Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Ukontrolleret blødning er en af ​​de hyppigste dødsårsager. Opnåelse af hurtig hæmostase sikrer forsøgspersonens overlevelse som førstehjælp under kamp, ​​trafikulykker og operationer for at reducere dødsfald. Nanoporøs fiberforstærket kompositscaffold (NFRCS) afledt af en simpel hæmostatisk filmdannende sammensætning (HFFC) som en kontinuerlig fase kan udløse og forbedre hæmostasen. Udviklingen af ​​NFRCS er baseret på designet af guldsmedens vinge. Guldsmedens vingestruktur består af tværgående og langsgående vinger, og vingemembranerne er forbundet med hinanden for at opretholde mikrostrukturens integritet. HFFC dækker fiberoverfladen ensartet med en film af nanometertykkelse og forbinder den tilfældigt fordelte bomuldstykkelse (Ct) (dispergeret fase) for at danne en nanoporøs struktur. Kombinationen af ​​kontinuerlige og dispergerede faser reducerer produktets omkostninger med ti gange sammenlignet med kommercielt tilgængelige produkter. Modificerede NFRCS (tamponer eller armbånd) kan bruges i en række biomedicinske anvendelser. In vivo-studier har konkluderet, at den udviklede Cp NFRCS udløser og forstærker koagulationsprocessen på applikationsstedet. NFRCS kan modulere mikromiljøet og virke på celleniveau på grund af sin nanoporøse struktur, hvilket resulterer i bedre sårheling i excisionssårmodellen.
Ukontrolleret blødning under kamp, ​​intraoperative og nødsituationer kan udgøre en alvorlig trussel mod de såredes liv1. Disse tilstande fører yderligere til en generel stigning i den perifere vaskulære modstand, hvilket fører til hæmoragisk shock. Passende foranstaltninger til at kontrollere blødning under og efter operation betragtes som potentielt livstruende2,3. Skader på store kar fører til massivt blodtab, hvilket resulterer i en dødelighed på ≤ 50% i kamp og 31% under operation1. Massivt blodtab fører til et fald i kropsvolumen, hvilket reducerer hjertets minutvolumen. En stigning i den samlede perifere vaskulære modstand og en progressiv forringelse af mikrocirkulationen fører til hypoxi i de livsopretholdende organer. Hæmoragisk shock kan forekomme, hvis tilstanden fortsætter uden effektiv intervention1,4,5. Andre komplikationer omfatter progression af hypotermi og metabolisk acidose, samt en koagulationsforstyrrelse, der hæmmer koagulationsprocessen. Alvorligt hæmoragisk shock er forbundet med en højere risiko for død6,7,8. Ved grad III (progressivt) shock er blodtransfusion afgørende for patientens overlevelse under intraoperativ og postoperativ morbiditet og mortalitet. For at overvinde alle ovenstående livstruende situationer har vi udviklet et nanoporøst fiberforstærket kompositstillads (NFRCS), der anvender en minimal polymerkoncentration (0,5%) ved hjælp af en kombination af vandopløselige hæmostatiske polymerer.
Ved hjælp af fiberforstærkning kan der udvikles omkostningseffektive produkter. De tilfældigt arrangerede fibre ligner strukturen af ​​en guldsmeds vinge, afbalanceret af de vandrette og lodrette striber på vingerne. Vingens tværgående og langsgående vener kommunikerer med vingemembranen (fig. 1). NFRCS består af forstærket Ct som et stilladssystem med bedre fysisk og mekanisk styrke (figur 1). På grund af overkommeligheden og håndværksmæssig kvalitet foretrækker kirurger at bruge bomuldstrådmålere (Ct) under operationer og forbindinger. I betragtning af dets mange fordele, herunder > 90% krystallinsk cellulose (som bidrager til at forbedre den hæmostatiske aktivitet), blev Ct derfor anvendt som et skeletsystem i NFRCS9,10. I betragtning af dets mange fordele, herunder > 90% krystallinsk cellulose (som bidrager til at forbedre den hæmostatiske aktivitet), blev Ct derfor anvendt som et skeletsystem i NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристаллической целлюческой целюлозвы гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Derfor, i betragtning af dets mange fordele, herunder >90% krystallinsk cellulose (involveret i øget hæmostatisk aktivitet), blev Ct anvendt som NFRCS-skeletsystemet9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强歼行ﴻC被用作NFRCS9,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Derfor, i betragtning af dets mange fordele, herunder over 90% krystallinsk cellulose (hjælper med at forbedre hæmostatisk aktivitet), blev Ct brugt som et stillads for NFRCS9,10.Ct blev overfladisk belagt (nano-tyk filmdannelse blev observeret) og forbundet med en hæmostatisk filmdannende sammensætning (HFFC). HFFC fungerer som en matrigel, der holder tilfældigt placeret Ct sammen. Det udviklede design overfører spændinger inden for den dispergerede fase (forstærkningsfibre). Det er vanskeligt at opnå nanoporøse strukturer med god mekanisk styrke ved hjælp af minimale polymerkoncentrationer. Derudover er det ikke let at tilpasse forskellige forme til forskellige biomedicinske anvendelser.
Figuren viser et diagram over NFRCS-designet baseret på guldsmedens vingestruktur (A). Dette billede viser en sammenlignende analogi af en guldsmeds vingestruktur (vingens krydsende og langsgående vener er forbundet) og et tværsnitsmikroskopisk fotomikrograf af Cp NFRCS (B). Skematisk repræsentation af NFRCS.
NFRC'er blev udviklet ved hjælp af HFFC som en kontinuerlig fase for at imødegå ovenstående begrænsninger. HFFC er sammensat af forskellige filmdannende hæmostatiske polymerer, herunder chitosan (som den primære hæmostatiske polymer) med methylcellulose (MC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC 50 cp) og polyvinylalkohol (PVA) (125 kDa) som en støttepolymer, der fremmer trombedannelse. Tilsætningen af ​​polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) forbedrede NFRCS' fugtabsorptionskapacitet. Polyethylenglycol 400 (PEG 400) blev tilsat for at forbedre polymertværbinding i bundne polymerblandinger. Tre forskellige HFFC-hæmostatiske sammensætninger (Cm HFFC, Ch HFFC og Cp HFFC), nemlig chitosan med MC (Cm), chitosan med HPMC (Ch) og chitosan med PVA (Cp), blev påført Ct. Forskellige in vitro- og in vivo-karakteriseringsstudier har bekræftet den hæmostatiske og sårhelende aktivitet af NFRCS. Kompositmaterialer, der tilbydes af NFRCS, kan bruges til at tilpasse forskellige former for stilladser for at imødekomme specifikke behov.
Derudover kan NFRCS modificeres som en bandage eller rulle, der dækker hele skadesområdet på underekstremiteterne og andre dele af kroppen. Specifikt til skader på lemmer i kamp kan det designede NFRCS ændres til en halv arm eller et helt ben (Supplerende figur S11). NFRCS kan laves om til et armbånd med vævslim, som kan bruges til at stoppe blødning fra alvorlige selvmordstruede håndledsskader. Vores hovedmål er at udvikle et NFRCS med så lidt polymer som muligt, der kan leveres til en stor befolkning (under fattigdomsgrænsen), og som kan placeres i et førstehjælpskasse. NFRCS er enkelt, effektivt og økonomisk i design, gavner lokalsamfundene og kan have en global indflydelse.
Chitosan (molekylvægt 80 kDa) og amarant blev købt fra Merck, Indien. Hydroxypropylmethylcellulose 50 Cp, polyethylenglycol 400 og methylcellulose blev købt fra Loba Chemie Pvt. LLC, Mumbai. Polyvinylalkohol (molekylvægt 125 kDa) (87-90% hydrolyseret) blev købt fra National Chemicals, Gujarat. Polyvinylpyrrolidin K30 blev købt fra Molychem, Mumbai, og sterile podninger blev købt fra Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q-vand (Direct-Q3 vandrensningssystem, Merck, Indien) som bærer.
NFRCS blev udviklet ved hjælp af en frysetørringsmetode11,12. Alle HFFC-sammensætninger (Tabel 1) blev fremstillet ved hjælp af en mekanisk omrører. Fremstil en 0,5% opløsning af chitosan ved hjælp af 1% eddikesyre i vand ved kontinuerlig omrøring ved 800 rpm på en mekanisk omrører. Den nøjagtige vægt af den fyldte polymer angivet i tabel 1 blev tilsat chitosanopløsningen og omrørt, indtil en klar polymeropløsning blev opnået. PVP K30 og PEG 400 blev tilsat den resulterende blanding i de mængder, der er angivet i tabel 1, og omrøringen blev fortsat, indtil en klar viskøs polymeropløsning blev opnået. Det resulterende bad af polymeropløsning blev sonikeret i 60 minutter for at fjerne fangede luftbobler fra polymerblandingen. Som vist i supplerende figur S1(b) var Ct jævnt fordelt i hver brønd i en 6-brønds plade (form) suppleret med 5 ml HFFC.
Pladen med seks brønde blev sonikeret i 60 minutter for at opnå ensartet befugtning og fordeling af HFFC i Ct-netværket. Derefter blev pladen med seks brønde fryset ved -20 °C i 8-12 timer. Frysepladerne blev frysetørret i 48 timer for at opnå forskellige formuleringer af NFRCS. Den samme procedure bruges til at fremstille forskellige former og strukturer, såsom tamponer eller cylindriske tamponer, eller enhver anden form til forskellige anvendelser.
Nøjagtigt afvejet chitosan (80 kDa) (3%) opløses i 1% eddikesyre ved hjælp af en magnetomrører. Til den resulterende chitosanopløsning blev der tilsat 1% PEG 400, og der blev omrørt i 30 minutter. Den resulterende opløsning hældes i en firkantet eller rektangulær beholder, og den fryses ved -80°C i 12 timer. De frosne prøver blev frysetørret i 48 timer for at opnå porøs Cs13.
Det udviklede NFRCS blev underkastet eksperimenter ved hjælp af Fourier-transform infrarød spektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) for at bekræfte chitosans kemiske kompatibilitet med andre polymerer14,15. FTIR-spektrene (bredden af ​​det spektrale område fra 400 til 4000 cm-1) for alle testede prøver blev opnået ved at udføre 32 scanninger.
Blodabsorptionshastigheden (BAR) for alle formuleringer blev evalueret ved hjælp af metoden beskrevet af Chen et al. 16 med mindre ændringer. De udviklede NFRK'er af alle sammensætninger blev tørret i en vakuumovn ved 105 °C natten over for at fjerne resterende opløsningsmiddel. 30 mg NFRCS (initial prøvevægt – W0) og 30 mg Ct (positiv kontrol) blev placeret i separate skåle indeholdende en forblanding af 3,8% natriumcitrat. Ved forudbestemte tidsintervaller, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 og 60 sekunder, blev NFRCS'erne fjernet, og deres overflader blev renset for uabsorberet blod ved at placere prøverne på Ct i 30 sekunder. Den endelige vægt af blod absorberet af NFRCS 16 blev taget i betragtning (W1) på hvert tidspunkt. Beregn BAR-procentdelen ved hjælp af følgende formel:
Blodkoagulationstiden (BCT) blev bestemt som rapporteret af Wang et al. 17. Den tid, det tager for helblod (rotteblod forblandet med 3,8% natriumcitrat) at koagulere i nærvær af NFRCS, blev beregnet som BCT for testprøven. De forskellige NFRCS-komponenter (30 mg) blev placeret i 10 ml skruelågshætteglas og inkuberet ved 37°C. Blod (0,5 ml) blev tilsat hætteglasset, og 0,3 ml 0,2 M CaCl2 blev tilsat for at aktivere blodkoagulationen. Vend til sidst hætteglasset hvert 15. sekund (op til 180°), indtil der dannes en fast koagel. BCT for prøven estimeres ud fra antallet af vendinger17,18. Baseret på BCT blev to optimale sammensætninger fra NFRCS Cm, Ch og Cp udvalgt til yderligere karakteriseringsstudier.
BCT af Ch NFRCS- og Cp NFRCS-sammensætninger blev bestemt ved at implementere metoden beskrevet af Li et al. 19. Placer 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs (positiv kontrol) i separate petriskåle (37 °C). Blod indeholdende 3,8% natriumcitrat blev blandet med 0,2 M CaCl2 i et volumenforhold på 10:1 for at starte blodkoagulationsprocessen. 20 µl 0,2 M CaCl2 rotteblodblanding blev påført prøveoverfladen og placeret i en tom petriskål. Kontrollen var blod hældt i tomme petriskåle uden Ct. Med faste intervaller på 0, 3 og 5 minutter stoppes koagulationen ved at tilsætte 10 ml deioniseret (DI) vand til prøven indeholdende skålen uden at forstyrre koagulatet. Ukoagulerede erytrocytter (erytrocytter) undergår hæmolyse i nærvær af deioniseret vand og frigiver hæmoglobin. Hæmoglobin på forskellige tidspunkter (HA(t)) blev målt ved 540 nm (λmax hæmoglobin) ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer. Den absolutte absorption af hæmoglobin (AH(0)) i 0 min af 20 µl blod i 10 ml deioniseret vand blev taget som referencestandard. Den relative hæmoglobinoptagelse (RHA) af koaguleret blod blev beregnet ud fra forholdet HA(t)/HA(0) ved brug af den samme blodportion.
Ved hjælp af en teksturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) blev NFRK's klæbeegenskaber til beskadiget væv bestemt. En åbenbundet cylindrisk skål blev presset mod indersiden af ​​svineskindet (uden fedtlaget). Prøver (Ch NFRCS og Cp NFRCS) blev påført via kanyle i cylindriske forme for at skabe klæbeevne til grisens hud. Efter 3 minutters inkubation ved stuetemperatur (RT) (25° C.) blev NFRCS' klæbestyrke registreret med en konstant hastighed på 0,5 mm/sek.
Hovedfunktionen ved kirurgiske forseglinger er at øge blodkoagulationsevnen, samtidig med at blodtab reduceres. Tabsfri koagulation i NFRCS blev evalueret ved hjælp af en tidligere publiceret metode med små ændringer 19. Lav et mikrocentrifugerør (2 ml) (indre diameter 10 mm) med et 8 × 5 mm2 hul på den ene side af centrifugerøret (repræsenterer et åbent sår). NFRCS bruges til at lukke åbningen, og tape bruges til at forsegle de ydre kanter. Tilsæt 20 µl 0,2 M CaCl2 til mikrocentrifugerøret, der indeholder 3,8% natriumcitrat-forblandingen. Efter 10 minutter blev mikrocentrifugerørene fjernet fra skålene, og stigningen i skålenes masse blev bestemt på grund af udstrømningen af ​​blod fra NFRK (n = 3). Blodtab Ch NFRCS og Cp NFRCS blev sammenlignet med Cs.
Vådintegriteten af ​​NFRCS blev bestemt baseret på metoden beskrevet af Mishra og Chaudhary21 med mindre ændringer. Placer NFRCS i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe med 50 ml vand og hvirvl i 60 sekunder uden at danne en top. Visuel inspektion og prioritering af prøver for fysisk integritet baseret på indsamling.
Bindingsstyrken af ​​HFFC til Ct blev undersøgt ved hjælp af tidligere publicerede metoder med mindre modifikationer. Overfladebelægningens integritet blev vurderet ved at eksponere NFRK for akustiske bølger (ekstern stimulus) i nærvær af milliQ vand (Ct). De udviklede NFRCS Ch NFRCS og Cp NFRCS blev placeret i et bægerglas fyldt med vand og sonikeret i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 30 minutter. Efter tørring blev den procentvise forskel mellem den oprindelige og den endelige vægt af NFRCS brugt til at beregne det procentvise tab af materiale (HFFC). In vitro BCT understøttede yderligere bindingsstyrken eller tabet af overfladematerialer. Effektiviteten af ​​HFFC-binding til Ct giver blodkoagulation og en elastisk belægning på overfladen af ​​Ct22.
Homogeniteten af ​​den udviklede NFRCS blev bestemt ved hjælp af BCT af prøver (30 mg) taget fra tilfældigt udvalgte generelle placeringer af NFRCS. Følg den tidligere nævnte BCT-procedure for at bestemme NFRCS-overholdelse. Nærhed mellem alle fem prøver sikrer ensartet overfladedækning og HFFC-aflejring i Ct-nettet.
Det nominelle blodkontaktareal (NBCA) blev bestemt som tidligere rapporteret med nogle ændringer. Blodet koaguleres ved at klemme 20 µl blod mellem de to overflader af Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs. Efter 1 time blev de to dele af stenten adskilt, og koaglets areal blev manuelt målt. Gennemsnitsværdien af ​​tre gentagelser blev betragtet som NBCA NFRCS19.
Dynamisk dampsorptionsanalyse (DVS) blev brugt til at evaluere effektiviteten af ​​NFRCS til at absorbere vand fra det eksterne miljø eller fra det skadested, der er ansvarligt for at initiere koagulation. DVS evaluerer eller registrerer dampoptagelsen og -tabet i en prøve gravimetrisk ved hjælp af en ultrafølsom vægt med en masseopløsning på ±0,1 µg. Et partialdamptryk (relativ fugtighed) genereres af en elektronisk massestrømningsregulator omkring prøven ved at blande mættede og tørre bærergasser. I henhold til retningslinjerne fra Den Europæiske Farmakopé blev prøverne, baseret på prøvernes procentdel af fugtoptagelse, kategoriseret i 4 kategorier (0-0,012 % w/w - ikke-hygroskopisk, 0,2-2 % w/w let hygroskopisk, 2-15 % moderat hygroskopisk og > 15 % meget hygroskopisk)23. I henhold til retningslinjerne fra Den Europæiske Farmakopé blev prøverne, baseret på prøvernes procentdel af fugtoptagelse, kategoriseret i 4 kategorier (0-0,012 % w/w - ikke-hygroskopisk, 0,2-2 % w/w let hygroskopisk, 2-15 % moderat hygroskopisk og > 15 % meget hygroskopisk)23.I overensstemmelse med anbefalingerne i Den Europæiske Farmakopé blev prøverne, afhængigt af prøvernes procentdel af fugtabsorption, opdelt i 4 kategorier (0-0,012 % w/w – ikke-hygroskopisk, 0,2-2 % w/w let hygroskopisk, 2-15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat hygroskopisk og > 15 % meget hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012 % w/w非吸湿性、0,2-2 % w/w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为刱为 分为 刱为 ,0＆为 ,0＆为. W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23I overensstemmelse med anbefalingerne fra Den Europæiske Farmakopé er prøver opdelt i 4 klasser afhængigt af den procentdel af fugt, der absorberes af prøven (0-0,012 vægt% – ikke-hygroskopisk, 0,2-2 vægt% let hygroskopisk, 2-15 vægt%.% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat hygroskopisk, > 15 % meget hygroskopisk) 23.Den hygroskopiske effektivitet af NFCS X NFCS og TsN NFCS blev bestemt på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA. Under denne proces blev kørselstid, relativ luftfugtighed (RH) og prøvevægt i realtid ved 25°C24 målt. Fugtindholdet beregnes ved nøjagtig NFRCS-masseanalyse ved hjælp af følgende ligning:
MC er NFRCS-fugtighed. m1 – tørvægt af NSAID'er. m2 er NFRCS-massen i realtid ved en given RF.
Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen efter tømning af prøverne ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen efter tømning af prøverne ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота. образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen, efter at prøverne var blevet tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总积逢积鯝✨ 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотро образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af nitrogenadsorptionsforsøg med flydende nitrogen, efter at prøverne var blevet tømt i 10 timer ved 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Totalt overfladeareal, porevolumen og NFRCS-porestørrelse blev bestemt med en Quantachrome fra NOVA 1000e, Østrig, ved hjælp af RS 232-software.
Forbered 5% erytrocytter (saltvand som fortyndingsmiddel) fra fuldblod. Overfør derefter en aliquot af HFFC (0,25 ml) til en 96-brønds plade og 5% erytrocytmasse (0,1 ml). Inkuber blandingen ved 37°C i 40 minutter. En blanding af røde blodlegemer og serum blev betragtet som en positiv kontrol, og en blanding af saltvand og røde blodlegemer som en negativ kontrol. Hæmagglutination blev bestemt i henhold til Stajitzky-skalaen. De foreslåede skalaer er som følger: + + + + tætte granulære aggregater; + + + glatte bundpuder med buede kanter; + + glatte bundpuder med iturevne kanter; + smalle røde ringe omkring kanterne af de glatte puder; – (negativ) diskret rød knap 12 i midten af ​​den nederste brønd.
Hæmokompatibiliteten af ​​NFRCS blev undersøgt i henhold til metoden fra Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Den gravimetriske metode beskrevet af Singh et al. Mindre ændringer blev foretaget for at vurdere trombedannelse i nærvær af eller på overfladen af ​​NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS blev inkuberet i fosfatbufret saltvand (PBS) i 24 timer ved 37°C. Efter 24 timer blev PBS fjernet, og NFRCS blev behandlet med 2 ml blod indeholdende 3,8% natriumcitrat. Til overfladen af ​​NFRCS tilsættes 0,04 ml 0,1 M CaCl2 til de inkuberede prøver. Efter 45 minutter blev 5 ml destilleret vand tilsat for at stoppe koagulationen. Koaguleret blod på overfladen af ​​NFRK blev behandlet med 36-38% formaldehydopløsning. De koagulerede blodpropper fikseret med formaldehyd blev tørret og vejet. Procentdelen af ​​trombose blev estimeret ved at beregne vægten af ​​glasset uden blod og prøve (negativ kontrol) og glasset med blod (positiv kontrol).
Som en indledende bekræftelse blev prøverne visualiseret under et optisk mikroskop for at forstå HFFC-overfladebelægningens, det sammenkoblede Ct og Ct-netværkets evne til at danne porer. Tynde snit af Ch og Cp fra NFRCS blev trimmet med en skalpelblad. Den resulterende sektion blev placeret på et objektglas, dækket med et dækglas, og kanterne blev fastgjort med lim. De forberedte objektglas blev undersøgt under et optisk mikroskop, og fotografier blev taget ved forskellige forstørrelser.
Polymeraflejring i Ct-netværk blev visualiseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi baseret på metoden beskrevet af Rice et al.29. HFFC-sammensætningen, der blev anvendt til formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (amarant), og NFRCS (Ch & Cp) blev fremstillet i henhold til den tidligere nævnte metode. HFFC-sammensætningen, der blev anvendt til formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (amarant), og NFRCS (Ch & Cp) blev fremstillet i henhold til den tidligere nævnte metode.HFFC-sammensætningen, der blev anvendt til formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (amarant), og NFRCS (Ch og Cp) blev opnået i henhold til den tidligere nævnte metode.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的CS（&ChNFR Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的CS（&ChNFR Cp).HFFC-sammensætningen, der blev anvendt i formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (Amaranth) og modtog NFRCS (Ch og Cp), som tidligere nævnt.Tynde snit af NFRK blev skåret fra de opnåede prøver, placeret på objektglas og dækket med dækglas. Observer de forberedte objektglas under et fluorescensmikroskop med et grønt filter (310-380 nm). Billeder blev taget ved 4x forstørrelse for at forstå Ct-forhold og overskydende polymeraflejring i Ct-netværket.
Overfladetopografien af ​​NFRCS Ch og Cp blev bestemt ved hjælp af et atomkraftmikroskop (AFM) med en ultraskarp TESP-cantilever i tapping-tilstand: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan. Overfladeruheden blev bestemt ved root mean square (RMS) ved hjælp af software (Scanning Probe Image Processor). Forskellige NFRCS-placeringer blev gengivet på 3D-billeder for at kontrollere overfladeensartethed. Standardafvigelsen for scoren for et givet område er defineret som overfladeruheden. RMS-ligningen blev brugt til at kvantificere overfladeruheden af ​​NFRCS31.
FESEM-baserede studier blev udført ved hjælp af FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, for at forstå overflademorfologien af ​​Ch NFRCS og Cp NFRCS, som viste bedre BCT end Cm NFRCS. FESEM-studiet blev udført i henhold til metoden beskrevet af Zhao et al. 32 med mindre ændringer. NFRCS 20 til 30 mg Ch NFRCS og Cp NFRCS blev forblandet med 20 µl 3,8% natriumcitrat forblandet med rotteblod. 20 μl 0,2 M CaCl2 blev tilsat de blodbehandlede prøver for at starte koagulation, og prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. Derudover blev overskydende erytrocytter fjernet fra NFRCS-overfladen ved skylning med saltvand.
Efterfølgende prøver blev behandlet med 0,1% glutaraldehyd og derefter tørret i en varmluftovn ved 37°C for at fjerne fugt. De tørrede prøver blev coatet og analyseret 32. Andre billeder opnået under analysen var koageldannelse på overfladen af ​​individuelle bomuldsfibre, polymeraflejring mellem Ct, erytrocytmorfologi (form), koagelintegritet og erytrocytmorfologi i nærvær af NFRCS. Ubehandlede NFRCS-områder og Ch- og Cp-behandlede NFRCS-områder inkuberet med blod blev scannet for elementære ioner (natrium, kalium, nitrogen, calcium, magnesium, zink, kobber og selen) 33. Sammenlign elementærionprocenter mellem behandlede og ubehandlede prøver for at forstå elementærionakkumulering under koageldannelse og koagelhomogenitet.
Tykkelsen af ​​Cp HFFC-overfladebelægningen på Ct-overfladen blev bestemt ved hjælp af FESEM. Tværsnittene af Cp NFRCS blev skåret ud af rammeværket og sputterbelagt. De resulterende sputterbelægningsprøver blev observeret ved hjælp af FESEM, og tykkelsen af ​​overfladebelægningen blev målt 34, 35, 36.
Røntgen-mikro-CT giver 3D ikke-destruktiv billeddannelse i høj opløsning og giver dig mulighed for at studere den interne strukturelle arrangement af NFRK. Mikro-CT bruger en røntgenstråle, der passerer gennem prøven, til at registrere den lokale lineære dæmpningskoefficient for røntgenstrålerne i prøven, hvilket hjælper med at indhente morfologisk information. Den interne placering af Ct i Cp NFRCS og blodbehandlede Cp NFRCS blev undersøgt ved hjælp af mikro-CT for at forstå absorptionseffektivitet og blodkoagulationsevne i nærvær af NFRCS37,38,39. 3D-strukturerne af blodbehandlede og ubehandlede Cp NFRCS-prøver blev rekonstrueret ved hjælp af mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland). Ved hjælp af VG STUDIO-MAX software version 2.2 blev flere røntgenbilleder taget fra forskellige vinkler (ideelt set 360° dækning) for at udvikle 3D-billeder til NFRCS. De indsamlede projektionsdata blev rekonstrueret til 3D volumetriske billeder ved hjælp af den tilsvarende simple 3D ScanIP Academic software.
Derudover blev 20 µl forblandet citratblod og 20 µl 0,2 M CaCl2 tilsat NFRCS for at initiere blodkoagulation. De forberedte prøver lades hærde. NFRK-overfladen blev behandlet med 0,5% glutaraldehyd og tørret i en varmluftovn ved 30-40 °C i 30 minutter. Blodproppen dannet på NFRCS blev scannet, rekonstrueret, og et 3D-billede af blodproppen blev visualiseret.
Antibakterielle assays blev udført på Cp NFRCS (bedst sammenlignet med Ch NFRCS) ved hjælp af den tidligere beskrevne metode med mindre ændringer. Den antibakterielle aktivitet af Cp NFRCS og Cp HFFC blev bestemt ved hjælp af tre forskellige testmikroorganismer [S. aureus (gram-positive bakterier), E. coli (gram-negative bakterier) og hvid Candida (C. albicans)] dyrket på agar i petriskåle i en inkubator. Inokuler 50 ml af den fortyndede bakteriekultursuspension ensartet ved en koncentration på 105-106 CFU ml-1 på agarmediet. Hæld mediet i en petriskål og lad det størkne. Der blev lavet brønde på overfladen af ​​agarpladen for at fylde dem med HFFC (3 brønde til HFFC og 1 til negativ kontrol). Tilsæt 200 µl HFFC til 3 brønde og 200 µl pH 7,4 PBS til den 4. brønd. På den anden side af petriskålen placeres en 12 mm Cp NFRCS-disk på den størknede agar og fugtes med PBS (pH 7,4). Ciprofloxacin-, ampicillin- og fluconazoltabletter betragtes som referencestandarder for Staphylococcus aureus, Escherichia coli og Candida albicans. Mål hæmningszonen manuelt, og tag et digitalt billede af hæmningszonen.
Efter institutionel etisk godkendelse blev studiet udført på Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i det sydlige Indien. In vitro TEG-eksperimentelprotokollen er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle etiske komité på Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Forsøgspersonerne blev rekrutteret blandt frivillige bloddonorer (i alderen 18 til 55 år) fra hospitalets blodbank. Derudover blev der indhentet en informeret samtykkeerklæring fra de frivillige til indsamling af blodprøver. Naturlig TEG (N-TEG) ​​blev brugt til at undersøge effekten af ​​Cp HFFC-formuleringen på fuldblod blandet med natriumcitrat. N-TEG er bredt anerkendt for sin rolle i genoplivning på plejestedet, hvilket skaber problemer for klinikere på grund af potentialet for klinisk signifikant forsinkelse i resultaterne (rutinemæssige koagulationstests). N-TEG-analyse blev udført ved hjælp af fuldblod. Informeret samtykke og detaljeret sygehistorie blev indhentet fra alle deltagere. Studiet inkluderede ikke deltagere med hæmostatiske eller trombotiske komplikationer såsom graviditet/fødselsdage eller leversygdom. Forsøgspersoner, der tog medicin, der påvirker koagulationskaskaden, blev også ekskluderet fra studiet. Grundlæggende laboratorietests (hæmoglobin, protrombintid, aktiveret tromboplastin og blodpladetælling) blev udført på alle deltagere i henhold til standardprocedurer. N-TEG bestemmer blodproppens viskoelasticitet, initial koagelstruktur, partikelinteraktion, koagelstyrke og koagellyse. N-TEG-analysen giver grafiske og numeriske data om de kollektive effekter af flere cellulære elementer og plasma. N-TEG-analyse blev udført på to forskellige volumener Cp HFFC (10 µl og 50 µl). Som et resultat blev 1 ml fuldblod med citronsyre tilsat til 10 μl Cp HFFC. Tilsæt 1 ml (Cp HFFC + citratblod), 340 µl blandet blod til 20 µl 0,2 M CaCl2-holdig TEG-skål. Derefter blev TEG-skåle fyldt i TEG® 5000, US for at måle R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% af blodprøverne i nærvær af Cp HFFC41.
In vivo-studieprotokollen blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle in vivo NFRCS-studier (2 × 2 cm2) blev udført på hun-Wistar-rotter (med en vægt på 200 til 250 g). Alle dyr blev akklimatiseret ved en temperatur på 24-26 °C, og dyrene havde fri adgang til standardfoder og vand ad libitum. Alle dyr blev tilfældigt opdelt i forskellige grupper, hver gruppe bestod af tre dyr. Alle studier blev udført i overensstemmelse med Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43. Før undersøgelsen blev dyrene bedøvet ved intraperitoneal (ip) administration af en blanding af 20-50 mg ketamin (pr. 1 kg kropsvægt) og 2-10 mg xylazin (pr. 1 kg kropsvægt). Efter undersøgelsen blev blødningsvolumenet beregnet ved at evaluere forskellen mellem prøvernes start- og slutvægt, og gennemsnitsværdien fra de tre tests blev taget som blødningsvolumen for prøvens prøve.
Rottehaleamputationsmodellen blev implementeret for at forstå NFRCS' potentiale til at modulere blødning i traumer, kamp eller trafikulykker (skadesmodel). 50% af halen blev afskåret med en skalpelblad og placeret i luften i 15 sekunder for at sikre normal blødning. Derudover blev testprøver placeret på en rottes hale ved at påføre tryk (Ct, Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS). Blødning og PCT blev rapporteret for testprøver (n = 3)17,45.
Effektiviteten af ​​NFRCS-trykkontrol i kamp blev undersøgt på en model af den superficielle lårbensarterie. Lårbensarterien blotlægges, punkteres med en 24G trokar og forblødes inden for 15 sekunder. Efter observation af ukontrolleret blødning placeres testprøven på punkteringsstedet med påført tryk. Umiddelbart efter påføring af testprøven blev koagulationstiden registreret, og hæmostatisk effektivitet blev observeret i de næste 5 minutter. Den samme procedure blev gentaget med Cs og Ct46.
Dowling et al. 47 foreslog en leverskademodel til at vurdere det hæmostatiske potentiale af hæmostatiske materialer i forbindelse med intraoperativ blødning. BCT blev registreret for Ct-prøver (negativ kontrol), Cs-rammeværk (positiv kontrol), Ch NFRCS-prøver og Cp NFRCS-prøver. Rottens suprahepatiske vena cava blev eksponeret ved at udføre en median laparotomi. Derefter blev den distale del af venstre lap skåret ud med en saks. Lav et snit i leveren med en skalpelblad og lad den bløde i et par sekunder. Nøjagtigt vejede Ch NFRCS- og Cp NFRCS-testprøver blev placeret på den beskadigede overflade uden positivt tryk, og BCT blev registreret. Kontrolgruppen (Ct) påførte derefter tryk efterfulgt af Cs 30 s47 uden at bryde skaden.
In vivo sårhelingsanalyser blev udført ved hjælp af en excisionssårmodel for at evaluere sårhelingsegenskaberne af de udviklede polymerbaserede NFRCS'er. Modeller af excisionssår blev udvalgt og udført i henhold til tidligere publicerede metoder med mindre ændringer19,32,48. Alle dyr blev bedøvet som tidligere beskrevet. Brug en biopsipunch (12 mm) til at lave et cirkulært dybt snit i ryggens hud. De forberedte sårsteder blev forbandt med Cs (positiv kontrol), Ct (i erkendelse af, at vatrondeller forstyrrer helingen), Ch NFRCS og Cp NFRCS (eksperimentel gruppe) og en negativ kontrol uden nogen behandling. På hver dag i undersøgelsen blev sårarealet målt hos alle rotter. Brug et digitalkamera til at tage et billede af sårområdet, og påfør en ny forbinding. Procentdelen af ​​sårlukning blev målt ved hjælp af følgende formel:
Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på undersøgelsens 12. dag blev rottehuden fra den bedste gruppe fjernet ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) og undersøgt ved H&E-farvning og Massons trikromfarvning. Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på undersøgelsens 12. dag blev rottehuden fra den bedste gruppe fjernet ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) og undersøgt ved H&E-farvning og Massons trikromfarvning.Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på undersøgelsens 12. dag blev huden fra rotterne i den bedste gruppe ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) fjernet og undersøgt ved farvning med hæmatoxylin-eosin og Massons trichrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Rotter i den bedste gruppe ((Cp NFRCS) og kontrolgrupper) blev udskåret til hæmatoxylin-eosin-farvning og Massons trikrom-farvning baseret på procentvis sårlukning på dag 12 af studiet.Den implementerede farvningsprocedure blev udført i henhold til tidligere beskrevne metoder49,50. Kort fortalt blev prøverne efter fiksering i 10% formalin dehydreret ved hjælp af en række graduerede alkoholer. Brug en mikrotom til at opnå tynde snit (5 µm tykke) af det udskårne væv. Tynde serielle snit af kontroller og Cp NFRCS blev behandlet med hæmatoxylin og eosin for at undersøge histopatologiske ændringer. Massons trikromfarvning blev brugt til at detektere dannelsen af ​​kollagenfibriller. De opnåede resultater blev blindt undersøgt af patologer.
Stabiliteten af ​​Cp NFRCS-prøver blev undersøgt ved stuetemperatur (25 °C ± 2 °C/60 % RF ± 5 %) i 12 måneder51. Cp NFRCS (overflademisfarvning og mikrobiel vækst) blev visuelt inspiceret og testet for foldslidstyrke og BCT i henhold til ovenstående metoder beskrevet i afsnittet Materialer og metoder.
Skalerbarheden og reproducerbarheden af ​​Cp NFRCS blev undersøgt ved at fremstille Cp NFRCS med en størrelse på 15 × 15 cm2. Derudover blev 30 mg prøver (n = 5) udtaget fra forskellige Cp NFRCS-fraktioner, og BCT'en af ​​de undersøgte prøver blev evalueret som beskrevet tidligere i metodeafsnittet.
Vi har forsøgt at udvikle forskellige former og strukturer ved hjælp af Cp NFRCS-sammensætninger til forskellige biomedicinske anvendelser. Sådanne former eller konfigurationer omfatter koniske podepinde til næseblod, tandbehandlinger og cylindriske podepinde til vaginal blødning.
Alle datasæt er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse og blev analyseret ved ANOVA ved hjælp af Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) efterfulgt af Bonferronis multiple comparisons test (*p < 0,05).
Alle procedurer udført i humane studier var i overensstemmelse med Instituttets og Det Nationale Forskningsråds standarder samt Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens efterfølgende ændringer eller lignende etiske standarder. Alle deltagere blev informeret om studiets karakteristika og dets frivillige karakter. Deltagerdata forbliver fortrolige efter indsamling. In vitro TEG-forsøgsprotokollen er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle etiske komité ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Frivillige underskrev informeret samtykke til at indsamle blodprøver.
Alle procedurer udført i dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Kastuba Faculty of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Alle dyreforsøg, der blev designet, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Committee for the Control and Supervision of Animal Experimentation (CPCSEA). Alle forfattere følger ARRIVE-retningslinjerne.
FTIR-spektrene for alle NFRCS blev analyseret og sammenlignet med chitosanspektret vist i figur 2A. Karakteristiske spektrale toppe for chitosan (registreret) ved 3437 cm-1 (OH- og NH-strækning, overlap), 2945 og 2897 cm-1 (CH-strækning), 1660 cm-1 (NH2-stamme), 1589 cm-1 (N-H-bøjning), 1157 cm-1 (brostrækning O-), 1067 cm-1 (strækning C-O, sekundær hydroxyl), 993 cm-1 (strækning CO, Bo-OH) 52, 53, 54. Supplerende tabel S1 viser FTIR NFRCS-absorptionsspektrumværdierne for chitosan (reporter), ren chitosan, Cm, Ch og Cp. FTIR-spektrene for alle NFRCS (Cm, Ch og Cp) viste de samme karakteristiske absorptionsbånd som ren chitosan uden nogen signifikante ændringer (fig. 2A). FTIR-resultaterne bekræftede fraværet af kemiske eller fysiske interaktioner mellem de polymerer, der blev brugt til at udvikle NFRCS, hvilket indikerer, at de anvendte polymerer er inerte.
In vitro-karakterisering af Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs. (A) repræsenterer de kombinerede FTIR-spektre af sammensætningerne af chitosan og Cm NFRCS, Ch NFRCS og Cp NFRCS under kompression. (B) a) Optagelseshastighed i fuldblod for NFRCS Cm, Ch, Cp og Cg (n = 3); Ct-prøverne viste en højere BAR, fordi vatpinden har en højere absorptionseffektivitet; b) Absorption efter blod. Illustration af den absorberede prøve. Grafisk repræsentation af BCT for testprøve C (Cp NFRCS havde den bedste BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E og G blev vist som middelværdi ± SD, og ​​fejllinjerne repræsenterer SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E og G blev vist som middelværdi ± SD, og ​​fejllinjerne repræsenterer SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляюю отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E og G præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse, og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen, ***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предстантставля отклонение, ***p <0,0001. Data i C, D, E og G er vist som middelværdi ± standardafvigelse, fejllinjer repræsenterer standardafvigelse, ***p < 0,0001.