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Les hémorragies incontrôlées constituent l'une des principales causes de décès. L'obtention rapide d'une hémostase est cruciale pour la survie du patient et constitue un geste de premiers secours essentiel lors de combats, d'accidents de la route et d'opérations de sauvetage. Un échafaudage composite renforcé de fibres nanoporeuses (NFRCS), dérivé d'une composition hémostatique filmogène simple (HFFC) utilisée comme phase continue, peut déclencher et amplifier l'hémostase. Le développement du NFRCS s'inspire de la structure de l'aile de la libellule. Cette structure est composée d'ailes transversales et longitudinales, dont les membranes sont reliées entre elles pour maintenir l'intégrité de la microstructure. La HFFC recouvre uniformément la surface de la fibre d'un film d'épaisseur nanométrique et relie les particules de coton (Ct) réparties aléatoirement (phase dispersée) pour former une structure nanoporeuse. L'association des phases continue et dispersée permet de réduire le coût du produit d'un facteur dix par rapport aux produits disponibles sur le marché. Des NFRCS modifiés (tampons ou bracelets) peuvent être utilisés dans diverses applications biomédicales. Des études in vivo ont conclu que le Cp NFRCS développé déclenche et améliore le processus de coagulation au site d'application. Grâce à sa structure nanoporeuse, le NFRCS peut moduler le microenvironnement et agir au niveau cellulaire, ce qui favorise une meilleure cicatrisation dans le modèle de plaie par excision.
Les hémorragies incontrôlées en situation de combat, peropératoire ou d'urgence peuvent mettre gravement en danger la vie des blessés¹. Ces situations entraînent une augmentation globale des résistances vasculaires périphériques, pouvant conduire à un choc hémorragique. Les mesures appropriées pour contrôler les saignements pendant et après une intervention chirurgicale sont considérées comme potentiellement mortelles²,³. Les lésions des gros vaisseaux entraînent des pertes sanguines massives, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 50 % en situation de combat et 31 % en chirurgie¹. Ces pertes sanguines massives entraînent une diminution du volume corporel, réduisant ainsi le débit cardiaque. L'augmentation des résistances vasculaires périphériques totales et l'altération progressive de la microcirculation conduisent à une hypoxie des organes vitaux. Un choc hémorragique peut survenir si l'état du patient persiste sans intervention efficace¹,⁴,⁵. Parmi les autres complications figurent l'aggravation de l'hypothermie et de l'acidose métabolique, ainsi qu'un trouble de la coagulation. Un choc hémorragique sévère est associé à un risque de décès plus élevé⁶,⁷,⁸. En cas de choc de grade III (progressif), la transfusion sanguine est essentielle à la survie du patient, compte tenu de la morbidité et de la mortalité peropératoires et postopératoires. Afin de pallier ces situations critiques, nous avons mis au point un échafaudage composite renforcé de fibres nanoporeuses (NFRCS) utilisant une concentration minimale de polymères (0,5 %) grâce à une combinaison de polymères hémostatiques hydrosolubles.
L'utilisation de fibres de renforcement permet de développer des produits économiques. La disposition aléatoire des fibres rappelle la structure de l'aile d'une libellule, équilibrée par les stries horizontales et verticales. Les nervures transversales et longitudinales communiquent avec la membrane alaire (Fig. 1). Le NFRCS est constitué de fil de coton renforcé (Ct) servant d'armature, offrant une résistance physique et mécanique supérieure (Figure 1). De par leur prix abordable et leur facilité de fabrication, les fils de coton (Ct) sont privilégiés par les chirurgiens pour les interventions et les pansements. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, notamment sa teneur en cellulose cristalline > 90 % (qui contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses multiples avantages, notamment sa teneur en cellulose cristalline > 90 % (qui contribue à l'amélioration de l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme système squelettique du NFRCS9,10. Il est vrai que j'ai beaucoup de primes, dans un total de plus de 90 % de cellulite cristallisé (révélé dans le temps) гемостатической активности), Ct utilisé dans le système de squelette NFRCS9,10. Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, notamment sa teneur en cellulose cristalline >90 % (impliquée dans une activité hémostatique accrue), le Ct a été utilisé comme système squelettique NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Par conséquent, compte tenu de ses nombreux avantages, notamment sa teneur de plus de 90 % en cellulose cristalline (qui contribue à améliorer l'activité hémostatique), le Ct a été utilisé comme support pour le NFRCS9,10.Le Ct a été recouvert superficiellement (formation d'un film nanométrique) et interconnecté par une composition filmogène hémostatique (HFFC). La HFFC agit comme un Matrigel, maintenant ensemble les particules de Ct disposées aléatoirement. La conception développée transmet les contraintes au sein de la phase dispersée (fibres de renforcement). Il est difficile d'obtenir des structures nanoporeuses présentant une bonne résistance mécanique avec des concentrations minimales de polymère. De plus, il est complexe de personnaliser différents moules pour diverses applications biomédicales.
La figure présente un schéma de la conception du NFRCS inspirée de la structure de l'aile de la libellule (A). Cette image établit une analogie comparative entre la structure de l'aile d'une libellule (les nervures transversales et longitudinales de l'aile sont interconnectées) et une photomicrographie en coupe transversale du NFRCS de Cp (B). Représentation schématique du NFRCS.
Des NFRC ont été développés en utilisant du HFFC comme phase continue afin de pallier les limitations mentionnées ci-dessus. Le HFFC est composé de divers polymères hémostatiques filmogènes, notamment du chitosane (polymère hémostatique principal) associé à de la méthylcellulose (MC), de l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC 50 cp) et de l'alcool polyvinylique (PVA) (125 kDa) comme polymère de support favorisant la formation du thrombus. L'ajout de polyvinylpyrrolidone K30 (PVP K30) a amélioré la capacité d'absorption d'humidité des NFRC. Du polyéthylène glycol 400 (PEG 400) a été ajouté pour améliorer la réticulation des polymères dans les mélanges de polymères liés. Trois compositions hémostatiques HFFC différentes (HFFC-Cm, HFFC-Ch et HFFC-Cp), à savoir du chitosane avec MC (Cm), du chitosane avec HPMC (Ch) et du chitosane avec PVA (Cp), ont été appliquées au Ct. Diverses études de caractérisation in vitro et in vivo ont confirmé l'activité hémostatique et cicatrisante des NFRCS. Les matériaux composites proposés par les NFRCS permettent de personnaliser différents types d'échafaudages afin de répondre à des besoins spécifiques.
De plus, le NFRCS peut être transformé en bandage ou en rouleau pour couvrir toute la zone blessée des membres inférieurs et d'autres parties du corps. Spécialement conçu pour les blessures aux membres lors de combats, le NFRCS peut être adapté à un demi-bras ou une jambe entière (Figure supplémentaire S11). Il peut également être transformé en bracelet à l'aide de colle tissulaire, permettant ainsi de stopper les saignements graves du poignet, notamment lors de tentatives de suicide. Notre objectif principal est de développer un NFRCS contenant le moins de polymère possible, accessible à une large population (en dessous du seuil de pauvreté) et pouvant être intégré à une trousse de premiers secours. Simple, efficace et économique, le NFRCS bénéficie aux communautés locales et peut avoir un impact global.
Le chitosane (masse moléculaire 80 kDa) et l'amarante ont été achetés chez Merck (Inde). L'hydroxypropylméthylcellulose 50 Cp, le polyéthylène glycol 400 et la méthylcellulose ont été achetés chez Loba Chemie Pvt. LLC (Mumbai). L'alcool polyvinylique (masse moléculaire 125 kDa) (hydrolysé à 87-90 %) a été acheté chez National Chemicals (Gujarat). La polyvinylpyrrolidine K30 a été achetée chez Molychem (Mumbai). Les écouvillons stériles ont été achetés chez Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd. (Tamil Nadu), l'eau Milli-Q (système de purification d'eau Direct-Q3, Merck, Inde) servant de support.
Le NFRCS a été développé par lyophilisation^11,12. Toutes les compositions HFFC (Tableau 1) ont été préparées sous agitation mécanique. Une solution de chitosane à 0,5 % a été préparée dans une solution aqueuse d'acide acétique à 1 %, sous agitation continue à 800 tr/min. La masse exacte de polymère indiquée dans le Tableau 1 a été ajoutée à la solution de chitosane et agitée jusqu'à obtention d'une solution limpide. Le PVP K30 et le PEG 400 ont ensuite été ajoutés au mélange obtenu dans les proportions indiquées dans le Tableau 1, et l'agitation a été poursuivie jusqu'à obtention d'une solution polymère visqueuse et limpide. Le bain de solution polymère ainsi obtenu a été soniqué pendant 60 minutes afin d'éliminer les bulles d'air. Comme illustré dans la Figure supplémentaire S1(b), le Ct a été réparti uniformément dans chaque puits d'une plaque 6 puits (moule) contenant 5 ml de HFFC.
La plaque à six puits a été soniquée pendant 60 minutes afin d'obtenir un mouillage et une distribution uniformes du HFFC dans le réseau Ct. Elle a ensuite été congelée à -20 °C pendant 8 à 12 heures. Les plaques congelées ont été lyophilisées pendant 48 heures pour obtenir différentes formulations de NFRCS. La même procédure est utilisée pour produire différentes formes et structures, telles que des tampons ou des tampons cylindriques, ou toute autre forme pour différentes applications.
Du chitosane (80 kDa) (3 %), pesé avec précision, est dissous dans de l'acide acétique à 1 % sous agitation magnétique. On ajoute ensuite 1 % de PEG 400 à la solution obtenue et on agite pendant 30 minutes. La solution est versée dans un récipient carré ou rectangulaire et congelée à -80 °C pendant 12 heures. Les échantillons congelés sont lyophilisés pendant 48 heures pour obtenir du Cs13 poreux.
Le NFRCS développé a été soumis à des expériences utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japon) pour confirmer la compatibilité chimique du chitosane avec d'autres polymères14,15. Les spectres FTIR (largeur de la gamme spectrale de 400 à 4000 cm-1) de tous les échantillons testés ont été obtenus en effectuant 32 balayages.
Le taux d'absorption sanguine (TAS) de toutes les formulations a été évalué selon la méthode décrite par Chen et al.¹⁶, légèrement modifiée. Les NFRCS développés, de toutes compositions, ont été séchés sous vide à 105 °C pendant une nuit afin d'éliminer les solvants résiduels. 30 mg de NFRCS (masse initiale de l'échantillon – W₀) et 30 mg de Ct (témoin positif) ont été placés dans des récipients séparés contenant un prémélange de citrate de sodium à 3,8 %. À intervalles de temps prédéterminés (5, 10, 20, 30, 40 et 60 secondes), les NFRCS ont été retirés et leur surface nettoyée du sang non absorbé en les déposant sur le témoin positif (Ct) pendant 30 secondes. La masse finale de sang absorbée par les NFRCS¹⁶ a été mesurée (W₁) à chaque instant. Le pourcentage de TAS a été calculé à l'aide de la formule suivante :
Le temps de coagulation sanguine (TCS) a été déterminé selon la méthode décrite par Wang et al.¹⁷. Le temps nécessaire à la coagulation du sang total (sang de rat prémélangé avec 3,8 % de citrate de sodium) en présence de NFRCS a été calculé comme étant le TCS de l'échantillon testé. Les différents composants du NFRCS (30 mg) ont été placés dans des flacons à vis de 10 ml et incubés à 37 °C. 0,5 ml de sang ont été ajoutés au flacon, ainsi que 0,3 ml de CaCl₂ 0,2 M pour activer la coagulation. Le flacon a ensuite été retourné toutes les 15 secondes (jusqu'à 180°) jusqu'à la formation d'un caillot ferme. Le TCS de l'échantillon est estimé par le nombre de retournements du flacon^17,18. Sur la base du TCS, deux compositions optimales de NFRCS (Cm, Ch et Cp) ont été sélectionnées pour des études de caractérisation complémentaires.
Le temps de coagulation (TC) des compositions Ch NFRCS et Cp NFRCS a été déterminé selon la méthode décrite par Li et al.¹⁹. Des échantillons de 15 x 15 mm² de Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs (témoin positif) ont été placés dans des boîtes de Petri séparées (37 °C). Du sang contenant 3,8 % de citrate de sodium a été mélangé à du CaCl₂ 0,2 M dans un rapport volumique de 10:1 pour initier la coagulation. 20 µl de ce mélange de sang de rat et de CaCl₂ 0,2 M ont été déposés à la surface de l'échantillon, puis ces derniers ont été placés dans une boîte de Petri vide. Le témoin était constitué de sang versé dans des boîtes de Petri vides sans Ct. À intervalles réguliers de 0, 3 et 5 minutes, la coagulation a été stoppée par l'ajout de 10 ml d'eau déminéralisée (DI) à l'échantillon, sans perturber le caillot. Les érythrocytes non coagulés subissent une hémolyse en présence d'eau déminéralisée et libèrent de l'hémoglobine. L'hémoglobine a été mesurée à différents moments (HA(t)) à 540 nm (λmax hémoglobine) à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible. L'absorption absolue de l'hémoglobine (AH(0)) à 0 min d'un échantillon de 20 µl de sang dans 10 ml d'eau déminéralisée a servi de référence. Le taux d'absorption relatif d'hémoglobine (RHA) du sang coagulé a été calculé à partir du rapport HA(t)/HA(0) en utilisant le même échantillon de sang.
Les propriétés adhésives du NFRCS aux tissus endommagés ont été déterminées à l'aide d'un analyseur de texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, États-Unis). Un récipient cylindrique à fond ouvert a été appliqué contre la face interne de la peau de porc (sans la couche de graisse). Les échantillons (Ch NFRCS et Cp NFRCS) ont été déposés à l'aide d'une canule dans des moules cylindriques afin de favoriser l'adhérence à la peau du porc. Après une incubation de 3 minutes à température ambiante (25 °C), la force d'adhérence du NFRCS a été enregistrée à une vitesse constante de 0,5 mm/s.
La principale caractéristique des adhésifs chirurgicaux est d'améliorer la coagulation sanguine tout en réduisant les pertes de sang. La coagulation sans perte dans le NFRCS a été évaluée selon une méthode précédemment publiée, légèrement modifiée¹⁹. Préparer un tube à microcentrifuger (2 ml) (diamètre intérieur 10 mm) percé d'un orifice de 8 × 5 mm² sur l'une de ses faces (représentant une plaie ouverte). Utiliser le NFRCS pour fermer l'orifice et un ruban adhésif pour sceller les bords extérieurs. Ajouter 20 µl de CaCl₂ 0,2 M au tube à microcentrifuger contenant le prémélange de citrate de sodium à 3,8 %. Après 10 minutes, retirer les tubes des boîtes de Petri et mesurer l'augmentation de masse de ces dernières due à l'écoulement du sang du NFRCS (n = 3). Les pertes de sang avec Ch NFRCS et Cp NFRCS ont été comparées à Cs.
L'intégrité à l'état humide des échantillons de NFRCS a été déterminée selon la méthode décrite par Mishra et Chaudhary²¹, avec quelques modifications mineures. Placer les échantillons de NFRCS dans un erlenmeyer de 100 ml contenant 50 ml d'eau et agiter pendant 60 s sans formation de bouchon. Un examen visuel et une priorisation des échantillons en fonction de leur intégrité physique ont été effectués lors du prélèvement.
La force de liaison du HFFC à la calcineurine (Ct) a été étudiée selon des méthodes précédemment publiées, légèrement modifiées. L'intégrité du revêtement de surface a été évaluée en exposant le NFRK à des ondes acoustiques (stimulus externe) en présence d'eau Milli-Q (Ct). Les NFRCS Ch et Cp développés ont été placés dans un bécher rempli d'eau et soumis à une sonication pendant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 30 minutes, respectivement. Après séchage, la différence de poids entre le poids initial et le poids final du NFRCS a permis de calculer le pourcentage de perte de matière (HFFC). Des tests BCT in vitro ont confirmé la force de liaison et la perte de matière en surface. L'efficacité de la liaison du HFFC à la Ct induit une coagulation sanguine et la formation d'un revêtement élastique à la surface de la Ct22.
L'homogénéité du NFRCS développé a été déterminée par l'épaisseur de la couche de carbone (BCT) d'échantillons (30 mg) prélevés aléatoirement à différents endroits du NFRCS. Suivre la procédure BCT décrite précédemment pour déterminer la conformité du NFRCS. La proximité des cinq échantillons garantit une couverture de surface uniforme et un dépôt homogène de HFFC dans la maille de carbone.
La surface nominale de contact sanguin (SNC) a été déterminée selon la méthode précédemment décrite, avec quelques modifications. Le sang a été coagulé en clampant 20 µl de sang entre les deux surfaces de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS et Cs. Après une heure, les deux parties du stent ont été séparées et la surface du caillot a été mesurée manuellement. La valeur moyenne de trois répétitions a été considérée comme la SNC NFRCS19.
L'analyse par sorption dynamique de vapeur (DVS) a été utilisée pour évaluer l'efficacité du NFRCS à absorber l'eau provenant de l'environnement extérieur ou du site de la lésion à l'origine de la coagulation. La DVS évalue et enregistre l'absorption et la perte de vapeur dans un échantillon par gravimétrie, à l'aide d'une balance ultrasensible d'une résolution massique de ±0,1 µg. Une pression partielle de vapeur (humidité relative) est générée autour de l'échantillon par un régulateur de débit massique électronique, grâce au mélange de gaz vecteurs saturés et secs. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, ces derniers ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopiques, 0,2–2 % p/p – légèrement hygroscopiques, 2–15 % – modérément hygroscopiques et > 15 % – très hygroscopiques)23. Conformément aux directives de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, ces derniers ont été classés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopiques, 0,2–2 % p/p – légèrement hygroscopiques, 2–15 % – modérément hygroscopiques et > 15 % – très hygroscopiques)23.Conformément aux recommandations de la Pharmacopée européenne, en fonction du pourcentage d'absorption d'humidité par les échantillons, ces derniers ont été divisés en 4 catégories (0–0,012 % p/p – non hygroscopiques, 0,2–2 % p/p légèrement hygroscopiques, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % modérément hygroscopiques et > 15 % très hygroscopiques)23.0,2 à 2 % w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w-吸湿 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 % 非常吸湿）23.Conformément aux recommandations de la Pharmacopée européenne, les échantillons sont divisés en 4 classes en fonction du pourcentage d'humidité absorbée par l'échantillon (0-0,012 % en poids – non hygroscopique, 0,2-2 % en poids – légèrement hygroscopique, 2-15 % en poids).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % modérément hygroscopiques, > 15 % très hygroscopiques) 23.L'efficacité hygroscopique des NFCS X NFCS et TsN NFCS a été déterminée à l'aide d'un analyseur DVS TA TGA Q5000 SA. Au cours de ce processus, la durée de l'analyse, l'humidité relative (HR) et la masse de l'échantillon en temps réel à 25 °C ont été enregistrées. La teneur en humidité est calculée par une analyse massique précise des NFCS à l'aide de l'équation suivante :
MC représente l'humidité NFRCS. m1 représente le poids sec des AINS. m2 représente la masse NFRCS en temps réel à une humidité relative donnée.
La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après avoir vidé les échantillons à 25 °C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Il est prévu que les mesures de protection soient appliquées à l'absorption de l'azote après l'absorption de l'azote. 25 °С течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La surface totale a été estimée à l'aide d'une expérience d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après que les échantillons aient été vidés à 25°C pendant 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。à 25°C Les mesures de protection contre l'azote sont appliquées après l'absorption de l'azote. в Température 10 heures à 25°C (< 7 × 10-3 températures). La surface totale a été estimée à l'aide d'expériences d'adsorption d'azote avec de l'azote liquide après que les échantillons aient été vidés pendant 10 heures à 25°C (< 7 x 10-3 torr).La surface totale, le volume des pores et la taille des pores NFRCS ont été déterminés avec un Quantachrome de NOVA 1000e, Autriche, à l'aide du logiciel RS 232.
Préparer une suspension de globules rouges à 5 % (diluée dans du sérum physiologique) à partir de sang total. Transférer ensuite un aliquot de sérum fœtal bovin (HFFC) (0,25 ml) dans une plaque 96 puits, puis ajouter 0,1 ml de la suspension de globules rouges à 5 %. Incuber le mélange à 37 °C pendant 40 minutes. Un mélange de globules rouges et de sérum a servi de témoin positif, et un mélange de sérum physiologique et de globules rouges, de témoin négatif. L'hémagglutination a été déterminée selon l'échelle de Stajitzky. La signification des réponses est la suivante : + + + + agrégats granulaires denses ; + + + zones à fond lisse avec bords incurvés ; + + zones à fond lisse avec bords déchirés ; + anneaux rouges étroits autour des zones à fond lisse ; – (négatif) petit bouton rouge discret au centre du puits inférieur.
L'hémocompatibilité des NFRCS a été étudiée selon la méthode de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) (ISO 10993-4, 1999)^26,27. La méthode gravimétrique décrite par Singh et al. a été légèrement modifiée afin d'évaluer la formation de thrombus en présence ou à la surface des NFRCS. 500 mg de NFRCS de Cs, Ch et Cp ont été incubés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 24 heures à 37 °C. Après 24 heures, le PBS a été retiré et les NFRCS ont été traités avec 2 ml de sang contenant 3,8 % de citrate de sodium. 0,04 ml de CaCl₂ 0,1 M ont été ajoutés à la surface des NFRCS incubés. Après 45 minutes, 5 ml d'eau distillée ont été ajoutés pour stopper la coagulation. Le sang coagulé à la surface des NFRCS a été traité avec une solution de formaldéhyde à 36-38 %. Les caillots fixés au formaldéhyde ont été séchés et pesés. Le pourcentage de thrombose a été estimé en calculant le poids du verre sans sang ni échantillon (témoin négatif) et celui du verre contenant du sang (témoin positif).
Pour une première confirmation, les échantillons ont été observés au microscope optique afin d'évaluer la capacité du revêtement de surface HFFC, des interconnexions Ct et du réseau Ct à former des pores. Des coupes fines de Ch et Cp issues de NFRCS ont été réalisées à l'aide d'un scalpel. La coupe obtenue a été déposée sur une lame de verre, recouverte d'une lamelle et ses bords ont été fixés avec de la colle. Les lames préparées ont été observées au microscope optique et des photographies ont été prises à différents grossissements.
Le dépôt de polymère dans les réseaux Ct a été visualisé à l'aide de la microscopie à fluorescence basée sur la méthode décrite par Rice et al.29. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante), et les NFRCS (Ch & Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment. La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante), et les NFRCS (Ch & Cp) ont été préparés selon la méthode mentionnée précédemment.La composition HFFC utilisée pour la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (amarante) et le NFRCS (Ch et Cp) a été obtenu selon la méthode mentionnée précédemment.Le système HFFC est doté d'un système de gestion des émissions de gaz à effet de serre et d'un système de radiocommunication.Le système HFFC est doté d'un système de gestion des émissions de gaz à effet de serre et d'un système de radiocommunication.La composition HFFC utilisée dans la formulation a été mélangée avec un colorant fluorescent (Amarante) et a reçu du NFRCS (Ch et Cp), comme mentionné précédemment.Des coupes fines de NFRK ont été réalisées à partir des échantillons obtenus, déposées sur des lames de verre et recouvertes de lamelles. Les lames préparées ont été observées au microscope à fluorescence avec un filtre vert (310-380 nm). Des images ont été prises à un grossissement de 4x afin d'étudier les relations Ct et le dépôt excessif de polymère dans le réseau Ct.
La topographie de surface des échantillons NFRCS Ch et Cp a été déterminée par microscopie à force atomique (AFM) avec un levier TESP ultra-fin en mode tapping : 42 N/m, 320 kHz, rayon de courbure (ROC) de 2 à 5 nm (Bruker, Taïwan). La rugosité de surface a été déterminée par la méthode des moindres carrés (RMS) à l’aide du logiciel Scanning Probe Image Processor. Différentes zones des échantillons NFRCS ont été modélisées en 3D afin de vérifier l’uniformité de surface. L’écart type du score pour une zone donnée définit la rugosité de surface. L’équation RMS a été utilisée pour quantifier la rugosité de surface de l’échantillon NFRCS31.
Des études par microscopie électronique à balayage à émission de champ (MEB-FEG) ont été réalisées à l'aide d'un microscope SU8000 (HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo) afin d'étudier la morphologie de surface des NFRCS Ch et Cp, qui présentaient une meilleure épaisseur de coagulation (BCT) que les NFRCS Cm. L'étude MEB-FEG a été menée selon la méthode décrite par Zhao et al.³², avec quelques modifications mineures. 20 à 30 mg de NFRCS Ch et Cp ont été prémélangés avec 20 µl de citrate de sodium à 3,8 % préalablement mélangé à du sang de rat. 20 µl de CaCl₂ 0,2 M ont été ajoutés aux échantillons traités au sang pour initier la coagulation, et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 10 minutes. Enfin, les érythrocytes en excès ont été éliminés de la surface des NFRCS par rinçage au sérum physiologique.
Les échantillons suivants ont été traités avec du glutaraldéhyde à 0,1 % puis séchés à l'étuve à 37 °C pour éliminer l'humidité. Les échantillons séchés ont été recouverts et analysés³². Parmi les autres images obtenues lors de l'analyse figuraient la formation de caillots à la surface des fibres de coton individuelles, le dépôt de polymères entre les fibres de coton (Ct), la morphologie des érythrocytes (forme), l'intégrité du caillot et la morphologie des érythrocytes en présence de NFRCS. Les zones de NFRCS non traitées et les zones de NFRCS traitées avec Ch et Cp, incubées avec du sang, ont été analysées pour la présence d'ions élémentaires (sodium, potassium, azote, calcium, magnésium, zinc, cuivre et sélénium)³³. La comparaison des pourcentages d'ions élémentaires entre les échantillons traités et non traités permet de comprendre l'accumulation d'ions élémentaires lors de la formation du caillot et son homogénéité.
L'épaisseur du revêtement de surface Cp HFFC sur la surface Ct a été déterminée par MEB-FEG. Des sections transversales de Cp NFRCS ont été découpées dans la structure et métallisées par pulvérisation cathodique. Les échantillons de revêtement obtenus ont été observés par MEB-FEG et l'épaisseur du revêtement de surface a été mesurée^{34, 35, 36}.
La microtomographie aux rayons X (micro-CT) fournit une imagerie 3D non destructive haute résolution et permet d'étudier la structure interne du NFRCS. La micro-CT utilise un faisceau de rayons X traversant l'échantillon pour enregistrer le coefficient d'atténuation linéaire local des rayons X, ce qui permet d'obtenir des informations morphologiques. La localisation interne du Ct dans le Cp NFRCS et le Cp NFRCS traité au sang a été examinée par micro-CT afin de comprendre l'efficacité d'absorption et la coagulation sanguine en présence de NFRCS^37,38,39. Les structures 3D des échantillons de Cp NFRCS traités et non traités au sang ont été reconstruites par micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Allemagne). À l'aide du logiciel VG STUDIO-MAX version 2.2, plusieurs images radiographiques ont été acquises sous différents angles (idéalement une couverture à 360°) pour générer des images 3D du NFRCS. Les données de projection collectées ont été reconstruites en images volumiques 3D à l'aide du logiciel ScanIP Academic.
Afin d'étudier la distribution du caillot, 20 µl de sang citraté prémélangé et 20 µl de CaCl₂ 0,2 M ont été ajoutés au NFRCS pour initier la coagulation. Les échantillons préparés ont été laissés à durcir. La surface du NFRK a été traitée avec du glutaraldéhyde à 0,5 % puis séchée à l'étuve à air chaud (30–40 °C) pendant 30 min. Le caillot sanguin formé sur le NFRCS a été scanné, reconstruit et une image 3D du caillot a été visualisée.
Des tests antibactériens ont été réalisés sur Cp NFRCS (dont l'activité est supérieure à celle de Ch NFRCS) selon la méthode précédemment décrite, avec quelques modifications mineures. L'activité antibactérienne de Cp NFRCS et de Cp HFFC a été déterminée à l'aide de trois micro-organismes tests différents [Staphylococcus aureus (bactérie Gram-positive), Escherichia coli (bactérie Gram-négative) et Candida albicans (Candida albicans)] cultivés sur gélose dans des boîtes de Petri incubées. Inoculer uniformément 50 ml de la suspension de culture bactérienne diluée à une concentration de 10⁵-10⁶ UFC/ml sur le milieu gélosé. Verser le milieu dans une boîte de Petri et laisser solidifier. Des puits ont été formés à la surface de la gélose pour y déposer le HFFC (3 puits pour le HFFC et 1 pour le témoin négatif). Ajouter 200 µl de HFFC dans 3 puits et 200 µl de PBS à pH 7,4 dans le 4e puits. De l'autre côté de la boîte de Petri, déposer un disque de Cp NFRCS de 12 mm sur la gélose solidifiée et l'humidifier avec du PBS (pH 7,4). Les comprimés de ciprofloxacine, d'ampicilline et de fluconazole sont considérés comme des solutions de référence pour Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans. Mesurer manuellement la zone d'inhibition et en prendre une image numérique.
Après approbation éthique institutionnelle, l'étude a été menée au Kasturba Medical College of Education and Research de Manipal, dans l'État du Karnataka, au sud de l'Inde. Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College de Manipal, Karnataka (CEI : 674/2020). Les participants ont été recrutés parmi des donneurs de sang volontaires (âgés de 18 à 55 ans) de la banque de sang de l'hôpital. Un formulaire de consentement éclairé a été obtenu de chaque volontaire pour le prélèvement des échantillons sanguins. Le TEG natif (N-TEG) ​​a été utilisé pour étudier l'effet de la formulation Cp HFFC sur du sang total prémélangé avec du citrate de sodium. Le N-TEG est largement reconnu pour son rôle dans la réanimation au chevet du patient, ce qui peut poser problème aux cliniciens en raison du risque de retard cliniquement significatif dans l'obtention des résultats (tests de coagulation de routine). L'analyse N-TEG a été réalisée sur sang total. Le consentement éclairé et les antécédents médicaux détaillés de tous les participants ont été recueillis. L'étude n'a pas inclus les participants présentant des complications hémostatiques ou thrombotiques telles que la grossesse/le post-partum ou une maladie hépatique. Les sujets prenant des médicaments affectant la cascade de coagulation ont également été exclus. Des analyses biologiques de base (hémoglobine, temps de prothrombine, thromboplastine activée et numération plaquettaire) ont été réalisées chez tous les participants selon les procédures standard. La N-TEG détermine la viscoélasticité du caillot sanguin, sa structure initiale, l'interaction des particules, son renforcement et sa lyse. L'analyse N-TEG fournit des données graphiques et numériques sur les effets combinés de plusieurs éléments cellulaires et du plasma. L'analyse N-TEG a été réalisée sur deux volumes différents de Cp HFFC (10 µl et 50 µl). Pour ce faire, 1 ml de sang total additionné d'acide citrique a été ajouté à 10 µl de Cp HFFC. 1 ml de ce mélange (Cp HFFC + sang citraté), soit 340 µl de sang mélangé, a ensuite été ajouté à 20 µl de CaCl₂ 0,2 M dans la cuve TEG. Par la suite, les boîtes TEG ont été chargées dans le TEG® 5000, US pour mesurer R, K, l'angle alpha, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% des échantillons de sang en présence de Cp HFFC41.
Le protocole de l'étude in vivo a été examiné et approuvé par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC) de la Faculté de médecine Kasturba, Institut d'enseignement supérieur de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux recommandations du Comité de contrôle et de supervision de l'expérimentation animale (CPCSEA). Toutes les études in vivo NFRCS (2 × 2 cm²) ont été réalisées sur des rates Wistar femelles (pesant entre 200 et 250 g). Les animaux ont été acclimatés à une température de 24 à 26 °C et ont eu libre accès à une alimentation standard et à de l'eau à volonté. Ils ont été répartis aléatoirement en différents groupes de trois animaux chacun. Toutes les études ont été réalisées conformément au document « Études animales : Rapport d'expériences in vivo » (réf. 43). Avant l'étude, les animaux ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale (i.p.) d'un mélange de 20 à 50 mg de kétamine (par kg de poids corporel) et de 2 à 10 mg de xylazine (par kg de poids corporel). Après l'étude, le volume de saignement a été calculé en évaluant la différence entre le poids initial et le poids final des échantillons ; la valeur moyenne obtenue à partir des trois mesures a été retenue comme volume de saignement de l'échantillon.
Le modèle d'amputation de la queue du rat a été utilisé pour évaluer le potentiel des NFRCS à moduler les saignements lors de traumatismes, de combats ou d'accidents de la route (modèle de lésion). La queue a été sectionnée à 50 % à l'aide d'un scalpel et placée à l'air libre pendant 15 secondes afin de garantir un saignement normal. Des échantillons de test ont ensuite été appliqués sur la queue du rat par pression (Ct, Cs, Ch NFRCS et Cp NFRCS). Les saignements et le PCT ont été mesurés pour les échantillons testés (n = 3)^17,45.
L'efficacité du contrôle de pression NFRCS en situation de combat a été étudiée sur un modèle d'artère fémorale superficielle. L'artère fémorale est exposée, ponctionnée à l'aide d'un trocart 24G et saignée en moins de 15 secondes. En cas de saignement non contrôlé, l'échantillon test est placé au point de ponction et une pression est appliquée. Immédiatement après l'application de l'échantillon test, le temps de coagulation est enregistré et l'efficacité hémostatique est observée pendant les 5 minutes suivantes. La même procédure a été répétée avec du césium (Cs) et du césium 46 (Ct46).
Dowling et al.⁴⁷ ont proposé un modèle de lésion hépatique pour évaluer le potentiel hémostatique de matériaux hémostatiques dans le contexte d'un saignement peropératoire. Le temps de contact hémostatique (TCH) a été enregistré pour les échantillons Ct (témoin négatif), Cs (témoin positif), Ch NFRCS et Cp NFRCS. La veine cave sus-hépatique du rat a été exposée par laparotomie médiane. La partie distale du lobe gauche a ensuite été excisée aux ciseaux. Une incision a été pratiquée dans le foie au scalpel et un saignement a été induit pendant quelques secondes. Les échantillons de Ch NFRCS et de Cp NFRCS, pesés avec précision, ont été placés sur la surface lésée sans exercer de pression, et le TCH a été enregistré. Le groupe témoin (Ct) a ensuite subi une pression suivie de celle appliquée avec Cs pendant 30 secondes⁴⁷, sans aggravation de la lésion.
Des tests de cicatrisation in vivo ont été réalisés à l'aide d'un modèle de plaie par excision afin d'évaluer les propriétés cicatrisantes des NFRCS à base de polymères développés. Les modèles de plaies par excision ont été sélectionnés et réalisés selon des méthodes précédemment publiées, avec quelques modifications mineures^19,32,48. Tous les animaux ont été anesthésiés comme décrit précédemment. Une incision circulaire profonde a été pratiquée dans la peau du dos à l'aide d'un emporte-pièce (12 mm). Les sites de plaie préparés ont été recouverts de pansements : Cs (témoin positif), Ct (en tenant compte du fait que les compresses de coton interfèrent avec la cicatrisation), Ch NFRCS et Cp NFRCS (groupe expérimental), ainsi que d'un témoin négatif sans traitement. Chaque jour de l'étude, la surface de la plaie a été mesurée chez tous les rats. Une photographie de la zone de la plaie a été prise à l'aide d'un appareil photo numérique, puis un nouveau pansement a été appliqué. Le pourcentage de fermeture de la plaie a été calculé à l'aide de la formule suivante :
En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau du rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration au trichrome de Masson. En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau du rat du meilleur groupe a été excisée ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) et étudiée par coloration H&E et coloration au trichrome de Masson.En fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude, la peau des rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et du groupe témoin) a été excisée et examinée par coloration à l'hématoxyline-éosine et au trichrome de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) et Masson sont également concernés.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS) et les normes H&E)Les rats du meilleur groupe ((Cp NFRCS) et des groupes témoins) ont été excisés pour la coloration à l'hématoxyline-éosine et la coloration au trichrome de Masson en fonction du pourcentage de fermeture de la plaie au 12e jour de l'étude.La procédure de coloration mise en œuvre a été réalisée selon les méthodes décrites précédemment^49,50. Brièvement, après fixation dans du formol à 10 %, les échantillons ont été déshydratés par une série de bains d'alcool de concentrations croissantes. Des coupes fines (5 µm d'épaisseur) du tissu excisé ont été réalisées à l'aide d'un microtome. Des coupes sériées fines des témoins et des cellules Cp NFRCS ont été colorées à l'hématoxyline-éosine afin d'étudier les modifications histopathologiques. La coloration au trichrome de Masson a été utilisée pour détecter la formation de fibrilles de collagène. Les résultats obtenus ont été analysés en aveugle par des pathologistes.
La stabilité des échantillons de Cp NFRCS a été étudiée à température ambiante (25°C ± 2°C/60% HR ± 5%) pendant 12 mois51. Le Cp NFRCS (décoloration de surface et croissance microbienne) a été inspecté visuellement et testé pour la résistance à l'usure par pliage et le BCT selon les méthodes décrites dans la section Matériaux et Méthodes.
L'extensibilité et la reproductibilité du Cp NFRCS ont été examinées en préparant du Cp NFRCS d'une taille de 15×15 cm2. De plus, des échantillons de 30 mg (n = 5) ont été prélevés de différentes fractions de Cp NFRCS et le BCT des échantillons étudiés a été évalué comme décrit précédemment dans la section Méthodes.
Nous avons cherché à développer différentes formes et structures à partir de compositions Cp NFRCS pour diverses applications biomédicales. Parmi ces formes ou configurations, on peut citer les écouvillons coniques pour les saignements de nez et les interventions dentaires, ainsi que les écouvillons cylindriques pour les saignements vaginaux.
Tous les ensembles de données sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type et ont été analysés par ANOVA à l'aide de Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) suivi du test de comparaisons multiples de Bonferroni (*p<0,05).
Toutes les procédures réalisées dans le cadre des études sur l'humain étaient conformes aux normes de l'Institut et du Conseil national de la recherche, ainsi qu'à la Déclaration d'Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs, ou à des normes éthiques similaires. Tous les participants ont été informés des caractéristiques de l'étude et de son caractère volontaire. Les données des participants restent confidentielles une fois recueillies. Le protocole expérimental TEG in vitro a été examiné et approuvé par le Comité d'éthique institutionnel du Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (CEI : 674/2020). Les volontaires ont signé un formulaire de consentement éclairé pour le prélèvement d'échantillons de sang.
Toutes les procédures réalisées dans le cadre des études animales ont été menées conformément aux directives de la Faculté de médecine Kastuba, Institut d'enseignement supérieur de Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Toutes les expériences animales ont été conçues conformément aux directives du Comité de contrôle et de supervision de l'expérimentation animale (CPCSEA). Tous les auteurs respectent les directives ARRIVE.
Les spectres FTIR de tous les NFRCS ont été analysés et comparés au spectre du chitosane présenté sur la figure 2A. Les pics spectraux caractéristiques du chitosane (enregistrés) sont à 3437 cm⁻¹ (vibration d'élongation OH et NH, chevauchement), 2945 et 2897 cm⁻¹ (vibration d'élongation CH), 1660 cm⁻¹ (déformation NH₂), 1589 cm⁻¹ (déformation N–H), 1157 cm⁻¹ (vibration d'élongation O-), 1067 cm⁻¹ (vibration d'élongation C–O, hydroxyle secondaire), 993 cm⁻¹ (vibration d'élongation CO, Bo-OH). Le tableau supplémentaire S1 présente les valeurs des spectres d'absorption FTIR des NFRCS pour le chitosane (référence), le chitosane pur, Cm, Ch et Cp. Les spectres FTIR de tous les NFRCS (Cm, Ch et Cp) ont présenté les mêmes bandes d'absorption caractéristiques que le chitosane pur, sans modification significative (Fig. 2A). Ces résultats FTIR ont confirmé l'absence d'interactions chimiques ou physiques entre les polymères utilisés pour élaborer les NFRCS, indiquant ainsi leur inertie.
Caractérisation in vitro des NFRCS Cm, Ch, Cp et Cs. (A) Spectres FTIR combinés des compositions de chitosane et des NFRCS Cm, Ch et Cp sous compression. (B) a) Taux d'absorption sanguine totale des NFRCS Cm, Ch, Cp et Cg (n = 3) ; les échantillons Ct ont présenté un taux d'absorption sanguine plus élevé en raison de la meilleure efficacité d'absorption du coton-tige ; b) Sang après absorption. Illustration de l'échantillon absorbé. Représentation graphique du temps de contact sanguin (TCS) de l'échantillon C (le NFRCS Cp a présenté le meilleur TCS (15 s, n = 3)). Les données des figures C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, et les barres d'erreur représentent l'écart-type, ***p < 0,0001. Les données des figures C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, et les barres d'erreur représentent l'écart-type, ***p < 0,0001. Les valeurs C, D, E et G sont prévues pour l'ouverture standard ± p < 0,0001. Les données des figures C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart type, et les barres d'erreur représentent l'écart type, ***p<0,0001. C、D、E et G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E et G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Les dates en C, D, E et G correspondent à une ouverture standard, les plans sont prévus pour l'ouverture standard, ***p <0,0001. Les données des figures C, D, E et G sont présentées sous forme de moyenne ± écart type, les barres d'erreur représentent l'écart type, ***p<0,0001.