Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Ongecontroleerde bloedingen zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken. Het bereiken van snelle hemostase waarborgt de overleving van het slachtoffer als eerste hulp tijdens gevechten, verkeersongevallen en operaties ter voorkoming van sterfgevallen. Nanoporeuze vezelversterkte composiet scaffolds (NFRCS), afgeleid van een eenvoudige hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC), kunnen als continue fase hemostase activeren en verbeteren. De ontwikkeling van de NFRCS is gebaseerd op het ontwerp van de vleugel van de libel. De vleugelstructuur van de libel bestaat uit dwars- en langsvleugels, en de vleugelmembranen zijn met elkaar verbonden om de integriteit van de microstructuur te behouden. HFFC bedekt het oppervlak van de vezel gelijkmatig met een film van nanometerdikte en verbindt de willekeurig verdeelde katoendikte (Ct) (gedispergeerde fase) om een ​​nanoporeuze structuur te vormen. De combinatie van continue en gedispergeerde fasen verlaagt de kosten van het product met een factor tien in vergelijking met commercieel verkrijgbare producten. Gemodificeerde NFRCS (tampons of polsbandjes) kunnen in diverse biomedische toepassingen worden gebruikt. In-vivo-onderzoeken hebben aangetoond dat de ontwikkelde Cp NFRCS het stollingsproces op de plaats van toediening triggert en verbetert. Dankzij de nanoporeuze structuur kan NFRCS de micro-omgeving moduleren en op cellulair niveau werken, wat resulteert in een betere wondgenezing in het excisiewondmodel.
Ongecontroleerde bloedingen tijdens gevechten, intraoperatieve situaties en noodsituaties kunnen een ernstige bedreiging vormen voor het leven van de gewonden1. Deze omstandigheden leiden verder tot een algehele toename van de perifere vaatweerstand, wat leidt tot een hemorragische shock. Passende maatregelen om bloedingen tijdens en na de operatie te beheersen, worden als potentieel levensbedreigend beschouwd2,3. Schade aan grote bloedvaten leidt tot massaal bloedverlies, wat resulteert in een sterftecijfer van ≤ 50% in gevechten en 31% tijdens operaties1. Massaal bloedverlies leidt tot een afname van het lichaamsvolume, wat het hartminuutvolume verlaagt. Een toename van de totale perifere vaatweerstand en een progressieve verslechtering van de microcirculatie leiden tot hypoxie in de levensondersteunende organen. Een hemorragische shock kan optreden als de aandoening aanhoudt zonder effectieve interventie1,4,5. Andere complicaties zijn onder andere de progressie van hypothermie en metabole acidose, evenals een stollingsstoornis die het stollingsproces belemmert. Ernstige hemorragische shock gaat gepaard met een hoger risico op overlijden6,7,8. Bij graad III (progressieve) shock is bloedtransfusie essentieel voor de overleving van de patiënt tijdens de intra- en postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Om alle bovengenoemde levensbedreigende situaties te overwinnen, hebben we een nanoporeuze, met vezels versterkte composiet scaffold (NFRCS) ontwikkeld die gebruikmaakt van een minimale polymeerconcentratie (0,5%) en een combinatie van wateroplosbare hemostatische polymeren.
Met behulp van vezelversterking kunnen kosteneffectieve producten worden ontwikkeld. De willekeurig geplaatste vezels lijken op de structuur van een libelvleugel, in evenwicht gehouden door de horizontale en verticale strepen op de vleugels. De dwars- en lengteaders van de vleugel staan ​​in verbinding met het vleugelmembraan (Fig. 1). NFRCS bestaat uit versterkt Ct als een steigersysteem met een betere fysieke en mechanische sterkte (Fig. 1). Vanwege de betaalbaarheid en het vakmanschap geven chirurgen de voorkeur aan het gebruik van katoenen draad (Ct) tijdens operaties en verbanden. Gezien de vele voordelen, waaronder > 90% kristallijne cellulose (draagt ​​bij aan de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct gebruikt als skeletsysteem van NFRCS9,10. Gezien de vele voordelen, waaronder > 90% kristallijne cellulose (draagt ​​bij aan de verbetering van de hemostatische activiteit), werd Ct gebruikt als skeletsysteem van NFRCS9,10. Als u een percentage van > 90% bereikt, целлюлозы (участвует in повышении гемостатической активности), Ct использовали in качестве скелетной системы NFRCS9,10. Gezien de vele voordelen, waaronder >90% kristallijne cellulose (betrokken bij verhoogde hemostatische activiteit), werd Ct gebruikt als het NFRCS-skeletsysteem9,10.Ct Bekijk de resultaten van NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Gezien de vele voordelen, waaronder meer dan 90% kristallijne cellulose (helpt de hemostatische activiteit te verbeteren), werd Ct gebruikt als raamwerk voor NFRCS9,10.Ct was oppervlakkig gecoat (er werd nanodikke filmvorming waargenomen) en verbonden met een hemostatische filmvormende samenstelling (HFFC). HFFC fungeert als een matrigel en houdt willekeurig geplaatste Ct bij elkaar. Het ontwikkelde ontwerp brengt spanning over in de gedispergeerde fase (versterkende vezels). Het is moeilijk om nanoporeuze structuren met een goede mechanische sterkte te verkrijgen met minimale polymeerconcentraties. Bovendien is het niet eenvoudig om verschillende mallen aan te passen voor verschillende biomedische toepassingen.
De afbeelding toont een diagram van het NFRCS-ontwerp gebaseerd op de vleugelstructuur van een libel (A). Deze afbeelding toont een vergelijkende analogie van de vleugelstructuur van een libel (de kruisende en longitudinale aderen van de vleugel zijn met elkaar verbonden) en een dwarsdoorsnedefotomicrofoto van Cp NFRCS (B). Schematische weergave van NFRCS.
NFRC's werden ontwikkeld met HFFC als continue fase om de bovenstaande beperkingen aan te pakken. HFFC is samengesteld uit verschillende filmvormende hemostatische polymeren, waaronder chitosan (als het belangrijkste hemostatische polymeer) met methylcellulose (MC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC 50 cp) en polyvinylalcohol (PVA) (125 kDa) als dragerpolymeer dat trombusvorming bevordert. De toevoeging van polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) verbeterde het vochtabsorptievermogen van de NFRCS. Polyethyleenglycol 400 (PEG 400) werd toegevoegd om de polymeercrosslinking in gebonden polymeerblends te verbeteren. Drie verschillende HFFC-hemostatische samenstellingen (Cm HFFC, Ch HFFC en Cp HFFC), namelijk chitosan met MC (Cm), chitosan met HPMC (Ch) en chitosan met PVA (Cp), werden aangebracht op Ct. Diverse in-vitro- en in-vivo-karakteriseringsstudies hebben de hemostatische en wondhelende werking van NFRCS bevestigd. De composietmaterialen van NFRCS kunnen worden gebruikt om diverse soorten scaffolding aan te passen aan specifieke behoeften.
Bovendien kan NFRCS worden aangepast als een verband of rol om het volledige letselgebied van de onderste ledematen en andere lichaamsdelen te bedekken. Specifiek voor verwondingen aan de ledematen in gevechten kan het ontworpen NFRCS-ontwerp worden aangepast naar een halve arm of een heel been (aanvullende afbeelding S11). De NFRCS kan met weefsellijm worden verwerkt tot een polsbandje, dat kan worden gebruikt om bloedingen te stelpen bij ernstige suïcidale polsblessures. Ons hoofddoel is om een ​​NFRCS te ontwikkelen met zo min mogelijk polymeer, dat kan worden toegediend aan een grote bevolkingsgroep (onder de armoedegrens) en dat in een EHBO-doos kan worden geplaatst. NFRCS is eenvoudig, efficiënt en economisch van ontwerp, biedt voordelen voor lokale gemeenschappen en kan een wereldwijde impact hebben.
Chitosan (moleculair gewicht 80 kDa) en amarant werden gekocht bij Merck, India. Hydroxypropylmethylcellulose 50 Cp, polyethyleenglycol 400 en methylcellulose werden gekocht bij Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polyvinylalcohol (moleculair gewicht 125 kDa) (87-90% gehydrolyseerd) werd gekocht bij National Chemicals, Gujarat. Polyvinylpyrrolidine K30 werd gekocht bij Molychem, Mumbai; steriele wattenstaafjes werden gekocht bij Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, met Milli Q water (Direct-Q3 waterzuiveringssysteem, Merck, India) als drager.
NFRCS werd ontwikkeld met behulp van een lyofilisatiemethode11,12. Alle HFFC-composities (tabel 1) werden bereid met behulp van een mechanische roerder. Bereid een 0,5% chitosanoplossing met 1% azijnzuur in water door continu te roeren met 800 tpm op een mechanische roerder. Het exacte gewicht van het beladen polymeer zoals aangegeven in tabel 1 werd toegevoegd aan de chitosanoplossing en geroerd tot een heldere polymeeroplossing was verkregen. PVP K30 en PEG 400 werden aan het resulterende mengsel toegevoegd in de hoeveelheden aangegeven in tabel 1, en het roeren werd voortgezet tot een heldere viskeuze polymeeroplossing was verkregen. Het resulterende bad met polymeeroplossing werd 60 minuten gesoniceerd om ingesloten luchtbellen uit het polymeermengsel te verwijderen. Zoals weergegeven in aanvullende figuur S1(b), was Ct gelijkmatig verdeeld in elke well van een 6-wellsplaat (mal) aangevuld met 5 ml HFFC.
De plaat met zes wells werd 60 minuten gesoniceerd om een ​​gelijkmatige bevochtiging en verdeling van HFFC in het Ct-netwerk te bereiken. Vervolgens werd de plaat met zes wells 8-12 uur ingevroren bij -20 °C. De vriesplaten werden 48 uur gelyofiliseerd om verschillende NFRCS-formuleringen te verkrijgen. Dezelfde procedure wordt gebruikt om verschillende vormen en structuren te produceren, zoals tampons of cilindrische tampons, of elke andere vorm voor verschillende toepassingen.
Nauwkeurig gewogen chitosan (80 kDa) (3%) wordt opgelost in 1% azijnzuur met behulp van een magneetroerder. Aan de resulterende chitosanoplossing werd 1% PEG 400 toegevoegd en 30 minuten geroerd. Giet de resulterende oplossing in een vierkante of rechthoekige container en vries deze 12 uur in bij -80 °C. Bevroren monsters werden 48 uur gelyofiliseerd om poreus Cs13 te verkrijgen.
De ontwikkelde NFRCS werd onderworpen aan experimenten met Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) om de chemische compatibiliteit van chitosan met andere polymeren te bevestigen14,15. De FTIR-spectra (breedte van het spectraalbereik van 400 tot 4000 cm-1) van alle geteste monsters werden verkregen door 32 scans uit te voeren.
De bloedabsorptiesnelheid (BAR) voor alle formuleringen werd geëvalueerd met behulp van de methode beschreven door Chen et al. 16 met kleine aanpassingen. De ontwikkelde NFRK's van alle samenstellingen werden 's nachts gedroogd in een vacuümoven bij 105 °C om resterend oplosmiddel te verwijderen. 30 mg NFRCS (initieel monstergewicht – W0) en 30 mg Ct (positieve controle) werden in aparte schaaltjes geplaatst met een premix van 3,8% natriumcitraat. Op vooraf bepaalde tijdsintervallen, d.w.z. 5, 10, 20, 30, 40 en 60 seconden, werden de NFRCS verwijderd en werden hun oppervlakken gereinigd van niet-geabsorbeerd bloed door de monsters gedurende 30 seconden op Ct te plaatsen. Het uiteindelijke gewicht van het door NFRCS 16 geabsorbeerde bloed (W1) werd op elk tijdstip in aanmerking genomen. Bereken het BAR-percentage met behulp van de volgende formule:
De bloedstollingstijd (BCT) werd bepaald zoals gerapporteerd door Wang et al. 17 . De tijd die nodig was voor heel bloed (rattenbloed voorgemengd met 3,8% natriumcitraat) om te stollen in aanwezigheid van NFRCS werd berekend als de BCT van het testmonster. De verschillende NFRCS-componenten (30 mg) werden in 10 ml schroefdopflesjes geplaatst en geïncubeerd bij 37 °C. Bloed (0,5 ml) werd aan het flesje toegevoegd en 0,3 ml van 0,2 M CaCl2 werd toegevoegd om de bloedstolling te activeren. Keer ten slotte het flesje elke 15 seconden om (tot 180 °) totdat er een stevig stolsel ontstaat. De BCT van het monster wordt geschat door het aantal flips vails17,18. Op basis van BCT werden twee optimale samenstellingen van NFRCS Cm, Ch en Cp geselecteerd voor verdere karakteriseringsstudies.
De BCT van Ch NFRCS en Cp NFRCS samenstellingen werd bepaald door de methode beschreven door Li et al. 19 te implementeren. Plaats 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs (positieve controle) in afzonderlijke petrischalen (37 °C). Bloed dat 3,8% natriumcitraat bevatte, werd gemengd met 0,2 M CaCl2 in een volumeverhouding van 10:1 om het bloedstollingsproces te starten. 20 µl van een 0,2 M CaCl2 rattenbloedmengsel werd op het monsteroppervlak aangebracht en in een lege petrischaal geplaatst. De controle was bloed gegoten in lege petrischalen zonder Ct. Stop de stolling op vaste tijdstippen van 0, 3 en 5 minuten door 10 ml gedeïoniseerd (DI) water toe te voegen aan het monster dat de schaal bevat, zonder het stolsel te verstoren. Niet-gecoaguleerde erytrocyten (erytrocyten) ondergaan hemolyse in aanwezigheid van gedeïoniseerd water en geven hemoglobine af. Hemoglobine op verschillende tijdstippen (HA(t)) werd gemeten bij 540 nm (λmax hemoglobine) met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. De absolute absorptie van hemoglobine (AH(0)) in 0 min van 20 µl bloed in 10 ml gedeïoniseerd water werd als referentiestandaard genomen. De relatieve hemoglobineopname (RHA) van gestold bloed werd berekend aan de hand van de verhouding HA(t)/HA(0) met behulp van dezelfde bloedbatch.
Met behulp van een textuuranalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, VS) werden de hechtingseigenschappen van NFRK aan beschadigd weefsel bepaald. Druk een cilindrisch schaaltje met open bodem tegen de binnenkant van de varkenshuid (zonder de vetlaag). Monsters (Ch NFRCS en Cp NFRCS) werden via een canule in cilindrische mallen aangebracht om hechting aan de huid van het varken te creëren. Na een incubatie van 3 minuten bij kamertemperatuur (25 °C) werd de hechtsterkte van de NFRCS gemeten met een constante snelheid van 0,5 mm/s.
De belangrijkste eigenschap van chirurgische sealants is het verhogen van de bloedstolling en het verminderen van bloedverlies. Verliesloze coagulatie in NFRCS werd geëvalueerd met behulp van een eerder gepubliceerde methode met kleine aanpassingen 19 . Maak een microcentrifugebuis (2 ml) (binnendiameter 10 mm) met een gat van 8 × 5 mm2 aan één kant van de centrifugebuis (die een open wond voorstelt). NFRCS wordt gebruikt om de opening te sluiten en tape wordt gebruikt om de buitenranden af ​​te dichten. Voeg 20 µl 0,2 M CaCl2 toe aan de microcentrifugebuis met het 3,8% natriumcitraat-premix. Na 10 minuten werden de microcentrifugebuizen uit de schalen verwijderd en werd de toename in de massa van de schalen bepaald als gevolg van de uitstroom van bloed uit de NFRK (n = 3). Bloedverlies Ch NFRCS en Cp NFRCS werden vergeleken met Cs.
De natte integriteit van de NFRCS werd bepaald op basis van de methode beschreven door Mishra en Chaudhary21 met kleine aanpassingen. Plaats de NFRCS in een erlenmeyer van 100 ml met 50 ml water en draai gedurende 60 seconden rond zonder dat er een top ontstaat. Visuele inspectie en prioritering van de monsters op fysieke integriteit op basis van de verzameling.
De bindingssterkte van HFFC aan Ct werd bestudeerd met behulp van eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen. De integriteit van de oppervlaktecoating werd beoordeeld door NFRK bloot te stellen aan akoestische golven (externe stimulus) in aanwezigheid van milliQ water (Ct). De ontwikkelde NFRCS Ch NFRCS en Cp NFRCS werden in een met water gevulde beker geplaatst en respectievelijk 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 en 30 minuten gesoniceerd. Na droging werd het percentage verschil tussen het begin- en eindgewicht van de NFRCS gebruikt om het percentage materiaalverlies (HFFC) te berekenen. In vitro BCT ondersteunde verder de bindingssterkte of het verlies van oppervlaktematerialen. De efficiëntie van HFFC-binding aan Ct zorgt voor bloedstolling en een elastische coating op het oppervlak van Ct22.
De homogeniteit van de ontwikkelde NFRCS werd bepaald door middel van een BCT van monsters (30 mg) genomen van willekeurig geselecteerde algemene locaties in de NFRCS. Volg de eerder genoemde BCT-procedure om de NFRCS-conformiteit te bepalen. De nabijheid van alle vijf monsters zorgt voor een uniforme oppervlaktebedekking en HFFC-afzetting in het Ct-gaas.
Het nominale bloedcontactoppervlak (NBCA) werd bepaald zoals eerder gerapporteerd, met enkele aanpassingen. Coaguleer het bloed door 20 µl bloed tussen de twee oppervlakken van Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs te klemmen. Na 1 uur werden de twee delen van de stent gescheiden en werd het stolseloppervlak handmatig gemeten. De gemiddelde waarde van drie herhalingen werd beschouwd als NBCA NFRCS19.
Dynamische dampsorptie (DVS)-analyse werd gebruikt om de effectiviteit van NFRCS te evalueren bij het absorberen van water uit de externe omgeving of van de verwondingsplek die verantwoordelijk is voor het initiëren van coagulatie. De DVS evalueert of registreert de dampopname en het dampverlies in een monster gravimetrisch met behulp van een ultragevoelige balans met een massaresolutie van ±0,1 µg. Een elektronische massastroomregelaar genereert een partiële dampspanning (relatieve vochtigheid) rond het monster door verzadigde en droge draaggassen te mengen. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee werden de monsters, op basis van het percentage vochtopname door de monsters, ingedeeld in vier categorieën (0–0,012% w/w− niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15% matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23. Volgens de richtlijnen van de Europese Farmacopee werden de monsters, op basis van het percentage vochtopname door de monsters, ingedeeld in vier categorieën (0–0,012% w/w− niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2–15% matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.Overeenkomstig de aanbevelingen van de Europese Farmacopee werden de monsters, afhankelijk van het percentage vochtopname door de monsters, verdeeld in 4 categorieën (0–0,012% w/w – niet-hygroscopisch, 0,2–2% w/w licht hygroscopisch, 2– vijftien%).% aandeel en > 15% aandeel)23. % matig hygroscopisch en > 15% zeer hygroscopisch)23.4 类（0-0,012% w/w- 0,2-2% w/w 2-15% > 15% 23.根据 欧洲 药典 指南, 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 (（0-0,012%) W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 、 2-15% 适度 吸湿,> 15 %非常吸湿）23。Overeenkomstig de aanbevelingen van de Europese Farmacopee worden monsters verdeeld in 4 klassen, afhankelijk van het percentage vocht dat door het monster wordt opgenomen (0-0,012% qua gewicht – niet-hygroscopisch, 0,2-2% qua gewicht – licht hygroscopisch, 2-15% qua gewicht).% aandeel van het vermogen, > 15 % percentage van het vermogen) 23. % matig hygroscopisch, > 15% zeer hygroscopisch) 23.De hygroscopische efficiëntie van NFCS X NFCS en TsN NFCS werd bepaald met een DVS TA TGA Q5000 SA-analysator. Tijdens dit proces werden de looptijd, relatieve vochtigheid (RV) en het realtime monstergewicht bij 25 °C24 gemeten. Het vochtgehalte wordt berekend door middel van nauwkeurige NFRCS-massaanalyse met behulp van de volgende vergelijking:
MC is de NFRCS-vochtigheid. m1 is het drooggewicht van NSAID's. m2 is de realtime NFRCS-massa bij een gegeven RV.
Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C waren leeggemaakt (< 7 × 10–3 Torr). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25 °C waren leeggemaakt (< 7 × 10–3 Torr). Zorg ervoor dat u een goed beeld krijgt van uw bedrijf temperatuurbereik 25 °С in течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van een stikstofadsorptie-experiment met vloeibare stikstof nadat de monsters gedurende 10 uur bij 25°C waren geleegd (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。在 25°C Zorg ervoor dat u een goed product kunt vinden Meer informatie over het gebruik van producten bij 10 graden Celsius 25°C (< 7 × 10-3 graden). Het totale oppervlak werd geschat met behulp van stikstofadsorptie-experimenten met vloeibare stikstof nadat de monsters 10 uur lang bij 25°C (< 7 x 10-3 torr) waren leeggelaten.Het totale oppervlak, het poriënvolume en de NFRCS-poriegrootte werden bepaald met een Quantachrome van NOVA 1000e, Oostenrijk, met behulp van RS 232-software.
Bereid 5% RBC's (zoutoplossing als verdunningsmiddel) uit volbloed. Breng vervolgens een aliquot HFFC (0,25 ml) en 5% RBC-massa (0,1 ml) over naar een 96-wellsplaat. Incubeer het mengsel 40 minuten bij 37 °C. Een mengsel van rode bloedcellen en serum werd beschouwd als positieve controle en een mengsel van zoutoplossing en rode bloedcellen als negatieve controle. Hemagglutinatie werd bepaald volgens de Stajitzky-schaal. De voorgestelde schalen zijn als volgt: + + + + dichte granulaire aggregaten; + + + gladde bodemkussentjes met gebogen randen; + + gladde bodemkussentjes met gescheurde randen; + smalle rode ringen rond de randen van de gladde kussentjes; – (negatief) discrete rode knop 12 in het midden van de onderste well.
De hemocompatibiliteit van NFRCS werd bestudeerd volgens de methode van de International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. De gravimetrische methode beschreven door Singh et al. Kleine aanpassingen werden gemaakt om trombusvorming in de aanwezigheid van of op het oppervlak van NFRCS te beoordelen. 500 mg Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS werden 24 uur bij 37 °C geïncubeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na 24 uur werd PBS verwijderd en NFRCS werd behandeld met 2 ml bloed dat 3,8% natriumcitraat bevatte. Voeg op het oppervlak van de NFRCS 0,04 ml 0,1 M CaCl2 toe aan de geïncubeerde monsters. Na 45 minuten werd 5 ml gedestilleerd water toegevoegd om coagulatie te stoppen. Gecoaguleerd bloed op het oppervlak van NFRK werd behandeld met 36-38% formaldehyde-oplossing. De met formaldehyde gefixeerde stolsels werden gedroogd en gewogen. Het percentage trombose werd geschat door het gewicht te berekenen van het glas zonder bloed en monster (negatieve controle) en het glas met bloed (positieve controle).
Als eerste bevestiging werden de monsters onder een optische microscoop bekeken om inzicht te krijgen in het vermogen van de HFFC-oppervlaktecoating, de Ct-interconnectie en het Ct-netwerk om poriën te vormen. Dunne coupes van Ch en Cp uit NFRCS werden bijgesneden met een scalpelmesje. De resulterende coupe werd op een objectglaasje geplaatst, bedekt met een dekglaasje en de randen werden met lijm vastgezet. De geprepareerde glaasjes werden onder een optische microscoop bekeken en er werden foto's gemaakt met verschillende vergrotingen.
De afzetting van polymeren in Ct-netwerken werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie op basis van de methode beschreven door Rice et al.29. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth) en NFRCS (Ch en Cp) werden bereid volgens de eerder genoemde methode. De HFFC-samenstelling die voor de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth) en NFRCS (Ch en Cp) werden bereid volgens de eerder genoemde methode.De voor de formulering gebruikte HFFC-samenstelling werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth) en NFRCS (Ch en Cp) werd verkregen volgens de eerder genoemde methode.NFRCS（Ch & Cp）。NFRCS（Ch & Cp）。De HFFC-samenstelling die in de formulering werd gebruikt, werd gemengd met een fluorescerende kleurstof (amaranth) en kreeg NFRCS (Ch en Cp), zoals eerder vermeld.Dunne coupes NFRK werden uit de verkregen monsters gesneden, op objectglaasjes geplaatst en afgedekt met dekglaasjes. Bekijk de geprepareerde objectglaasjes onder een fluorescentiemicroscoop met een groen filter (310-380 nm). Er werden beelden gemaakt met een vergroting van 4x om inzicht te krijgen in de Ct-relaties en de overtollige polymeerafzetting in het Ct-netwerk.
De oppervlaktetopografie van NFRCS Ch en Cp werd bepaald met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) met een ultrascherpe TESP-cantilever in tapping-modus: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. De oppervlakteruwheid werd bepaald met behulp van root mean square (RMS) met behulp van software (Scanning Probe Image Processor). Verschillende NFRCS-locaties werden weergegeven in 3D-beelden om de uniformiteit van het oppervlak te controleren. De standaarddeviatie van de score voor een bepaald gebied wordt gedefinieerd als de oppervlakteruwheid. De RMS-vergelijking werd gebruikt om de oppervlakteruwheid van NFRCS31 te kwantificeren.
FESEM-gebaseerde studies werden uitgevoerd met behulp van FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, om de oppervlaktemorfologie van Ch NFRCS en Cp NFRCS te begrijpen, wat een betere BCT liet zien dan Cm NFRCS. De FESEM-studie werd uitgevoerd volgens de methode beschreven door Zhao et al. 32 met kleine aanpassingen. 20 tot 30 mg Ch NFRCS en Cp NFRCS werden voorgemengd met 20 µl 3,8% natriumcitraat, gemengd met rattenbloed. 20 µl 0,2 M CaCl2 werd toegevoegd aan de met bloed behandelde monsters om de stolling te initiëren en de monsters werden 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarnaast werden overtollige erytrocyten van het NFRCS-oppervlak verwijderd door te spoelen met zoutoplossing.
Volgende monsters werden behandeld met 0,1% glutaraldehyde en vervolgens gedroogd in een heteluchtoven bij 37 °C om vocht te verwijderen. De gedroogde monsters werden gecoat en geanalyseerd 32 . Andere beelden verkregen tijdens de analyse waren stolselvorming op het oppervlak van individuele katoenvezels, polymeerafzetting tussen Ct, erytrocytmorfologie (vorm), stolselintegriteit en erytrocytmorfologie in aanwezigheid van NFRCS. Onbehandelde NFRCS-gebieden en met Ch en Cp behandelde NFRCS-gebieden geïncubeerd met bloed werden gescand op elementaire ionen (natrium, kalium, stikstof, calcium, magnesium, zink, koper en selenium)33. Vergelijk elementaire ionpercentages tussen behandelde en onbehandelde monsters om de accumulatie van elementaire ionen tijdens stolselvorming en stolselhomogeniteit te begrijpen.
De dikte van de Cp HFFC-oppervlaktecoating op het Ct-oppervlak werd bepaald met behulp van FESEM. De dwarsdoorsneden van Cp NFRCS werden uit het raamwerk gesneden en met behulp van sputtercoating gecoat. De resulterende sputtercoatingmonsters werden met behulp van FESEM geobserveerd en de dikte van de oppervlaktecoating werd gemeten 34, 35, 36.
Röntgenmicro-CT biedt niet-destructieve 3D-beelden met hoge resolutie en stelt u in staat de interne structurele structuur van NFRK te bestuderen. Micro-CT maakt gebruik van een röntgenbundel die door het monster gaat om de lokale lineaire verzwakkingscoëfficiënt van de röntgenstralen in het monster te registreren, wat helpt bij het verkrijgen van morfologische informatie. De interne locatie van Ct in Cp NFRCS en bloedbehandelde Cp NFRCS werd onderzocht met behulp van micro-CT om inzicht te krijgen in de absorptie-efficiëntie en bloedstolling in aanwezigheid van NFRCS37,38,39. De 3D-structuren van bloedbehandelde en onbehandelde Cp NFRCS-monsters werden gereconstrueerd met behulp van micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Duitsland). Met behulp van VG STUDIO-MAX software versie 2.2 werden verschillende röntgenfoto's gemaakt vanuit verschillende hoeken (idealiter 360° dekking) om 3D-beelden voor NFRCS te ontwikkelen. De verzamelde projectiegegevens werden gereconstrueerd tot volumetrische 3D-beelden met behulp van de bijbehorende eenvoudige 3D ScanIP Academic-software.
Om de verdeling van het stolsel te begrijpen, werden bovendien 20 µl voorgemengd gecitreerd bloed en 20 µl 0,2 M CaCl2 aan de NFRCS toegevoegd om de bloedstolling te initiëren. De voorbereide monsters werden uitgehard. Het NFRK-oppervlak werd behandeld met 0,5% glutaraldehyde en 30 minuten gedroogd in een heteluchtoven bij 30-40 °C. Het bloedstolsel dat zich op de NFRCS vormde, werd gescand, gereconstrueerd en er werd een 3D-afbeelding van gemaakt.
Antibacteriële assays werden uitgevoerd op Cp NFRCS (beste vergelijking met Ch NFRCS) met behulp van de eerder beschreven methode met kleine aanpassingen. De antibacteriële activiteit van Cp NFRCS en Cp HFFC werd bepaald met behulp van drie verschillende testmicro-organismen [S. aureus (grampositieve bacteriën), E. coli (gramnegatieve bacteriën) en witte Candida (C. albicans)] die op agar groeiden in petrischalen in een broedstoof. Inoculeer 50 ml van de verdunde bacteriecultuursuspensie in een concentratie van 105-106 CFU ml-1 gelijkmatig op het agarmedium. Giet het medium in een petrischaal en laat het stollen. Maak putjes op het oppervlak van de agarplaat om deze te vullen met HFFC (3 putjes voor HFFC en 1 voor negatieve controle). Voeg 200 µl HFFC toe aan 3 putjes en 200 µl pH 7,4 PBS aan het 4e putje. Plaats aan de andere kant van de petrischaal een 12 mm Cp NFRCS-schijfje op de gestolde agar en bevochtig met PBS (pH 7,4). Ciprofloxacine-, ampicilline- en fluconazoltabletten worden beschouwd als referentiestandaarden voor Staphylococcus aureus, Escherichia coli en Candida albicans. Meet de inhibitiezone handmatig en maak een digitale opname van de inhibitiezone.
Na institutionele ethische goedkeuring werd de studie uitgevoerd aan het Kasturba Medical College of Education and Research in Manipal, Karnataka, in Zuid-India. Het in vitro TEG-experimentele protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Proefpersonen werden gerekruteerd uit vrijwillige bloeddonoren (van 18 tot 55 jaar) van de bloedbank van het ziekenhuis. Daarnaast werd van de vrijwilligers een informed consent-formulier verkregen voor het verzamelen van bloedmonsters. Native TEG (N-TEG) ​​​​werd gebruikt om het effect van de Cp HFFC-formulering op volbloed gemengd met natriumcitraat te bestuderen. N-TEG staat algemeen bekend om zijn rol bij reanimatie op de plaats van zorg, wat problemen oplevert voor clinici vanwege de mogelijkheid van klinisch significante vertraging in de resultaten (routinematige stollingstesten). N-TEG-analyse werd uitgevoerd met volbloed. Geïnformeerde consent en een gedetailleerde medische geschiedenis werden verkregen van alle deelnemers. De studie omvatte geen deelnemers met hemostatische of trombotische complicaties zoals zwangerschap/postpartum of leverziekte. Proefpersonen die geneesmiddelen gebruikten die de stollingscascade beïnvloeden, werden ook uitgesloten van de studie. Basislaboratoriumtests (hemoglobine, protrombinetijd, geactiveerde tromboplastine en aantal bloedplaatjes) werden bij alle deelnemers uitgevoerd volgens standaardprocedures. N-TEG bepaalt de visco-elasticiteit van het bloedstolsel, de initiële stolselstructuur, de interactie met deeltjes, de versterking van het stolsel en de lysis van het stolsel. De N-TEG-analyse levert grafische en numerieke gegevens op over de collectieve effecten van verschillende cellulaire elementen en plasma. De N-TEG-analyse werd uitgevoerd op twee verschillende volumes Cp HFFC (10 µl en 50 µl). Hieruit werd 1 ml volbloed met citroenzuur toegevoegd aan 10 µl Cp HFFC. Voeg 1 ml (Cp HFFC + gecitreerd bloed), 340 µl gemengd bloed, toe aan 20 µl 0,2 M CaCl2 bevattende TEG-schaal. Vervolgens werden de TEG-schaaltjes in de TEG® 5000 US geplaatst om R, K, alfahoek, MA, G, CI, TPI, EPL en LY te meten in 30% van de bloedmonsters in aanwezigheid van Cp HFFC41.
Het in vivo studieprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van het Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle in vivo NFRCS-onderzoeken (2 × 2 cm2) werden uitgevoerd op vrouwelijke Wistar-ratten (met een gewicht van 200 tot 250 g). Alle dieren werden geacclimatiseerd bij een temperatuur van 24-26 °C; de dieren hadden vrije toegang tot standaardvoer en water ad libitum. Alle dieren werden willekeurig verdeeld in verschillende groepen, elke groep bestond uit drie dieren. Alle onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 . Vóór het onderzoek werden de dieren intraperitoneaal (ip) verdoofd met een mengsel van 20-50 mg ketamine (per 1 kg lichaamsgewicht) en 2-10 mg xylazine (per 1 kg lichaamsgewicht). Na het onderzoek werd het bloedingsvolume berekend door het verschil tussen het begin- en eindgewicht van de monsters te evalueren. De gemiddelde waarde van de drie tests werd als bloedingsvolume van het monster genomen.
Het rattenstaartamputatiemodel werd geïmplementeerd om inzicht te krijgen in het potentieel van NFRCS om bloedingen te moduleren bij trauma, gevechten of verkeersongevallen (letselmodel). Snijd 50% van de staart af met een scalpelmesje en plaats deze 15 seconden in de lucht om een ​​normale bloeding te garanderen. Daarnaast werden testmonsters op de staart van een rat geplaatst door druk uit te oefenen (Ct, Cs, Ch NFRCS en Cp NFRCS). Bloedingen en PCT werden gerapporteerd voor testmonsters (n = 3)17,45.
De effectiviteit van NFRCS-drukcontrole tijdens gevechten werd onderzocht op een model van de oppervlakkige arteria femoralis. De arteria femoralis werd vrijgelegd, geprikt met een 24G-trocart en binnen 15 seconden afgetapt. Nadat een ongecontroleerde bloeding werd waargenomen, werd het testmonster onder druk op de punctieplaats geplaatst. Direct na het aanbrengen van het testmonster werd de stollingstijd geregistreerd en werd de hemostatische efficiëntie gedurende de volgende 5 minuten gemeten. Dezelfde procedure werd herhaald met Cs en Ct46.
Dowling et al. 47 stelden een leverletselmodel voor om het hemostatische potentieel van hemostatische materialen te beoordelen in de context van intraoperatieve bloedingen. BCT werd geregistreerd voor Ct-monsters (negatieve controle), Cs-framework (positieve controle), Ch NFRCS-monsters en Cp NFRCS-monsters. De suprahepatische vena cava van de rat werd vrijgelegd door middel van een mediane laparotomie. Daarna werd het distale deel van de linkerkwab met een schaar uitgesneden. Maak een incisie in de lever met een scalpelmesje en laat deze enkele seconden bloeden. Nauwkeurig gewogen Ch NFRCS- en Cp NFRCS-testmonsters werden zonder positieve druk op het beschadigde oppervlak geplaatst en BCT werd geregistreerd. De controlegroep (Ct) oefende vervolgens druk uit, gevolgd door Cs 30 s47 zonder de verwonding te verbreken.
In vivo wondgenezingstesten werden uitgevoerd met behulp van een excisiewondmodel om de wondgenezingseigenschappen van de ontwikkelde polymeergebaseerde NFRCS'en te evalueren. Modellen van excisiewonden werden geselecteerd en uitgevoerd volgens eerder gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen19,32,48. Alle dieren werden verdoofd zoals eerder beschreven. Gebruik een biopsiepons (12 mm) om een ​​cirkelvormige diepe incisie in de huid van de rug te maken. De voorbereide wondplekken werden verbonden met Cs (positieve controle), Ct (in de wetenschap dat wattenschijfjes de genezing belemmeren), Ch NFRCS en Cp NFRCS (experimentele groep) en een negatieve controle zonder enige behandeling. Op elke dag van de studie werd de wondoppervlakte bij alle ratten gemeten. Gebruik een digitale camera om een ​​foto van de wond te maken en breng een nieuw verband aan. Het percentage wondgenezing werd gemeten met de volgende formule:
Op basis van het percentage wondgenezing op de 12e dag van het onderzoek werd de rattenhuid van de beste groep verwijderd ((Cp NFRCS) en de controlegroep) en bestudeerd met behulp van H&E-kleuring en Masson's trichroomkleuring. Op basis van het percentage wondgenezing op de 12e dag van het onderzoek werd de rattenhuid van de beste groep verwijderd ((Cp NFRCS) en de controlegroep) en bestudeerd met behulp van H&E-kleuring en Masson's trichroomkleuring.Op basis van het percentage wondgenezing op de 12e dag van het onderzoek werd de huid van de ratten uit de beste groep ((Cp NFRCS) en de controlegroep) verwijderd en onderzocht door middel van kleuring met hematoxyline-eosine en Masson's trichroom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E-染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤,进行H&E染色和眳组）Ratten in de beste groep ((Cp NFRCS) en controlegroepen) werden uitgesneden voor hematoxyline-eosinekleuring en Masson's trichroomkleuring op basis van het percentage wondgenezing op dag 12 van het onderzoek.De geïmplementeerde kleuringsprocedure werd uitgevoerd volgens de eerder beschreven methoden49,50. Kort gezegd, na fixatie in 10% formaline werden de monsters gedehydrateerd met behulp van een reeks gegradeerde alcoholen. Gebruik een microtoom om dunne coupes (5 µm dik) van het geëxcideerde weefsel te verkrijgen. Dunne seriële coupes van controles en Cp NFRCS werden behandeld met hematoxyline en eosine om histopathologische veranderingen te bestuderen. Masson's trichroomkleuring werd gebruikt om de vorming van collageenfibrillen te detecteren. De verkregen resultaten werden blind bestudeerd door pathologen.
De stabiliteit van Cp NFRCS-monsters werd gedurende 12 maanden bij kamertemperatuur (25 °C ± 2 °C/60% RV ± 5%) onderzocht51. Cp NFRCS (oppervlakteverkleuring en microbiële groei) werd visueel geïnspecteerd en getest op vouwslijtageweerstand en BCT volgens de bovenstaande methoden, die in het gedeelte Materialen en Methoden worden beschreven.
De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van Cp NFRCS werden onderzocht door Cp NFRCS te bereiden met een grootte van 15 × 15 cm². Daarnaast werden monsters van 30 mg (n = 5) uit verschillende Cp NFRCS-fracties gehaald en werd de BCT van de bestudeerde monsters geëvalueerd zoals eerder beschreven in de Methoden-sectie.
We hebben geprobeerd verschillende vormen en structuren te ontwikkelen met behulp van Cp NFRCS-composities voor diverse biomedische toepassingen. Dergelijke vormen of configuraties omvatten conische swabs voor neusbloedingen en tandheelkundige ingrepen, en cilindrische swabs voor vaginale bloedingen.
Alle datasets worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en werden geanalyseerd door ANOVA met Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, VS), gevolgd door Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest (*p < 0,05).
Alle procedures die in humane studies werden uitgevoerd, waren in overeenstemming met de normen van het Instituut en de Nationale Onderzoeksraad, evenals met de Verklaring van Helsinki uit 1964 en de daaropvolgende amendementen, of vergelijkbare ethische normen. Alle deelnemers werden geïnformeerd over de kenmerken van de studie en het vrijwillige karakter ervan. De gegevens van de deelnemers blijven vertrouwelijk nadat ze zijn verzameld. Het in-vitro TEG-experimentele protocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Vrijwilligers ondertekenden een geïnformeerde toestemming voor het afnemen van bloedmonsters.
Alle procedures die in dierstudies zijn uitgevoerd, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Kastuba Faculteit Geneeskunde van het Manipal Instituut voor Hoger Onderwijs, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle ontworpen dierproeven zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Comité voor Controle en Toezicht op Dierproeven (CPCSEA). Alle auteurs volgen de ARRIVE-richtlijnen.
De FTIR-spectra van alle NFRCS werden geanalyseerd en vergeleken met het chitosanspectrum weergegeven in Figuur 2A. Karakteristieke spectrale pieken van chitosan (opgenomen) bij 3437 cm-1 (OH- en NH-strekking, overlap), 2945 en 2897 cm-1 (CH-strekking), 1660 cm-1 (NH2-spanning), 1589 cm-1 (N–H-buiging), 1157 cm-1 (brugstrekking O-), 1067 cm-1 (strekking C–O, secundaire hydroxyl), 993 cm-1 (strekking CO, Bo-OH) 52,53,54. Aanvullende tabel S1 toont de FTIR NFRCS-absorptiespectrumwaarden voor chitosan (reporter), zuiver chitosan, Cm, Ch en Cp. De FTIR-spectra van alle NFRCS (Cm, Ch en Cp) vertoonden dezelfde karakteristieke absorptiebanden als zuiver chitosan, zonder significante veranderingen (fig. 2A). De FTIR-resultaten bevestigden de afwezigheid van chemische of fysische interacties tussen de polymeren die gebruikt zijn voor de ontwikkeling van de NFRCS, wat aangeeft dat de gebruikte polymeren inert zijn.
In-vitrokarakterisering van Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS en Cs. (A) geeft de gecombineerde FTIR-spectra weer van de samenstellingen van chitosan en Cm NFRCS, Ch NFRCS en Cp NFRCS onder compressie. (B) a) Opnamesnelheid van NFRCS Cm, Ch, Cp en Cg in volbloed (n = 3); de Ct-monsters vertoonden een hogere BAR omdat het wattenstaafje een hogere absorptie-efficiëntie heeft; b) Bloed na bloedopname. Illustratie van het geabsorbeerde monster. Grafische weergave van de BCT van testmonster C (Cp NFRCS had de beste BCT (15 s, n = 3)). Gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken geven SD weer, ***p < 0,0001. Gegevens in C, D, E en G werden weergegeven als gemiddelde ± SD, en de foutbalken geven SD weer, ***p < 0,0001. In de C, D, E en G-modus is het ± стандартное отклонение, een планки погрешностей Als de waarde is gewijzigd, ***p <0,0001. Gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de foutbalken geven de standaarddeviatie weer, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 In C, D, E en G zijn de instellingen voor ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Gegevens in C, D, E en G worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, de foutbalken geven de standaarddeviatie weer, ***p<0,0001.