFRCS werd 0,04 ml 0,1 M CaCl2 toegevoegd aan de geïncubeerde monsters. Na 45 minuten werd 5 ml gedestilleerd water toegevoegd om de stolling te stoppen. Gestold bloed op het oppervlak van NFRCS werd behandeld met een 36-38% formaldehydeoplossing. De met formaldehyde gefixeerde stolsels werden gedroogd en gewogen. Het percentage trombose werd geschat door het gewicht te berekenen van het glas zonder bloed en het monster (negatieve controle) en het glas met bloed (positieve controle).
Ter eerste bevestiging werden de monsters onder een optische microscoop bekeken om inzicht te krijgen in het vermogen van de HFFC-oppervlaktecoating, de onderling verbonden Ct-structuren en het Ct-netwerk om poriën te vormen. Dunne secties van Ch en Cp uit NFRCS werden met een scalpelmesje uitgesneden. De resulterende sectie werd op een objectglas geplaatst, afgedekt met een dekglaasje en de randen werden met lijm vastgezet. De geprepareerde preparaten werden onder een optische microscoop bekeken en er werden foto's gemaakt bij verschillende vergrotingen.
Polymere afzetting in Ct-netwerken werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie op basis van de methode beschreven door Rice et al.29. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth), en NFRCS (Ch & Cp) werden bereid volgens de eerder beschreven methode. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth), en NFRCS (Ch & Cp) werden bereid volgens de eerder beschreven methode.De voor de formulering gebruikte HFFC-samenstelling werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth) en NFRCS (Ch en Cp) werd verkregen volgens de eerder beschreven methode.NFRCS（Ch & Cp）。NFRCS（Ch & Cp）。De in de formulering gebruikte HFFC-samenstelling werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (Amaranth) en ontving NFRCS (Ch en Cp), zoals eerder vermeld.Dunne secties van NFRK werden uit de verkregen monsters gesneden, op objectglaasjes geplaatst en afgedekt met dekglaasjes. De geprepareerde preparaten werden onder een fluorescentiemicroscoop met een groen filter (310-380 nm) bekeken. Er werden beelden gemaakt met een vergroting van 4x om de Ct-relaties en de overmatige polymeerafzetting in het Ct-netwerk te begrijpen.
De oppervlaktetopografie van NFRCS Ch en Cp werd bepaald met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) met een ultrascherpe TESP-cantilever in tapping-modus: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. De oppervlakteruwheid werd bepaald door middel van de wortelgemiddelde kwadraatwaarde (RMS) met behulp van software (Scanning Probe Image Processor). Verschillende NFRCS-locaties werden weergegeven in 3D-afbeeldingen om de oppervlakteuniformiteit te controleren. De standaardafwijking van de score voor een bepaald gebied wordt gedefinieerd als de oppervlakteruwheid. De RMS-formule werd gebruikt om de oppervlakteruwheid van NFRCS31 te kwantificeren.
FESEM-onderzoeken werden uitgevoerd met behulp van een FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, om de oppervlaktemorfologie van Ch NFRCS en Cp NFRCS te begrijpen, die een betere BCT vertoonden dan Cm NFRCS. Het FESEM-onderzoek werd uitgevoerd volgens de methode beschreven door Zhao et al. 32 met kleine aanpassingen. 20 tot 30 mg NFRCS, Ch NFRCS en Cp NFRCS werden voorgemengd met 20 µl 3,8% natriumcitraat, voorgemengd met rattenbloed. 20 µl 0,2 M CaCl2 werd aan de met bloed behandelde monsters toegevoegd om de coagulatie te initiëren en de monsters werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Bovendien werden overtollige erytrocyten van het NFRCS-oppervlak verwijderd door te spoelen met fysiologische zoutoplossing.
Vervolgens werden de monsters behandeld met 0,1% glutaraldehyde en daarna gedroogd in een heteluchtoven bij 37 °C om vocht te verwijderen. De gedroogde monsters werden gecoat en geanalyseerd 32. Andere beelden die tijdens de analyse werden verkregen, waren stolselvorming op het oppervlak van individuele katoenvezels, polymeerafzetting tussen Ct, erytrocytmorfologie (vorm), stolselintegriteit en erytrocytmorfologie in aanwezigheid van NFRCS. Onbehandelde NFRCS-gebieden en met Ch en Cp behandelde NFRCS-gebieden die met bloed waren geïncubeerd, werden gescand op elementaire ionen (natrium, kalium, stikstof, calcium, magnesium, zink, koper en selenium)33. Vergelijk de percentages elementaire ionen tussen behandelde en onbehandelde monsters om inzicht te krijgen in de accumulatie van elementaire ionen tijdens stolselvorming en de homogeniteit van het stolsel.
De dikte van de Cp HFFC-oppervlaktecoating op het Ct-oppervlak werd bepaald met behulp van FESEM. Dwarsdoorsneden van Cp NFRCS werden uit het raamwerk gesneden en gesputterd. De resulterende gesputterde coatingmonsters werden geobserveerd met FESEM en de dikte van de oppervlaktecoating werd gemeten 34, 35, 36.
Röntgenmicro-CT biedt niet-destructieve 3D-beeldvorming met hoge resolutie en maakt het mogelijk om de interne structuur van NFRK te bestuderen. Micro-CT gebruikt een röntgenbundel die door het monster gaat om de lokale lineaire verzwakkingscoëfficiënt van de röntgenstralen in het monster te registreren, wat helpt bij het verkrijgen van morfologische informatie. De interne locatie van Ct in Cp NFRCS en met bloed behandelde Cp NFRCS werd onderzocht met micro-CT om de absorptie-efficiëntie en bloedstolling in aanwezigheid van NFRCS te begrijpen37,38,39. De 3D-structuren van met bloed behandelde en onbehandelde Cp NFRCS-monsters werden gereconstrueerd met behulp van micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Duitsland). Met behulp van VG STUDIO-MAX software versie 2.2 werden verschillende röntgenfoto's vanuit verschillende hoeken (idealiter 360° dekking) gemaakt om 3D-beelden van NFRCS te ontwikkelen. De verzamelde projectiegegevens werden gereconstrueerd tot 3D-volumetrische beelden met behulp van de bijbehorende eenvoudige 3D ScanIP Academic software.
Om de verdeling van het stolsel te begrijpen, werden bovendien 20 µl voorgemengd gecitrateerd bloed en 20 µl 0,2 M CaCl2 aan de NFRCS toegevoegd om bloedstolling te initiëren. De voorbereide monsters werden vervolgens uitgehard. Het NFRK-oppervlak werd behandeld met 0,5% glutaraldehyde en gedroogd in een heteluchtoven bij 30-40 °C gedurende 30 minuten. Het op de NFRCS gevormde bloedstolsel werd gescand, gereconstrueerd en een 3D-afbeelding van het bloedstolsel werd gevisualiseerd.
Antibacteriële testen werden uitgevoerd op Cp NFRCS (het best te vergelijken met Ch NFRCS) met behulp van de eerder beschreven methode met kleine aanpassingen. De antibacteriële activiteit van Cp NFRCS en Cp HFFC werd bepaald met behulp van drie verschillende testmicro-organismen [S. aureus (grampositieve bacterie), E. coli (gramnegatieve bacterie) en witte Candida (C. albicans)] die groeiden op agar in petrischalen in een incubator. Ent 50 ml van de verdunde bacteriële kweeksuspensie gelijkmatig op het agarmedium met een concentratie van 10⁵-10⁶ CFU ml⁻¹. Giet het medium in een petrischaal en laat het stollen. Maak putjes in het oppervlak van de agarplaat om te vullen met HFFC (3 putjes voor HFFC en 1 voor de negatieve controle). Voeg 200 µl HFFC toe aan 3 putjes en 200 µl pH 7,4 PBS aan het 4e putje. Plaats aan de andere kant van de petrischaal een 12 mm Cp NFRCS-schijfje op de gestolde agar en bevochtig dit met PBS (pH 7,4). Ciprofloxacine-, ampicilline- en fluconazoltabletten worden beschouwd als referentiestandaarden voor Staphylococcus aureus, Escherichia coli en Candida albicans. Meet handmatig de remzone en maak een digitale foto van de remzone.
Na institutionele ethische goedkeuring werd het onderzoek uitgevoerd aan het Kasturba Medical College of Education and Research in Manipal, Karnataka, in Zuid-India. Het in vitro TEG-experimentprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). De proefpersonen werden gerekruteerd uit vrijwillige bloeddonoren (18 tot 55 jaar) van de bloedbank van het ziekenhuis. Daarnaast werd van de vrijwilligers een formulier voor geïnformeerde toestemming verkregen voor het afnemen van bloedmonsters. Native TEG (N-TEG) ​​werd gebruikt om het effect van de Cp HFFC-formulering op volbloed, voorgemengd met natriumcitraat, te bestuderen. N-TEG staat algemeen bekend om zijn rol bij reanimatie aan het bed van de patiënt, wat echter problemen oplevert voor artsen vanwege de potentiële klinisch significante vertraging in de resultaten (routinematige stollingsonderzoeken). N-TEG-analyse werd uitgevoerd met volbloed. Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen en een gedetailleerde medische geschiedenis vastgelegd. De studie sloot deelnemers met hemostatische of trombotische complicaties, zoals zwangerschap/postpartum of leverziekte, uit. Ook proefpersonen die medicijnen gebruikten die de stollingscascade beïnvloeden, werden uitgesloten. Bij alle deelnemers werden standaard laboratoriumtests uitgevoerd (hemoglobine, protrombinetijd, geactiveerde tromboplastine en trombocytengetal) volgens standaardprocedures. N-TEG bepaalt de visco-elasticiteit van bloedstolsels, de initiële stolselstructuur, de interactie tussen deeltjes, de stolselversterking en de stolsellysis. De N-TEG-analyse levert grafische en numerieke gegevens over de gezamenlijke effecten van verschillende cellulaire elementen en plasma. De N-TEG-analyse werd uitgevoerd op twee verschillende volumes Cp HFFC (10 µl en 50 µl). Hiervoor werd 1 ml volbloed met citroenzuur toegevoegd aan 10 µl Cp HFFC. Voeg 1 ml (Cp HFFC + gecitrateerd bloed), 340 µl gemengd bloed toe aan een TEG-schaaltje met 20 µl 0,2 M CaCl2. Vervolgens werden de TEG-schaaltjes in de TEG® 5000, US geplaatst om R, K, alfa-hoek, MA, G, CI, TPI, EPL en LY te meten in 30% van de bloedmonsters in aanwezigheid van Cp HFFC41.
Het in vivo-studieprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutionele Dierethische Commissie (IAEC) van de Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dierexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Commissie voor de Controle en Supervisie van Dierproeven (CPCSEA). Alle in vivo NFRCS-studies (2 × 2 cm²) werden uitgevoerd op vrouwelijke Wistar-ratten (gewicht 200 tot 250 g). Alle dieren werden geacclimatiseerd bij een temperatuur van 24-26 °C en hadden onbeperkt toegang tot standaardvoer en water. Alle dieren werden willekeurig verdeeld over verschillende groepen van elk drie dieren. Alle studies werden uitgevoerd in overeenstemming met Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Voorafgaand aan het onderzoek werden de dieren verdoofd door middel van intraperitoneale (ip) toediening van een mengsel van 20-50 mg ketamine (per 1 kg lichaamsgewicht) en 2-10 mg xylazine (per 1 kg lichaamsgewicht). Na afloop van het onderzoek werd het bloedverlies berekend door het verschil tussen het begin- en eindgewicht van de monsters te bepalen. De gemiddelde waarde van de drie metingen werd gebruikt als het bloedverlies van het monster.
Het model met amputatie van de rattenstaart werd gebruikt om het potentieel van NFRCS te onderzoeken om bloedingen te moduleren bij trauma, gevechten of verkeersongevallen (letselmodel). 50% van de staart werd afgesneden met een scalpel en gedurende 15 seconden in de lucht gehouden om normale bloeding te garanderen. Daarnaast werden testmonsters op de staart van een rat aangebracht door druk uit te oefenen (Ct, Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS). Bloeding en PCT werden gerapporteerd voor testmonsters (n = 3)17,45.
De effectiviteit van de NFRCS-drukregeling in gevechtssituaties werd onderzocht op een model van de arteria femoralis superficialis. De arteria femoralis werd blootgelegd, aangeprikt met een 24G-trocar en binnen 15 seconden ontbloed. Nadat ongecontroleerde bloeding werd waargenomen, werd het testmonster op de punctieplaats geplaatst en onder druk gezet. Direct na het aanbrengen van het testmonster werd de stollingstijd geregistreerd en de hemostatische werkzaamheid gedurende de volgende 5 minuten geobserveerd. Dezelfde procedure werd herhaald met Cs en Ct46.
Dowling et al. 47 stelden een leverbeschadigingsmodel voor om het hemostatische potentieel van hemostatische materialen te beoordelen in de context van intraoperatieve bloedingen. De BCT werd geregistreerd voor Ct-monsters (negatieve controle), Cs-framework (positieve controle), Ch NFRCS-monsters en Cp NFRCS-monsters. De vena cava suprahepatica van de rat werd blootgelegd door middel van een mediane laparotomie. Daarna werd het distale deel van de linker leverkwab met een schaar weggeknipt. Er werd een incisie in de lever gemaakt met een scalpel en deze werd enkele seconden laten bloeden. Nauwkeurig afgewogen Ch NFRCS- en Cp NFRCS-testmonsters werden op het beschadigde oppervlak geplaatst zonder positieve druk uit te oefenen en de BCT werd geregistreerd. De controlegroep (Ct) oefende vervolgens druk uit, gevolgd door Cs 30 s47 zonder de verwonding te verbreken.
In vivo wondgenezingsassays werden uitgevoerd met behulp van een excisiewondmodel om de wondgenezende eigenschappen van de ontwikkelde polymeergebaseerde NFRCS's te evalueren. Modellen van excisiewonden werden geselecteerd en uitgevoerd volgens eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen19,32,48. Alle dieren werden verdoofd zoals eerder beschreven. Met een biopunctie-instrument (12 mm) werd een cirkelvormige, diepe incisie in de huid van de rug gemaakt. De voorbereide wondplekken werden bedekt met Cs (positieve controle), Ct (omdat wattenschijfjes de genezing kunnen belemmeren), Ch NFRCS en Cp NFRCS (experimentele groep) en een negatieve controle zonder behandeling. Dagelijks werd het wondoppervlak van alle ratten gemeten. Met een digitale camera werd een foto van het wondoppervlak gemaakt en een nieuw verband aangebracht. Het percentage wondsluiting werd berekend met de volgende formule:
Op basis van het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek werd de rattenhuid van de beste groep (Cp NFRCS en de controlegroep) verwijderd en onderzocht met behulp van H&E-kleuring en Masson-trichroomkleuring. Op basis van het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek werd de rattenhuid van de beste groep (Cp NFRCS en de controlegroep) verwijderd en onderzocht met behulp van H&E-kleuring en Masson-trichroomkleuring.Op basis van het percentage wondsluiting op de 12e dag van het onderzoek werd de huid van de ratten uit de beste groep (Cp NFRCS en de controlegroep) verwijderd en onderzocht door kleuring met hematoxyline-eosine en Masson's trichroomkleuring.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E-染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Ratten in de beste groep (Cp NFRCS en controlegroep) werden geëxcideerd voor hematoxyline-eosinekleuring en Masson-trichroomkleuring op basis van het percentage wondsluiting op dag 12 van het onderzoek.De toegepaste kleuringsprocedure werd uitgevoerd volgens eerder beschreven methoden49,50. Kort gezegd werden de monsters na fixatie in 10% formaline gedehydrateerd met behulp van een reeks alcoholen met oplopende concentraties. Met een microtoom werden dunne coupes (5 µm dik) van het uitgesneden weefsel verkregen. Dunne seriële coupes van controles en Cp NFRCS werden behandeld met hematoxyline en eosine om histopathologische veranderingen te bestuderen. Masson's trichroomkleuring werd gebruikt om de vorming van collageenvezels aan te tonen. De verkregen resultaten werden blind beoordeeld door pathologen.
De stabiliteit van Cp NFRCS-monsters werd gedurende 12 maanden bij kamertemperatuur (25 °C ± 2 °C/60% RH ± 5%) onderzocht51. Cp NFRCS (oppervlakteverkleuring en microbiële groei) werd visueel geïnspecteerd en getest op vouwslijtvastheid en BCT volgens de hierboven beschreven methoden in het gedeelte Materialen en Methoden.
De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Cp NFRCS werden onderzocht door Cp NFRCS te bereiden met een afmeting van 15×15 cm2. Daarnaast werden monsters van 30 mg (n = 5) uit verschillende Cp NFRCS-fracties gesneden en werd de BCT van de onderzochte monsters geëvalueerd zoals eerder beschreven in de methodesectie.
We hebben geprobeerd verschillende vormen en structuren te ontwikkelen met behulp van Cp NFRCS-samenstellingen voor diverse biomedische toepassingen. Dergelijke vormen of configuraties omvatten conische wattenstaafjes voor neusbloedingen en tandheelkundige ingrepen, en cilindrische wattenstaafjes voor vaginaal bloedverlies.
Alle datasets worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en werden geanalyseerd met behulp van ANOVA met Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, VS), gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Bonferroni (*p<0,05).
Alle procedures die in de studies met menselijke proefpersonen werden uitgevoerd, voldeden aan de normen van het Instituut en de Nationale Onderzoeksraad, evenals aan de Verklaring van Helsinki van 1964 en de daaropvolgende wijzigingen, of vergelijkbare ethische normen. Alle deelnemers werden geïnformeerd over de kenmerken van de studie en het vrijwillige karakter ervan. De gegevens van de deelnemers blijven vertrouwelijk zodra ze zijn verzameld. Het in vitro TEG-experimentprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Vrijwilligers hebben een informed consent-formulier ondertekend voor het afnemen van bloedmonsters.
Alle procedures die in dierstudies werden uitgevoerd, voldeden aan de richtlijnen van de Kastuba Faculteit Geneeskunde, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dierexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle auteurs volgen de ARRIVE-richtlijnen.
De FTIR-spectra van alle NFRCS werden geanalyseerd en vergeleken met het chitosanspectrum weergegeven in figuur 2A. Karakteristieke spectrale pieken van chitosan (geregistreerd) bij 3437 cm⁻¹ (OH- en NH-rek, overlapping), 2945 en 2897 cm⁻¹ (CH-rek), 1660 cm⁻¹ (NH₂-rek), 1589 cm⁻¹ (N–H-buiging), 1157 cm⁻¹ (brugrek O-), 1067 cm⁻¹ (rek C–O, secundaire hydroxyl), 993 cm⁻¹ (rek CO, Bo-OH) 52.53.54. Aanvullende tabel S1 toont de FTIR-absorptiespectrumwaarden van NFRCS voor chitosan (reporter), zuiver chitosan, Cm, Ch en Cp. De FTIR-spectra van alle NFRCS (Cm, Ch en Cp) vertoonden dezelfde karakteristieke absorptiebanden als zuiver chitosan, zonder significante veranderingen (Fig. 2A). De FTIR-resultaten bevestigden de afwezigheid van chemische of fysische interacties tussen de polymeren die gebruikt zijn voor de ontwikkeling van de NFRCS, wat aangeeft dat de gebruikte polymeren inert zijn.
In vitro karakterisering van Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs. (A) Toont de gecombineerde FTIR-spectra van de samenstellingen van chitosan en Cm NFRCS, Ch NFRCS en Cp NFRCS onder compressie. (B) a) Opnamesnelheid van NFRCS Cm, Ch, Cp en Cg in volbloed (n = 3); De Ct-monsters vertoonden een hogere BAR omdat het wattenstaafje een hogere absorptie-efficiëntie heeft; b) Bloed na bloedabsorptie. Illustratie van het geabsorbeerde monster. Grafische weergave van de BCT van testmonster C (Cp NFRCS had de beste BCT (15 s, n = 3)). De gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken representeren de SD, ***p < 0,0001. De gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken representeren de SD, ***p < 0,0001. In de C, D, E en G-modus is het ± стандартное отклонение, een планки погрешностей Als de waarde is gewijzigd, ***p <0,0001. De gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de foutbalken geven de standaarddeviatie weer, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 In C, D, E en G zijn de instellingen voor ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. De gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking, foutbalken representeren de standaardafwijking, ***p<0,0001.